Post on 30-Sep-2015
Diapositiva 1
Instituto Politcnico NacionalUnidad Profesional Interdisciplinaria de BiotecnologaBiotecnologa de la Respuesta Inmune 5BV1 Profesor:Cesar Agustn Jimnez Sierra
Espinosa Pacheco CamiloMorales Martnez Francisco JavierPrez Mora Wendy Aracely.Velo Silvestre Jazmn Elizabeth
Pruebas Inmunolgicas
ENZIMOINMUNOANLISIS (ELISA de Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
Pruebas Inmunolgicas
La serologa es la rama de la inmunologa que estudia las interacciones antgeno-anticuerpo para su aplicacin en el diagnostico clnico.
Hay seis tipos fundamentales de pruebas serolgicas:
Reaccin de precipitacin
Aglutinacin
Fijacin del complemento
Inmunofluorescencia
Radioinmunoensayo
Enzimoinmunoanlisis (ELISA).
ENZIMOINMUNOANLISIS (Prueba De ELISA)
Fue descrito en 1971 por los investigadores suecos Eva Engvall y Peter Perlman, y en la actualidad se designan con este nombre a todos los inmunoensayos enzimticos en fase heterognea.
Este ensayo se basa en el uso de antgenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunolgica como enzimtica pudiendo ser revelada mediante la adicin de un substrato especfico que, en contacto con la enzima, producir un color observable a simple vista y cuantificable por un lector de densidad ptica.
Componentes de una prueba ELISA
Muestra
Fase slida o soporte: Posos o placas en donde se realizan las pruebas estos pueden ser de diferentes materiales; nitrocelulosa, polivinilo, poliestireno, ltex, nylon, celulosa y sefarosa.
Antgeno o Anticuerpo (policlonales o monoclonales)
-Anticuerpos policlonales: heterogneosReconocen eptopos diferentes del AgProducidos por numerosos clones de Linfocitos B
-Anticuerpos Monoclonales:HomogneosEspecificidad nicaProducidos por un nico clon de Linfocitos B
Conjugado-Enzima: Algunas de las caractersticas de deben reunir son: Actividad especifica Pureza Estabilidad Solubilidad Fcil medicin y deteccin No se reduce la actividad por la conjugacin Bajo costo Estables en amplio intervalo de condiciones del ensayo. Con grupos funcionales adecuados para su unin a Anticuerpos o Antgenos.
Algunas de las enzimas que se utilizan son:PeroxidasaFosfatasa alcalina-galactosidasaPenicilinasaUreasaGlucosa oxidasa
Bloqueo: Protena ajena al sistema que se esta manejando el cual recubre los espacios huecos que no llena el Antgeno; Estos se utilizan para que los Anticuerpos no se unan de forma inespecfica a la fase solida.CasenaCasena/Tween20Tween 20GelatinaBSA
Sustrato:Solubles en aguaFcil de manipularNo txicosNo mutgenicosBajo costo
La tcnica de ELISA se caracteriza por presentar alta sensibilidad, especificidad, rapidez y economa. Brinda la posibilidad de analizar un gran nmero de muestras de manera sencilla , rpida y econmica, sin mayor infraestructura.
Existen diferentes modalidades de ELISA y el mtodo competitivo, que permiten la determinacin de antgenos o anticuerpos en fluidos biolgicos.
Directo. Inmunohistoqumica
Indirecto
Sndwich
Competitivo
Inhibicin
Directo
Se utiliza especficamente para detectar un antgeno, porque busca a una sustancia extraa.
En una prueba de ELISA directa la cual es considerada la ms simple, el antgeno se adsorbe en una placa de plstico, a continuacin un exceso de otra protena (generalmente albmina de suero bovino) se aade para bloquear todos los otros sitios de unin. Mientras que una enzima est ligada a un anticuerpo en una reaccin separada, el complejo enzima-anticuerpo se aplica para adsorber al antgeno.Posteriormente el exceso de complejo enzima-anticuerpo se lava, quedando enzima anticuerpo unido a antgeno. Mediante la adicin del sustrato de la enzima se detecta la enzima que ilustra la seal del antgeno.
100 l
Antgeno*
ConjugadoAb-E
Sustrato enzimtico
Bloqueador
Sistemas de Elisa
E.l.i.s.a
Nota: Los esquemas varan en el tamao verdadero de las estructuras mostradas.
Mtodo Directo de ELISA
* Principalmente se busca Ag problema
+ Color + [Ab-Ag]
Indirectos
Es utilizado para detectar los anticuerpos que el paciente ha creado contra el antgeno
Consta de las siguientes etapas:
Fijacin al soporte insoluble de antgenos especficos para los anticuerpos objeto de estudio. Lavado para eliminar los antgenos fijados deficientemente o no fijados.
Adicin del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarn especficamente con los antgenos fijados al soporte. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
Adicin de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los anticuerpos especficos aadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los antgenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea.
Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.
100 l
Antgeno
ConjugadoAb-E
Sustrato enzimtico
Bloqueador
E.l.i.s.a
Nota: Los esquemas varan en el tamao verdadero de las estructuras mostradas.
Mtodo Indirecto de ELISA
* Principalmente cuando se busca Ab problema
Anticuerpo*
+ Color + [Ab-Ag]
Sistemas de Elisa
Sndwich
Es una variable menos comn, pero es altamente eficiente en la deteccin de antgeno.
ELISA sndwich cuantifica antgenos entre dos capas de anticuerpos (anticuerpo de captura y de deteccin). El antgeno a medir debe contener al menos dos eptopos antignicos capaces de unirse al anticuerpo.
