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Soluciones Agilent para
aplicaciones
alimentarias: de la
preparación de muestra
a la separación
Tecnologías que mejoran el
rendimiento y la productividad
Julián de la Mata
14 de Febrero de 2013
1
Agenda
• Necesidades actuales de los análisis alimentarios
• Consideraciones y consejos en los análisis por LC y LCMS.
• Revisión de las distintas opciones de preparación de muestras.
• Fundamentos importantes en el desarrollo de métodos
• Flujo de trabajo en análisis alimentario usando LC/MS
• Insecticidas botánicos en pescado
• Fármacos veterinarios en matrices de origen animal.
• Herramientas para mejorar sus análisis alimentaríos.
2
¿Cómo es hoy el Analisis Alimentario?
• Aumento en la complejidad en el suministro y origen de los alimentos
• La globalización en el suministro de alimentos ha hecho necesario un análisis detallado del valor nutricional, la composición y los contaminantes de los alimentos.
• La preocupación por la Seguridad Alimentaria y sus efectos en la salud humana han incrementado la regulación y las exigencias relacionadas con el análisis de alimentos.
• Los viejos métodos para el análisis de alimentos eran muy tediosos y no adecuados a las necesidades modernas para obtener un mayor rendimiento en los análisis de alimentos.
• Las muestras son de todos los tipos!
• Un apropiado analisis de alimentos no se pueden lograr sin la adecuada metodología de LC y preparación de muestra.
3
Técnicas cromatográficas en el análisis
alimentario
4
• Cromatografía de Gases • Usada tipicamente para:
• No-polares volátiles, aceites,
etc
• Puede requerir derivatización
de los compuestos
• Cromatografía Líquida
• Usada tipicamente para:
• Polares, termo lábiles
• Sin necesidad de
derivatización de muchos de
los compuestos.
• Requiere preparación de
muestra más sencilla.
Retos en análisis alimentario
• Desarrollo de nuevos métodos
• Encontrar maneras de reducir costes
• Hacer más con menos– incrementar la productividad del
laboratorio
• Mantenerse al día en los últimos cambios en Seguridad
Alimentaria
5
Desarrollo de Métodos LC en análisis alimentario
¿Que es diferente en el análisis LC para el análisis de
alimentos?
• Complejidad de la matriz de la muestra
• Múltiples residuos de interés
• A menudo, las muestras tienen analitos muy polares de
interés.
Las modernas tecnologías de columnas hacen el análisis
alimentarío más rápido y más fácil.
6
Nuevas tecnologías de columnas para el desarrollo
de métodos.
Columnas para análisis de alta resolución y alta velocidad
• Columnas Sub-2 µm para operación a ultra-altas presiones
• Columnas Superficialmente porosas Sub-3 µm
Considerationes cuando se desarrollan métodos en columnas con nuevas tecnologías
• Tamaño de partícula < 3 μm
• Límites de presión de las columnas >400 bar (típicamente 600-1200 bar)
• Operan con los mismos principios cromatográficos que las columnas de 5 μm, pero con resultados superiores.
Nuevas tecnologías de Columnas Superficialmente
porosas
• Eficiencia ≈ 90% de sub-2 µm
• Presión ≈ 40-50% de sub-2 µm
• N ≈ 2X 3.5 µm (totalmente porosas)
• dp = 2.7µm
• Frita con porosidad 2 µm frit para
reducir los atascos
• Plimite = 600 bar para HPLC o UHPLC
• Particulas
• Núcleo sólido de 1.7 μm
• Ruta de difusión de 0.5 μm
• Diametro total de 2.7 μm
Poroshell 120 columns:
1.7um
0.5um
0.5um
Beneficios de la tecnología de las columnas
Poroshell 120
• Permite aumentar la velocidad de separación (reducción del tiempo de análisis)
• Uso con cualquier instrumento (HPLC o UHPLC)
• Reducción de los costos de solventes y de desecho
• Poroshell 120
• Escalabilidad
• Facilidad de transferencia dé métodos
• Mayor transferencia de masa debido a la menor difusión.
• Fases similares a las columnas ZORBAX totalmente porosas.
