Soluciones Agilent para

aplicaciones

alimentarias: de la

preparación de muestra

a la separación

Tecnologías que mejoran el

rendimiento y la productividad

Julián de la Mata

14 de Febrero de 2013

1

Agenda

• Necesidades actuales de los análisis alimentarios

• Consideraciones y consejos en los análisis por LC y LCMS.

• Revisión de las distintas opciones de preparación de muestras.

• Fundamentos importantes en el desarrollo de métodos

• Flujo de trabajo en análisis alimentario usando LC/MS

• Insecticidas botánicos en pescado

• Fármacos veterinarios en matrices de origen animal.

• Herramientas para mejorar sus análisis alimentaríos.

2

¿Cómo es hoy el Analisis Alimentario?

• Aumento en la complejidad en el suministro y origen de los alimentos

• La globalización en el suministro de alimentos ha hecho necesario un análisis detallado del valor nutricional, la composición y los contaminantes de los alimentos.

• La preocupación por la Seguridad Alimentaria y sus efectos en la salud humana han incrementado la regulación y las exigencias relacionadas con el análisis de alimentos.

• Los viejos métodos para el análisis de alimentos eran muy tediosos y no adecuados a las necesidades modernas para obtener un mayor rendimiento en los análisis de alimentos.

• Las muestras son de todos los tipos!

• Un apropiado analisis de alimentos no se pueden lograr sin la adecuada metodología de LC y preparación de muestra.

3

Técnicas cromatográficas en el análisis

alimentario

4

• Cromatografía de Gases • Usada tipicamente para:

• No-polares volátiles, aceites,

etc

• Puede requerir derivatización

de los compuestos

• Cromatografía Líquida

• Usada tipicamente para:

• Polares, termo lábiles

• Sin necesidad de

derivatización de muchos de

los compuestos.

• Requiere preparación de

muestra más sencilla.

Retos en análisis alimentario

• Desarrollo de nuevos métodos

• Encontrar maneras de reducir costes

• Hacer más con menos– incrementar la productividad del

laboratorio

• Mantenerse al día en los últimos cambios en Seguridad

Alimentaria

5

Desarrollo de Métodos LC en análisis alimentario

¿Que es diferente en el análisis LC para el análisis de

alimentos?

• Complejidad de la matriz de la muestra

• Múltiples residuos de interés

• A menudo, las muestras tienen analitos muy polares de

interés.

Las modernas tecnologías de columnas hacen el análisis

alimentarío más rápido y más fácil.

6

Nuevas tecnologías de columnas para el desarrollo

de métodos.

Columnas para análisis de alta resolución y alta velocidad

• Columnas Sub-2 µm para operación a ultra-altas presiones

• Columnas Superficialmente porosas Sub-3 µm

Considerationes cuando se desarrollan métodos en columnas con nuevas tecnologías

• Tamaño de partícula < 3 μm

• Límites de presión de las columnas >400 bar (típicamente 600-1200 bar)

• Operan con los mismos principios cromatográficos que las columnas de 5 μm, pero con resultados superiores.

Nuevas tecnologías de Columnas Superficialmente

porosas

• Eficiencia ≈ 90% de sub-2 µm

• Presión ≈ 40-50% de sub-2 µm

• N ≈ 2X 3.5 µm (totalmente porosas)

• dp = 2.7µm

• Frita con porosidad 2 µm frit para

reducir los atascos

• Plimite = 600 bar para HPLC o UHPLC

• Particulas

• Núcleo sólido de 1.7 μm

• Ruta de difusión de 0.5 μm

• Diametro total de 2.7 μm

Poroshell 120 columns:

1.7um

0.5um

0.5um

Beneficios de la tecnología de las columnas

Poroshell 120

• Permite aumentar la velocidad de separación (reducción del tiempo de análisis)

• Uso con cualquier instrumento (HPLC o UHPLC)

• Reducción de los costos de solventes y de desecho

• Poroshell 120

• Escalabilidad

• Facilidad de transferencia dé métodos

• Mayor transferencia de masa debido a la menor difusión.

• Fases similares a las columnas ZORBAX totalmente porosas.

