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METABOLIMO CELULAR INTERMEDIO

Se denomina Metabolismo Celular Intermedio a la serie de reacciones integradas que se llevan a cabo en las células de un organismo, con el objeto de extraer la energía de los macronutrimentos ingeridos, el almacenamiento de dicha energía y su posterior utilización para la síntesis de nuevas moléculas que constituyen la célula, tales como los carbohidratos, las proteínas, los lípidos, los ácidos nucleicos, etc.

Dichas reacciones integradas forman parte de vías metabólicas específicas, todas ellas relacionadas mediante metabolitos intermediarios, tal como están relacionados los diferentes componentes de un mecanismo de relojería. Las vías metabólicas celulares pueden equipararse al sistema de carreteras de un país, en las que las ciudades comunicadas por una ruta determinada son el equivalente de las moléculas intermediarias en el total de dicha ruta metabólica. Las vías metabólicas pueden ser divididas en dos grandes grupos de acuerdo a su función:

(A) Vías Anabólicas (Anabolismo). Son aquellas vías especializadas en la síntesis de moléculas que a su vez pueden ser substratos para la síntesis de moléculas más complejas. De esta manera, la síntesis de nucleótidos es una vía previa asociada a la síntesis de ácidos nucleicos, así como la síntesis de ciertos aminoácidos precede a la síntesis de proteínas.

(B) Vías Catabólicas (Catabolismo). Son aquellas vías especializadas en la degradación de moléculas energéticas complejas mediante procesos oxidativos, generando los productos catabólicos CO2, H2O y NH3. Otras moléculas son catabolizadas para formar productos de deshecho los cuales son eliminados generalmente por vía renal, fecal, etc.

Todas las vías metabólicas son reguladas de diferentes maneras, implicando generalmente

a una o más enzimas participantes en la vía metabólica. Los principales mecanismos de control en células eucarióticas son

(a) concentración de substratos (b) control alostérico (c) Modificación covalente (d) control hormonal (e) compartamentalización subcelular

Una de las principales características de los organismos vivientes es la posibilidad de

extraer la energía de los diferentes nutrimentos energéticos que el individuo consume, lo cual los hace ser clasificados como organismos Quimotróficos, mientras que otros organismos transforman la energía luminosa en energía química mediante procesos fotosintéticos, lo cual hace que dichos organismos sean clasificados como organismos Fototrópicos.

Las células animales extraen la energía de los alimentos que consumen mediante procesos oxidativos conducentes a la producción de enlaces pirofosfato de alta energía presentes en la Adenosina Trifosfato (ATP). La síntesis de ATP requiere energía mientras que su hidrólisis libera la energía almacenada, la cual puede ser utilizada en una serie de procesos celulares tales como la contracción muscular, el transporte activo, biosíntesis de diferentes moléculas, etc. El proceso catabólico mediante el cual se extrae la energía contenida en los nutrimentos sucede en cuatro diferentes etapas:

(1) Digestión, absorción y transporte de las unidades monoméricas resultantes de la digestión (monosacáridos, aminoácidos, ácidos grasos, etc.).

(2) Producción de Acetil~CoA mediante la oxidación de las diferentes unidades monoméricas siguiendo vías metabólicas específicas.

(3) Oxidación de la Acetil~CoA en el Ciclo de Krebs con la consecuente producción de CO2 y de poder reductor en forma de NADH(H+) y FADH2

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(4) Oxidación de las coenzimas reducidas NADH(H+) y FADH2 para alimentar con electrones

al sistema de transporte electrónico mitocondrial lo cual implica la utilización de oxígeno como el último receptor de electrones transformándose en agua metabólica. La creación de un gradiente de electroquímico de protones como consecuencia del transporte mitocondrial de electrones, es en última instancia el mecanismo de fosforilación del ADP para generar el ATP por efecto de la enzima ATP sintetasa.

Las principales vías metabólicas para la producción de Acetil~CoA son la oxidación de

glucosa y otras hexosas mediante la glucólisis, la oxidación de los ácidos grasos, la oxidación de aminoácidos generadores de ácido pirúvico o de Acetil~CoA. Glucólisis

La glucólisis, también conocida como Via de Embden-Myerhof, es la via metabólica central del metabolismo de los carbohidratos, la cual sucede en el citoplasma de prácticamente en todas las células del organismo animal y es de especial importancia como fuente generadora de ATP en aquellas células que carecen de mitocondrias y por lo tanto no pueden llevar a cabo el Ciclo de Krebs, tales como los eritrocitos. Fundamentalmente, la glucólisis aeróbica es la transformación de la glucosa en ácido pirúvico y NADH(H+), mientras que la glucólisis anaeróbica genera ácido láctico por la reducción enzimática del ácido pirúvico utilizando NADH(H+) como fuente reductora . Algunos metabolitos intermedios de esta via metabólica pueden ser utilizados para la síntesis de otras moléculas tales como aminoácidos no esenciales y lípidos.

La secuencia de las reacciones que constituyen la glucólisis es prácticamente universal, ya que es la misma en animales, plantas y muchos microorganismos, difiriendo solamente de una especie a otra en los mecanismos de regulación, y en el destino metabólico del ácido pirúvico formado. Las reacciones de la glucólisis.

Según su mecanismo, diferentes tipos de reacciones enzimáticas ocurren durante la glucólisis, siendo algunas de ellas:

1. Transferencia de grupo fosfato del ATP a un metabolito intermediario o viceversa. 2. Cambio de posición de un grupo fosfato dentro de un mismo metabolito. 3. Isomerización de hexosas y triosas fosforiladas 4. Deshidratación

5. Bipartición/condensación aldólica de hexosas/triosas 6. Fosforilación oxidativa

La primera reacción de la glucólisis es la fosforilación enzimática de la glucosa para formar

el ester fosfórico denominado Glucosa-6-fosfato (G-6-P). Esta reacción consume un mol de ATP y es catalizada por un grupo de enzimas comúnmente denominadas Cinasas, de las cuales existen varios tipos, denominadas I, II, III, y IV en diferentes tejidos. En el hígado la principal variedad es el tipo IV denominada Glucocinasa. Dada la termodinámica de la reacción esta es irreversible. HC Glucosa + ATP-Mg++ Glucosa-6-fosfato + ADP-Mg++

La segunda reacción es la isomerización enzimática de la Glucosa-6-fosfato a Fructosa-6-fosfato, reacción que es catalizada reversiblemente por la enzima Fosfoglucoisomerasa. Esta reacción implica esencialmente la conversión de una aldohexosa fosfato en una cetohexosa fosfato. FGI Glucosa-6-fosfato Fructosa-6-fosfato

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La tercera reacción implica una segunda fosforilación dependiente de ATP, en la cual la

Fructosa-6-fosfato es transformada en Fructosa-1,6-bisfosfato. La reacción es catalizada por la enzima Fosfofructocinasa I. Debido al consumo de un mol de ATP, esta reacción es irreversible en condiciones metabólicas celulares. FFC Fructosa-6-fosfato + ATP Fructosa-1,6-bisfosfato + ADP La enzima Fosfofructocinasa I es una enzima alostérica fundamental para el control de la glucólisis. Esta enzima es inhibida por altos niveles de ATP, disminuyendo la afinidad de la enzima por sus substratos, la Fructosa-6-fosfato. El efecto alostérico inhibitorio del ATP puede ser revertido por el AMP, así que la actividad enzimática aumenta cuando la relación ATP/AMP disminuye. Otros reguladores alostéricos de esta enzima son la fructosa 2,6-bisfosfato y el ácido cítrico, un intermediario del Cíclo de Krebs.

La cuarta reacción implica la bipartición aldólica de la Fructosa-1,6-bisfosfato por efecto de la enzima Aldolasa, produciendo las dos triosas fosforiladas Dihidroxiacetona fosfato y el Gliceraldehido-3-fosfato. La reacción es reversible, tal como sucede durante la Gluconeogénesis, en la cual ocurre una condensación aldólica. Aldolasa Fructosa-1,6-bisfosfato Gliceraldehido-3-fosfato + Dihidroxiacetona fosfato

Debido a que ambos productos de la reacción son interconvertibles mediante la enzima Triosafosfato isomerasa, se establece un equilibrio entre una cetotriosa fosfato y una aldotriosa fosfato, reacción que es reversible y constituye la quinta reacción glucolítica. TFI Dihidroxiacetona fosfato Gliceraldehido-3-fosfato

La sexta reacción glucolítica implica la fosforilación oxidativa del Gliceraldehido-3-fosfato por la enzima Gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa la cual requiere NAD

+ como coenzima y

fosfato inorgánico (Pi) como substrato para formar el ácido 1,3-bisfosfoglicérico. Debido a la presencia de un enlace fosfoanhidrido (acilfosfato) en el ácido 1,3-bisfosfoglicérico, este compuesto es considerado ser un compuesto de alta energía. Esta reacción es reversible. Durante la reacción, el NAD

+ es reducido a NADH(H

+). El destino metabólico de esta coenzima reducida

depende de las condiciones aeróbicas o anaeróbicas del tejido en el cual se lleva a cabo la reacción. GA3FDH Gliceraldehido-3-fosfato + Pi + NAD

+ Acido 1,3-bisfosfoglicérico + NADH(H

+)

Esta reacción no se lleva a cabo si el fosfato es substituido por arseniato, en cuyo caso el

producto no es un substrato para la siguiente reacción de la via glicolítica. Por lo tanto el arseniato es considerado un inhibidor de la glucólisis en esta etapa específica.

