Post on 13-Apr-2018
7/26/2019 Practica N01 Concentracin de Biomasa
1/15
UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE
INGENIERA AGROINDUSTRIAL
Determinacin de a !i"ma#a$ Rec%ent" micr"#c&ic"en c'mara de Ne%!a%er(
CURSO$ Biotecnologa de los productos Agroindustriales
AUTORES$ Duarte Soto, Erick Alexander.
ASESOR: Ing. Jess Alexander. Snche !onales.
CICLO: I"
GUADALUPE ) PER*
+,-.
7/26/2019 Practica N01 Concentracin de Biomasa
2/15
PRACTICA N/,-( DETERMINACION DE 0IOMASA$ RECUENTO
MICROSC1PICO EN C2MARA DE NEU0AUER(
I3 INTRODUCCI1N$
En la agroindustria # en sus aplicaciones es i$portante conocer el n$erode $icroorganis$os presentes en una $uestra. Este conoci$iento puedeser utiliado en estudio de cur%as de creci$iento, anlisis de ali$entos,preparaciones de in&culos para 'er$entaci&n, etc.(n par$etro cla%e en el $odelado # $onitoreo del 'unciona$iento deplantas de agroindustriales dedicadas a procesos de 'er$entaci&n,pani'icaci&n entre otros en donde se utilicen in&culo es la concentraci&n de)io$asa. Bio$asa es un t*r$ino general +ue se re'iere a los$icroorganis$os presentes en un siste$a. Existen $uchas $aneras de
$edir la concentraci&n de )io$asa, co$o por ee$plo $asa, %olu$en,extensi&n linear de 'ila$entos, dispersi&n de lu, conteo de c*lulas uorganelos. Existen di'erentes $*todos para cuanti'icar el n$ero de$icroorganis$os o peso -)io$asa de c*lulas $icro)ianas en un culti%o/los $*todos pueden ser directos e indirectos.Entre los directos se puede $encionar a la deter$inaci&n de peso seco # elrecuento de c*lulas en c$ara de 0eu)auer.1a deter$inaci&n de peso seco es un $*todo de cuanti'icaci&n $u#utiliado en culti%os de gran densidad, so)re todo para hongos # le%aduras.2o$o los culti%os se so$eten a %arios procesos -'iltraci&n, la%ado, secadose pueden causar p*rdidas i$portantes de )io$asa # errores en la
cuanti'icaci&n. El $*todo de cuenta directa en c$ara tiene la %entaa deser $u# rpido # econ&$ico, aun+ue no se pueden distinguir las c*lulas%ia)les # no %ia)les. Se puede calcular el n$ero de $icroorganis$os enuna $uestra a partir del %olu$en de la c$ara # de las diluciones de la$uestra +ue sean necesarias. Sin e$)argo, tiene el incon%eniente de +uela o)ser%aci&n # cuanti'icaci&n se di'icultan en c*lulas $u# pe+ue3as -4 5 67$ o en po)laciones de )aa densidad de)ido al pe+ue3o %olu$en de$uestra +ue se utilia -8.4 5 8.9 $$ -A4%ia5%ati6 +,,7.
Entre los indirectos pode$os $encionar a ;ur)idi$etra # 0e'elo$etra las
cuales nos per$iten o)tener aproxi$ada$ente la cantidad de )io$asa deuna $uestra.
II3 O0JETIVOS$
2o$prender el uso # lectura por c$ara de 0eu)auer. Deter$inar la concentraci&n de $icroorganis$os utiliando la c$ara de
0eu)auer en el $icroscopio. Deter$inar la des%iaci&n estndar, pro$edio # coe'iciente de %ariaci&n
de la $uestra a analiar.
7/26/2019 Practica N01 Concentracin de Biomasa
3/15
III3FUNDAMENTO TE1RICO$
(na suspensi&n celular se caracteria por presentar un n$ero departculas $icrosc&picas dispersas en un 'luido.
