Gama Glo
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Barragán Montes Selene Sánchez Suarez Nanci Guzmán Morales Rogelio
GRUPO 1802
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
FACULTAD DE ESTUSUPERIORES “ZARAGOZA”
OBTENCIÓN Y PURIFICACIÓN DE GAMMAGLOBULINA POR
PRECIPITACIÓN CON SULFATO DE AMONIO
GAMMAGLOBULINAS Las gammaglobulinas
son glicoproteínas formadas por cadenas cuya principal función es defender a nuestro organismo por la presencia de sustancias extrañas (antígenos).
Las proteínas plasmáticas, se clasifican en: Albúmina: Intervienen en el control del nivel
de agua en el plasma sanguíneo, y en el transporte de lípidos por la sangre.
Globulinas: Relacionadas fundamentalmente con mecanismos de defensa del organismo.
Fibrinógeno: Proteína esencial para que se realice la coagulación sanguínea
Proteinas plasmaticas 7 %
SEPARACIÓN DE GAMMAGLOBULINAS
Específicos
Técnicas inmunológicas
Inespecíficos
Precipitación
Diálisis
Cromatografía
Electroforesis
Transferencia Western
Inmunoabsorción
Inmunoprecipitación
Separación de gammaglobulinas –Método específicos
Método Fundamento Ventajas Desventajas
PRECIPITACIÓN-SALINA
-ALCOHOLICA
-ISOELÉCTRICA
La sal extrae agua de solvatación de la proteína.
Baja la cte dieléctrica, entonces baja la capacidad de solvatación del solvente.
Las proteínas con carga se repelen si se trabaja cerca del PI.
Alto rendimientoConcentrar diluciones diluidas.Purificar proteínas a gran escala.
Alta selectividad
Baja selectividad.Necesario recurrir a la centrifugación.
Control de muchas variables (T, pH, ).
Separación de gammaglobulinas -Métodos inespecíficos
Separación de gammaglobulinas -Métodos inespecíficos
MÉTODO Fundamento
Ventajas Desventajas
DIÁLISIS
Separar moléculas por sus diferencias en sus índices de difusión.
Eliminación de sales
Concentración de muestras
Eliminación de solutos de pequeño tamaño
No selectiva
Método Fundamento Ventajas Desventajas
CROMATOGRAFÍA
- De intercambio iónico
-Exclusión molecular
- De afinidad
- HPLC y FPLC
Adsorción reversible que existe entre una molécula con carga determinada.
Separación en función del tamaño y forma
Capacidad de unión a un determinando ligando.
Acelerar el movimiento de las moléculas con el uso de bombas de presión
Alta capacidadAlta resolución
Se pueden cambiar los buffers
Mayor separación de moléculas biológicas
Limitan el ensanchamiento por difusión de las bandas de proteínasAlta resoluciónAlta reproducibilidad
La corrida puede afectar la actividad de la proteína
Dilución de la muestra
Depende de la presión y de la temperatura
Muy costoso
Separación de gammaglobulinas –Métodos inespecíficos
Técnica basada en los movimientos de
moléculas cargadas en un campo
eléctrico, cada molécula se mueve hacia el electrodo de carga
opuesta (cátodo y ánodo), este movimiento es
denominado “electroforesis”
ELECTROFORESIS DEL SUERO HUMANO
Electroforesis del suero humano P R O T E I N A S
Características:
*Los polipéptidos tienen tanto cargas + como -; un grupo amino (+) y un grupo carboxilo
(-).*Son anfóteros.
*Puntos isoeléctricos en los cuales suelen ser menos solubles y presentan mayor tendencia a agregarse.
Electroforesis del suero humano
Tipos deelectroforesis
Sobresoporte
Papel
Acetato de celulosa
Gel AlmidónPoliacrilamidaAgar
Isoelectroenfoque
Capilaridad
Bidimensional
Electroforesis del suero humano
Electroforesis del suero humano
Inmunoelectroforesis
Electroforesis del suero humanoAPLICACIÓN DE LA ELECTROFORESIS
Fraccionamiento de las hemoglobinas
Diferenciación de la hemoglobina fetal
Diagnóstico de talasemias, anemias falciformes, etc
Proteínas séricasProteínas urinariasLipoproteínasÁcidos nucleicosEnzimasInmunoelectrofores
isEtc.
FENÓMENO DE “SALTING OUT”
La precipitación de la globulina gamma por este método se debe al fenómeno de "salting out", el cuál consiste en que
las moléculas de agua que solvatan a la molécula de anticuerpo son desplazadas por los iones sulfato y amonio,
que además neutralizan los grupos cargados de la proteína, la cual llega a su punto isoeléctrico y precipita.
Fraccionación mediante “Salting Out”
Solución Original
(Homogéneo)
Se precipita de forma selectiva a la proteína roja y se transfiere el sobrenadante a un nuevo tubo en el cual aumento lo [Sal] para dejar en el sobrenadante la proteína deseada.
Separo el sobrenadante
en un tubo nuevo y llevo
a cabo el análisis que
deseo.
Técnica de pp. con (NH4)2SO4
Variables a controlar
pH
Temperatura
Ventajas
↑solubilidad en agua, fuerzas iónicas muy elevadasSolubilización salina a fuerza iónica, es menor que CaCl2, KCl, NaClPp. mayor que con cloruros.Solubilización en un amplio rango de [iónicas], proporciona límites mayores para pp. Comparando con las otras
Desventajas
Iones amonio interfieren en el análisis directo del nitrógeno , dilizarNo buen amortiguador, difícil de controlar pH por debajo de 8.0Concentración depende mucho de la temperatura.Pureza, evitar contaminantes de metales, iones pueden unirse a proteínas y catalizar reacciones de oxidación
Metodología
5min. – 5000rpm
realizar una pp. al 45% de saturación con (NH4)2SO4
realizar una segunda pp. al 33% con (NH4)2SO4
10min. – 2500rpm
3.5mL
V. mínimo
10 minutos
Corroborar haciendo pruebas con BaCl2. No debe aparecer algún pp.
UTILIDAD DE LAS PREPARACIONES DE GAMMAGLOBULINA
Para estandarizar el método de Folin-Ciocalteau utilizado en la titulación cuantitativa de anticuerpos.
Las preparaciones de la gammaglobulina se usan mucho para preparar antisueros que se usa para la prueba de Coombs y para la determinación inmunoquímica de gammaglobulina.
En pruebas de proteínas raras, en suero de pacientes con artritis reumatoide.
También tiene amplia aplicación terapéutica (antitoxinas: tetánica y diftérica o simplemente gammaglobulina).
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Referencias Bibliográficas