En condiciones anaeróbicas, el NADH(H+) es utilizado para reducir el ácido pirúvico a ácido

láctico y de esta manera regenerar NAD+ para mantener la glucólisis activa. En condiciones

aeróbicas el NADH(H+) es utilizado como una fuente de electrones para alimentar la cadena

respiratoria mitocondrial, debiendo ser transportados los hidrógenos al interior de la mitocondria mediante el sistema lanzadera del ácido málico o del α-glicerofosfato.

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La séptima reacción es la primera de dos reacciones en las que hay transferencia de un

enlace fosfato de alta energía al ADP con la consecuente formación de un mol de ATP, mecanismo que es denominado "Fosforilación a Nivel de Substrato". La reacción es catalizada reversiblemente por la enzima Fosfogliceratocinasa denominada así por la reacción inversa. FGC Acido1,3-bisfosfoglicérico + ADP Acido 3-fosfoglicérico + ATP

Un método alterno para la oxidación de glucosa el via denominada via de las pentosas fosfato, también conocida como derivación de la hexosa monofosfato. Esta via genera metabolitos intermediarios de la glucólisis anaeróbica, tales como el Gliceradehido-3-fosfato y la Fructosa-6-fosfato los cuales siguen luego la via glicolítica generadora de ATP. Esta via es especialmente importante

La octava es una reacción de isomerización, en la cual la enzima Fosfoglicerato fosfomutasa, cataliza la transferencia del grupo fosfato del carbono número 3 hacia el carbono número 2, formando así el ácido 2-fosfoglicérico. FGFM Acido 3-fosfoglicérico Acido 2-fosfoglicérico

La enzima Enolasa cataliza la novena reacción de esta vía metabólica, transformando enzimaticamente al ácido 2-fosfoglicérico en ácido fosfoenolpirúvico mediante una deshidratación. La presencia de un enlace enolfosfato hace del ácido Fosfoenolpirúvico un compuesto de alta energía. Enolasa Acido 2-fosfoglicérico Acido fosfoenolpirúvico Mg

++

Esta reacción puede ser inhibida por el fluoruro (F

-), el cual forma un complejo Mg++-

fosfato-fluoruro, utilizando así el Mg++ requerido por la enzima Enolasa. La décima y última reacción de la glucólisis implica la segunda fosforilación a nivel de substrato con la concomitante generación de un mol de ATP debido a la transferencia del enlace fosfato de alta energía del ácido fosfoenolpirúvico al ADP, reacción que es catalizada por la enzima Piruvatocinasa, nombre tomado por la reacción inversa. El ácido pirúvico así formado es el producto final de la glucólisis. PC Acido fosfoenolpirúvico Acido pirúvico En condiciones de anaerobiosis, el ácido pirúvico es reducido a ácido láctico por efecto de la enzima Lactato Deshidrogenasa (LDH) y el poder reductor en forma de NADH(H

+) que fue

generado durante la reacción catalizada por la enzima Gliceraldehido-3-fosfato Deshidrogenasa. De esta manera, la reoxidación del NADH(H

+) mediante la via de la formación del ácido láctico,

permite que la glucólisis continúe aún en condiciones anaeróbicas, mediante la regeneración de NAD

+.

Una vía metabólica alterna para la oxidación de glucosa es la denominada vía de las Pentosas Fosfato o Derivación de la Hexosa Monofosfato, la cual genera metabolitos intermedios tales como la Fructosa-6-fosfato y el Gliceraldehido-3-fosfato, los cuales pueden ser incorporados a la vía glicolítica anaeróbica para generar ATP y ácido láctico. Esta vía es por lo tanto especialmente importante en aquellas células cuya única fuente de energía es el ATP generado durante la glucólisis anaeróbica debido a que carecen de mitocondrias para generar ATP mediante la fosforilación oxidativa.

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Esta vía metabólica se lleva a cabo en el citosol y es especialmente importante la primera de

dos deshidrogenaciones que se llevan a cabo durante todo el proceso. La enzima Glucosa-6-fosfato Deshidrogenasa (G6PDH) oxida a la glucosa-6-fosfato a 6-fosfogluconolactona. En esta misma reacción el NADP

+ es reducido a NADPH(H

+). La generación de NADPH(H

+) es

especialmente importante ya que esta coenzima reducida es utilizada a su vez en varias otras funciones metabólicas celulares, tales como:

a. Síntesis de ácidos grasos b. Sistema Citocromo P450 c. Reducción enzimática del Glutation oxidado (G-S-S-G) d. Síntesis de Colesterol y hormonas esteroideas e. Síntesis de Cuerpos Cetónicos f. Mecanismo de acción de las Oxidasas de Función Mixta (MFOs)

Esta vía metabólica es también una fuente importante de Ribosa-5-fosfato, la cual es

utilizada para la síntesis de nucleótidos purínicos y pirimidínicos los que a su vez pueden ser utilizados para la síntesis de coenzimas específicas (FMN, FAD, NAD

+, NADP

+, CoA-SH, SAM,

PAPS, etc.), así como para la síntesis de los ácidos nucleicos ADN y ARN.

Esta vía requiere Glucosa-6-fosfato la cual es deshidrogenada para formar 6-fosfogluconolactona la cual es transformada en ácido 6-fosfoglucónico por apertura hidrolítica del anillo lactona. El ácido 6-fosfoglucónico resultante es oxidado en una reacción dependiente de NADP

+ seguido de una decarboxilación para generar Ribulosa-5-fosfato, una cetopentosa fosfato,

la cual es isomerizada a Ribosa-5-fosfato y a Xilulosa-5-fosfato por efecto de dos isomerasas específicas. La via continua mediante una serie de reacciones que esencialmente consisten en transcetolaciones y transalsolaciones de carbonos, para producir finalmente Fructosa-6-fosfato y Gliceraldehido-3-fosfato que son metabolitos intermediarios de la glucólisis, por lo que estos pueden ser derivados hacia dicha vía metabólica. Una deficiencia de la vitamina hidrosoluble Tiamina (Beri-beri) afecta esta via metabólica, ya que la enzima Transcetolasa requiere Pirofosfato de Tiamina como coenzima. Por otra parte una deficiencia de la enzima Glucosa-6-fosfato Deshidrogenasa disminuye la producción de la coenzima reducida NADPH(H

+) requerida para la protección antioxidante de la célula contra la

peroxidación de ácidos grasos insaturados y proteínas por efecto de los radicales libres de oxígeno, así como la producción de superóxido a partir de la Oxihemoglobina, lo cual sucede espontáneamente . Un agotamiento del Glutation reducido (G-SH) por deficiencia congénita de la enzima G6PDH en individuos homocigotos afecta especialmente al eritrocito, causando la ruptura de la membrana plasmática lo cual conduce a la condición denominada Anemia Hemolítica por Deficiencia de G6PDH. Esta condición pude ser sintomática en individuos homocigóticos excepto si son expuestos a la acción de ciertas drogas agotadoras del Glutation, principalmente las drogas antipalúdicas (Primaquina, Pamaquina, etc.) las cuales son reducidas por el NADPH(H

+). La

anemia, aunada a la presencia de cuerpos de Heinz intraeritrocíticos, orina obscura e hiperbilirubinemia son características diagnósticas de esta condición patológica. Transformaciones Metabólicas del ácido Pirúvico.

El ácido pirúvico generado en la glucólisis o bien como producto de la transaminación de la Alanina o de la desaminación oxidativa de ciertos aminoácidos, puede ser transformado enzimáticamente en diferentes productos según los requerimientos metabólicos y energéticos del organismo. Las transformaciones más importantes del piruvato son las siguientes.

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(A) Reducción del piruvato. En condiciones anaeróbicas tales como las del eritrocito, el

ácido pirúvico es reducido a ácido láctico, por efecto de la enzima Lactato Deshidrogenasa (LDH) y el poder reductor de la coenzima NADH(H+) generada durante la fosforilación oxidativa del Gliceraldehido-3-Fosfato. De esta manera se regenera NAD+ y la vía glicolítica puede continuar aún en condiciones anaeróbicas. En el músculo esquelético donde el ácido láctico es producido principalmente, y debido a que no puede ser transformado en otro metabolito, el ácido láctico pasa al torrente circulatorio para ser llevado hacia el hígado. En el hepatocito, el ácido láctico puede ser reconvertido a glucosa mediante las reacciones de la Neoglucogénesis, o bien ser transformado de nuevo en ácido pirúvico para luego ser transformado en Acetil~CoA.

LDH

Ac. pirúvico + NADH(H+) Ac. láctico + NAD+

(B) Transaminación del piruvato. La transaminación del ácido pirúvico ocurre por efecto de la enzima Alanina amino Transferasa (ALT), la cual requiere Fosfato de Piridoxal (PP) como coenzima y que genera Alanina así como la transformación concomitante de ácido glutámico en ácido α-cetoglutárico. Debido a su reversibilidad, esta reacción es crucial para la conversión metabólica de Alanina en Glucosa mediante la Neoglucogénesis.

ALT

Ac. Pirúvico + Ac. Glutámico Alanina + Ac. α-cetoglutárico PP

(C) Descarboxilación oxidativa del piruvato. En condiciones aeróbicas, el ácido pirúvico es descarboxilado oxidativamente mediante el complejo multienzimático denominado comúnmente Piruvato Deshidrogenasa (PDH), complejo que requiere la participación simultanea de las coenzimas Pirofosfato de Tiamina (TPP), Acido Lipóico, CoA-SH, FAD y NAD+. Los productos finales de esta reacción son Acetil-CoA, NADH y CO2.