Se pueden utilizar tanto anticuerpos monoclonales como policlonales. Los antecuerpos monoclonales reconocen un eptopo nico que permite la deteccin y cuantificacin final de las pequeas diferencias en el antgeno, mientras que los policlonales a menudo son utilizados como anticuerpo de captura.
Una de las ventajas de este tipo de prueba ELISA es que la muestra no tiene que ser purificada antes de su anlisis sin afectar la sensibilidad del ensayo (de 2 a 5 veces mas sensible que ELISA directo o indirecto).
Esquema de procedimiento:
Placa recubierta con anticuerpo de captura.
Se aade la muestra y cualquier antgeno presente se une a la captura de anticuerpos.
Se aade anticuerpo de deteccin el cual se une al antgeno.
Se aade el anticuerpo secundario ligado a enzima y se une al anticuerpo de deteccin.
El sustrato es agregado , y es convertido a una forma detectable por la enzima.
E.l.i.s.a
Nota: Los esquemas varan en el tamao verdadero de las estructuras mostradas.
Mtodo del Sndwich de ELISA
+ Color + [Ab-Ag]
100 l
Antgeno*
ConjugadoAb-E
Sustrato enzimtico
Bloqueador
Anticuerpo de sensibilizacin
* Principalmente cuando se busca Ag problema
Sistemas de Elisa
Competitivo
Consta de las siguientes etapas:
1.- Fijacinalsoporteinsolubledeanticuerpos especficos del agente patgeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados.
2.- Adicin en concentracin conocida de una mezcla de antgenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior, marcados con una enzima y antgenos desconocidos objeto de estudio.
3.- Paralelamente, aadir nicamente antgenos del anticuerpo usado en el paso anterior, marcados con una enzima. Lavar para eliminar los antgenos que no hayan reaccionado.
4.- Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea.
5.- Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados.
Si las lecturas de ambas pruebas son anlogas, el antgeno a estudio no tiene nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte.
Si hay diferenciaen laslecturasde ambospocillos,el antgeno objeto de estudio, est relacionado serolgicamente con el anticuerpo empleado para tapizarel soporteyla diferencia dedensidad ptica, es proporcional a la concentracin del antgeno problema en la muestra.
100 l
Antgeno*problema
Sustrato enzimtico
Bloqueador
E.l.i.s.a
Nota: Los esquemas varan con el tamao verdadero de las estructuras mostradas.
Mtodo Competitivo de ELISA
* Principalmente cuando se busca Ag problema
ConjugadoAg-E
Ab estandar
+ Color + [Ag-E] = - [Ag de muestra]
Sistemas de Elisa
Ag estandar
Bloqueador
E.l.i.s.a
Nota: Los esquemas varan en el tamao verdadero de las estructuras mostradas.
Mtodo de Inhibicin de ELISA
Ag problema* de la muestra
MuestraProblema
(+)
(-)
(+)
100 l
Ab estandar
ConjugadoAb-E
(-)
+ Color + [Ab-Ag] = - [Ag de muestra]
Sustrato enzimtico
* Principalmente cuando se busca Ag problema
Sistemas de Elisa
Importancia
Son utilizadas en el diagnostico medico, industria de alimentos y el estudio y control del medio ambiente.
En estudios serolgicos, hematolgicos, endocrinolgicos, oncolgicos, en trasplantes, medicina forense y antropologa.
Con propsitos mdicos se han aplicado en la determinacin de hormonas y protenas plasmticas, antgenos tumorales, drogas, Ag y Ac de microorganismos (parsitos, hongos bacterias, virus).
Los resultados aportan elementos diagnsticos, informacin de una enfermedad y coadyuvan en la planificacin del tratamiento.
Aplicaciones
Prueba de embarazo
Diagnstico de hepatitis vricas
Infecciones por el virus del herpes simplex y virus de rubola
Infecciones por retrovirus
Patologa animal
Enfermedades producidas por parsitos
Babesias y tripanosomas
Toxocara canis
Toxoplasmosis
Triquinosis
Enfermedades producidas por Micoplasmas
Enfermedades producidas por bacterias
Mycobacterium tuberculosis
Brucelas
Enterotoxinas Vibrio cholerae
Estreptococos
Salmonelas
Enfermedades producidas por virus
Enfermedad de Aujeszky
Enfermedad de Newcstle
Fiebre aftosa
Leucemia felina
Peste porcina africana
Peste porcina clsica
Rinotraqueitis infecciosa
Rotavirus
Artritis vrica
Otras aplicaciones
Hormonas
Gonadotropina corinica
Progesterona
Testosterona
Hormonas tiroideas
Cuantificacin de inmunoglobulinas
IgG
IgE
IgA
Inmunopatologa
Anticuerpos anti-DNA
Factor reumatoide
Inmunocomplejos circulantes
Enfermedades producidas por virus
En frutales
PPV
CLSV
TRSV
En ctricos
CTV
En patata
PLRV
PVY
PVX
PVA
TRV
En cereales
En guisante
En lpulo
En soja
En ornamentales
En plantas hortcolas
Enfermedades producidas por bacterias
Enfermedades producidas por Micoplasmas
Enfermedades producidas por hongos
Patologa vegetal
Bibliografa
http://cnia.inta.gov.ar/helminto/pub%20triquinosis/ELISAtrichinella.pdf
http://www.elisa-antibody.com
Tortora et al; Introduccin a la Microbiologa; 9na edicin; Editorial Medica Panamericana; Argentina, 2007, Pp.:544
John L. Ingraham. Introduccin a la Microbiologa; Volumen 2. Editorial Reverte S.A. . Madrid, Espaa. Pp.:448, 449 y 457
Cibergrafa