Comparando Eficiencia y Presión con Diferentes

Tipos de Columnas

Tamaño de partícula/Tipo

Presión Eficiencia LC Compatibilidad

5µm Totalmente Porosa

40 bar 5,000 Todos los

instrumentos hasta 400 bar

3.5µm Totalmente Porosa

80 bar 7,800 Todos los

instrumentos hasta 400 bar

2.7µm

Poroshell 120 100 bar 12,000

Todos LCs/UHPLCs (hasta 600 bar)

1.8µm Totalmente Porosa

250 bar 12,500 Todos

LCs/UHPLCs (hasta to 1200 bar)

Columnas: 4.6 x 50mm, Fase Movil: 60% ACN:40% Agua Flujo: 2 mL/min

Mejoras en la transferencia de masas del analíto

gracias a una menor Difusión

Totalmente Porosa

Superficialmente Porosa

• Particulas totalmente porosas • Difusión a través de toda la partícula

• Poroshell 120

• Difusión solo en la capa porosa

• Resultados:

• Menor término C

• Mayor eficiencia

• Y

• Mayores flujos con

• Mínimo impacto en la eficiencia

CBAh /Ecuación van Deemter

Otras consideraciones al seleccionar una columna

• Robusted y reproducibilidad lote-a-lote de las columnas

Poroshell 120

min 1 2 3 4

mAU

0

50

100

min 1 2 3 4

mAU

0 50

100

min 1 2 3 4

mAU

0 50

100 150

min 1 2 3 4

mAU

0 50

100 150

min 1 2 3 4

mAU

0 50

100 150

B10015

B11041

B11256

B12041

B10018

2012

2010

Aditivos en Bebidas

Pasos generales en un método LC robusto para

Análisis de Alimentos

• Elija el tipo de cromatografía– a menudo fase reversa (C18,

polar embebida, etc…) o fases HILIC.

• Elija las condiciones apropiadas de inicio y fin de gradiente.

• Ajuste el pH para obtener la mejor retención del analito.

• Cambie de fase ligada para obtener la separación de picos

más adecuada y la mejor resolución.

13

El cambio en la retención con el pH para los

compuestos ionizables es clave en el desarrollo de

métodos.

• En fase reversa, los analitos no cargados tienen mejor

retención (i.e. los ácidos a bajo pH y las bases a alto pH)

• Los Silanoles de la sílica ionizan a pH medio,

incrementando la retención de los analitos básicos (i.e

posibles interacciones de intercambio iónico)

• Elija un pH de la fase móvil para optimizar la retención y la

selectividad durante el desarrollo de métodos

• La columna Poroshell 120 EC-C18 puede usarse en un

amplio rango de pH.

• Existen otras opciones para pHs altos

El cambio en la retención con el pH para

Compuestos Ionizables depende del compuesto

Fase Móvil : 45% MeOH, 55% 20 mM Tampón Fostafo

Más retención para analitos no cargados (i.e. acidos a bajo pH y bases a alto pH)

0

2

4

6

8

10

12

pH 2.5 pH 6.5 pH 8 pH 11.5

Acetylsalicylic acid (pka 3.5)

Pyridine (pKa 5.2)

Codeine (pKa 8)

Procainamide (pKa 9.2)

Amphetamine (pKa 9.9)

Caffeine (pKa 14)

Rete

nti

on

Tim

e

¿Por qué cambiar la fase estacionaria?

• Diferentes interacciones para compuestos polares y no

polares.

• Explotar otras interacciones con la fase ligada (e.g., pi-pi)

• Todo esto cambia al cambiar la fase ligada!

• Cambiando la fase ligada se puede mejorar la

selectividad/resolución y reducir el tiempo de análisis

• Cuando usas columnas Poroshell 120 la comparación de

fases ligadas puede hacerse rápidamente!

• Más fácil con múltiples opciones de columnas , además usando

tecnologias de alta velocidad.

Fases estacionarias de las columnas Poroshell 120

Poroshell 120 EC-C18 and C8

• Robustas C18 y C8 desactivadas para las mejores formas de pico a pH 2-9

Poroshell 120 Stablebond C18 and C8

• Química robusta para pH<2

Poroshell 120 Phenyl-Hexyl

• Misma selectividad que las ZORBAX Eclipse Plus Phenyl-Hexyl

• Excelente elección para interacciones pi-pi.

