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  • SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

    Page 1

    Aplicaciones de Q-TOF(Soluciones Analticas en Identificacin con LCMS)

    Juan Carlos Lpez Flores, MScMarzo-Abril-Mayo Junio , 2008

    ROADSHOW LCMSAMRICA LATINA

    AGILENT TECHNOLOGIES

  • SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

    Page 2

    Situacin de anlisis cualitativo para identificacin

    La muestra es desconocida Puede tenerse alguna idea de la clase de

    compuestos, pero no se sabe a ciencia cierta si estn o no presentes

    El(Los) compuesto(s) de inters puede estar presente en muy bajas concentraciones

    Se requiere alta sensibilidadDado que en LC-MS no existen bibliotecas de espectros (como en GCMS usando EI) se requieren herramientas adicionales a solo MS

    MS de alta exactitud y resolucin Varios pasos de MS (MS/MS, MS3 o MSn) Combinacin de ambos (MS/MS con alta exactitud

    en las masas)

  • SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

    Page 3

    Complejidad de muestras, cuantos y cules compuestoshay en una muestra?

    6x10

    0.2

    0.4

    0.6

    0.8

    1

    1.2

    1.4

    1.6

    1.8

    2

    2.2

    2.4

    2.6

    2.8

    Cpd 279:+ ECC Scan CoffeeSpiked12.d

    Counts vs. Acquisition Time (min)0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9

    Ms de 280 compuestos en caf con pesticidas aadidos

  • SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

    Page 4

    9 compuestos coeluyendo en 6 segundos5x10

    0.2

    0.4

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    1

    1.2

    1.4

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    2

    2.2

    2.4

    2.6

    2.8

    3

    3.2

    3.4

    Cpd 105:+ ECC Scan CoffeeSpiked12.d

    Counts vs. Acquisition Time (min).31 1.315 1.32 1.325 1.33 1.335 1.34 1.345 1.35 1.355 1.36 1.365 1.37 1.375 1.38 1.385 1.39 1.395 1.4 1.405 1.41 1.415 1.42 1.425 1.43 1.435 1.44 1.445

    6 segundos

  • SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

    Page 5

    Extracto de orina realmente complejo > 1000 compuestosAmplio intervalo dinmico Como se analiza?

    6x10

    0.2

    0.4

    0.6

    0.8

    1

    1.2

    1.4

    1.6

    1.8

    2

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    2.4

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    3

    3.2

    3.4

    3.6

    3.8

    4

    4.2

    4.4

    4.6

    4.8

    5

    5.2

    Cpd 932:+ ECC Scan DQC3.d

    1417

    Counts vs. Acquisition Time (scans)250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 1050 1100 1150 1200 1250 1300 1350 1400

    5x10

    -0.2-0.1

    00.1

    0.20.3

    0.40.5

    0.60.7

    0.80.9

    11.1

    1.21.3

    1.41.5

    1.61.7

    1.81.9

    22.12.2

    2.32.4

    2.5

    Cpd 932:+ ECC Scan DQC3.d

    Counts vs. Acquisition Time (min)3.08 3.1 3.12 3.14 3.16 3.18 3.2 3.22 3.24 3.26 3.28 3.3 3.32 3.34 3.36 3.38 3.4 3.42 3.44 3.46 3.48 3.5

  • SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

    Page 6

    El mayor reto en Proteomics: Encontrar biomarcadores en fludoshumanos como suero, plasma o Lquido cefalo raqudeo

    En el suero humano, las concentraciones de protenas se estiman estn en un intervalo de doce rdenes de magnitud

    Number of Proteins

    (rdenes de magnitud)

    An no resueltas

    2D gelesLC-MS

    Nivel

    121110987654321

    Biomarcadoresen tejidos

    (mg/ml)

    (ug/ml)

    (ng/ml)

    (pg/ml)

    (fg/ml)

    - Alta abundancia

    - Abundancia moderada

    - Baja abundancia

    - Muy baja abundanciaCitoquinas

  • SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

    Page 7

    Retirando las capas de protenas es el primer paso

    Uno de los mayores objetivos es encontrar protenas tiles desde el punto de vista clnico(biomarcadores). Estas son tpicamente protenas de baja abundancia. Las tecnologas actuales permitenver solo las tres capas superiores.

    Level 1

    Level 2

    Level 3

    Level 4

    Level 5

    Level 6

    Ya estudiadas

    Las protenas de inters

    Level 7Level 8

  • SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

    Page 8

    Resultados con instrumento con baja exactitud en masas (MW 609. 2, con solo C, H, O y N)

    H25N36O5CH21N40OC33H31N13

  • SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

    Page 9

    Resultados con instrumento con alta exactitud en masas (MW 609. 28066, con solo C, H, O y N)

  • SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

    Page 10

    Definiciones

    Una disolucin con cido en concentracin 0.0025M

    Una disolucin de pH 2.6 pH = -log 0.025

    Error en la medicin de masasError pequeo 200.0 y 200.1 (200.0 200.1)/200.0 = 0.0005

    Error en masas exactas(200.0000-200.0016)/200.0000 = 0.000005

    Exactitud en masas = Error x 1,000,0000.00005X1,000,000 = 5 ppm

  • SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

    Page 11

    Importancia de las mediciones exactas de masas

    Reserpina (C33H40N2O9) tiene un in protonado a m/z 609.28066

    Un espectrmetro de masas tipo cuadrupolo reporta masas en +/- 0.1 = 165 ppm

    0.1/609.28 x 10e6 = 164.128

    Nmero de frmulas posibles usando solo C, H, O y N:

