Bacterias anaerobiasIdentificaciónLiliana Fernández CanigiaLab. Domecq y LafageHospital Alemán

lfcanigia@labdl.com.ar

Carrera de especialistas- Universidad de San Luis- Agosto 2013

Cultivo de anaerobios: Limitaciones técnicas

Bacterias fastidiosasRequerimientos culturales

especiales◦Atmosfera (<1% O2)◦Nutrientes◦Tiempo de desarrollo◦Metabolismo (algunos inactivos)

Cultivo de anaerobios: Muestra

Características macroscópicas: aspecto, olor pútrido, fluorescencia, granos de “azufre”, etc

Observación microscópica: flora polimicrobiana, leucocitos, orienta terapia empírica, etc.

Diagnóstico microbiológico:Medios

Medios sólidos (placa) NO selectivos: (Agar base enriquecido Brucella, Columbia, Schaedler, etc)◦ Agar Base + Vit K (1 mg/ml) + Hemina (5

mg/ml) + sangre lacada al 5% (BHKA)Medios sólidos (placa) selectivos:

◦ BHKA + AKA (30 a 50 µg/ml)◦ BHKA + VAN (5 µg/ml)◦ Otros: BE, AYH, etc

Medios líquidos: Resguardo (“Backup”)◦ Caldo BHI, tioglicolato suplementado con

cisteína, Vit K y hemina:

Diagnóstico microbiológico:Cultivo

Utilizar medios frescos, recientemente preparados o pre-reducidos

Procesar rápidamenteEvaluar qué microorganismos

buscamos para elegir el medio: suplementos específicos

Cultivo de anaerobios: Atmósfera

Métodos para generar atmósfera anaerobia: ◦ Mezcla de gases: Se utiliza una mezcla compuesta por

5-10% H2, 5-10% CO2 y 80 a 90% de N2, ◦ Generadores comerciales: Hay diferentes sistemas

comerciales: Con catalizador (Gas Pack, BBL; Anaerobic Gas generator,

Oxoid): BH4Na y ácido cítrico y una tableta de HCO3Na para generar H2 y CO2

Sin catalizador :  mezcla de reactivos que fijan el O2 y generan CO2. Activados con agua: Anaerocult, Merck; Britania. Activan al contacto con el aire: Anaerogen, Oxoid; Key Scientific, Mitsubishi; Genbox, Biomerieux

Cultivo de anaerobios: Atmósfera

Sistemas de incubación: a)     Jarras anaerobiasb)     Cámara anaerobiac)      Bolsas anaerobias

Cultivo de anaerobios: Incubación - Controles

Incubación:◦ al menos 48 hs a 35-37ºC, hasta 5 a 7 días. ◦ Atmósfera anaerobia (< 1% O2)

Control de anaerobiosis◦ Indicadores de Ox-Red: resarzurina, azul

de metileno ◦ Recuperación de anaerobios estrictos: F.

nucleatum, BGN pigmentados, etc.

Cultivo de anaerobios: Generadores comerciales

Bacterias anaerobiasIdentificación: Gram-negativos y positivos

Identificación de Anaerobios: Consideraciones clínicas y de diagnóstico

Infecciones polimicrobianas (> 5 mo)

Sensibilidad a los antimicrobianos relativamente predecible

Tratamiento basado en drenaje y debridamiento

Infecciones mediados por toxinasTiempo de respuesta del

laboratorio

Identificación de Anaerobios: Identificamos?

Infecciones severas por anaerobios (bacteriemias, osteomielitis, empiemas, abscesos hepáticos, de cabeza y cuello, actinomicosis, etc)

Reconocimiento del foco primarioSensibilidad no tan predecible y

asociada a especie (Bacteroides fragilis multirresistentes aislado de bacteriemia. Wareham et al. CID, 2005:40)

Asociación de especie a factores de virulencia (Porphyromonas gingivalis asociada a periodontitis, B. fragilis enterotoxigenico asociados a bacteriemia)

IDENTIFICACION DE BACTERIAS ANAEROBIAS: Identificamos?

Fines epidemiológicos Estudios de patogenicidad Descripción de nuevos patógenos Asociación a infecciones Resistencia antibiótica

Identificación de Anaerobios: Estrategia

Identificación presuntiva

Identificación definitiva: Métodos moleculares

Identificación de Anaerobios: Identificación presuntiva

Características macroscópicas

Características microscópicas

Pruebas básicas, rápidas especies (pruebas bioquímicas convencionales y enzimas preformadas)

Identificación de Anaerobios: Identificación definitiva

Mayor número de pruebas convencionales y/o enzimáticas

Métodos comercialesCromatografía Gas-líquidoMétodos moleculares: genómica y proteómica

Descripción macroscópica

Coloración de Gram

Prueba de toleranciaal oxígeno (CA)

Procedimiento a seguir con cada colonia:

CULTIVO DE ANAEROBIOS: Identificación

CULTIVO DE ANAEROBIOS: ¿Qué es la prueba de tolerancia al Oxígeno? (Control aerobio)

Subcultivo en agar chocolate de la colonia en estudio

Incubación en atmósfera AEROBIA enriquecida en CO2 (lata con vela) a 37ºC, 24 a 72 hs.