• Selectividad alternativa a EC-C18 o SB-C18

• Selectividad similar a columnas fenil, difenil, u otras columnas fenil-hexil

Poroshell 120 SB-Aq

• Fase de ligado propietario que es una

excelente elección para analitos

polares.

Poroshell 120 Bonus-RP

• Su grupo polar embebido proporciona

una selectividad única para

compuestos polares

Poroshell 120 EC-CN

• Química CN desactivada con caracter

flexible para fase reversa y normal

Poroshell 120 HILIC

• Sílica HILIC para uso en Cromatografía

de Interacción Hidrofílica de moléculas

polares.

Consideraciónes en el desarrollo de métodos en LCMS

• Selección de fase móvil

• A menudo se prefieren los gradientes debido a las diferencias en las características de retención.

• Elección del tampón

• Por ejemplo un tampón volátil para LCMS (Fórmico,acético, etc)

• Dimensiones de columna para una mayor sensibilidad y velocidad

• Elija columna estrechas para una mayor sensibilidad y más cortas para análisis rápidos.

18

En el análisis de alimentos, ¿cuales son los

mayores inconvenientes?

• Seleccionar el método de preparación de muestra „correcto‟

para mi muestra de alimento.

• La preparación de muestra consume mucho tiempo.

• La selección de la columna/ el refinamiento del método.

• Las obstrucciones de columna

• Las inconsistencias en la solución

de problemas.

• ¿Necesito hacer preparación de

muestra si tengo un QQQ?

19

¿Es necesaria la preparación de muestra si tengo

un QQQ?

Un QQQ es tan específico que tu puedes seleccionar los iones

de interés.

Pero no retirar los compuestos endógenos/interferencias de

matriz no es lo mismo que no verlos.

Ha de hacerse preparación de muestra o aceptar las

consecuencias.

La “solución” variará dependiendo de cada situación

específica.

20

Filtrado de la muestra Eliminación de fosfolípidos

Protección de la columna

Preparación de muestras en análisis de alimentos

21

SPE

•Límites de

detección

•Automatización

QuEChERS

•Fácil de usar

•Ideal para muestras

alimenticias

Extracción Líquido-

líquido.(SLE , en soporte sólido

ChemElut)

•Separación de fases

•A menudo lleva mucho tiempo

Filtration

•Retirada de partículas

•Retirada de lípidos

Un ejemplo actual en el análisis de alimentos: Insecticidas botánicos en peces

• La Nicotina es un insecticida botánico usado ampliamente en

US y Canada.

• Prohibido como insecticida en la Unión Europea y que será

prohibido en US a comienzos de 2014.

• Es un líquido oleoso a temperatura ambiente

y miscible en agua.

22

Un ejemplo actual en el análisis de alimentos: Insecticidas botánicos en peces

• ¿Cómo termina la nicotina en el pescado en otros organismos acuáticos?

– Insecticidas usados en granjas Lluvia Rios Mares

– Pescadores fumadores

– Colillas de cigarrillos

– Peces fumadores…

23

Un ejemplo actual en el análisis de alimentos: Insecticidas botánicos en peces

• ¿Cómo preparar una muestra real de pescado?

– Si la matriz de la muestra es sólida, especialmente alimentos, considere

primero QuEChERS.

– QuEChERS es el métodos de preparación de muestras más común en

muchos laboratorios de análisis de alimentos.

– Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe.

24

Q u E C h E R S

Un ejemplo actual en el análisis de alimentos: Insecticidas botánicos en peces

• Beneficios del QuEChERS en el análisis de nicotina en pescados

– QuEChERS es la combinación de dos pasos. 1º extracción, 2º SPE

dispersiva.

– Se requiere muy poco o ningún desarrollo de método.

• 1º extracción: Simplemente elija un método AOAC, EN, u original.

• 2º SPE dispersiva: Elija uno de nuestros kits dispersivos.

– Adaptelo a sus necesidades. Se puede obtener material dispersivo a

granel y personalizar el método para adecuarlo a sus necesidades.

