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CROMATOGRAFÍA DE GASES
Cristóbal Caicedo M.
Departamento de Química
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Definiciones:Definiciones:
En cromatografía de gases se hace pasar el analito en forma gaseosa a través de la columna, arrastrado por una fase móvil gaseosa, llamada el gas portador, la cual percola a través de la fase estacionaria.
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La muestra (el analito) puede ser un gas o un líquido, el cual debe ser:
volátil de bajo peso molecular, térmicamente estable
El analito
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La fase móvil denominada GAS PORTADOR o GAS ACARREADOR, es un gas inerte cuya finalidad es transportar las partículas de la muestra a través de la columna.
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• La fase estacionaria puede ser un sólido (CGS) y la separación se fundamenta en la ADSORCIÓN sobre la superficie sólida activa.
• Adsorbentes tales como carbón vegetal, gel de sílice y tamices moleculares son las fases estacionarias en la CG.
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La fase estacionaria puede ser también un líquido de alto punto de ebullición (CGL), el cual se extiende en una fina película sobre un sólido inerte que rellena una columna, llamado soporte sólido o recubre la pared interna de una columna (otc). La base de la separación es la PARTICIÓN o DISTRIBUCIÓN de las partículas de la muestra dentro o fuera de esta película líquida.
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Sistema de introducción de muestras
Fuente de fase móvil
Columna Sistema de detección
Registrador
Pantallateclado
Sistemas de manejo de datos
Control de temperatura
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Principales componentes Gas de acarreo
Controladores de flujo
Inyectores
Columnas
Detectores
Sistema de datos
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ESQUEMA DE UN CROMATÓGRAFO DE GASES
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LA FASE MÓVIL
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LA FASE MÓVIL
La fase móvil viene en cilindros de gases a una presión aproximada de 2500 psi (150-160 atm.)
El propósito del gas acarreador, es transportar la muestra a través de la columna hasta el detector.
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Características del gas acarreador:
Inerte químicamente. Alta pureza: mayor del 99.9%
(Impurezas: aire y agua)Grado: 4.5
Seco Adecuado para el detector usado.
Se debe colocar un filtro de carbón activado y una trampa para humedad antes de la entrada del gas al instrumento
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Gases y Detector
TCD He o H2
FID He o N2
ECDN2 o Ar - Metano
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Productores de gases especiales para CG:
Aga-FANO, Aga Colombia, División Linde Gas del Grupo Linde.
Praxair (oxigenos de Colombia)
Cryogas (Grupo BOC)-(Grupo Linde)
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GASES ACARREADORES MÁS COMUNES
Gas Pm Conductividad térmica x 10 a 100ºC (g. Cal / s.cm.ºC)
Viscosidad x 106 a 100ºC (P)
Argón 39.95 5.087 270.2
CO2 44.01 5.06 197.2
Helio 4.00 39.85 234.1
Hidrógeno 2.016 49.94 104.6
Nitrógeno 28.01 7.18 212.0
Oxígeno 32.00 7.427 248.5
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Impurezas comunes en los gases (ppm)
GAS O2 H2 N2 CO2
Ar 5 5 200 *
He 5 5 100 *
H2 10 * 1500 100
N2 5 5 * *
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CONTROLADORES DEL FLUJO
Regulador de presión en el cilindro.
Regulador de presión o de flujo en el cromatógrafo.
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REGULADORES DE PRESIÓN El flujo en el cilindro se controla
mediante un regulador de presión de dos niveles, válvula de dos vías.2500 psi – 80 psi
Presión al cromatógrafo: 20 – 80 psi
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MEDIDICIÓN DEL FLUJO en el cromatógrafo:
Medidor de flujo de burbuja de jabón:
simplicidad bajo costo Independiente del tipo de gas
usado.
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Rotámetro.ventajas:muestra flujo continuo del gasDesventajas: depende del tipo de gasmas caro que el de jabón.
Controlador electrónico de presión del flujo.
Caudales (mL/min): 15 – 80 mL (C. Empac.) 0.25-8 ml/min(C.
Capilares)
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FLUJOS ÓPTIMOS DE GAS PORTADOR
COLUMNA
GAS PORTADOR. FLUJO mL/min
HELIO HIDRÓGENO
¼” D.E. 60-80 30-40
1/8” D.E. 30-40 15-20
PLOT o SCOT 2-8 1-4
WCOT 0.5-5 0.25-2.5
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SISTEMA DE INTRODUCCIÓN DE MUESTRAS
INYECTORES
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No hay sistema universal de introducción de muestras.
Las muestras se introducen al equipo de CG por medio de válvulas o jeringas que la colocan en un puerto de inyección o inyector.
