Post on 28-Jan-2016
Separación de células
Separación de células
Separación de células por centrifugación
Separación de células
Centrifugación isopícnica (en un gradiente de densidad)
Separación de células
Formación de un gradiente discontinuo
Separación de células
Formador de gradientes continuos
Separación de células
Gradiente formado durante la centrifugación
Gradiente de Percoll
20.000 g , 1 hora
Separación de células
Centrifugación isopícnica
Fibroblastos MR-5
Células Hela
Separación de células
Células Hela
Fibroblastos MR-5
Recuperación de las células
Separación de células
Separación por elutriación
Separación de células
La centrifugadora
Separación de células
La cámara de separación
Separación de células
A) Una población mixta de células entra en la cámara de separación con una velocidad de flujo y una velocidad de centrifugación determinadas
B) Se aumenta la velocidad de flujo (o se reduce la velocidad de rotación) para que los distintos tipos de célula se vayan separando. Las células más pequeñas se colocan en el frente de elutriación.
La separación por elutriación
C) Se vuelve a aumentar la velocidad de flujo (o a reducir la velocidad de rotación) para que las células más pequeñas salgan de la cámara y se puedan recoger.
Separación de células
Separación de células mediante campos magnéticos
Separación de células
Dynabeads® (Invitrogen)
Separación de células
Las Dynabeads® se pueden conjugar con diversos ligandos
Separación de célulasDynabeads® (Invitrogen)
Pincha en el recuadro para ver el vídeo
Separación de célulasEl protocolo de separación puede constar de un
solo paso o de varios. La selección puede ser positiva (se unen a lo que me interesa) o negativa (se unen a lo que no me interesa). Hay protocolos
que usan los dos tipos de selección.
Separación de células con Dynabeads® (Invitrogen)
Separación de células
Separación negativa
Las células que no me interesan se unen a anticuerpos específicos unidos a esferas magnéticas (se trata de una selección negativa)
El imán atrae a las esferas magnéticas (y las células adheridas a ellas, que se
quedan inmovilizadas en la pared del tubo)
Las células que me interesan (y otras) quedan en suspensión
listas para ser separadas mediante citometría de flujo
Separación de células
MACS® (magnetic cell sorting)
Microbeads
CD8+ T cells
Separación de células
MACS® microbeads
Separación de células
Columnas
Columnas MACS®
Separación de células
Separación positiva
Separación de células
MACS® columns
Separación de células
Separación en un campo magnético: MACS® (Miltenyi)
Separación de células
Citometría de flujo
Separación de células
Citometría de flujo
Separación de células
Citometría de flujo: Aplicaciones
Separación de células
Componentes de un citómetro de flujo
Separación de célulasEl punto de interrogación es el núcleo del sistema. Allí es
donde el láser incide en la muestra y el sistema óptico recoge la luz difractada y la
fluorescencia.
El punto de interrogación
Separación de células
Enfoque hidrodinámico
En el punto de encuentro, el fluido envolvente
arrastra a las células que van llegando por el
conducto interno, que se hace más estrecho en su
extremo
Las células fluyen por un conducto central que está
rodeado por otro conducto de mayor
diámetro que transporta una disolución salina a
mayor velocidad.
El resultado final es que se crea una hilera de
células que atravesarán el láser de una en una.
Separación de células
Cuando el láser incide en la célula,
ésta difracta la luz en todas direcciones
La difracción frontal (o difracción de bajo ángulo) es la luz difractada hacia delante. Su intensidad es
directamente proporcional al tamaño de la célula.
Difracción a bajo ángulo
Separación de células
Detección de la difracción a bajo ángulo
La luz difractada se cuantifica mediante
un detector que convierte la
intensidad en voltaje
Delante del detector hay una barra que
evita que la intensa luz del láser incida
directamente sobre él.
Separación de célulasLa luz que llega al
detector se convierte en un
impulso de tensión
La magnitud del impulso es proporcional al tamaño de la célula.