25

Un ejemplo actual en el análisis de alimentos: Insecticidas botánicos en peces

26

1º: Extracción

2º: SPE Dispersive

3 1 2 4 5

6 7 8 9

Un ejemplo actual en el análisis de alimentos: Insecticidas botánicos en peces

• ¿qué columna elegir para el análisis de nicotina? HILIC !!! ¿por qué?

27

Beneficios de HILIC sobre Fase Reversa

HILIC Fase Reversa

Tiempo de

retención

La Nicotina y sus metabolitos

se retendrán y separarán

La nicotina y la mayoría de sus

metabolitos eluirán demasiado

pronto.

Solvente de

muestra

No „evaporación y

reconstitución‟.

•Cambio de solvente de

muestra o

•Dilución son NECESARIOS.

Fase Móvil Inicial 90% ACN. Fase movil con muy poco

orgánico o 100% acuosa.

Sensibilidad MS Alta (¿por qué?) Baja (¿por qué?)

Presión Baja Rango de flujo más

amplio. Alta Rango de flujo limitado.

Un ejemplo actual en el análisis de alimentos: Insecticidas botánicos en peces

• Condiciones LC-MS/MS

– Columna: Poroshell 120 HILIC 2.7 µm, 2.1 X 100 mm

– LC: Agilent Infinity 1290 UHPLC

– MS: Agilent 6460 con JetStream y ESI+

– Fase Móvil A: 10 mM formiato amónico (pH=3.0)

– Fase móvil B: ACN

– Flujo: 0.7 mL/min

– Gradiente:

28

Tiempo (min) %B

0 90

4 70

4.5 70

4.6 90

6 90

Un ejemplo actual en el análisis de alimentos: Insecticidas botánicos en peces

• Nicotina y sus metabolitos

29

Nicotina Cotinina Anabasina

log P 1.20 0.07 1.25

pKa 8.02 8.8 11.0

Transición MRM 163.1132.1 177.180.1 163.1118.1

Energía colisión 82 112 92

Un ejemplo actual en el análisis de alimentos: Insecticidas botánicos en peces

30

Cotinina

Matrina (ISTD)

Nicotina

Anabasina

Un ejemplo actual en el análisis de alimentos: Insecticidas botánicos en peces

• Resultados – Curvas de Calibración y límites de detección

31

Cotinina

R2=0.9978

Anabasina

R2=0.9993

Nicotina

R2=0.9996

Rango de Calibración 1 – 500 ng/g de

pescado.

Gran linearidad.

LOD: 1 ng/g

LOQ: 5 ng/g

Un ejemplo actual en el análisis de alimentos: Insecticidas botánicos en peces

• Resultados – Precision y exactitud (n=8)

32

Nicotina Anabasina Cotinina

Bajo (10 ng/g)

Medio (100 ng/g)

Alto (500 ng/g)

Bajo (10 ng/g)

Medio (100 ng/g)

Alto (500 ng/g)

Bajo (10 ng/g)

Medio (100 ng/g)

Alto (500 ng/g)

Media 11.4 97.7 450.2 9.2 86.4 389.1 12.8 117.0 466.9

Recupera

ciónes 113.7 % 97.7 % 90.0 % 91.8 % 86.4 % 77.8 % 127.9 % 117.0 % 93.4 %

%RSD 6.4 % 1.6 % 2.1 % 6.2 % 1.6 % 2.5 % 5.4 % 2.2 % 2.1 %

Fundamentos de la aplicación

Historia del desarrollo

Descripción del producto

Nota de aplicación

Nuevo Kit de QuEChERS modificado: Fármacos Veternarios en carnes

Fundamentos de la aplicación: Fármacos Veternarios en carnes

-- Las interferencias adicionales de proteinas y lípidos encontradas en las carnes, comparadas con las frutas y vegetales, requieren el uso de PSA y C18EC en la fase de SPE dispersiva

-- Estos farmacos veterinarios en particular no requieren sales tamponadas, como las requeridas en la extracción de pesticidas lábiles al pH de los métodos AOAC o EN.

