Post on 02-Sep-2018
Título de la presentación en un máximo de dos líneas Título de la presentación en un máximo de dos líneas
Diagnóstico de Laboratorio de la
Enfermedad de Chagas
Diferentes Escenarios
María Isabel Jercic Lara majercic@ispch.cl Sección Parasitología
2011
• Se registran casos en todo el territorio
nacional.
• No se tiene registros de casos por
transmisión vectorial en los últimos años. – Certificado de Interrupción 1999
• Encuesta calidad de vida 2010
–Encuesta Prevalencia para la
población general es de 0.7 %
• 119.000 personas aproximadamente
• 0,33 % en Donantes de Sangre.
Antecedentes
Puertas de entrada para la pesquisa de
pacientes infectados con Trypanosoma cruzi
Donantes de
Sangre
1
Tamizaje
Embarazadas
2
- Principal fuente de pesquisa de nuevos
casos.
- Tamizaje en todo el territorio nacional
(2008).
- Se pretende conseguir Certificación de
la interrupción Transfusional de la
infección.
- Principal mecanismo activo de
transmisión de la infección en nuestro
país.
- Iniciativa de algunos SS de incorporar el
tamizaje a embarazadas.
Puertas de entrada para la pesquisa de
pacientes infectados con Trypanosoma cruzi
-Pacientes provenientes de áreas
tradicionalmente endémicas.
-Viajes
-Transmisión oral
- Síndrome de TORCH
- Pacientes inmunocomprometidos
- Estudios pre y post-transplante.
- Apoyar a la evaluación de la situación
de interrupción de la transmisión
vectorial.
- Búsqueda de nuevos casos de
infección por la vía vectorial.
Sospecha
clínica o
descarte de
infección
3
Estudios
Serológicos
4
Diagnóstico de
Laboratorio
Diagnóstico Directo
Buscar el parásito
Diagnóstico Indirecto
Buscar Anticuerpos específicos
Diagnóstico Molecular
Buscar material genético
Perfil de marcadores
ETAPA AGUDA ETAPA CRÓNICA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 24 36 48
Aproximación en Semanas
IgM
IgG
Directo
DNA
Infección
Diagnóstico Directo
Observación del parásito
Observación Microscópica
Gota Gruesa
Frotis
MicroStrout
Biopsia
Técnicas
más
empleadas
Búsqueda de Anticuerpos
Diagnóstico Indirecto
Tamizaje
ELISA
Aglutinación de Partículas (HAI)
Inmunocromatografía
Confirmación
IFI
Western Blot
Técnicas
más
empleadas
Diagnóstico Molecular
PCR convencional
PCR
Tiempo real
Cuantifica el número de copias
Técnicas
más
empleadas
Selección de los métodos
• Dependerá del tipo de paciente y la etapa
de la enfermedad
–Directos y Moleculares
• Etapa Aguda
–Infección reciente
–Recién Nacidos
–Inmunocomprometidos
– Indirectos
• Etapa crónica
Métodos Indirectos Diagnóstico Indirecto
TAMIZAJE
REACTIVO
Repetir en Duplicado
REACTIVO
REACTIVO
ENVIAR A
CONFIRMACIÓN
REACTIVO
NO REACTIVO
NO CONCLUYENTE
NO REACTIVO
NO REACTIVO
INFORMAR
INDETERMINADO NO REACTIVO
INFORMAR
Sensibilidad
•<Etapa aguda
•>Etapa crónica
ELISA para la detección de Anticuerpos IgG contra T.cruzi
C
E E
E
E E
E S
S
S
S S S
S
S
S
Técnica de tamizaje, sencilla, rápida y aplicable a un gran número de
personas simultáneamente. No hace diagnóstico de la enfermedad por si
sola, y un resultado positivo no puede ser informado directamente al
paciente o donante.