Hacer por lo menos dos veces con cada colonia y al menos 3 con cocos gram-positivos y microcolonias en general.

Identificación de Anaerobios: Pruebas especialesDiscos de potencia especial: Vc 5 ug, Co

30 ug, Kana 1000 ug (bgn)Desarrollo en SPS (5%) y sensibilidad al

metronidazol (10µg) (cgp) (P. anaerobius)

Desarrollo en bilis con discos o pastillasProducción de Indol (spot) CAMP reversa (C. perfringens)Producción de lipasa y lecitinasa (bgn y

bgp esporulados)

1- Bacilos gram negativos: Discos potencia especial :Vc 5µg+ Cs 10µg + Ka 1000 µgIndolBilisNitratoEsculinaCatalasa

Gram

TablasEspecíficas

4- Cocos gram positivos:

Vc 5µg+ Cs 10µg SPS Metronidazol (5µ)

3- Cocos gram negativos:

Vc 5µg+ Cs 10µg NitratoFluorescencia (UV)

2- Bacilos gram positivos:No esporulados:

CatalasaNitratoIndol

Esporulados:GlucosaCAMP reversa GelatinaUreaLipasa LecitinasaIndol

IDENTIFICACION PRESUNTIVA

IDENTIFICACION DE BACTERIAS ANAEROBIAS Pruebas básicas

Caldo BHI con extracción

SIM u otros medios para anaerobios

Spot

Pastillas OxgallDesarrollo en

caldoDiscos

preparados

Indol Bilis

IDENTIFICACION DE BACTERIAS ANAEROBIAS Pruebas básicas

No requieren el desarrollo del microorganismo (no se incuban en anaerobiosis)

Son pruebas rápidasRequieren mucho inóculoPuede haber variabilidad entre métodos

Enzimas preformadas

IDENTIFICACION DE BACTERIAS ANAEROBIAS Pruebas básicas

Sistemas de identificación rápida◦Sustratos cromogénicos (Pastillas

DIATABS)◦Sistemas comerciales: API ZYM, RAPID

ID ANA II, Rapid ID32A, etc.◦Sustratos fluorogénicos: 4-metil-

umbeliferona derivados (SIGMA)

Enzimas preformadas

IDENTIFICACION DE BACTERIAS ANAEROBIASPruebas básicas

Desarrollo en Púrpura de bromo-cresol, verde timol u otro indicador(incubación en anaerobiosis)

Difícil de ver punto final: agregado de colorante posterior y/o lectura de pH

El microorganismo tiene que ser fuerte/moderado fermentador

El microorganismo debe desarrollar bien en el medio que se utiliza

Control de pureza Los azúcares son caros

Fermentación de azúcares

Identificación de Anaerobios: Patrones de discos de potencia especial

Microorganismo Vc Kn Co Bi SPS MTZGram-negativos R1 R V R

Bacteroides grupo fragilis y géneros relacionados

R R R R

Prevotella spp. R RS S/R S

Porphyromonas spp. S R R S

Fusobacterium spp.2 R S S S

Bacteroides grupo ureolyticus3 R S S S

Veillonella spp. R S S

Gram-positivos S4 V R

Cocos gram-positiivos S V R S RS,5 S

Clostridium spp. S SR R

1- Porphyromonas spp. son Van S. 2- Nitrato negativo, 3- incluye Campylobacter spp. 4- Algunas cepas de lactobacillus y la mayoría de Clostridium inocum R a vancomicina 5µg). 5- Peptostreptococcus anaerobius S. Adaptada de: Jousimies-Somer HR, et al. Anaerobic Baberiology Manual, 6th edition. 2002

1- Bacilos gram negativos: Discos potencia especial :Vc 5µg+ Cs 10µg + Ka 1000 µgDesarrollo en BilisIndolNitratoEsculinaCatalasa (15%)Enzimas preformadasUrea

Gram

TablasEspecíficas

IDENTIFICACION PRESUNTIVA

Bacilos gram-negativos: Discos de potencia especial

Bacteroides grupo fragilis y géneros relacionados: Parabacteroides, Alistipes, Odoribacter

CoVc

Kn Bi

Prevotella spp.PigmentadasNo pigmentadas

Taxo

nom

ía d

e la

s bac

teria

s an

aero

bias

Género (especie tipo)

Morfolog.