-- Se extrajeron cuatro(4) clases de farmacos veterinarios de interés:

1) Sulfanilamidas 2) Lactonas macrocíclicas 3) Quinolonas 4) Clopidoles

Historia del desarrollo:

Fármacos Veternarios en carnes

-- Inicialmente se usaron kits QuEChERS de Agilent con sales no tamponadas y d-SPE para residuos de fármacos,pero luego fueron modificadas para conseguir los requerimientos de recuperaciones de los analitos de interés

Descripción; PN Ingredientes

Kit de sales de Extracción Original

5982-5550

4 g MgSO4;

1 g NaCl

d-SPE: “Otros métodos en alimentos”

5982-4956

150 mg C18;

900 mg MgSO4

-- Matrices de muestra: carne, miel, huevos y leche

Historia del desarrollo:

Fármacos Veternarios en carnes

-- Los experimentos mostraron que el MgSO4 impactaba negativamente en las

recuperaciones de muchos compuestos, particularmetne las sulfanilamidas y las lactonas macrocíclicas. Reemplazando con Na2SO4 aumentaba las recuperaciones

Actual Modificado

Descripción del nuevo kit de QuEChERS

Fármacos Veterinarios en Carnes

Descripción Contenidos Cantidad/paquete

tamaño

Part Number

Kit de

Extracción

4 g Na2SO4;

1 g NaCl

50 sobres y 50 tubos

(50 mL)

5982-0032

d-SPE 50 mg PSA;

150 mg C18EC;

900 mg Na2SO4

50 tubos de 15-mL 5982-4950

Nota de aplicación 5991-0013EN :

Reactivos:

Solución de ácido fórmico al 1% en ACN hecho con 1 mL de ácido fórmico en 100 mL ACN; comparado con solucion de ácido acético al 1 % en ACN hecho con 1 mL de ácido acético en 100 mL ACN.

Estándares:

Solutiones hechas a concentraciones de 10 ug/mL (sulfanilamidas y lactonas macrocíclicas), 5 ug/mL (clopidoles) y 1 ug/mL (quinolonas)

Equipo:

Agilent 1260 HPLC con Detector Diode Array

Agilent 6460 Triple Cuadrupolo LC/MS con fuente de ionización AJST Electrospray

Columna Agilent Zorbax Solvent Saver HD Eclipse Plus C18

Cromatograma de los 36 Fármacos veterinarios

GPC en el análisis alimentario

La técnica de cromatografía por Permeación en

gel tiene varías aplicaciones en el campo de la

alimentación:

Como técnica de clean-up en la preparación de

de la muestra

Como procedimiento de análisis de contaminantes provenientes del

empaquetado de los alimentos.

Cómo técnica de caracterización de

ingredientes de los alimentos.

40

Instrumento PL-GPC 50 con

detector de Viscosimetría y light

Scattering

GPC para caracterización de ingredientes de los

alimentos. Aditivos.

GPC acuosa de pectina

41

Figura 1. Cromatogramas

conTriple-detector de pectina

(autoscalados) analizada con el

Agilent PL-GPC 50 y dos columnas

Agilent PL aquagel-OH MIXED-H

en serie

Figura 2. Curva de distribución de

peso molecular calculado para la

Pectina

GPC para caracterización de ingredientes de los

alimentos

GPC orgánico de almidón

42

Figura 3. cromatogramas con

detección por Viscometría e índice

de refracción de almidón analizado

con tres columnas Agilent PLgel

Olexis en serie.

Figura 4. Distribuciones de pesos

moleculares superpuestas para dos

muestras de almidón. Las

diferencias en distribuciones de

peso molecular informan de sus

propiedades físicas diferentes.

¿Dónde podemos hacer mejoras?

• Consejos para el mantenimiento del instrumento

• Añada una guarda columna o filtro en linea para proteger el sistema.

• Filtre la muestra. Garantiza la retirada de partículas y proteinas/lípidos

(con Captiva ND lipids)

• Evite alta concentración de sal en HILIC, especialmente cuando el

gradiente reverso va alta concentración de fase móvil acuosa como el

50%. Comience con 10 mM de formiato amónico (pH=3.0) e isocrático a

90:10 ACN:10 mM formiato amónico (pH=3.0). (Para la protección de la

columna, bomba, y fuente de ionización.)

43

Use Guarda Columnas y filtros en línea

• Los filtros en línea y las guarda

columnas extienden la vida de las

columnas de HPLC impidiendo que

las partículas y las impurezas

provoquen un atasco potencialmente

irreversible de la columna analítica.