Muestras: Gases Líquidos sólidos (material vaporizable o soluble). Muestras no vaporalizables, requieren
algún tipo de introducción por pirólisis.
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CARACTERÍSTICAS DE UN INYECTOR
1. Calentamiento2. Volumen pequeño3. Barrido total del área
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Funciones de un inyector:
1. Recibir la muestra,2. Vaporizarla inmediatamente, 3. Introducir la muestra vaporizada
a la cabeza de la columna como una banda estrecha.
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También es preciso acomodar diversos tamaños de muestra, desde de 1g para columnas de tubo abierto hasta gramos, para columnas a escala preparativa.
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Esquema de un inyector
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INYECCIÓN DE MUESTRAS GASEOSAS
Las muestras gaseosas pueden introducirse por:
Jeringas (volumen: 0.001-50 mL).
Válvulas (volumen o loop fijo: 1L-100mL).
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INYECCIÓN DE MUESTRAS LÍQUIDAS
Debido a la expansión de los líquidos cuando se vaporizan, se trabaja con tamaños de muestra mucho más pequeñas que en gases.
Jeringas (0.1 – 25L).
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Jeringa de inyección
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Válvulas de introducción de muestras
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MODOS DE INYECCIÓN
1. En la cámara de vaporización
2. Directamente en la columna (on column)
La mejor técnica de inyección depende del tipo de columna y del tipo de análisis: isotérmico o de temperatura programada.
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Inyección en la cámara de vaporización.
La vaporización inmediatamente después de la inyección asegura la reproducibilidad en los tiempos de retención y una buena resolución.
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Cámara de vaporizaciónEl vaporizador es un tubo de 2-4 pulg. de longitud y 0.020-0.030 mm de d.i. (liner)Ventajas:
Facilidad de cambiar el tubo para manejar diferentes diámetros de columnas.
Elimina todo contacto de la muestra con el metal del puerto de inyección o columna.
Facilidad de adaptar el inyector a un sistema on-column cuando se usan columnas de vidrio.
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Inyección directa en la columna (on-column)
La vaporización inmediata no es satisfactoria para algunas muestras:
Compuestos sensibles al calor. Muy diluídas y requieran gran
volumen de inyección. Compuestos o solutos con un amplio
intervalo de puntos de ebullición.
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INYECCIÓN DE MUESTRAS SÓLIDAS
Disolver en un disolvente apropiado y se trata como una muestra líquida a inyectar.
Requisitos del disolvente: No debe reaccionar con ningún
componente de interés en el sólido o en la columna.si los componentes han sido extraídos, el disolvente debe ser miscible con el sólido.
No debe co-eluir con ninguno de los componentes de interés.
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Sistemas automáticos de introducción de muestras
Automatic samplers para líquidos, sólidos y gases. Sistema de jeringa y de válvulas
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Muestreadores para gases Headspace1. Análisis de etanol y otros volátiles en
sangre.2. Análisis de monómeros residuales en
polímeros (cloruro de vinilo en PVC).3. Análisis de compuestos responsables
de los aromas.4. Trabajo forense.
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Headspace
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Sistema de inyección para c.c.
Tres formas de introducción de muestras son usadas en mas del 90% en las columnas capilares.
1. Split injection.2. Splitless injection o inyección
directa.3. “cool” on-column injection
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Split injection(Inyección con división de
flujo)
muestras: 0.001 – 0.5 μL
La relación de flujo varía: 10 a 1000:1.
flujo (venteo)relación de división
flujo (columna)
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Splitless injection (Inyección sin división de
flujo)
Análisis de trazas Programación de temperatura es
esencial debido a la reconcentración del vaporizado en la cabeza de la columna.
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On-column injection (inyección directa en la
columna)
Análisis de trazas La muestra se inyecta
directamente en la columna, sin la etapa de vaporización.
Es el método mas preciso y exacto de introducción de muestra.
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On-column injection
1. La inyección debe realizarse a una temperatura menor o igual a la de ebullición del solvente,
2. Inyección rápida,3. Volumen de 2 μL o menor.
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Sistema de inyección on column para columnas capilares de diámetro grande
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Desventajas On-column injection
1. Los componentes no volátiles de la muestra se depositan directamente en la columna.
2. La técnica no es automatizada.
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VOLÚMENES DE MUESTRA PARA DIFERENTES TIPOS DE COLUMNA
Tipo de ColumnaTamaño de Muestra
Gaseosa Líquida
Preparativa (2.5cm DE, 20% Líquido)
0.05 – 1L 0.02 – 1mL
Analítica Regular (0.6cm DE, 10% Líquido)
0.5 – 50mL 0.02 - 20L
Alta Eficiencia (0.3cm DE, 2% Líquido)
0.1 – 1mL 0.01 - 2L
Capilar (sin relleno) (0.15 cm DE, 5.0m)
0.1 - 10L 0.001 – 0.5L
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HORNOS Y COLUMNAS
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HORNO Y COLUMNAS El propósito primario del horno es
proporcionar a la columna una temperatura constante.