PDH Ac. Pirúvico + NAD+ + CoA-SH Acetil~CoA + NADH(H+) + CO2

(D) Carboxilación del piruvato. Esta es una reacción clave para la iniciación del Ciclo de Krebs, además de ser un paso obligatorio en el proceso de Neoglucogéneisis a partir de aquellos aminoácidos transformables en ácido pirúvico. Esta es una típica reacción de carboxilación dependiente de Biotina y ATP catalizada por la enzima Piruvato Carboxilasa (PC).

PC Ac. pirúvico + Biotina-CO2 + ATP Ac. Oxaloacético + Biotina + ADP + Pi

Ciclo del ácido cítrico, ciclo de krebs, o ciclo del ácido tricarboxílico

El ciclo del ácido cítrico o ciclo del ácido tricarboxílico es denominado también Ciclo de Krebs en honor a uno de sus descubridores. Esta vía metabólica se lleva a cabo en matriz mitocondrial y constituye la via terminal para la oxidación de todos los nutrimentos, carbohidratos lípidos y proteínas, una vez transformados en Acetil~CoA.

Algunos de los intermediarios de esta vía metabólica pueden ser utilizados en algunas otras vías anabólicas, tales como la síntesis del grupo Heme, lo cual requiere Succinil~CoA, un metabolitos intermediario. El ácido glutámico y el ácido aspártico pueden ser generados por transaminación del ácido α-cetoglutárico y del ácido oxaloacético respectivamente. La Neoglucogénesis, que es la síntesis de glucosa a partir de moléculas precursoras no-carbohidratos, tales como algunos aminoácidos, el glicerol y el ácido láctico, es un proceso que implica la formación obligatoria de Acido Oxaloacético que es un metabolito intermediario de Ciclo de Krebs.

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Durante las reacciones oxidativas del cíclo se generan equivalentes reductores en forma

de hidrógeno o de electrones, como consecuencia de la reducción de las coenzimas NAD+ y FAD por efecto de enzimas Deshidrogenasas específicas. Estos equivalentes reductores en forma de NADH y FADH2 respectivamente, alimentan con electrones al Sistema Mitocondrial de Transporte Electrónico para la generación de enlaces pirofosfato de alta energía en el ATP, mecanismo que es denominado Fosforilación Oxidativa y que constituye la culminación de todo el proceso productos de energía en la célula. Reacciones del ciclo

La oxidación de los dos carbonos de la Acetil~CoA se inicia cuando una molécula es condensada con una molécula de ácido oxaloacético el cual actúa como un acarreador del grupo acetato, generando una molécula de ácido cítrico, un ácido tricarboxílico de seis carbonos. Tanto la Acetil~CoA como el ácido oxaloacético son generados en la matriz mitocondrial a partir del mismo precursor metabólico que es el ácido pirúvico, el que a su vez es el producto final de la glucólisis aeróbica o del catabolismo de varios aminoácidos, como la Alanina, Serina, Glicina, etc.

Luego de esta reacción de condensación, siguen una serie de reacciones durante las cuales se generan dos moléculas de CO2, tres moléculas de NADH y una molécula de FADH2 . Al final se regenera el ácido oxaloacético. Puesto que solo una pequeña cantidad de oxaloacetato es requerida para facilitar la conversión de una gran cantidad de moléculas de Acetil~CoA, puede considerarse que la concentración de oxaloacetato es el factor más crítico en la velocidad de formación de citrato.

La reacción que es catalizada por la enzima Citrato Sintetasa que es una de la las enzimas que regulan la velocidad del cíclo. CS Acetil~CoA + Oxaloacetato + H2O Citrato + CoA-SH (1)

La segunda y tercera reacciones implican la isomerización del citrato a isocitrato por deshidratación y rehidratación, reacciones que son catalizadas por la enzima Aconitasa, mediante la formación del intermediario cis-aconitato. La reacción es inhibida en presencia del Fluoroacetato, en cual forma Fluoroacetil-CoA, se condensa con el oxaloacetato formando Fluorocitrato y este inhibe a la Aconitasa. A Citrato cis-Aconitato + H2O (2) A cis-Aconitato + H2O Isocitrato (3)

La cuarta y quinta reacciones consisten en una decarboxilación oxidativa del isocitrato para formar Acido α-cetoglutárico. Ambas reacciones son catalizadas por la enzima Isocitrato Deshidrogenasa (IDH), mediante la formación del metabolito intermediario Acido Oxalosuccínico. La coenzima requerida es NAD+ la cual es reducid a NADH. IDH Isocitrato + NAD+ Oxalosuccinato + NADH (4) IDH Oxalosuccinato α-cetoglutarato + CO2 (5)

La sexta reacción del ciclo es catalizada por un complejo multienzimático denominado α-Cetoglutarato Deshidrogenasa (α-CDH). Dicho complejo cataliza una reacción tipo decarboxilación oxidativa de un α-cetoácido, y origina el compuesto de alta energía Succinil~CoA, CO2 y NADH.

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El mecanismo de esta reacción irreversible es similar al que forma Acetil~CoA a partir del

piruvato. El complejo multienzimático requiere la participación de cinco diferentes coenzimas: Pirofosfato de Tiamina, Acido Lipóico, CoA-SH, FAD y NAD+, siendo el NAD+ la última coenzima que acepta los electrones. α-CDH α-cetoglutarato + NAD+ Succinil~CoA + NADH (6)

La séptima reacción del Ciclo de Krebs implica la transformación de la Succinil~CoA en Succinato debido a la acción de la enzima Succinato Tiocinasa (Succinil~CoA Sintetasa) por la reacción inversa. Esta reacción implica la formación de un enlace fosfato de alta energía en forma de GTP mediante la fosforilación del GDP en presencia de fosfato inorgánico (Pi). Esta es la única reacción del Ciclo de Krebs que genera un enlace fosfato rico en energía mediante fosforilación a nivel de substrato STC Succinil~CoA + GDP + Pi Succinato + GTP + CoA-SH (7)

En la octava reacción el Succinato es deshidrogenado generando Fumarato mediante la acción de la enzima Succinato Deshidrogenasa (SDH), la cual es una enzima unida a la superficie interior de la membrana mitocondrial interna. Esta es la única reacción del Ciclo que implica una transferencia directa de hidrógenos de un substrato a una Flavoproteina sin la participación de NAD+. La enzima esta fuertemente unida a una molécula de FAD que actúa como coenzima, así como a una Ferrosulfoproteina (Fe.S). Esta reacción puede ser inhibida competitivamente por la adición de Malonato o de Oxaloacetato. SDH Succinato + FAD Fumarato FADH2 (8)

La enzima Fumarato Hidratasa o Fumarasa cataliza la novena reacción en la cual el Succinato es hidratado para generar Malato. La adición de una molécula de agua a la doble ligadura del Fumarato en la configuración trans es estereoespecífica, por lo que solo se forma L-Malato. FH Fumarato + H2O L-Malato (9) En la décima y ultima reacción del ciclo se regenera el Oxaloacetato mediante la deshidrogenación del L-Malato mediante la acción de la enzima Malato Deshidrogenasa (MDH), enzima que requiere NAD+ como coenzima. MDH L-Malato + NAD+ Oxaloacetato + NADH (10)

Como consecuencia de las cuatro oxidaciones catalizadas por Deshidrogenasas especificas durante una vuelta del ciclo, se producen tres mole de NADH(H+) y un mol de FADH2, además e dos moles de CO2 y un mol de GTP. Los equivalentes reductores son transferidos a la cadena respiratoria localizada en la membrana mitocondrial interna para la generación de enlaces fosfato de alta energía en forma de enlaces pirofosfato en el ATP mediante el mecanismo conocido como Fosforilación Oxidativa. La suma de las reacciones estequeométricas del Ciclo de Krebs consecuentemente es: Acetil~CoA + 3NAD+ + FAD + GDP + Pi + H2O 2CO2 + 3NADH + FADH2 + GTP + CoA + 2H+

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Se puede observar que los dos carbonos que entran al ciclo en forma de Acetil~CoA, no se

pierden en forma de CO2 durante la primera vuelta del ciclo, sino que son los dos carbones superiores del oxaloacetato. Debido a la necesidad de regenerar NAD+ y FAD, el Ciclo de Krebs opera solamente cuando dispone de oxigeno, el cual es utilizado como el último receptor de electrones en la ultima reacción de la cadena respiratoria para la formación de agua metabólica. Regulación del Ciclo.

La actividad del Ciclo de Krebs es controlada en varias de sus reacciones. El primer sitio de control es la transformación de Piruvato en Acetil~CoA, reacción que es catalizada por la enzima Piruvato Deshidrogenasa. Dicha enzima es inhibida alostericamente por ATP y activada por AMP. Sin embargo, el control principal es por modificación covalente de la enzima al fosforilar un residuo de Serina, lo cual inactiva la enzima. La fosforilación es estimulada por altas concentraciones de ATP, Acetil~CoA y NADH, e inhibida por piruvato, CoA-SH, NAD+ y ADP. El piruvato también activa la enzima Piruvato Deshidrogenasa Fosfato Fosfatasa que desfosforila a la enzima y de esta manera la reactiva.

La enzima Citrato Sintetasa es inhibida por ATP, el cual disminuye la afinidad de la enzima por su substrato, el oxaloacetato, reduciendo la velocidad de la reacción. La enzima Isocitrato Deshidrogenasa es estimulada por ADP y NAD+, e inhibida por NADH. Estos factores modifican la afinidad de la enzima por su substrato, el Isocitrato.