• Alargan la vida media de las

columnas

• Ahorran costos al tener que

comprar menos columnas

• Mínimo o ningún impacto en la

cromatografía!

Page 44

Guarda Columna

Capilar Integrado

Unión/Ferrula

Poroshell 120

Fast Guard para UHPLC

Beneficios de instalar una Fast Guard para UHPLC

Page 45

400

450

500

550

600

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

0.08

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

400

450

500

550

600

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

0.08

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

Sulfachloropyridazine PW Sulfamethoxazole PW End Pressure

Ancho d

e P

ico (

min

) A

ncho d

e P

ico (

min

)

Pre

sió

n (b

ar)

Pre

sió

n (b

ar)

Método: Test de tiempo de vida acelerado- Muestra Similac (sustituto de la leche diluido

300:1) que contiene 2 sulfamidas; El cambio en el ancho de pico indica fallo de columna

Sin Guarda Fallo de Columna;

se requiere nueva

columna

Con Guarda Fallo de Guarda;

guarda reeplazada;

Misma columna en

todo el análisis

Mediante la instalación de una guarda columna con muestras más sucias, se puede

alargar la vida de la columna y utilizar guarda columnas más baratas en vez de

reemplazar la columna ayuda a ahorrar costes

$$$ Se

requiere

nueva

columna

Guarda columna alarga la vida de la columna

Guard reemplazada

Utilize Captiva ND o ND lipids

Ideal para una gran variedad de muestras que necesitan filtración de partículas, precipitación de proteinas y retirada de lípidos

- Disponible en tubos simples de 3mL y en placas de 96 pocillos

- Indicado para analisis de compuestos en matrices alimentarias como la leche.

Mejore la calidad de sus datos: Mejor sensibilidad

retirando Lípidos con Captiva ND Lipids

47

La retirada de lípidos reduce dramáticamente la supresión iónica y se obtienen mejores resultados

Datos de alta calidad con más sensibilidad y mejor precisión

100

0

0 Minutos 35

Infusión Post columna de Albuterol

Fosfolípidos

Fosfolípidos

100

0

0 Minutos 35

Experimento con mustras después de la eliminación de Proteinas y Lipidos Con Captiva ND Lipids de una matriz de plasma humano

Norm

%

Norm

%

No hay fosfolípidos

Infusión Post-Columna (PCI) de Albuterol antes del Tratamiento con Captiva ND Lipids en Plasma Humano

Picos de lípidos–

sistema

contaminado

causa supresión

iónica

Infusión Post columna de Albuterol

Conclusión— Obtener una solución libre de

problemas

• Encuentre la mejor herramienta, para la “justa” preparación de muestra

– Entre las posibilidades se encuentran la SPE tradicional, la extracción

liquido/líquido , la SLE, o nuevos métodos que ahorran tiempo y gastos

como los QuEChERS

– QuEChERS es ideal para detecciones MRL (maximum residue level) para

muchas muestras alimenticias y la SPE tradicional es buena para

detecciones a niveles más bajos cuando se necesiten.

– La utilización de filtros de jeringa o sistemas de filtración Captiva o viales

con filtro incorporado y las guarda columnas son procedimientos muy

simples, pero extremadamente útiles para proteger su instrumento.

48

Una nueva herramienta para el desarrollo de métodos

El NAVEGADOR de Columnas y Preparación de Muestras

http://www.agilent.com/chem/navigator

49

Facilita la elección de columnas y preparación de muestras

Una nueva herramienta en la selección de Filtros

de Jeringa

Una guía en la elección de Filtros de jeringa Agilent Captiva

http:// www.agilent.com/chem/SelectFilter

50

Guía de Columnas y Desarrollo de Métodos

51

Solicite la Guía de

Columnas y Desarrollo de

Métodos:

Una guía de 162 páginas con

recomendaciones de columnas y

pasos en el desarrollo de métodos.

Número de Publicación 5990-7595EN

Soporte Técnico Agilent

Teléfono de Atención al Cliente:

901 11 68 90

email: customercare_spain@agilent.com

www.agilent.com/chem