7/26/2019 Practica N01 Concentracin de Biomasa
4/15
Fi8%ra +(@anipulaci&n de la c$ara de 0eu)auer.
03 CONTEO EN CAMARA DE NUE0AUER
4. 2olocar el cu)reo)etos so)re el portao)etos de la c$ara e introducirentre a$)os la $uestra celular pre%ia$ente preparada. De)e e%itarse +uela $uestra re)alse, si esto sucede las c*lulas a contar ta$)i*n seperdern.
9. 1a %elocidad de llenado de la c$ara de)e ser ho$og*nea, e%itando as
una $ala distri)uci&n de las c*lulas en el preparado +ue traer apareadoerrores en el recuento.
. 1a $uestra no de)e secarse, por lo tanto es reco$enda)le guardar lac$ara de 0eu)auer cargada dentro de una c$ara h$eda para +uesedi$enten las c*lulas.
. 1uego se coloca la c$ara en un $icroscopio &ptico # se procede alconteo, eligiendo para ello los cuadrados apropiados.
6. Se elegir un criterio para de'inir +u* c*lulas se cuentan # cules no,
cuando las $is$as +uedan so)re uno de los )ordes del cuadrado.
7/26/2019 Practica N01 Concentracin de Biomasa
5/15
. (na %e contadas las c*lulas se calcula la concentraci&n en la $uestraoriginal, considerando: la diluci&n de la $uestra hecha para el se$)rado, lacantidad de cuadrados considerados, el n$ero de c*lulas contadas # el%olu$en de $uestra de)ao de cada cuadrado.
V3 MATERIALES 9 METODOLOGIA
A3 MATERIALES
=ipetas. -48 $l., 4 $l.
1a$ina cu)re o)eto.
;u)os de ensa#os. -2apacidad $a#o a 48 $l.
!radilla.
Agua de ca3o. 1e%adura -Saccharo$#ces cere%isiae.
03 E:UIPOS
@icroscopio.
2$ara de 0eu)auer.
C3 METODOLOGIA
Se prepararon las soluciones a distintas concentraciones de
le%adura con agua. De la soluci&n se to$& 48 $l # se colocaron en un tu)o de ensa#o el
cual se lla$& $uestra original. Se to$aron tu)os de ensa#os # se
llenaron con agua a C $l. De la $uestra original se pipeteo 4 $ililitro # se le adiciono al tu)o de
ensa#o con C $ililitros de agua, as se realiaron posterior$ente
para o)tener diluciones de 48?4 ,48?9 #48?. 2on una pipeta se to$& una deter$inada cantidad de la $uestra 48?
9 # se coloc& en el )orde del cu)reo)etos de $anera +ue el l+uido
entre por capilaridad sin +ue se 'or$en )ur)uas en la c$ara. Se 1le%& la c$ara al $icroscopio # con el o)eti%o 48x se locali&
en el ca$po %isual el cuadrante central, en'ocando de tal 'or$a +ue
se o)ser%en ntida$ente los cuadrantes # luego se pas& al o)eti%o
8x.
7/26/2019 Practica N01 Concentracin de Biomasa
6/15
2ontar las c*lulas presentes en los cuadros elegidos -general$ente
se cuentan en los cuadrados de los cuatro ngulos # el centro, o en
'or$a diagonal e$peando por el pri$ero de la parte superior
i+uierda. ;a$)i*n se de)en contar las le%aduras +ue estn
u)icadas tocando la pri$era de las tres lneas +ue se encuentran
circundando el cuadro, las +ue se encuentran en la parte superior #
la derecha del cuadrado.