El control final del ciclo es la reacción catalizada por la enzima α-Cetoglutarato Deshidrogenasa, la cual es inhibida por los productos de la reacción, Succinil~CoA y NADH, y también por ATP. El Ciclo de Krebs es igualmente controlado por la disponibilidad de Oxaloacetato. Sistema mitocondrial de transporte electrónico y mecanismo de fosforilación oxidativa

La mayor parte del ATP formado como resultado de la oxidación completa de los carbohidratos, lípidos y proteínas, es producto del proceso metabólico denominado Fosforilación Oxidativa, el cual se lleva a cabo en la membrana mitocondrial interna.

La mitocondria es un organelo celular constituido por un sistema de doble membrana; una membrana externa que está en contacto con el citosol y una membrana interna altamente invaginada con el objeto de ofrecer una mayor superficie. La membrana interna contiene un 75% de proteína, muchas de las cuales constituyen el Sistema de Transporte Electrónico o Cadena Respiratoria Mitocondrial, además de otra serie de proteínas cuya función es muy variada, pudiendo ser transportadores, enzimas, etc. La membrana externa es relativamente permeable a los iones y pequeñas moléculas, mientras que la membrana interna resulta impermeable a muchas moléculas dentro de las que se incluyen Oxaloacetato, NADH, etc. La matriz mitocondrial contiene todos los sistemas enzimáticos responsables de la producción de coenzimas reducidas, tales como NADH y FADH2. Dentro de estos sistemas enzimáticos se encuentran las enzimas del Cíclo de Krebs, las enzimas de la β-Oxidación de los Acidos Grasos, el complejo multienzimático Piruvato Deshidrogenasa, etc. Mecanismo de la Fosforilación Oxidativa.

Varias hipótesis han sido propuestas para explicar la forma en la que el transporte electrónico está acoplado a la generación de ATP. Una de las hipótesis mas aceptadas y la que mejor se ajusta a los hechos hasta ahora conocidos es la Teoría Quimiosmótica propuesta por Mitchell.

Según Mitchell el suceso primario en la fosforilación oxidativa es la translocación unidireccional de protones (H+) al exterior de una membrana de acoplamiento que es la membrana mitocondrial interna. Los protones son impulsados por la energía liberada durante las reacciones de oxido-reducción de la cadena respiratoria. Al acumularse los protones fuera de la membrana mitocondrial interna se crea una diferencia de potencial electroquímico (gradiente electroquímico, ∆H+) a través de la membrana mitocondrial interna.

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Todos los componentes de la Cadena Respiratoria se localizan en la membrana

mitocondrial interna y están organizados en forma de complejos (Complejos I III y IV) cuya función es la transportar electrones desde el complejo I hasta el complejo IV. La caída de potencial del electrón al pasar de un complejo al siguiente complejo libera energía la cual es utilizada para bombear protones (H+) de la matriz mitocondrial hacia el espacio intermembranal, lo cual genera un gradiente electroquímico. Posteriormente, la energía generada por este gradiente de protones es atrapada y almacenada como ATP cuando los protones fluyen al interior de la mitocondria a través del componente Fo de la enzima ATP sintetasa, la cual utiliza la fuerza protomotríz para fosforilar al ADP y generar ATP, en la fracción F1 de la enzima. Complejos del Sistema de Transporte Electrónico.

La cadena respiratoria o Sistema de Transporte Electrónico esta constituida por cuatro complejos de proteínas todos ellos localizados en la membrana mitocondrial interna, ya sea como proteínas integrales o periféricas, y dos transportadores móviles de electrones. El resultado neto es la transferencia de electrones del NADH y del FADH2 al oxígeno con la consecuente formación de agua metabólica. El complejo V, aunque no participa directamente en el transporte electrónico, es la enzima que en última instancia sintetiza ATP. Los complejos proteicos son los siguientes: COMPLEJO I (NADH Deshidrogenasa) COMPLEJO II (Succinato Deshidrogenasa) COMPLEJO III (Coenzima Q-Citocromo c Reductasa) COMPLEJO IV (Citocromo c Reductasa) COMPLEJO V ( ATP sintetasa)

Todos los componentes de la Cadena Respiratoria están dispuestos en orden creciente de Potencial Redox (una medida de afinidad por los electrones) donde los electrones fluyen a través de los componentes de manera escalonada desde el componente con menor afinidad por los electrones (NAD+) hasta el de mayor afinidad (Oxígeno). Los lípidos como fuente de energía.

La oxidación de los lípidos de la dieta deben constituir aproximadamente el 30% del total de las calorías ingeridas en todos los alimentos. La oxidación completa de un gramo de grasa libera 9 Kcal., por lo tanto, de los alimentos que el humano ingiere, los triglicéridos son el combustible más energético. Lipólisis.

La reserva energética más abundante en el organismo lo constituye el tejido adiposo en el cual se almacenan triglicéridos principalmente. Para la utilización de esta fuente de energía es necesario liberar los ácidos grasos constituyentes de los triglicéridos almacenados. Este proceso metabólico denominado Lipólisis es un fenómeno que es regulado por varias hormonas lipolíticas, tales como Adrenalina, Noradrenalina, Glucagon, ACTH, MSH, GH, Vasopresina etc. Estas hormonas median su acción mediante la formación de un segundo mensajero químico, el 3',5'cAMP, el cual es el producto de la actividad de la enzima Adenilciclasa sobre el ATP. La Adenilciclasa es a su vez activada por la acción de la subunidad alfa de una Proteína G estimuladora (Gs), la cual actúa como un transductor de la señal hormonal.

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En última instancia y como consecuencia de este proceso la enzima Lipasa Sensible a

Hormonas actúa sobre los Triglicéridos almacenados en el adipocito, produciendo Acidos Grasos Libres (AGL) y Diglicéridos, siendo estos últimos a su vez substratos para otras Lipasas específicas, conduciendo finalmente a la hidrólisis completa hasta Glicerol y dos Acidos Grasos Libres. Los ácidos grasos difunden a través de la membrana del adipocito hacia el torrente sanguíneo donde se unen a Albúmina y a otras proteínas transportadoras de Acidos Grasos, para ser transportados hacia el músculo y el hígado principalmente. Transporte de ácidos grasos hacia la matriz mitocondrial.

Luego de su transporte hacia el tejido muscular y su entrada a la célula luego de ser liberados por la albúmina, los ácidos grasos libres son convertidos a derivados de CoA-SH denominados Acil~CoA. Esta reacción es catalizada por la enzima Acil-CoA Sintetasa, y requiere la utilización de dos enlaces fosfatos de alta energía en el ATP, el cual es transformado en AMP y Pirofosfato inorgánico el cual es posteriormente hidrolizado a dos fosfatos inorgánicos, lo cual asegura la irreversibilidad de la reacción.

En esta forma, como Acil~CoA, los ácidos grasos pueden pasar a través de la membrana mitocondrial externa, sin embargo no pueden atravesar la membrana mitocondrial externa. Para lograr esto, el grupo Acilo de la Acil~CoA es transferido al grupo hidroxilo de una molécula transportadora, la Carnitina, formando el compuesto Acil-Carnitina para ser transferidos al interior de la matriz mitocondrial mediante el sistema de translocación denominado Acil-Carnitina Transferasa, enzima de la cual existen dos tipos I y II, la primera relacionada con el lado externo de la membrana mitocondrial interna y que se encarga de translocar grupos acilo de cadena larga tal como el Ácido Palmítico. Los grupos acilo de cadena corta son transferidos por el sistema denominado Carnitina-Acetil Transferasa.

El papel esencial de la Carnitina es el transporte de ácidos grasos de cadena larga (12 a 18 carbones de longitud) a través de las membranas mitocondriales. Los ácidos grasos de cadena larga no pueden penetrar la membrana mitocondrial interna por lo que requieren de un acarreador específico. Los ácidos grasos que entran a la célula a través de la membrana plasmática son “activados” mediante la enzima Acil~CoA Sintetasa la cual esterifica al ácido graso con la Coenzima A (CoA-SH) en una reacción que requiere ATP. Acil~CoAS Acido graso + CoA-SH + ATP Acil graso~CoA + AMP + PPi

En la superficie externa de la membrana mitocondrial interna se localiza la enzima Carnitina-Acil Transferasa I (CAT-I), la cual transfiere el grupo Acil graso a la Carnitina, formando el complejo Acil graso-Carnitina el cual puede pasar a través de la membrana mitocondrial interna. CAT-I Acil~CoA + Carnitina Acil-Carnitina + CoA-SH

Una vez dentro de la matriz mitocondrial, la enzima Carnitina-Acil Transferasa II (CAT-II) localizada en la cara interna de la membrana mitocondrial interna, cataliza la reconversión del complejo Acil graso-Carnitina en Acil graso~CoA. CAT-II Acil-Carnitina + CoA-SH Acil graso~CoA + Carnitina

De esta manera el ácido graso unido a la CoA-SH puede iniciar la serie de reacciones que comprenden la β-oxidación y la Carnitina regresa al compartimento intermembranal.

Una falla en este mecanismo de transporte debida a una deficiencia de Carnitina o debido a la disminución en la actividad de las enzimas CAT-I o CAT-II, repercute en la producción de energía a partir de la oxidación de los ácidos grasos.