Comparando Eficiencia y Presión con Diferentes
Tipos de Columnas
Tamaño de partícula/Tipo
Presión Eficiencia LC Compatibilidad
5µm Totalmente Porosa
40 bar 5,000 Todos los
instrumentos hasta 400 bar
3.5µm Totalmente Porosa
80 bar 7,800 Todos los
instrumentos hasta 400 bar
2.7µm
Poroshell 120 100 bar 12,000
Todos LCs/UHPLCs (hasta 600 bar)
1.8µm Totalmente Porosa
250 bar 12,500 Todos
LCs/UHPLCs (hasta to 1200 bar)
Columnas: 4.6 x 50mm, Fase Movil: 60% ACN:40% Agua Flujo: 2 mL/min
Mejoras en la transferencia de masas del analíto
gracias a una menor Difusión
Totalmente Porosa
Superficialmente Porosa
• Particulas totalmente porosas • Difusión a través de toda la partícula
• Poroshell 120
• Difusión solo en la capa porosa
• Resultados:
• Menor término C
• Mayor eficiencia
• Y
• Mayores flujos con
• Mínimo impacto en la eficiencia
CBAh /Ecuación van Deemter
Otras consideraciones al seleccionar una columna
• Robusted y reproducibilidad lote-a-lote de las columnas
Poroshell 120
min 1 2 3 4
mAU
0
50
100
min 1 2 3 4
mAU
0 50
100
min 1 2 3 4
mAU
0 50
100 150
min 1 2 3 4
mAU
0 50
100 150
min 1 2 3 4
mAU
0 50
100 150
B10015
B11041
B11256
B12041
B10018
2012
2010
Aditivos en Bebidas
Pasos generales en un método LC robusto para
Análisis de Alimentos
• Elija el tipo de cromatografía– a menudo fase reversa (C18,
polar embebida, etc…) o fases HILIC.
• Elija las condiciones apropiadas de inicio y fin de gradiente.
• Ajuste el pH para obtener la mejor retención del analito.
• Cambie de fase ligada para obtener la separación de picos
más adecuada y la mejor resolución.
13
El cambio en la retención con el pH para los
compuestos ionizables es clave en el desarrollo de
métodos.
• En fase reversa, los analitos no cargados tienen mejor
retención (i.e. los ácidos a bajo pH y las bases a alto pH)
• Los Silanoles de la sílica ionizan a pH medio,
incrementando la retención de los analitos básicos (i.e
posibles interacciones de intercambio iónico)
• Elija un pH de la fase móvil para optimizar la retención y la
selectividad durante el desarrollo de métodos
• La columna Poroshell 120 EC-C18 puede usarse en un
amplio rango de pH.
• Existen otras opciones para pHs altos
El cambio en la retención con el pH para
Compuestos Ionizables depende del compuesto
Fase Móvil : 45% MeOH, 55% 20 mM Tampón Fostafo
Más retención para analitos no cargados (i.e. acidos a bajo pH y bases a alto pH)
0
2
4
6
8
10
12
pH 2.5 pH 6.5 pH 8 pH 11.5
Acetylsalicylic acid (pka 3.5)
Pyridine (pKa 5.2)
Codeine (pKa 8)
Procainamide (pKa 9.2)
Amphetamine (pKa 9.9)
Caffeine (pKa 14)
Rete
nti
on
Tim
e
¿Por qué cambiar la fase estacionaria?
• Diferentes interacciones para compuestos polares y no
polares.
• Explotar otras interacciones con la fase ligada (e.g., pi-pi)
• Todo esto cambia al cambiar la fase ligada!
• Cambiando la fase ligada se puede mejorar la
selectividad/resolución y reducir el tiempo de análisis
• Cuando usas columnas Poroshell 120 la comparación de
fases ligadas puede hacerse rápidamente!
• Más fácil con múltiples opciones de columnas , además usando
tecnologias de alta velocidad.
Fases estacionarias de las columnas Poroshell 120
Poroshell 120 EC-C18 and C8
• Robustas C18 y C8 desactivadas para las mejores formas de pico a pH 2-9
Poroshell 120 Stablebond C18 and C8
• Química robusta para pH<2
Poroshell 120 Phenyl-Hexyl
• Misma selectividad que las ZORBAX Eclipse Plus Phenyl-Hexyl
• Excelente elección para interacciones pi-pi.
