Barragán Montes Selene Sánchez Suarez Nanci Guzmán Morales Rogelio

GRUPO 1802

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUSUPERIORES “ZARAGOZA”

OBTENCIÓN Y PURIFICACIÓN DE GAMMAGLOBULINA POR

PRECIPITACIÓN CON SULFATO DE AMONIO

GAMMAGLOBULINAS Las gammaglobulinas

son glicoproteínas formadas por cadenas cuya principal función es defender a nuestro organismo por la presencia de sustancias extrañas (antígenos).

Las proteínas plasmáticas, se clasifican en: Albúmina: Intervienen en el control del nivel

de agua en el plasma sanguíneo, y en el transporte de lípidos por la sangre.

Globulinas: Relacionadas fundamentalmente con mecanismos de defensa del organismo.

Fibrinógeno: Proteína esencial para que se realice la coagulación sanguínea

Proteinas plasmaticas 7 %

SEPARACIÓN DE GAMMAGLOBULINAS

Específicos

Técnicas inmunológicas

Inespecíficos

Precipitación

Diálisis

Cromatografía

Electroforesis

Transferencia Western

Inmunoabsorción

Inmunoprecipitación

Separación de gammaglobulinas –Método específicos

Método Fundamento Ventajas Desventajas

PRECIPITACIÓN-SALINA

-ALCOHOLICA

-ISOELÉCTRICA

La sal extrae agua de solvatación de la proteína.

Baja la cte dieléctrica, entonces baja la capacidad de solvatación del solvente.

Las proteínas con carga se repelen si se trabaja cerca del PI.

Alto rendimientoConcentrar diluciones diluidas.Purificar proteínas a gran escala.

Alta selectividad

Baja selectividad.Necesario recurrir a la centrifugación.

Control de muchas variables (T, pH, ).

Separación de gammaglobulinas -Métodos inespecíficos

Separación de gammaglobulinas -Métodos inespecíficos

MÉTODO Fundamento

Ventajas Desventajas

DIÁLISIS

Separar moléculas por sus diferencias en sus índices de difusión.

Eliminación de sales

Concentración de muestras

Eliminación de solutos de pequeño tamaño

No selectiva

Método Fundamento Ventajas Desventajas

CROMATOGRAFÍA

- De intercambio iónico

-Exclusión molecular

- De afinidad

- HPLC y FPLC

Adsorción reversible que existe entre una molécula con carga determinada.

Separación en función del tamaño y forma

Capacidad de unión a un determinando ligando.

Acelerar el movimiento de las moléculas con el uso de bombas de presión

Alta capacidadAlta resolución

Se pueden cambiar los buffers

Mayor separación de moléculas biológicas

Limitan el ensanchamiento por difusión de las bandas de proteínasAlta resoluciónAlta reproducibilidad

La corrida puede afectar la actividad de la proteína

Dilución de la muestra

Depende de la presión y de la temperatura

Muy costoso

Separación de gammaglobulinas –Métodos inespecíficos

Técnica basada en los movimientos de

moléculas cargadas en un campo

eléctrico, cada molécula se mueve hacia el electrodo de carga

opuesta (cátodo y ánodo), este movimiento es

denominado “electroforesis”

ELECTROFORESIS DEL SUERO HUMANO

Electroforesis del suero humano P R O T E I N A S

Características:

*Los polipéptidos tienen tanto cargas + como -; un grupo amino (+) y un grupo carboxilo

(-).*Son anfóteros.

*Puntos isoeléctricos en los cuales suelen ser menos solubles y presentan mayor tendencia a agregarse.

Electroforesis del suero humano

Tipos deelectroforesis

Sobresoporte

Papel

Acetato de celulosa

Gel AlmidónPoliacrilamidaAgar

Isoelectroenfoque

Capilaridad

Bidimensional

Electroforesis del suero humano

Electroforesis del suero humano

Inmunoelectroforesis

Electroforesis del suero humanoAPLICACIÓN DE LA ELECTROFORESIS

Fraccionamiento de las hemoglobinas

Diferenciación de la hemoglobina fetal

Diagnóstico de talasemias, anemias falciformes, etc

Proteínas séricasProteínas urinariasLipoproteínasÁcidos nucleicosEnzimasInmunoelectrofores

isEtc.

FENÓMENO DE “SALTING OUT”

La precipitación de la globulina gamma por este método se debe al fenómeno de "salting out", el cuál consiste en que

las moléculas de agua que solvatan a la molécula de anticuerpo son desplazadas por los iones sulfato y amonio,

que además neutralizan los grupos cargados de la proteína, la cual llega a su punto isoeléctrico y precipita.

Fraccionación mediante “Salting Out”

Solución Original

(Homogéneo)

Se precipita de forma selectiva a la proteína roja y se transfiere el sobrenadante a un nuevo tubo en el cual aumento lo [Sal] para dejar en el sobrenadante la proteína deseada.

Separo el sobrenadante

en un tubo nuevo y llevo

a cabo el análisis que

deseo.

Técnica de pp. con (NH4)2SO4

Variables a controlar

pH

Temperatura

Ventajas

↑solubilidad en agua, fuerzas iónicas muy elevadasSolubilización salina a fuerza iónica, es menor que CaCl2, KCl, NaClPp. mayor que con cloruros.Solubilización en un amplio rango de [iónicas], proporciona límites mayores para pp. Comparando con las otras

Desventajas

Iones amonio interfieren en el análisis directo del nitrógeno , dilizarNo buen amortiguador, difícil de controlar pH por debajo de 8.0Concentración depende mucho de la temperatura.Pureza, evitar contaminantes de metales, iones pueden unirse a proteínas y catalizar reacciones de oxidación

Metodología

5min. – 5000rpm

realizar una pp. al 45% de saturación con (NH4)2SO4

realizar una segunda pp. al 33% con (NH4)2SO4

10min. – 2500rpm

3.5mL

V. mínimo

10 minutos

Corroborar haciendo pruebas con BaCl2. No debe aparecer algún pp.

UTILIDAD DE LAS PREPARACIONES DE GAMMAGLOBULINA

Para estandarizar el método de Folin-Ciocalteau utilizado en la titulación cuantitativa de anticuerpos.

Las preparaciones de la gammaglobulina se usan mucho para preparar antisueros que se usa para la prueba de Coombs y para la determinación inmunoquímica de gammaglobulina.

En pruebas de proteínas raras, en suero de pacientes con artritis reumatoide.

También tiene amplia aplicación terapéutica (antitoxinas: tetánica y diftérica o simplemente gammaglobulina).

Bhaga V. Bioquímica. 2a ed. México, D.F.: Editorial Interamericana;1984.

Matthew J., Lynch. Métodos de laboratorio. 2ª ed. México, D.F.: Editorial Interamericana; 1985.

Laguna J. Bioquímica. 3ª ed. México, D.F.: Editorial La Prensa Médica Mexicana;1979

Jeremy M., Tymoczko J., Lubert S. Inmunoquímica 5ª ed. Barcelona, España: Editorial Reverté; 2003.

Mc Gilvery R. Bioquímica, Aplicaciones Clínicas. 3ª ed. México, D.F.: Editorial Interamericana; 1986.

Murray R., Granner D., Mayes P., Harper R. Bioquímica ilustrada. 16 ed. México, D.F.: Editorial El Manual Moderno; 2003.

Referencias Bibliográficas