Requisitos de calidad:
100% Sensibilidad
> 90% Especificidad
Nombre del
Reactivo Fabricante Nº Lote Sensibilidad % Especificidad % Concordancia % Año
CHAGATEST ELISA
recombinante v3 WIENER LAB., ARGENTINA 906536 100 98,8 99,2 2000
TEST ELISA PARA
CHAGAS II
BIOS CHILE, INGENIERIA
GENETICA S.A 800602 100 98,8 99,3 2002
INMULITE CHAGAS
IgG
DIAGNOSTIC PRODUCTS
CORPORATION LKCS 10105 96,9 76,4 85,3 2003
TEST ELISA PARA
CHAGAS III
BIOS CHILE, INGENIERIA
GENETICA S.A 1140703 100 100 100 2003
BIOELISA CHAGAS BIOKIT S.A C 1403 100 100 100 2003
ELISA Chagatek BIOMERIEUX BRASIL S.A 50201 100 97,3 98,6 2006
*SMART COMB
CHAGAS Ab
SMARTEST
DIAGNOSTICS, ISRAEL 708282 98,9 70,7 84,7 2007
TEST ELISA PARA
CHAGAS III
BIOS CHILE, INGENIERIA
GENETICA S.A 231007 100 100 100 2008
ARCHITECT CHAGAS Abott Diagnóstics 94154HN00 100 100 70 2011
CHAGASTEST ELISA
recombinante v
4.0
WINER LAB
ARGENTINA 1008049150 100 90 84 2011
Reactivos Evaluados 2000 – 2011
Confirmación
Laboratorios reconocidos
IFI
Laboratorio de Referencia
IFI
WB
En Chile no se realiza en los Servicios
de Sangre
Hospital de Iquique
Hospital de La
Serena
Hospital Van
Buren Hospital
Universidad
Católica
Hospital San Borja
Arriarán
Hospital Gustavo
Fricke
Técnicas realizadas por Centros
Reconocidos por el Laboratorio de
Referencia de Parasitología del
Instituto de Salud Pública (ISP)
Su resultado positivo valida el
resultado de la prueba de tamizaje y
puede ser informado al paciente
Examen de Confirmación
Laboratorios Reconocidos
Requisitos de calidad
100% Sensibilidad
> 95% Especificidad
Se pueden emplear Se emplean hoy
Inmunofluorescencia Indirecta
F
Confirmación
Laboratorios reconocidos
IFI
Laboratorio de Referencia
IFI
WB
En Chile Instituto de Salud Pública
Técnicas realizadas por el
Laboratorio de Referencia de
Parasitología del Instituto de Salud
Pública (ISP).
Su resultado positivo valida el
resultado de la prueba de tamizaje y
puede ser informado al paciente
Examen de Confirmación
Requisitos de calidad
100% Sensibilidad
98% Especificidad
Se acepta 2 % No concluyentes
Se pueden emplear Se emplean hoy
Inmunofluorescencia Indirecta
Western blot
Enzimoinmuno ensayo IgG
Embarazada
en 2º trimestre
Tamizaje
Laboratorio
Embarazada
Infectada
confirmada
Confirmar
Resultado
Positivo
Estudio
Infección
transplacentaria
Tamizaje mujeres embarazadas
Laboratorio
reconocido
Recién Nacido o Lactante Hijo de madre con Enfermedad de Chagas
2 ml de sangre con anticoagulante o Guanidina
PARA PCR (K-N)
Positivo en 2 ocasiones
No Detectable
2ª muestra segundo mes de
vida
Positivo en 2 ocasiones
CONFIRMADO
No Detectable
3ª muestra 9°
mes de vida
Positivo
CONFIRMADO
No Detectable
DESCARTADO
1 ml de sangre PARA EXAMENES DIRECTOS
NEGATIVO
ESPERAR RESULTADO PCR O SEGUMIENTOM
CON EXAMENES INDIRECTOS
POSITIVO CONFIRMADO
TRATAMIENTO Y SEGUIMIENTO
Reacción en cadena de la polimerasa para T. cruzi
(PCR)
Técnica que detecta y amplifica secuencias de DNA específicas para
Trypanosoma cruzi
Estudio Serológico
Niños Menores de 5 años
Estudio
familiar y de
caso índice
Muestra de
Sangre en
papel filtro
Diagnóstico Directo
POSITIVO
INFORMAR
NEGATIVO
Si sigue la sospecha
REPETIR o enviar al ISP
Sensibilidad
•>Etapa aguda
•<Etapa crónica
Métodos Moleculares
> de 9 meses < de 9 meses
inmunocomprometidos
Sensibilidad
•>Etapa aguda
•<Etapa crónica
Menores de 9 meses e
inmunocomprometidos
Muestra con DNA detectable
Positivo Se requieren una 2ª para confirmar
resultado
No detectable Seguimiento
Límite de
detección
Partidores
empleados
K-N
Mayores de 9 meses
Paciente con serología Positiva
confirmada
Positivo
No detectable
Límite de
detección
Partidores
empleados
Mayores de 9 meses
Paciente con serología Negativa
Positivo Se requieren una 2ª para confirmar
resultado
No detectable Límite de
detección
Partidores
empleados
Inmunocomprometidos
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011
Diagnósticos Confirmaciones
Total de Muestras analizadas para búsqueda de Anticuerpos
contra Trypanosoma cruzi por el ISP.