• Selectividad alternativa a EC-C18 o SB-C18
• Selectividad similar a columnas fenil, difenil, u otras columnas fenil-hexil
Poroshell 120 SB-Aq
• Fase de ligado propietario que es una
excelente elección para analitos
polares.
Poroshell 120 Bonus-RP
• Su grupo polar embebido proporciona
una selectividad única para
compuestos polares
Poroshell 120 EC-CN
• Química CN desactivada con caracter
flexible para fase reversa y normal
Poroshell 120 HILIC
• Sílica HILIC para uso en Cromatografía
de Interacción Hidrofílica de moléculas
polares.
Consideraciónes en el desarrollo de métodos en LCMS
• Selección de fase móvil
• A menudo se prefieren los gradientes debido a las diferencias en las características de retención.
• Elección del tampón
• Por ejemplo un tampón volátil para LCMS (Fórmico,acético, etc)
• Dimensiones de columna para una mayor sensibilidad y velocidad
• Elija columna estrechas para una mayor sensibilidad y más cortas para análisis rápidos.
18
En el análisis de alimentos, ¿cuales son los
mayores inconvenientes?
• Seleccionar el método de preparación de muestra „correcto‟
para mi muestra de alimento.
• La preparación de muestra consume mucho tiempo.
• La selección de la columna/ el refinamiento del método.
• Las obstrucciones de columna
• Las inconsistencias en la solución
de problemas.
• ¿Necesito hacer preparación de
muestra si tengo un QQQ?
19
¿Es necesaria la preparación de muestra si tengo
un QQQ?
Un QQQ es tan específico que tu puedes seleccionar los iones
de interés.
Pero no retirar los compuestos endógenos/interferencias de
matriz no es lo mismo que no verlos.
Ha de hacerse preparación de muestra o aceptar las
consecuencias.
La “solución” variará dependiendo de cada situación
específica.
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Filtrado de la muestra Eliminación de fosfolípidos
Protección de la columna
Preparación de muestras en análisis de alimentos
21
SPE
•Límites de
detección
•Automatización
QuEChERS
•Fácil de usar
•Ideal para muestras
alimenticias
Extracción Líquido-
líquido.(SLE , en soporte sólido
ChemElut)
•Separación de fases
•A menudo lleva mucho tiempo
Filtration
•Retirada de partículas
•Retirada de lípidos
Un ejemplo actual en el análisis de alimentos: Insecticidas botánicos en peces
• La Nicotina es un insecticida botánico usado ampliamente en
US y Canada.
• Prohibido como insecticida en la Unión Europea y que será
prohibido en US a comienzos de 2014.
• Es un líquido oleoso a temperatura ambiente
y miscible en agua.
22
Un ejemplo actual en el análisis de alimentos: Insecticidas botánicos en peces
• ¿Cómo termina la nicotina en el pescado en otros organismos acuáticos?
– Insecticidas usados en granjas Lluvia Rios Mares
– Pescadores fumadores
– Colillas de cigarrillos
– Peces fumadores…
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Un ejemplo actual en el análisis de alimentos: Insecticidas botánicos en peces
• ¿Cómo preparar una muestra real de pescado?
– Si la matriz de la muestra es sólida, especialmente alimentos, considere
primero QuEChERS.
– QuEChERS es el métodos de preparación de muestras más común en
muchos laboratorios de análisis de alimentos.
– Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe.
24
Q u E C h E R S
Un ejemplo actual en el análisis de alimentos: Insecticidas botánicos en peces
• Beneficios del QuEChERS en el análisis de nicotina en pescados
– QuEChERS es la combinación de dos pasos. 1º extracción, 2º SPE
dispersiva.
– Se requiere muy poco o ningún desarrollo de método.
• 1º extracción: Simplemente elija un método AOAC, EN, u original.
• 2º SPE dispersiva: Elija uno de nuestros kits dispersivos.
– Adaptelo a sus necesidades. Se puede obtener material dispersivo a
granel y personalizar el método para adecuarlo a sus necesidades.