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Por otra parte, los comúnmente llamados cuerpos cetónicos: ácido acetoacético, ácido β-

hidroxibutírico y la acetona, son sintetizados en el hígado a partir de unidades de Acetil~CoA derivadas de la oxidación de los ácidos grasos. Por lo tanto, cualquier defecto en la oxidación de ácidos grasos necesariamente altera el proceso de cetogénesis. Otra consecuencia es la acumulación de lípidos en tejido muscular y otros tejidos. Características Clínicas

Clínicamente el síndrome miopático por deficiencia de Carnitina se caracteriza por debilidad muscular progresiva, acumulación de lípidos en el músculo y aumento en la concentración plasmática de enzimas de origen muscular (Aldolasa, ALT, CPK). Los síntomas pueden presentarse ya sea a temprana edad o puede retrasarse hasta una edad media. Los niveles de Carnitina en estos pacientes están considerablemente disminuidos, mientras que los niveles hepáticos y plasmáticos son generalmente normales. Muchos de estos pacientes también desarrollan cardiomiopatía. Se cree que una disminución en la producción de ATP resultante de la disminución en la oxidación de ácidos grasos, es un factor contribuyente para la disfunción de los músculos esquelético y cardiaco. Se ha postulado que los pacientes con enfermedad miopática tienen una biosíntesis normal de Carnitina pero su transporte hacia el músculo es defectiva.

Las manifestaciones clínicas de la forma sistémica de deficiencia de Carnitina

generalmente se presentan a temprana edad. La deficiencia sistémica de Carnitina se asocia con disfunción hepática y sintomatología del SNC, incluyendo episodios repetitivos de encefalopatía y vómitos, seguidos de estupor profundo, confusión y coma. Otros signos y síntomas incluyen hipoglicemia, hiperamonemia, y elevación de los niveles plasmáticos de enzimas hepáticas y musculares. Los niveles plasmáticos de ácidos grasos libres generalmente están elevados pero no pueden producir cuerpos cetónicos. Un aumento discreto a pronunciado de los lípidos neutros se observa tanto en el músculo como en el hígado. Los pacientes tienen bajos niveles de Carnitina en el hígado y en el músculo esquelético y niveles variables en el suero.

La cardiomiopatía acompañada de niveles reducidos de Carnitina en el corazón es

igualmente una característica importante en muchos casos de deficiencia sistémica de Carnitina. Las crisis recurrentes en la deficiencia sistémica de Carnitina parecen ser provocadas por

una restricción calórica. En tales condiciones, se requiere un aumento en la utilización de ácidos grasos y un aumento en la neoglucogénesis; sin embargo el uso efectivo de los ácidos grasos está limitado por la deficiencia de Carnitina y la neoglucogénesis que ocurre principalmente en el hígado requiere grandes cantidades de ATP, cuya generación depende en gran parte de la oxidación de los ácidos grasos. Consecuentemente el paciente que no puede oxidar ácidos grasos de cadena larga es igualmente incapaz de formar glucosa a partir de las moléculas glucogénicas, lo cual es causa de hipoglicemia en el paciente. Otra causa de hipoglicemia es que los tejidos periféricos que normalmente utilizan ácidos grasos se vuelven dependientes de glucosa. La falla en la producción hepática de ATP afecta igualmente el ciclo de la urea, produciendo un aumento en los niveles de amoniaco. Se ha postulado que la deficiencia sistémica de Carnitina representa un defecto en la biosíntesis de Carnitina.

Los casos de deficiencia de Carnitina resultantes de un defecto genético se clasifican como

deficiencias primarias de Carnitina. Se han descrito igualmente casos de deficiencia secundaria de Carnitina. Tales casos son debidos a desordenes del metabolismo de los ácidos orgánicos o debidos a la farmacoterapia con ciertas drogas. En tales casos se acumulan en los tejidos intermediarios de Acil~CoA, los cuales al reaccionar con la Carnitina producen complejos Acil-Carnitina los cuales son excretados por la orina, lo cual causa agotamiento de la poza de Carnitina, causando consecuentemente una deficiencia secundaria de Carnitina. La administración de Carnitina es benéfica y recomendable en estos pacientes.

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Oxidación de los Acidos grasos.

El proceso más importante para la oxidación de los ácidos grasos es la denominada β-oxidación el cual es un proceso mitocondrial en espiral. Cada vuelta de la espiral oxidativa genera una molécula de Acetil~CoA, una molécula de FADH2 y una molécula de NADH, de tal manera que al cabo de un cierto número de espirales oxidativas, todos los carbones de un ácido graso con un número par de carbones habrán sido transformados en Acetil~CoA.

El número de moléculas de Acetil~CoA producidas por molécula de ácido graso oxidado siempre es igual al número de carbones en el ácido graso dividido entre dos, cuando se trata de un ácido graso con un número par de carbones ya sea saturado o insaturado. Los ácidos grasos con un número non de carbones también pueden ser degradados por este mecanismo de β-oxidación, aunque los últimos tres carbones del ácido graso en cuestión como Propionil~CoA son transformados en Succinil~CoA luego de una carboxilación enzimática dependiente de Biotina seguida de una reacción de isomerización que requiere vitamina B12. Estas últimas reacciones son compartidas por varias moléculas para su oxidación y consecuente producción de energía tales como ciertos aminoácidos (Valina, Metionina, Isoleucina y Treonina), los carbones 25, 26 y 27 del Colesterol, la Timina, etc. Las reacciones de la β-oxidación de los ácidos grasos.

El ácido graso “activo” en forma de Acil-CoA es deshidrogenado una primera vez por la acción de la enzima Acil-CoA Deshidrogenasa, enzima que requiere FAD como aceptor de hidrógenos y que origina Trans-Enoil~CoA, substrato que es hidratado por la enzima Enoil-CoA Hidratasa formando el compuesto hidroxilado L-β-hidroxiAcil~CoA, el cual es un substrato para una segunda deshidrogenación , reacción que es catalizada por la enzima L-β-Hidroxiacil Deshidrogenasa la cual requiere NAD+ como coenzima la cual es reducida a NADH. El producto de esta reacción denominado β-cetoacil~CoA es finalmente un substrato para la enzima β-Cetoacil Tiolasa, la cual mediante una reacción tipo tiólisis efectuada con el grupo tiol de una molécula de CoA-SH regenera una molécula de Acil~CoA que es dos carbones más corta que el grupo acilo original. El proceso se repite cíclicamente, hasta que todos los carbonos han sido convertidos en Acetil-CoA. Las moléculas de Acetil~CoA así generadas pueden ser oxidadas completamente en las reacciones del ciclo de Krebs. Las coenzimas reducidas FADH2 y NADH son fuentes de electrones para alimentar la cadena respiratoria mitocondrial y así generar energía. Las cuatro reacciones que constituyen la espiral oxidativa se muestran abajo. Acil~CoA + FAD trans-Enoil~CoA + FADH2 (1) trans-Enoil~CoA + H2O L-β-hidroxiAcil~CoA (2) L-β-hidroxiAcil~CoA + NAD+ β-CetoAcil~CoA + NADH (3) β-Cetoacil~CoA + CoA-SH Acil~CoA + Acetil~CoA (4) Oxidación de Aminoácidos

Es recomendable que solamente el 18% del total de las calorías ingeridas diariamente provenga de las proteínas. Podemos deducir por lo tanto que las proteínas no son la primera elección para la producción energética sino más bien que los aminoácidos componentes de las proteínas ingeridas pueden ser utilizados para otros procesos metabólicos tales como la síntesis proteica, síntesis de compuestos nitrogenados no esenciales, etc.

Sin embargo, el esqueleto carbonado de todos los aminoácidos es una fuente potencial de carbonos para ser oxidados en Ciclo de Krebs previa eliminación del grupo α-amino, lo cual puede ser efectuado mediante dos tipos de reacciones: Transaminación y Desaminación oxidativa o no oxidativa

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Transaminación.

12 de los 20 aminoácidos existentes en las proteínas pueden ser transaminados originando así el cetoácido correspondiente, el cual a su vez puede ser transformado en Acetil-CoA o bien en algún otro de los intermediarios del Ciclo de Krebs. De esta manera la Alanina se transforma en Piruvato en una reacción catalizada por la Alanina Aminotransferasa (ALT) y Fosfato de Piridoxal como cofactor, mientras que el Aspartato se transforma en oxaloacetato en una reacción catalizada por la enzima Aspartato Aminotransferasa (AST), etc. ALT Alanina + Ac. α-cetoglutárico Ac. Pirúvico + Ac. Glutámico PP AST Ac. Aspártico + Ac. α-cetoglutárico Ac. Oxaloacético + Ac. Glutámico PP Desaminación Oxidativa y No-Oxidativa.

Algunos aminoácidos pueden ser transformados en cetoácidos mediante una reacción que implica la eliminación del grupo α-amino del aminoácido en forma de amoníaco el cual es una molécula sumamente neurotóxica y por lo tanto debe ser rápidamente transformada en Carbamoil fosfato y posteriormente en Urea mediante las reacciones del Cíclo de la Urea o Ciclo de Krebs-Henseleit. La Urea es un compuesto inocuo que es fácilmente soluble y que puede ser eliminado por vía renal.

El cetoácido formado durante la reacción de desaminación puede ser luego oxidado mediante la vía universal para la oxidación de substratos precursores de energía: el Ciclo de Krebs.

Así tenemos que la degradación de la Cisteína, Alanina, Glicina, Serina y Treonina e Hidroxiprolina produce Piruvato. El Asparatato y la Asparagina, son convertidos a Oxaloacetato.

La Leucina, Lisina, Fenilalanina Tirosina, Triptófano e Isoleucina pueden ser degradados directamente a Acetil~CoA sin formar ácido pirúvico. La Tirosina, la Fenilalanina y el Asparatato, producen Fumarato.

La Succinil~CoA puede provenir del catabolismo de la Isoleucina, la Metionina, la Treonina y la Valina.

Finalmente, el α-cetoglutarato, es un producto de la degradación del Glutamato, Glutamina, Histidina, Prolina y Arginina.