Recogida de datos de difracción a bajo ángulo
Separación de células
Recogida de datos de difracción a bajo ángulo
La magnitud del impulso es proporcional al tamaño de la célula.
Separación de células
Histograma de la difracción a bajo ángulo
El histograma indica el número de células
que presenta la propiedad física
seleccionada o que expresa el marcador molecular de interés
Separación de células
Umbral de detección de tamaños
Si no se aplica un umbral, la señal mayoritaria
corresponde a residuos celulares, bacterias o
células pequeñas
Aplicado un umbral, sólo se detectan las señales que superan un valor determinado
Separación de células
La difracción lateral (o difracción de ángulo elevado) es la luz difractada
hacia los lados.
Difracción a ángulos elevados
La difracción lateral es provocada por los gránulos y depende de la complejidad
interna de la célula.
Separación de células
Detección de la difracción a ángulos elevados
La difracción lateral se mide en un detector colocado perpendicularmente (a 90º) a la
trayectoria del láser .
Separación de células
Histograma de la difracción a ángulo elevado
Separación de célulasLa difracción frontal
(en función del tamaño) parece indicar
que sólo hay una población de células.
La difracción lateral (en función de la
complejidad) indica que hay tres tipos de
células.
Resultados combinados de la difracción
Separación de células
Análisis bidimensional de la difracción
Este histograma refleja dos
parámetros. En el eje X se representa la difracción a bajo ángulo y en el eje Y
la difracción a ángulos elevados.
El número de células es
proporcional a la densidad de
puntos.
Separación de células
Análisis multiparamétrico de la difracción
Separación de células
Otro ejemplo
Separación de células
El fenómeno de la fluorescencia
Separación de células
Marcaje de células con anticuerpos fluorescentes
Emission light
Separación de células
Detección de la fluorescencia
La fluorescencia se mide mediante
detectores colocados perpendicularmente
(a 90º) a la trayectoria del láser
Mediante un sistema de filtros y espejos se dirige la señal de fluorescencia hasta
los detectores (se pueden medir 3 ó 4 señales distintas en un mismo experimento)
Separación de célulasCuando la célula marcada
atraviesa el láser, se genera una señal de fluorescencia que llega al detector y se convierte en un pulso de tensión proporcional a
la magnitud de la señal.
Experimento con fluorescencia (1 color)
Separación de células
Histograma de la fluorescencia (1 color)
Separación de células
Experimento con fluorescencia (2 colores)
Separación de células
Longitudes de onda de excitación y emisión
La excitación de los dos fluoróforos se
lleva a cabo con láser de una longitud de
onda de 480 nm
Cada fluoróforo emite fluorescencia con
una longitud de onda distinta: Alexa emite a
520 nm y la Ficoeritrina emite a
580 nm
Separación de células
Diversas poblaciones de células
Separación de células
FACS (Fluorescence-activated cell sorter)
Separación de células
Clasificación de las células
La gota que contiene una célula se
aproxima al punto de interrogación
La gota se carga según el tipo de fluorescencia que tenga la célula. La carga
(positiva, negativa o nula) determina a qué tubo se
dirige la célula.
Separación de células
Clasificación de células del sistema inmunitario
Separación de células
Clasificación de células activada por fluorescencia (FACS)
Separación de células1.- Cada célula es analizada por el láser
2.- La boquilla vibradora crea gotas al final del tubo. En cada gota hay una sola célula.
3.- A cada gota se le asigna un tipo de carga, en función de la fluorescencia de la célula que contiene.
4.- Las placas deflectoras atraen o repelen a las células, que son recogidas en distintos tubos según su carga (positiva o negativa, mayor o menor).
5.- Se analizan las células recogidas para comprobar que la selección ha sido correcta.
6.- Las células recogidas se pueden cultivar para obtener un mayor número de ellas.
Las etapas de la FACS