25
Un ejemplo actual en el análisis de alimentos: Insecticidas botánicos en peces
26
1º: Extracción
2º: SPE Dispersive
3 1 2 4 5
6 7 8 9
Un ejemplo actual en el análisis de alimentos: Insecticidas botánicos en peces
• ¿qué columna elegir para el análisis de nicotina? HILIC !!! ¿por qué?
27
Beneficios de HILIC sobre Fase Reversa
HILIC Fase Reversa
Tiempo de
retención
La Nicotina y sus metabolitos
se retendrán y separarán
La nicotina y la mayoría de sus
metabolitos eluirán demasiado
pronto.
Solvente de
muestra
No „evaporación y
reconstitución‟.
•Cambio de solvente de
muestra o
•Dilución son NECESARIOS.
Fase Móvil Inicial 90% ACN. Fase movil con muy poco
orgánico o 100% acuosa.
Sensibilidad MS Alta (¿por qué?) Baja (¿por qué?)
Presión Baja Rango de flujo más
amplio. Alta Rango de flujo limitado.
Un ejemplo actual en el análisis de alimentos: Insecticidas botánicos en peces
• Condiciones LC-MS/MS
– Columna: Poroshell 120 HILIC 2.7 µm, 2.1 X 100 mm
– LC: Agilent Infinity 1290 UHPLC
– MS: Agilent 6460 con JetStream y ESI+
– Fase Móvil A: 10 mM formiato amónico (pH=3.0)
– Fase móvil B: ACN
– Flujo: 0.7 mL/min
– Gradiente:
28
Tiempo (min) %B
0 90
4 70
4.5 70
4.6 90
6 90
Un ejemplo actual en el análisis de alimentos: Insecticidas botánicos en peces
• Nicotina y sus metabolitos
29
Nicotina Cotinina Anabasina
log P 1.20 0.07 1.25
pKa 8.02 8.8 11.0
Transición MRM 163.1132.1 177.180.1 163.1118.1
Energía colisión 82 112 92
Un ejemplo actual en el análisis de alimentos: Insecticidas botánicos en peces
30
Cotinina
Matrina (ISTD)
Nicotina
Anabasina
Un ejemplo actual en el análisis de alimentos: Insecticidas botánicos en peces
• Resultados – Curvas de Calibración y límites de detección
31
Cotinina
R2=0.9978
Anabasina
R2=0.9993
Nicotina
R2=0.9996
Rango de Calibración 1 – 500 ng/g de
pescado.
Gran linearidad.
LOD: 1 ng/g
LOQ: 5 ng/g
Un ejemplo actual en el análisis de alimentos: Insecticidas botánicos en peces
• Resultados – Precision y exactitud (n=8)
32
Nicotina Anabasina Cotinina
Bajo (10 ng/g)
Medio (100 ng/g)
Alto (500 ng/g)
Bajo (10 ng/g)
Medio (100 ng/g)
Alto (500 ng/g)
Bajo (10 ng/g)
Medio (100 ng/g)
Alto (500 ng/g)
Media 11.4 97.7 450.2 9.2 86.4 389.1 12.8 117.0 466.9
Recupera
ciónes 113.7 % 97.7 % 90.0 % 91.8 % 86.4 % 77.8 % 127.9 % 117.0 % 93.4 %
%RSD 6.4 % 1.6 % 2.1 % 6.2 % 1.6 % 2.5 % 5.4 % 2.2 % 2.1 %
Fundamentos de la aplicación
Historia del desarrollo
Descripción del producto
Nota de aplicación
Nuevo Kit de QuEChERS modificado: Fármacos Veternarios en carnes
Fundamentos de la aplicación: Fármacos Veternarios en carnes
-- Las interferencias adicionales de proteinas y lípidos encontradas en las carnes, comparadas con las frutas y vegetales, requieren el uso de PSA y C18EC en la fase de SPE dispersiva
-- Estos farmacos veterinarios en particular no requieren sales tamponadas, como las requeridas en la extracción de pesticidas lábiles al pH de los métodos AOAC o EN.