VI3 RESULTADOS 9 DISCUSIONES
CUADRO DE RESULTADOS$
SUSPENSIONES DELEVADURAS N;
Ciacin Pr"medi
"
C"e?icientede
@8 de a>ad%ra=mL de a8%a E#t'ndar Varia!iidad
49.6 g de le%adura 968 $l
7/26/2019 Practica N01 Concentracin de Biomasa
7/15
Ta!a -( 0$ero de c*lulas de le%aduras conta)iliadas en la soluci&n de 49.6g de le%adura 968 $l
7/26/2019 Practica N01 Concentracin de Biomasa
8/15
Ta!a ( 0$ero de c*lulas de le%aduras conta)iliadas en la soluci&n de 98 gde le%adura 968 $l ad%ra# = mL$
N deCelulas /mL= 130.4 cel
0.2mm0.2mm0.1mm
N deCelulas /mL= 130.4 cel
4 x103mm
3
N deCelulas /mL=32600 cel
mm3
N deCelulas
mL =
32600cel
mm3 x
1000mm3
mL
N deCelulas
mL =3.3 x10
7 cel
mL
CUADRICULAS@7 B 7
CUADRADOS @ B - - -
- 4C 4 46 9 96
9 4 4 99 9. 4G 4C 9 9 9-- 99 99 46 9 94-7 98 9 9 9G 9G-. 98 4 98 9 8
SUMA 499 446 44 4C 46
TOTAL 98G.
7/26/2019 Practica N01 Concentracin de Biomasa
9/15
Ta!a ( 0$ero de c*lulas de le%aduras conta)iliadas en la soluci&n de 8 gde le%adura 988 $l ad%ra# = mL$
N deCelulas /mL= 40.8cel
0.2mm0.2mm0.1mm
N deCelulas /mL= 40.8cel
4 x103mm
3
N deCelulas /mL=10200 cel
mm3
N deCelulas
mL =
10200 cel
mm3 x
1000mm3
mL
7/26/2019 Practica N01 Concentracin de Biomasa
10/15
N deCelulas
mL =1.0 x10
7 cel
mL
Ta!a ( 0$ero de c*lulas de le%aduras conta)iliadas en la soluci&n de 96 gde le%adura 968 $l ad%ra# = mL$
N deCelulas /mL= 19.6cel
0.2mm0.2mm0.1mm
N deCelulas /mL= 19.6cel
4 x103mm
3
N deCelulas /mL=4900cel
mm
3
7/26/2019 Practica N01 Concentracin de Biomasa
11/15
N deCelulas
mL =
4900 cel
mm3 x
1000mm3
mL
NdeCelulas
mL =4.9x 10
6 cel
mL
Ta!a ( 0$ero de c*lulas de le%aduras conta)iliadas en la soluci&n de 468g de le%adura 4888 $l ad%ra# = mL$
N deCelulas /mL= 210.6cel
0.2mm0.2mm0.1mm
N deCelulas /mL= 210.6 cel
4 x10
3
mm
3
7/26/2019 Practica N01 Concentracin de Biomasa
12/15
N deCelulas /mL=52650 cel
mm3
N deCelulas
mL
=52650 cel
mm
3 x
1000mm3
mL
N deCelulas
mL =5.3x10
7 cel
mL
Ta!a --(2antidad de 1e%aduras por $1 de Agua en cada disoluci&n
En la ta)las 9, , , G. =ode$os o)ser%ar +ue los coe'icientes de %aria)ilidadson 48.CF, 4.CF,46.6F, 4C.9CF- se de)i& +uis a las 'allas +uepresent& el $icroscopio con el te$a de la lu, +ue al 'inal %a in'luenciar en elresultado 'inal., 4.F respecti%a$ente/ esto nos indica el grado de%aria)ilidad o dispersi&n +ue existe entre los datos. Segn N%He @-+si 2H
es $enor o igual +ue 98F se dice +ue el pro$edio es representati%o, o +ue losdatos son ho$og*neos # si el 2H es $a#or al 98F, el pro$edio no esrepresentati%o de los datos, o los $is$os no son ho$og*neos, es por ello +uea'ir$a$os +ue los datos son ho$og*neos # el $*todo de recuento en$icroscopio utiliando la c$ara de 0eu)auer es adecuado para ladeter$inaci&n de )io$as.