2000 – 2011 (Octubre)
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010
Confirmadas Positivas Negativas
Porcentaje de confirmación de muestras con tamizaje positivo
para Trypanosoma cruzi
75%
80%
79%
92% 94% 91% 86%
91%
87%
85%
90%
De 100 muestras con tamizaje positivo, en promedio se confirman solo 86 de ellas.
Porcentaje de Muestras no concluyentes ISP 1,9 %
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010
Nuevas muestras Muestras concluidas
2,4 %
2,5 %
2,1 %
1,6% 2% 3,1% 2,8%
1,2%
1%
1,1%
0,7%
Western blot
Porcentaje de muestras no concluyentes de las
Confirmaciones serológicas ISP para Trypanosoma cruzi
2000 – 2010 (Mayo)
Evaluación de la carga parasitaria mediante
una reacción en cadena de polimerasa en
tiempo real en pacientes infectados con
Trypanosoma cruzi posterior al tratamiento
con Nifurtimox
Profesor guía:
• Beatriz Cancino F.
• Rodrigo Villarroel V.
Facultad de Ciencias de la Salud
Escuela de Tecnología Medica
Área de Parasitología
Tesista: Carolina Oyarzun A.
43%
27%
7%
5%
5%
3%
2%
2% 2% 2% 2%
Hosp. Dr. Juan Noe Crevanni
Hosp. Regional Dr. Ernesto Torres Galdames
Hosp. Regional San Jose del Carmen de Copiapo
Hosp. de Enfermedades Infecciosas Dr. Lucio Cordoba L.
Hosp. Dr. Antonio Tirado Lanas de Ovalle
Hosp. Regional de Rancagua
Hosp. de Litueche
Hosp. Militar
Hosp. Ricardo Valenzuela Saez de Rengo
Hosp. San Camilo
Hosp. San Juan de Dios de Santiago
Resultados
54 pacientes 157 muestras
11 centros hospitalarios
Conclusión
La detección a través de la técnica qPCR es un
método más sensible en comparación a la
técnica PCR convencional.
La qPCR es una técnica útil para el seguimiento
de la carga parasitaria en aquellos pacientes
tratados con Nifurtimox.
Alumno: Esteban Rodríguez Profesor guía: Beatriz Cancino
Estandarización e implementación de una
PCR múltiplex para la determinación de
Trypanosoma cruzi I y II,
en Muestras clínicas y Triatominos
Facultad de ciencias de la salud
Escuela de Tecnología Médica
Área de Parasitología
Materiales y Métodos
• Para realizar este trabajo se utilizó de base el realizado por Liarte
et.al.(2009), que permitió diferenciar, en una misma PCR, el grupo
de parásito presente en muestras clínicas y triatominos.
• Primers Díaz 7, Díaz 8 y TcSat 4, dirigidos contra el DNA satélite
del genoma del parásito.
• Si bien esta clasificación no es la vigente, se empleó porque
– Permite en un solo paso, en poco tiempo obtener resultado
– El Grupo I identificado es el mismo de la nueva clasificación
– El Grupo II identificado corresponde a:
• Grupo II actual más los Grupos III, IV, V y VI
• El Grupo de muestras caracterizado como II será posteriormente
estudiado por Hibridación por Southern blot
Analizado por el método estadístico X2, que demostró que los resultados
no son estadísticamente significativos (p=0,52015)
Pacientes agudos
58%
42%grupo I %
grupo II %
Distribución de los grupos por tipo de paciente
Resultados
Resultados analizado por el método X2, que demostró que los resultados
son estadísticamente significativos (p=0,024136)
Mepraia spinolai
77%
23%
grupo I
grupo II
Triatoma infestans
96%
4%
grupo I
grupo II
Distribución de grupos I y II en los Triatominos
Conclusiones • Se demostró que la PCR múltiplex es una buena
herramienta epidemiológica para determinar el grupo I y II de Trypanosoma cruzi, usando los primers Díaz 7, Díaz 8 y TcSat 4.
• Su especificidad diagnóstica es de un 100%
• Se demostró también que existe una mayor frecuencia del grupo I del parásito en muestras clínicas y triatominos.