-- Se extrajeron cuatro(4) clases de farmacos veterinarios de interés:
1) Sulfanilamidas 2) Lactonas macrocíclicas 3) Quinolonas 4) Clopidoles
Historia del desarrollo:
Fármacos Veternarios en carnes
-- Inicialmente se usaron kits QuEChERS de Agilent con sales no tamponadas y d-SPE para residuos de fármacos,pero luego fueron modificadas para conseguir los requerimientos de recuperaciones de los analitos de interés
Descripción; PN Ingredientes
Kit de sales de Extracción Original
5982-5550
4 g MgSO4;
1 g NaCl
d-SPE: “Otros métodos en alimentos”
5982-4956
150 mg C18;
900 mg MgSO4
-- Matrices de muestra: carne, miel, huevos y leche
Historia del desarrollo:
Fármacos Veternarios en carnes
-- Los experimentos mostraron que el MgSO4 impactaba negativamente en las
recuperaciones de muchos compuestos, particularmetne las sulfanilamidas y las lactonas macrocíclicas. Reemplazando con Na2SO4 aumentaba las recuperaciones
Actual Modificado
Descripción del nuevo kit de QuEChERS
Fármacos Veterinarios en Carnes
Descripción Contenidos Cantidad/paquete
tamaño
Part Number
Kit de
Extracción
4 g Na2SO4;
1 g NaCl
50 sobres y 50 tubos
(50 mL)
5982-0032
d-SPE 50 mg PSA;
150 mg C18EC;
900 mg Na2SO4
50 tubos de 15-mL 5982-4950
Nota de aplicación 5991-0013EN :
Reactivos:
Solución de ácido fórmico al 1% en ACN hecho con 1 mL de ácido fórmico en 100 mL ACN; comparado con solucion de ácido acético al 1 % en ACN hecho con 1 mL de ácido acético en 100 mL ACN.
Estándares:
Solutiones hechas a concentraciones de 10 ug/mL (sulfanilamidas y lactonas macrocíclicas), 5 ug/mL (clopidoles) y 1 ug/mL (quinolonas)
Equipo:
Agilent 1260 HPLC con Detector Diode Array
Agilent 6460 Triple Cuadrupolo LC/MS con fuente de ionización AJST Electrospray
Columna Agilent Zorbax Solvent Saver HD Eclipse Plus C18
GPC en el análisis alimentario
La técnica de cromatografía por Permeación en
gel tiene varías aplicaciones en el campo de la
alimentación:
Como técnica de clean-up en la preparación de
de la muestra
Como procedimiento de análisis de contaminantes provenientes del
empaquetado de los alimentos.
Cómo técnica de caracterización de
ingredientes de los alimentos.
40
Instrumento PL-GPC 50 con
detector de Viscosimetría y light
Scattering
GPC para caracterización de ingredientes de los
alimentos. Aditivos.
GPC acuosa de pectina
41
Figura 1. Cromatogramas
conTriple-detector de pectina
(autoscalados) analizada con el
Agilent PL-GPC 50 y dos columnas
Agilent PL aquagel-OH MIXED-H
en serie
Figura 2. Curva de distribución de
peso molecular calculado para la
Pectina
GPC para caracterización de ingredientes de los
alimentos
GPC orgánico de almidón
42
Figura 3. cromatogramas con
detección por Viscometría e índice
de refracción de almidón analizado
con tres columnas Agilent PLgel
Olexis en serie.
Figura 4. Distribuciones de pesos
moleculares superpuestas para dos
muestras de almidón. Las
diferencias en distribuciones de
peso molecular informan de sus
propiedades físicas diferentes.
¿Dónde podemos hacer mejoras?
• Consejos para el mantenimiento del instrumento
• Añada una guarda columna o filtro en linea para proteger el sistema.
• Filtre la muestra. Garantiza la retirada de partículas y proteinas/lípidos
(con Captiva ND lipids)
• Evite alta concentración de sal en HILIC, especialmente cuando el
gradiente reverso va alta concentración de fase móvil acuosa como el
50%. Comience con 10 mM de formiato amónico (pH=3.0) e isocrático a
90:10 ACN:10 mM formiato amónico (pH=3.0). (Para la protección de la
columna, bomba, y fuente de ionización.)
43
Use Guarda Columnas y filtros en línea
• Los filtros en línea y las guarda
columnas extienden la vida de las
columnas de HPLC impidiendo que
las partículas y las impurezas
provoquen un atasco potencialmente
irreversible de la columna analítica.