METABOLISMO DE LOS CARBOHIDRATOS

Los carbohidratos son las moléculas más abundantes en la biosfera y constituyen un componente muy importante de la dieta humana contribuyendo con un 60% o más al total de las calorías ingeridas diariamente ya sea en forma de polisacáridos o disacáridos principalmente. Básicamente el carbohidrato considerado metabolicamente ser el más importante, utilizado por la célula en diferentes vías tanto anabólicas como catabólicas, es sin duda alguna la Glucosa, por lo que el metabolismo de los carbohidratos gira en torno del metabolismo de la glucosa. Otros carbohidratos para ser utilizados metabolicamente, deben ser transformados en glucosa o en sus intermediarios metabólicos.

Prácticamente todos los organismos utilizan glucosa para cuatro propósitos metabólicos esenciales:

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1. Producción de energía. 2. Producción de intermediarios metabólicos para la síntesis de moléculas no-carbohidratos. 3. Síntesis de polisacáridos, glicoproteínas, glicolípidos, mucopolisacáridos, y nucleótidos. 4. Producción de coenzimas reducidas (NADPH), esencial para la síntesis de lípidos, esteroides, nucleótidos, etc. Digestión de los Carbohidratos

Los carbohidratos productores de energía más abundantes en la dieta humana son los almidones, y los disacáridos sacarosa y lactosa. Otros carbohidratos igualmente presentes en la dieta, tales como el glucógeno, la maltosa y la fructosa, se encuentran en menores cantidades; finalmente hay carbohidratos en la dieta que no son utilizables metabolicamente debido a la carencia de enzimas necesarias para su digestión; entre estos carbohidratos están la celulosa, los dextranos, levanos y mananos, constituyentes de la fibra presente en los vegetales que el humano ingiere.

Para que los carbohidratos puedan ser absorbidos en el epitelio intestinal, es necesario que tanto los polisacáridos así como los disacáridos sean hidrolizados enzimáticamente completamente hasta sus monosacáridos constituyentes. Este proceso hidrolítico ocurre en diferentes partes del tracto gastrointestinal mediante la acción combinada de diferentes hidrolasas específicas.

La digestión de los almidones se inicia en la boca por efecto de la enzima α-Amilasa

(Ptialina) presente en la saliva. Esta enzima no contribuye significativamente a la digestión de los almidones ya que los alimentos no permanecen durante mucho tiempo en la boca para su masticación. Esta enzima deja de actuar al llegar el bolo alimenticio al estómago donde el pH es muy ácido (pH 2).

La digestión es continuada y completada en el intestino delgado por acción de la α-amilasa pancreática, la cual genera fragmentos de dos y tres glucosas (Maltosa e Isomaltosa), así como algunos oligosacáridos ramificados denominados Dextrinas. Todos estos fragmentos son ahora substratos para otras enzimas propias de la membrana plasmática de las células epiteliales intestinales, principalmente discaridasas, tales como la Lactasa, Sacarasa, Maltasa, y Dextrinasasas. El pH ácido del contenido estomacal es neutralizado por el efecto del Bicarbonato (HCO3

-) secretado en el jugo pancreático. Intolerancia a la Lactosa.

La intolerancia a la lactosa es un problema clínico prevalente. Se ha estimado que en los EEUUA 50 millones de habitantes tienen problemas gastrointestinales luego de consumir alimentos ricos en lactosa. La prevalencia de esta condición varía enormemente entre razas y poblaciones, desde menos del 30 % entre los europeos hasta casi el 100% en algunas poblaciones asiáticas.

La intolerancia a la lactosa es usualmente una enfermedad de adultos y se asocia más comúnmente con una cantidad inadecuada de la enzima Lactasa en el intestino delgado. El termino “intolerancia a la leche” es frecuentemente utilizado como sinónimo de intolerancia a la lactosa, aunque la intolerancia a la leche puede ser causada por otros componentes de la leche además de la lactosa.

Es importante distinguir entre la deficiencia de lactasa o hipolacatasia que es una notable disminución en la enzima lactosa-florizina hidrolasa, y la intolerancia a la lactosa que es un síndrome clínico de intolerancia a la leche. El termino Alactasia se refiere a la falta total de la actividad de lactasa.

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Lactasa

La enzima Lactasa-floricina hidrolasa (LPH) es una enzima del borde del cepillo con dos sitios activos y tres actividades catalíticas. Uno de los sitios activos tiene actividad de lactasa (EC 3.2.1.23) y cataliza la hidrólisis de la lactosa en D-glucosa y D-galactosa; el otro sitio activo es el responsable tanto de la actividad de floricina hidrolasa (arilo glicosidasa), (EC 3.2.1.62) como de la actividad de β-glucosilceramidasa (EC 3.2.1. 45-46). La actividad de lactasa de la LPH es la responsable de la hidrólisis de la lactosa en la dieta.

Durante el desarrollo humano, la actividad de lactasa aparece en el feto al final de la

gestación, continua a un alto nivel durante el destete, y entonces declina a niveles muy bajos en el adulto, alcanzando un mínimo del 10% de la actividad en el infante, hacia los 20 años de edad (hipolactasia). Sin embargo en algunos grupos étnicos, la actividad de la lactasa continua durante toda la vida. Metabolismo de la Lactosa

La lactasa cataliza la hidrólisis de la lactosa en el lumen intestinal produciendo β-D-galactosa y α-D glucosa. Los productos de la reacción son transferidos hacia la circulación porta por las células del epitelio intestinal. En el hígado, la glucosa es fosforilada en el carbono 6' por la glucoquinasa y la hexoquinasa y luego almacenada en forma de glucogeno, o metabolizada por la vía glicolítica u otras vías metabólicas. La galactosa es fosforilada en el carbono 1' por la galactoquinasa. La galactosa puede ser almacenada como glucosa previa transformación en glucosa. Características Clínicas

Cuando la lactosa en la dieta no es hidrolizada completamente, las moléculas de lactosa no hidrolizadas son utilizadas como substrato por la flora bacteriana, produciendo gases como CO2 e hidrógeno, así como metabolitos de dos y tres carbones. Tanto los gases como los metabolitos producidos son los directamente responsables por la sintomatología de esta condición.

Los síntomas de la intolerancia a la lactosa se presentan solamente en algunos pacientes con hipolactasia y los síntomas incluyen: Meteorismo gástrico e intestinal Flatulencia Distensión Dispepsia Sensación de plenitud Cólico doloroso Diarrea

Algunos pacientes son incapaces de hacer la conexión entre el consumo de productos lácteos y sus síntomas debido a que hasta ese momento habían tolerado bien la leche. Los pacientes con vaciado gástrico rápido son más susceptibles a los síntomas de intolerancia a la lactosa debido a que una gran cantidad de lactosa llega más rápidamente al intestino delgado sobrepasando su capacidad para digerir a la lactosa. Los pacientes con síndrome de colon irritable (colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn) son más sensibles a la distensión intestinal y consecuentemente son más sintomáticos si tienen deficiencia de lactasa.

La mayor parte de los pacientes adultos con deficiencia de lactasa pueden tolerar una

ingestión modesta de lactosa, por ejemplo, la contenida en una taza de leche (12 gr.)

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La deficiencia de lactasa se presenta en forma de tres diferentes síndromes:

(1) Congénita: Esta es un muy raro error congénito del metabolismo y es transmitido como un modelo autosómico recesivo (Alactasia).

(2) Primaria, deficiencia de lactasa en el adulto, aislada: Este es el tipo común que será discutido en esta parte.

(3) Secundaria: Este tipo es causado por una disminución en la actividad de la lactasa en el intestino delgado como resultado de una enfermedad o de daño causado a la estructura del intestino delgado o a su función. Absorción de los carbohidratos en las células de la mucosa intestinal.

Tanto el duodeno como el yeyuno superior tienen la mayor capacidad para absorber los monosacáridos, glucosa, fructosa y galactosa, producto de la digestión completa de los polisacáridos y disacáridos presentes en la dieta. El yeyuno inferior y el ileon tienen una capacidad de absorción que disminuye progresivamente. La glucosa, la galactosa y la fructosa, son los únicos monosacáridos que son bien absorbidos en el intestino. Tanto la glucosa como la galactosa son absorbidos por mecanismos de transporte activo secundario que implica primeramente un mecanismo de simporte con Na

+ mediante una proteína transportadora que forma parte de la

estructura de la membrana plasmática de las células epiteliales intestinales denominada GLUT 1. Posteriormente el Na

+ es intercambiado contra K

+ mediante la bomba de sodio y potasio

dependiente de ATP, (Na+,K

+)-ATP denominada también (Na

+,K

+)-ATPasa, la cual utiliza energía

metabólica proveniente del ATP, el cual fosforila un residuo de ácido glutámico en la subunidad alfa de dicha bomba activándola energéticamente. Este mecanismo de transporte activo considerado primario para el Na

+ y secundario para la glucosa, puede ser inhibido por el glucósido

cardiotónico Ouabaina, así como por la fluoricina, en el túbulo renal. Tanto la glucosa como la galactosa abandonan la célula epitelial difundiendo pasivamente a través de una proteína de la membrana plasmática basal y lateral denominada GLUT 2. Metabolismo del Glucógeno

El organismo requiere una fuente metabólica de glucosa constante para mantener las funciones vitales. La glucosa es fuente de energía preferida por muchos órganos como el cerebro, y algunas células que tienen pocas o carecen de mitocondrias, tales como los eritrocitos. La glucosa es también una fuente esencial de energía para el músculo en ejercicio, en el cual la glucosa es un substrato para la glucólisis anaeróbica.