Sensible a Movilidad

Pigmento

Des. 20%bilis

Catalasa

Indol

Nitrato

Ferm. H.

carbono

Vc Kn Co

Bacteroides sensu stricto (B. fragilis)

corto R R R - - + - v - +

Alistipes (A. putredinis)

corto R R R - v v v v - +

Odoribacter (O. splanchnicus)

pleom. R R R - - v v + - v

Porphyromonas (P. asaccharolytica)

v S R R - + - v v - v

Parabacteroides (P. distasonis)

corto R R R - - + v - - +

Tannerella (T. forsythia)

pleom. R S S - - - v - - -

Prevotella (P. melaninogenica)

c-b R v v - v - - v - +

Fusobacterium (F. nucleatum)

v R S S - - v - v - v

Leptotrichia (L. buccalis)

v R S S - - - v - - +

Dialister (D. pneumosintes)

cocoide R S v - - - - - - -

Selenomonas (S. sputigena)

curvo R S v + - - - + + +

Sutterella (S. wadworthensis)

recto R S S - - v - v v -

Bilophila (B. wadsworthia)

recto R S S - - + + + + -

Desulfovibrio (D. desulfuricans)

curvo R S R + + v v v v -

Campylobacter(C. curvus)

curvo R S S + - v - - + -

Anaerobiospirillum (A. succiniproducens)

espiral, largo

R S v + - v - - - +

29

Bacteroides grupo fragilis: B. fragilisMorfología: cocobacilo gram-negativos, pueden ser

capsulados.Características culturales: Anaerobio aerotolerante, desarrolla en 15 a 20 hs en agar sangre sin suplementos. Identificación:

◦ Discos de potencia especial: ColistinR, KanaR, VanR .◦ Desarrolla en Bilis al 20%◦ Sacarolíticos

Otras características: Resistencia a -lactámicos y otros antianaeróbicos- Infecciones abdominales y bacteriemias

27/04/2023 L. Fernández Canigia 30

Bacteroides grupo fragilisB. fragilisB. thetaoiotaomicronB. vulgatusB. nordiiB. salyersiae

Parabacteroides: P. goldsteinii – P distasonis – P. merdae , P. gordonii, P. johnsonii.Int J Syst Evol Microbiol (2006)

Könönen E., Wade W., Citron D. en Manual of Clinical Microbiology 10 ed. Versalovic, Carrol, Funke, Jorensen J, Landry M., Warnock D. 2011

B. caccaeB. uniformisB. ovatusY … total 23

ESPECIES!

Bacteroides fragilis

B. thetaiotaomicron

Porphyromonas spp.Co

VcKn

Bi

asacarolíticas

Bacilos gram-negativos: Discos de potencia especial

Otros Bacilos gram-negativos (Bilis v)

Fusobacterium spp. (Bilis v)

CoVc

KnBi

Variable

Bilis S

nucleatum

Bacilos gram-negativos: Discos de potencia especial

Otros BGN Anaerobios (asacarolíticos) Campylobacter spp. /Bacteroides ureolyticus

Identificación rápida de Bacteroides grupo fragilis (VcR, KR, CoR, BiR)

Microorganismo Catalasa Indol Esculina -fuco l-arabinosa

B. fragilis + - + + -B. caccae -+ - + + +P. distasonisa + - + - +-

P. merdaea - - + - -B. vulgatus -+ - + + +B. thetaiotaomicronb + + + + +a- P. distasonis es -glucuronidasa negativa y catalasa positiva, P. merdae es -glucuronidasa positiva y catalasa negativa. b- otras especies productoras de indol son B. grupo fragilis : ej B. ovatus y B. uniformis y también Odoribacter splanchnicus que es asacarrolítico

Adaptada de: Jousimies-Somer HR, et al. Anaerobic Baberiology Manual, 6th edition. 2002-Könönen E., Wade W., Citron D. en Manual of Clinical Microbiology 10 ed. Versalovic, Carrol, Funke, Jorensen J, Landry M., Warnock D. 2011

Identificación rápida de Prevotella spp. NO pigmentadas (VcR, KR, CoR/S, BiS)

Microorganismo In Esculina -NAG -fuco -xyl Colistin

P buccae - + - - + SP. oris - + + + + RP. heparinolyticaa + + + + + R/SP. zoogleoformansa - + + + + R/SP. dentalisb - + + - V R/SP. grupo oralisd - + + + - R/SP. enoecac - V + + - RP. biviac - - + + - RP. disiens - - - - - R/S

a- Colonias se adhieren al agar, forma una masa viscosa en caldo. b- Prevotella dentalis forma colonias como gotas, c- P. enoeca es esculina variable y se aisla de cavidad oral, P. bivia es negativa, y ubicua (especialmente tracto genital), d- P. oralis, P. buccalis, P. veroralis y P. oulorum.