@M%H"6 +,,El conteo en la c$ara de 0eu)auer de)e e'ectuar en los 96cuadrantes de la c$ara, hasta o)tener un n$ero de 88 c*lulas con el 'in detener una con'iana del conteo del C8F.
Segn ern'nde @+,,+. Es i$portante deter$inar al $osto la concentraci&nde c*lulas para +ue luego se dosi'i+ue la cantidad espec'ica para alcanar una
SUSPENSIONES DE LEVADURASN; Cad%ra=mL de a8%a
49.6 g de le%adura 968 $l
7/26/2019 Practica N01 Concentracin de Biomasa
13/15
concentraci&n en el rango de -4,6 a 9,8 x 48cel$1 de $osto. =or lo +ueciertas cantidades halladas se han aproxi$ado al rango pero ta$)i*ndepender de la relaci&n de entre la cantidad de le%adura con la cantidad deagua.
Es i$portante contar en total en total 48 cuadrados, cinco en cada c$ara, esdecir de la c$ara de arri)a # la de a)ao @A4%ia5%ati6 +,,7sin e$)argo enla prctica realiada solo se contaron 6 cuadrados por lo +ue el porcentae deerror se incre$entar.
Segn Arnai6 et a @+,,,, los $*todos clsicos de deter$inaci&n de )io$asason $*todos directos +ue se )asan en el n$ero de c*lulas o en el pesocelular. 1os $*todos de enu$eraci&n celular, son $*todo de o)ser%aci&n,)asados en propiedades 'sicas o en la acti%idad )iol&gica. @ientras +ue los$*todos indirectos esti$an algn co$ponente celular o alguna acti%idad$eta)&lica espec'ica, estos no re+uieren de exa$en %isual de los organis$osni su incu)aci&n.
Segn Unam @-., en la t*cnica de conteo de c*lulas ha# +ue tener encuenta +ue en esta t*cnica uno de los 'actores +ue a'ecta la o)ser%aci&n de lasc*lulas de le%adura es la correcta diluci&n de la $uestra e$pleada se puededecir +ue si durante el conteo se o)ser%an aproxi$ada$ente C c*lulas la$uestra se encuentra $u# concentrada, $ientas +ue si se o)ser%an $enos de98 c*lulas, la $uestra se encuentra $u# diluida. En nuestro prctica la $uestranos arroaron %alores de un total de c*lulas son $a#ores a C, por lo +uepode$os decir +ue pro)a)le$ente se encuentra $u# diluida.
VII3 CONCLUSIONES$
Se co$prendi& el uso # lectura por c$ara de 0eu)auer. Se deter$in& la )io$asa presente en una soluci&n de le%adura #
expres& en unidades de c*lulas$l o)teni*ndose un rango de 4.89 #
6.9 x 482el$1 con un pro$edio de entre 4C. # 948. c*lulas por
cada cuadro de 8,9$$ x 8,9$$ x 8,4$$ # un coe'iciente de
%aria)ilidad de entre 44 # 4C F, en las 6 celdas al aar, por lo +ue nos
da$os cuenta +ue la $uestra de 6 celdas al aar es una $uestra
representati%a de la general. Se pudo deter$inar las c*lulas por $ililitro
gracias a la c$ara 0eu)auer. Se pudo co$prender # deter$inar el pro$edio de le%aduras contadas en
las 6 celdas al aar, por el $*todo de conteo directo, usando la c$ara
de 0eu)auer, +ue es un $*todo e'ica para el conteo de dichas
le%aduras. =or lo +ue la $uestra de las 6 al aar es representati%a.
7/26/2019 Practica N01 Concentracin de Biomasa
14/15
SUSPENSIONES DELEVADURAS N;
Ciacin Pr"medi
"
C"e?icientede
@8 de a>ad%ra=mL de a8%a E#t'ndar Varia!iidad
49.6 g de le%adura 968 $l
7/26/2019 Practica N01 Concentracin de Biomasa
15/15
IMAGEN 1: Observacin de
IMAGEN %: Observacin de