    165 ppm 209 10 ppm 13 5 ppm 7 3 ppm 4 2 ppm 2

    Las masas exactas reducen el riesgo de invertir esfuerzo en la molcula incorrecta

    Error en ppm = (error de masa/MW) x 106

  • SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

    Page 12

    Alta resolucin y nmero posible de frmulasqumicas

    1

    10

    100

    1000

    0.1 0.05 0.01 0.005 0.001 0.0005 0.0001

    Exactitud de masa (amu)

    # de

    frm

    ula/

    com

    pues

    tos

    posi

    bles

    176386882134716725687

  • SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

    Page 13

    Masas Atmicas e istopos

  • SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

    Page 14

    Diferencias entre MW promedio, monoisotpico y nominal

    Nombre FrmulaMolecular

    Masa Promedio(Da)

    MasaMonoisotpica

    Masa Nominal(Da)

    Carbn C 12.1115 12.0000 12Hidrgeno H 1.0080 1.0078 1Nitrgeno N 14.0067 14.0031 14Oxgeno O 15.9994 15.9949 16Azufre S 32.0600 31.9721 32

    Un lpido C18H35NO 281.4858 281.2718 281Un azcar C56H118N4O14 1071.5833 1070.8644 1070Un pptido C101H258N24O24 2193.3288 2191.9704 2190

  • SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

    Page 15

    Sistemas LC/MS de Agilent, vista por dentro

    Rough Pump

    Octopole 1

    Turbo 1

    Turbo 1

    Turbo 1

    Quad Mass Filter (Q1)

    Collision Cell

    Lens 1 and 2

    Quad Mass Filter (Q3)

    10KV Detector

    Ion Pulser

    Turbo 2

    Octopole 1

    DC Quad

    Rough Pump

    Turbo 1

    Turbo 1

    Turbo 1

    Quad Mass Filter (Q1)

    Collision CellLens 1 and 2

    Octopole 2

    Rough Pump

    Octopole 1

    Turbo 1

    Turbo 1

    Turbo 1

    Quad Mass Filter (Q1)

    Lens 1 and 210KV

    Detector 6520 Q-TOF6410 QQQ

    6100 Series SQ

  • SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

    Page 16

    Modelo Conceptual de un Espectrmetrode Masas de Tiempo de Vuelo (TOF)

    Video TOF

    Tubo de vuelo del TOF:Zona libre de campo elctrico. Opcional: Reflectron (espejo de iones)

    0 V

    Analizador de Masasde Tiempo de Vuelo (TOF)

    Deteccin Iones

    IonizacinExterna Campo Elctrico

    Pulsante

    Resolucin Espectral:

    alta

    Tcnica Pulsante

    E = - m v221 v =

    m2E

    t =length

    m2E

    2(30000)= 1.0

    50200

    = 91 sec

  • SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

    Page 17

    Posicionamiento de los instrumentos 6210 y 6220 TOF

    G6210 Resolucin de 4,000 @ 118 m/z (tpica)Resolucin de 7,000 @ 322 m/z (tpica)Resolucin de 13,000 @ 2722 m/z (spec)3.5 dcadas de intervalo dinmico

    G6220 >Cambio 2X Resolucin de 9,000 @ 118 m/z(spec)

    Cambio 2X- Resolucin de 14,000 @ 322 m/z(spec)

    Cambio 1.3X- Resolucin de 16,000 @ 2722 m/z(spec)

    Cambio 10X- 4.5 dcadas de intervalo dinmicoIntroduccin automtica de masas de referenciapara Multimodo, APCI yAPPI

    100% MassHunter software

  • SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

    Page 18

    Posicionamiento de los instrumentos 6510 y 6520 QTOF

    G6510Resolucin 4,000 @ 118 m/z (tpico)

    Resolucin 7,000 @ 322 m/z (tpico)

    Resolucin 13,000 @ 2722 m/z (spec)

    3.5 dcadas de intervalo dinmico

    Intervalo de masas 4,000 m/z cuad;

    12,000 m/z TOF

    G6520>cambio 2X- Resolucin de 9,000 @ 118 m/z (spec)Cambio 2X - Resolucin de 14,000 @ 322 m/z (spec)Cambio de 1.3X Resolucin de 16,000 @ 2722 m/z(spec)

    Cambio de 10X - 4.5 dcadas de intervalo dinmicoIntervalo de masas 4,000 m/z cuad; 20,000 m/z - TOF -standard

    Introduccin automtica de masas de referencia paraMultimodo, APCI y APPI

    8,000 m/z cuad opcin de intervalo de masasextendido (Fase III)

  • SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

    Page 19

    Diagrama TOF

  • SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

    Page 20

    Diseo que mejora la transmisin de iones y la resolucin

    Espejo de iones de dos etapas

    Sistema de vaco de 5 etapas

    Fuente de ionesortogonal

    Detector pticamenteacoplado con la digitalizacin ADCAl 25ppm/C, Acinox 20ppm/oC. Agilent 2ppm/oC

    Longitud real del paso de vuelo de 2.0m

    Tubo de vuelo con bajo CTE

  • SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

    Page 21

    Exactitud de masas, extremos ambientales

    Inyeccin cada 15 minutos, desde 11 - 36 C y de 10 a 95 % humedad relativa

    Mass Accuracy

    -5-4-3-2-1012345

    0 50 100 150 200 250 300

    Reserpine Injection

    Mas

    s Er

    ror,

    ppm

  • SIMPOSIUM 2006Agilent Restricted

    Page 22

    Fuente dual ElectrosprayDiseo de rociador dual para la muestra y los compuestos de referencia

    Rociador de referencia

    Rociador analtico

  • SIMPOSIUM 200