La glucosa puede ser obtenida de cuatro fuentes principales: la dieta, la glucogenólisis, la gluconeogénesis y la interconversión de azúcares. El organismo ha desarrollado mecanismos de almacenamiento de glucosa que puede ser liberada de una forma rápida y eficaz. Esto se logra a través de la síntesis (Glucogénesis) y el desdoblamiento del glucógeno (Glucógenolisis). En ausencia de una fuente dietética de glucosa, esta es rápidamente liberada del glucógeno hepático, de la misma manera que el glucógeno muscular es degradado en el músculo en ejercicio. Cuando los almacenes de glucógeno se agotan, el organismo es capaz de utilizar los aminoácidos de la proteína tisular para generar glucosa de novo mediante la vía denominada Gluconeogénesis Glucogénesis (Síntesis de Glucógeno).

El glucógeno es sintetizado a partir de moléculas de α-D-glucosa precedentes de la ingestión de almidones y disacáridos principalmente. El proceso se inicia en el citoplasma mediante la fosforilación enzimática de la glucosa en el carbono 6’, por efecto de la enzima Hexoquinasa y ATP-Mg++ para generar glucosa-6-fosfato que es el punto de partida para cualquier vía metabólica de la glucosa. HK Glucosa + ATP-Mg++ Glucosa-6-fosfato

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La Glucosa-6-fosfato es isomerizada a Glucosa-1-fosfato por efecto de la enzima

Fosfoglucomutasa (FGM), la cual requiere Glucosa-1,6-bisfosfato como coenzima FGM Glucosa-6-fosfato Glucosa-1-fosfato G-1,6-BP

La Glucosa-1-fosfato es activada al reaccionar con una molécula de UTP para generar UDP-Glucosa que es la forma en que la glucosa es incorporada a la síntesis de glucógeno. Esta reacción es catalizada por la enzima UDP-Glucosa Pirofosforilasa (UDPGPP). UDPGPP Glucosa-1-fosfato + UTP UDP-Glucosa + 2Pi

La enzima Glucógeno sintetasa (GS) es la formación de los enlaces glicosídicos α-1,4 presentes en el glucógeno. Esta enzima no pude unir una glucosa libre a UDP-Glucosa, sino que requiere una fracción de una molécula de glucógeno que no haya sido completamente degradada, o bien una proteína específica llamada Glucogenina la cual juega el papel de aceptor de UDP-Glucosa en el grupo fenólico de un residuo de Tirosina. Esta reacción es catalizada por la enzima Sintetasa Iniciadora de Glucógeno (SIG). SIG Glucogenina-OH + (UDP-Glucosa)n Glucogenina-o-(G)n + nUDP

La adición de nuevas unidades de UDP-glucosa al c4’ de la cadena naciente es función de la enzima Glucógeno Sintetasa (GS), la cual genera una cadena de residuos de glucosa de aproximadamente 14 unidades GS Glucogenina-o-(G)n + (UDP-Glucosa)n Glucogenina-o-(G)14 + nUDP

La formación de ramificaciones en la cadena de glucógeno naciente se lleva a cabo por efecto de la “enzima ramificante” Amilo-(α-1,4 α-1,6)-Transglucosilasa, la cual transfiere una cadena de cinco a ocho residuos de glucosa del extremo no reductor (C4’) de la cadena de glucógeno naciente a otro residuo de glucosa en la ahora más corta cadena de glucógeno naciente, creando así un enlace O-glicosídico α-1,6 en el punto de ramificación.

El alargamiento de los extremos no reductores y la formación de nuevas ramificaciones es función repetitiva y alterna de las enzimas Glucógeno Sintetasa (GS) y Amilo-(α-1,4 α-1,6)-Transglucosilasa respectivamente, utilizando UDP-Glucosa como única fuente de unidades de glucosa, hasta generar el total de la molécula de glucógeno formada por varios miles de residuos de glucosa solamente. Glucógenolisis (Degradación del Glucógeno).

Cuando la ingesta de carbohidratos no es suficiente para satisfacer los requerimientos celulares, el glucógeno almacenado tanto en el hígado como en el músculo es degradado para proveer la glucosa necesaria para las diferentes vías metabólicas. El glucogeno se almacena tanto en el hepatocito como en las células musculares en forma de gránulos, los cuales forman complejos con las enzimas requeridas para la degradación y la síntesis del glucógeno (Glucógenolisis y Glucogénesis respectivamente).

La glucógenolisis se inicia mediante la acción de la enzima Glucogeno fosforilasa, la cual rompe mediante fosforólisis los enlaces glucosídicos α-1,4 de los residuos de glucosa en cada uno de las terminales C4' de las múltiples ramificaciones de la molécula de glucogeno. El producto de esta reacción es la glucosa-1-fosfato (G-1-P) y el consecuente acortamiento de las ramificaciones de la molécula de glucógeno.

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Este proceso enzimático requiere fosfato inorgánico, por lo que no hay consumo de ATP.

La actividad enzimática de la enzima Glucogeno fosforilasa se detiene al llegar a cuatro residuos de glucosa previos al próximo punto de ramificación. La enzima desramificante α-(1-4) α-(1-4) Glucan-Transferasa en seguida transfiere tres residuos de glucosa (maltotriosa) de una ramificación al extremo 4' de otra ramificación, dejando así un solo residuo de glucosa en el sitio de ramificación. En seguida la enzima Amilo-alfa(1-6)-glucosidasa (Enzima desramificadora) hidroliza este solitario residuo, en forma de glucosa libre no fosforilada. En este punto la enzima Glucogeno fosforilasa puede reanudar su actividad. Eventualmente, toda la molécula de glucógeno es degradada completamente a Glucosa-1-P y Glucosa libre.

Posteriormente la glucosa-1-P es isomerizada por efecto de la enzima Fosfoglucomutasa para formar Glucosa-6-P, la cual en el músculo pude seguir la vía de la glucólisis, mientras que en el hígado y en el riñón la glucosa-6-P es hidrolizada en el enlace 6'-fosfoester para formar glucosa libre y Pi. De esta manera la glucosa libre puede ser vertida al torrente circulatorio.

Regulación hormonal del metabolismo del Glucógeno.

Tanto la glucogénesis como la glucógenolisis están sujetas a control hormonal. El control implica a las enzimas Glucogeno Sintetasa y Glucogeno Fosforilasa respectivamente, mediante un sistema de transducción de señales que implica la formación de segundos mensajeros químicos. Por otra parte varios efectores alostéricos igualmente participan en el mecanismo de regulación.

La hormona pancreática Insulina estimula la glucogénesis e inhibe la glucógenolisis, mientras que por el contrario, la hormona de las glándulas suprarrenales Epinefrina (Adrenalina) y la hormona pancreática Glucagon estimulan la glucógenolisis e inhiben la glucogénesis. Esto se logra mediante el control de la fosforilación ATP-dependiente de las enzimas Glucogeno Fosforilasa y Glucogeno Sintetasa. La Epinefrina ejerce su acción glucogenolítica principalmente en el músculo mientras que el glucagon lo hace principalmente el hígado. Ambas hormonas actúan a través de receptores específicos localizados en la membrana plasmática celular de los tejidos en cuestión. Dichos receptores forman parte un sistema transductor de señales en el que además están implicadas dos proteínas más: una proteína trimérica transductora denominada Proteína Gs y una enzima efectora denominada Adenilciclasa. Esta última genera un segundo mensajero químico mediante la transformación del ATP en 3',5'-AMP cíclico (cAMP). Este segundo mensajero químico inicia una serie de acciones intracelulares que conducen a la activación de la enzima Glucógeno Fosforilasa, la cual en última instancia libera G-1-Fosfato de los extremos no reductores del Glucógeno.

La insulina estimula el transporte de glucosa a través de la membrana celular, especialmente en músculo y en el tejido adiposo, pero no influye en el transporte intestinal de glucosa. Aparentemente la fructosa y la manosa son absorbidas por un proceso de difusión facilitada mediante la misma proteína transportadora. De la circulación porta, la glucosa es transferida a diferentes tejidos en los cuales la glucosa es utilizada como substrato para diferentes vías metabólicas.

Los niveles de glucosa sanguínea son mantenidos dentro de ciertos limites normales (70-110 mg/dl) mediante diferentes mecanismos reguladores, principalmente mediante hormonas reguladoras tales como la insulina, glucagon, epinefrina, etc.

La acción de la insulina se inicia cuando la hormona se une a su receptor en la membrana plasmática de la célula blanco. El receptor de insulina es una estructura tetramérica constituido por dos cadena alfa y dos cadenas beta unidas unas a otras mediante puentes disulfuro. La parte extracelular del receptor lo constituyen las dos cadenas alfa, glicoproteínas a las cuales se une la Insulina. Las subunidades beta son proteínas integrales de la membrana plasmática con un dominio extracelular, otro transmembranal y otro citoplasmático. El dominio citoplasmático tiene actividad de Tirosina Cinasa caracterizada por autofosforilación de residuos de Tirosina dependientes de ATP, así como fosforilación de residuos de Tirosina en proteínas del citoplasma, igualmente dependientes de ATP. Esta actividad de Tirosina Cinasa se activa al unirse la Insulina al receptor. Como consecuencia de esta activación se inician una serie de respuestas celulares.

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Entre las acciones de esta hormona, ya sea inmediatas o a largo plazo están el transporte

de glucosa, fosforilación de proteínas citoplasmáticas, regulación enzimática, síntesis proteica, duplicación del ADN y crecimiento celular.