• Alargan la vida media de las
columnas
• Ahorran costos al tener que
comprar menos columnas
• Mínimo o ningún impacto en la
cromatografía!
Page 44
Guarda Columna
Capilar Integrado
Unión/Ferrula
Poroshell 120
Fast Guard para UHPLC
Beneficios de instalar una Fast Guard para UHPLC
Page 45
400
450
500
550
600
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0.08
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
400
450
500
550
600
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0.08
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Sulfachloropyridazine PW Sulfamethoxazole PW End Pressure
Ancho d
e P
ico (
min
) A
ncho d
e P
ico (
min
)
Pre
sió
n (b
ar)
Pre
sió
n (b
ar)
Método: Test de tiempo de vida acelerado- Muestra Similac (sustituto de la leche diluido
300:1) que contiene 2 sulfamidas; El cambio en el ancho de pico indica fallo de columna
Sin Guarda Fallo de Columna;
se requiere nueva
columna
Con Guarda Fallo de Guarda;
guarda reeplazada;
Misma columna en
todo el análisis
Mediante la instalación de una guarda columna con muestras más sucias, se puede
alargar la vida de la columna y utilizar guarda columnas más baratas en vez de
reemplazar la columna ayuda a ahorrar costes
$$$ Se
requiere
nueva
columna
Guarda columna alarga la vida de la columna
Guard reemplazada
Utilize Captiva ND o ND lipids
Ideal para una gran variedad de muestras que necesitan filtración de partículas, precipitación de proteinas y retirada de lípidos
- Disponible en tubos simples de 3mL y en placas de 96 pocillos
- Indicado para analisis de compuestos en matrices alimentarias como la leche.
Mejore la calidad de sus datos: Mejor sensibilidad
retirando Lípidos con Captiva ND Lipids
47
La retirada de lípidos reduce dramáticamente la supresión iónica y se obtienen mejores resultados
Datos de alta calidad con más sensibilidad y mejor precisión
100
0
0 Minutos 35
Infusión Post columna de Albuterol
Fosfolípidos
Fosfolípidos
100
0
0 Minutos 35
Experimento con mustras después de la eliminación de Proteinas y Lipidos Con Captiva ND Lipids de una matriz de plasma humano
Norm
%
Norm
%
No hay fosfolípidos
Infusión Post-Columna (PCI) de Albuterol antes del Tratamiento con Captiva ND Lipids en Plasma Humano
Picos de lípidos–
sistema
contaminado
causa supresión
iónica
Infusión Post columna de Albuterol
Conclusión— Obtener una solución libre de
problemas
• Encuentre la mejor herramienta, para la “justa” preparación de muestra
– Entre las posibilidades se encuentran la SPE tradicional, la extracción
liquido/líquido , la SLE, o nuevos métodos que ahorran tiempo y gastos
como los QuEChERS
– QuEChERS es ideal para detecciones MRL (maximum residue level) para
muchas muestras alimenticias y la SPE tradicional es buena para
detecciones a niveles más bajos cuando se necesiten.
– La utilización de filtros de jeringa o sistemas de filtración Captiva o viales
con filtro incorporado y las guarda columnas son procedimientos muy
simples, pero extremadamente útiles para proteger su instrumento.
48
Una nueva herramienta para el desarrollo de métodos
El NAVEGADOR de Columnas y Preparación de Muestras
http://www.agilent.com/chem/navigator
49
Facilita la elección de columnas y preparación de muestras
Una nueva herramienta en la selección de Filtros
de Jeringa
Una guía en la elección de Filtros de jeringa Agilent Captiva
http:// www.agilent.com/chem/SelectFilter
50
Guía de Columnas y Desarrollo de Métodos
51
Solicite la Guía de
Columnas y Desarrollo de
Métodos:
Una guía de 162 páginas con
recomendaciones de columnas y
pasos en el desarrollo de métodos.
Número de Publicación 5990-7595EN
Soporte Técnico Agilent
Teléfono de Atención al Cliente:
901 11 68 90
email: customercare_spain@agilent.com
www.agilent.com/chem