Adaptada de: Jousimies-Somer HR, et al. Anaerobic Baberiology Manual, 6th edition. 2002

Identificación rápida de Fusobacterium spp. (VcR, KS, CoS, BiV – Nitrato NG)

Microorganismo In Lip Esculina Oxgall ONPG Gram

F. nucleatum + - - - - Extremos fusiformes

F. necrophorum + + - - - Pleomórficos

F. varium + -+ - + - Bac.regulares

F. mortiferum - - -+ + + Pleomórficos, formas

redondeadas

Adaptada de: Jousimies-Somer HR, et al. Anaerobic Baberiology Manual, 6th edition. 2002

Identificación a nivel de grupo de microorganismos gram-positivos anaerobios

Microorganismo Vc Kn Co SPS Metro Esporo Lec/lip

Cocos gram-positivos S V R RS S - NC

Peptostreptococcus anaerobius S R R S S - NC

Clostridium spp S SR R NC + + V

Bacilos gram-positivos no esporulados

S ND R NC V - NC

Vc: vancomicina 5µg, Kn: kanamicina 1000 µg, Co: colistin 10 µg, Metro: metronidazol 10µg), Esporo: test de esporulación, Lec/lip: lecitinasa/lipasa, NC: no corresponde, ND: no determinado

Gram

TablasEspecíficas

4- Cocos gram positivos:SPS Metronidazol (5 µg)GlucosaLactosaADHPYRUREAFAL

IDENTIFICACION PRESUNTIVA

IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA GÉNEROV5µ

Co10µ

SPS5%

MTZ10µ O2

COCOS G (+) S R RS S S

GRAM POSITIVOS

Peptostreptococcus anaerobius (S) Parvimonas micra Peptococcus niger Finegoldia magna

Anaerococcus spp.Peptoniphilus spp.Gallicola spp.Murdochiella spp.

SPS = S

P. anaerobius

Gentileza Mirta Litterio, H. Garrahan

Gram

TablasEspecíficas

2- Bacilos gram positivos:

No esporulados: CatalasaNitratoIndol

Esporulados:Glucosa CAMP reversa Gelatina UreaLipasa LecitinasaIndol Enzimas

IDENTIFICACION PRESUNTIVA

Clostridium septicum

Clostridium perfringens

Bacilos gram-positivos esporulados (esporos rara vez se observan en materiales clínicos).

Sacarolítico y proteolítico. Inmóvil

Exotoxinas: colagenasas, hialuronidasas

Toxina (fosfolipasa C o lecitinasa): Dermonecrótica y hemolítica

L. Fernández Canigia27/04/2023

Streptococcus agalactiae

Clostridium perfringens

CAMP reversa (E:95%)

Lecitinasa Lipasa

Bacilos gram-positivos no esporulados

No esporulados◦ Actinomyces ◦ Propionibacterium◦ Eubacterium ◦ Bifidobacterium◦ Lactobacillus◦ Mobiluncus

Actinomyces israelii

Identificación en microbiología

Fenotipo Genotipo Patrón de proteínas

5495

.054

17.9

4470

.0

6264

.1

1083

5.4

7274

.5

7122

.5

4736

.2

9589

.7

7828

.2

8021

.2

8847

.6

8369

.5

1025

9.6

1005

1.3

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

4x10

Inte

ns. [

a.u.

]

5000 6000 7000 8000 9000 10000 m/z

Tesis doctoral- Liliana Fernández Canigia 49

P. intermedia/nigrescens◦ Identificación por

electroforesis de enzimas multilocus (MDH y GDH (Shah y Garbia 1992)

◦ SDS page, PCR, oligonucleotidos

Pigmento marrón a negro Vc R, CoS, KnR, BiS- In+, Lip +

P. intermedia- P. nigrescens- P. pallens- P. aurantiaca -P. falsenii

Cultivo en agar Brucella suplementado con hemina vitamina K y sangre

Gingivitis de la embarazada Diferentes grados de

enfermedad periodontal Otras infecciones odontógenas Infecciones de cabeza y cuello,

pulmonares, tracto genital, abdominales, PyPB

50

Posición filogenética de especies del género Prevotella y su relación con Bacteroides y Porphyromonas. Árbol filogenético realizado con neighbor-joining utilizando secuencias de ARNr 16S. Shah et al. (2009)

P. falsenii (2009)P. aurantiaca (2010)

IDENTIFICACION: CONCLUSIONESBuena observación micro y macroscópicaSiempre hacer pruebas básicas de entrada

(patrones de sensibilidad de discos de antibióticos con potencia especial)

Utilizar pruebas no dependientes de cultivo como enzimas preformadas (inóculo alto)

Asegurarse buen desarrollo en pruebas de crecimiento.

La mayoría de las situaciones clínicas pueden resolverse con identificación fenotípica aunque sólo lleguemos a nivel de grupo o género.