Ha sido postulado que las proteínas fosforiladas estimulan la fusión de vesículas citoplasmáticas que contienen en su membrana los transportadores de glucosa, logrando así la presencia de transportadores de glucosa en la membrana plasmática celular.

Cuando la concentración de insulina disminuye, los transportadores de glucosa forman parte de nuevas vesículas por un mecanismo similar a la endocitosis. Diabetes Mellitus

Las consecuencias de la deficiencia de insulina en el humano es la enfermedad conocida como Diabetes Mellitus (D.M.), caracterizada por una elevación de los niveles plasmáticos de glucosa (hiperglicemia) debida a: A. Reducción de la entrada de glucosa a las células B. Reducción en la utilización de glucosa por los tejidos periféricos C. Aumento en la gluconeogénesis hepática

La D.M. constituye un serio problema de salud que afecta a millones de personas en todo el mundo. Aunque la D.M. normalmente se asocia con alteraciones del metabolismo de los carbohidratos, en realidad esta enfermedad afecta igualmente al metabolismo de los lípidos y las proteínas. Existen dos grandes tipos de diabetes denominados: 1. Diabetes Mellitus Insulinodependiente (DMID), también conocida como Diabetes tipo I 2. Diabetes Mellitus No Insulinodependiente (DMNID), también conocida como Diabetes tipo II

Una producción inadecuada de insulina debida a la destrucción de las células beta del páncreas conduce al desarrollo de DMID. La insulina es sintetizada en el páncreas en forma de una proteína precursora llamada Preproinsulina, la cual es transformada en Insulina luego de un proceso de proteolisis enzimática controlada. Una mutaciones del gene que codifica para la Preproinsulina puede causar alteraciones en la estructura primaria del producto génico de tal manera que no es reconocido y procesado por las enzimas proteolíticas requeridas para su transformación en Insulina activa. Una producción inadecuada de insulina también puede suceder en personas con predisposición genética a una respuesta autoinmune que cause la destrucción de las células beta de los islotes de Langerhans, sitio donde es sintetizada la Insulina.

La DMID generalmente se manifiesta durante la infancia o antes de los 20 años de edad y se caracteriza por hiperglicemia y cetoacidosis. La cetoacidosis es debida a un aumento en la movilización de ácidos grasos del tejido adiposo (Lipólisis) y una oxidación acelerada de ácidos grasos en el hepatocito, lo cual genera grandes cantidades de Acetil~CoA, la cual sobrepasa la capacidad oxidativa del Ciclo de Krebs, generando un exceso de los tres comúnmente denominados Cuerpos Cetónicos, Acido Acetoacético, Acido β-hidroxibutírico y Acetona. La acetona difunde fácilmente a todos los tejidos y es fácilmente eliminada por la orina, las vías respiratorias y por la transpiración, dando el aliento cetósico característico de los pacientes diabéticos no tratados. Sin embargo el principal problema lo constituyen los Acidos Acetoacético y β-Hidroxibutírico, los cuales al ionizarse liberan protones que causan acidificación de la sangre con la consecuente disminución del pH una vez que los sistemas tampón han sido agotados. Como consecuencia de esta Cetonemia se produce Cetonuria y finalmente Cetoacidosis, la cual puede conducir al Coma Cetoacidótico, el que al no ser controlado puede causar la muerte del paciente diabético.

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La DMNID generalmente afecta a los adultos de 40 años o más, y parece ser determinada

por factores genéticos que afectan tanto la producción de Insulina como la de los receptores para Insulina. En la DMNID se observa una disminución en la secreción de Insulina de las células pancreáticas, así como una resistencia a la Insulina por varios tejidos, especialmente el músculo esquelético. Los pacientes con DMNID desarrollan hiperglicemia pero no cetoacidosis. La obesidad es una de las causas más comunes de desarrollo de DMNID, aunque también pude ocurrir en personas con peso normal. Los pacientes obesos con DMNID pueden reducir los requerimientos de Insulina y estimular así la sensibilidad de los tejidos a la Insulina mediante una pérdida notable de peso corporal. La DMNID generalmente es controlada solamente mediante dieta y ejercicio.

Además de los efectos discutidos, la Diabetes Mellitus puede causar falla renal. Esta enfermedad es la causa de un gran número de amputaciones quirúrgicas de extremidades inferiores y de ceguera. Los pacientes diabéticos con altos niveles de colesterol tienen una gran predisposición a desarrollar ateroesclerosis.

La glucosa es necesaria como nutrimento principal para la mayor parte de los tejidos especialmente para el sistema nervioso central, el sistema músculo esquelético y los eritrocito y por lo tanto un aporte constante de glucosa es necesario. Cuando no existe un aporte de glucosa en los alimentos, esta puede ser obtenida mediante otros procesos metabólicos como son la Gluconeogénesis y la Interconversión de azúcares. Además de ser una importante fuente de energía metabólica, la glucosa es utilizada como materia prima para la síntesis de otros compuestos tales como la lactosa, ribosa, glicerol, N-Acetilglucosamina, N-Acetilgalactosamina, Acido N-Acetilneuramínico (NANA), glicoproteínas, glicosaminoglicanos (GAGs), etc. Gluconeogénesis

Algunos tejidos, tales como el cerebro y los eritrocitos requieren un aporte constante de glucosa. La gluconeogénesis es el proceso metabólico mediante el cual se satisfacen las necesidades de glucosa del organismo cuando esta no es aportada en cantidades suficientes en la dieta. La glucosa puede ser sintetizada predominantemente en el hígado y en menor escala en las células tubulares del riñón a partir de moléculas que no son carbohidratos conocidas genéricamente como moléculas glucogénicas entre las que se cuentan la mayor parte de los aminoácidos procedentes del músculo, el glicerol producido por la degradación de triglicéridos, el ácido láctico producido anaerobicamente en el eritrocito y el músculo, y los últimos tres carbones de los ácidos grasos con un número non de carbones producidos al ser oxidados. El organismo es capaz de sintetizar glucosa de esta manera en una cantidad importante que puede ser de algunos cientos de gramos por día.

Todas aquellas moléculas glucogénicas que generan ácido pirúvico pueden ser transformadas en glucosa utilizando aquellas reacciones de la glucólisis que son reversibles, sin embargo es necesario utilizar enzimas específicas para efectuar aquellas reacciones que no son reversibles, ya que la gluconeogénesis no es la vía metabólica reversa de la glucólisis. Cuatro enzimas son exclusivas de la gluconeogénesis 1. Piruvato Carboxilasa, la cual carboxila al ácido pirúvico en una reacción dependiente de Biotina CO2 transformándolo en ácido Oxaloacético y que se lleva a cabo en la matriz mitocondrial. El ácido Oxaloacético es impermeable a la membrana mitocondrial interna por lo que tiene que ser oxidado por la enzima Deshidrogenasa Málica, la cual genera Acido Málico el que es transportado a través de las membranas mitocondriales para ser luego transformado de nuevo en Ácido Oxaloacético en el citoplasma mediante la enzima Deshidrogenasa Málica citoplasmática.

PC Ac. Pirúvico + Biotina-CO2 Ac. Oxaloacético + Biotina

2. Fosfoenolpiruvato carboxicinasa, la cual descarboxila y fosforila al ácido Oxaloacético para transformarlo en ácido fosfoenolpirúvico (PEP), reacción que requiere GTP como donador de fosfato. PEPCC Ac. Oxaloacético + GTP Ac. Fosfoenolpirúvico + GDP

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3. Fructosa-1,6-bisfosfatasa, la cual remueve hidrolíticamente un fosfato de la fructosa-1,6-bisfosfato transformándola en fructosa-6-fosfato F1,6-BPasa Fructosa-1,6-bisfosfato + H2O Fructosa-6-fosfato + Pi 4. Glucosa-6-fosfatasa, la cual existe en el hígado y remueve hidrolíticamente un fosfato de la glucosa-6-fosfato para transformarla en glucosa libre la cual pasa a la circulación general. G6Pasa Glucosa-6-fosfato + H2O Glucosa + Pi

Por otra parte, todas las moléculas glucogénicas que forman metabolitos intermediarios del Ciclo de Krebs, principalmente ácido α-cetoglutárico, Succinil~CoA, ácido fumárico y ácido Oxaloacético, pueden ser convertidas a glucosa utilizando las enzimas 2, 3, y 4, además de las enzimas glucolíticas que catalizan las reacciones reversibles.

La gluconeogénesis se lleva a cabo parcialmente en la matriz mitocondrial y parcialmente en el citoplasma en cuyos organelos se encuentran respectivamente las enzimas requeridas, por lo tanto esta es una vía bilocular. Bibliografía Coffee, C.F. Metabolism, First Edition Fence Creek Publishing, Madisson, Conn. 1998 Benyon, S Metabolism and Nutrition Mosby International Ltd, 1998 Cohn, R.M. and Roth, K.S. Biochemistry and Disease William and Wilkins, Baltimore,1996 Devlin, T.M. Textbook of Biochemsitru with Clinical Correlations, 4th Edition Wiley-Liss, New York, 1997 Marks D.B., Marks, A.D. and Smith C.M. Basic Medical Biochemistry Williams and Wilkins, Baltimore, 1996 Glew, R.H. and Ninomiya, Y. Clinical Studies in Medical Biochemistry, Second Edition Oxford University Press, New York 1997 Smith, A.H., Beckett, G.J., Walker, S.W., Rae, P.W.H. Lecture Notes on Clinical Biochemistry, 6th. Edition Blackwell Science, Oxford, 1998 Stryer, L. Biochemistry, 4th Edition W.H. Freeman and Company, New York, 1995