En la columna, es donde ocurre el proceso de separación. La columna es el corazón del proceso cromatográfico.
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El horno:
1. Intervalo de temperatura de operación grande (-50 a 400ºC y –5 o –10 a 400ºC).
2. La temperatura en el horno y en toda la columna debe ser uniforme. La diferencia de temperatura entre la más alta y la más baja debe ser mínima
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3. Libre de influencias de cambios de temperatura ambiental o de voltaje de línea eléctrica.
4. La temperatura no debe ser afectada por el calentamiento de inyector o detector.
5. De fácil acceso para instalar columnas y accesorios.
6. Permitir realizar separación a temperaturas programadas.
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TEMPERATURA
“El tiempo de retención se duplica por cada 30ºC, que disminuye la temperatura de la columna.”
Corrida Isotérmica Temperatura Programada.
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Operación isotérmica
1. En muestras desconocidas, los componentes de alto punto de ebullición no son detectados.
2. Los primeros picos son finos, muy cercanos y pobremente resueltos, mientras los últimos serán bajos, anchos y excesivamente resueltos.
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Temperatura Programada
1. En muestras desconocidas se puede obtener información de los puntos de ebullición e información cualitativa y cuantitativa. Además:
2. Es rápida,3. Se minimiza la transformación de
material inestable.4. Es requerida para algunas aplicaciones
con columnas capilares (on-column in)5. Es un excelente medio para limpiar la
columna.
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TEMPERATURA ISOTÉRMICA Y TEMPERATURA PROGRAMADAAspecto Isotérmica Temp.
programada
Intervalo de ebullición de la muestra
Limitado hasta 100ºC
80 – 400ºC
Inyección de la muestra
Debe ser rápida No necesita ser rápida
Fase estacionaria Amplia selección Selección restringida
Pureza del gas portador
No crítica Esencial la alta pureza
Hornos separados para columna y detector
Conveniente Esencial
Control de caudal Suficiente presión
constante
Se requiere regulador
diferencial de caudal
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COLUMNA CROMATOGRÁFICA
La columna cromatográfica contiene la fase estacionaria líquida o sólida, es el lugar donde se realiza el proceso de separación; la columna es el corazón de la Cromatografía.
En CG se usan dos tipos de columnas: las rellenas o empacadas y las capilares.
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Columnas empacadas o Columnas empacadas o rellenasrellenas
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MATERIALES DE LAS COLUMNAS
Acero Inoxidable Aluminio Cobre Plástico Vidrio Sílica fundida
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TAMAÑO DE LAS COLUMNAS
La longitud es variable: desde 1.5 m hasta 50 o mas metros.
Diámetro también es variable: desde 100 o 150 μm de d.i. en las columnas capilares, hasta 4” de d.e. en las empacadas.
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TAMAÑO DE LAS COLUMNAS
Las dimensiones de una columna empacada oscilan entre:
2 y 4.6 mm de diámetro interno (DI) y de 1/8 a 1/4 de pulgada de diámetro externo (DO).
Longitud entre 6 y 30 pies para las más comunes.
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TAMAÑO DE LAS COLUMNAS
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CLASIFICACIÓN DE LAS COLUMNAS CAPILARES
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FASE ESTACIONARIA LÍQUIDA
Propiedades:1. Baja volatilidad2. Estabilidad térmica3. Químicamente inerte4. Características de disolvente (k’ y
)
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Fases estacionarias para CG
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Fases estacionarias para CG
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Polidimetilsiloxano
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Polietilenglicol
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Fases estacionarias para CG
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Fases estacionarias para CG
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SISTEMA DE DETECCIÓN El detector cromatográfico es un
dispositivo que mide la concentración de cada uno de los componentes de la muestra y genera una señal eléctrica proporcional a dicha concentración.
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CARACTERÍSTICAS DE UN DETECTOR
1. PRIMARIAS. Sensibilidad: denota la cantidad de
señal generada para determinada concentración de una muestra.
Ruido: se refiere a la respuesta del detector de corta duración y al azar, determinada por las propiedades eléctricas, la temperatura, las impurezas o la sensibilidad al caudal.
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Respuesta: Universal: significa que el detector
genera una respuesta para todos los componentes de la muestra, exceptuando el gas portador.
Selectiva: significa que le detector solo responde a determinados tipos de compuestos; por ejemplo, responde a compuestos que contiene átomos de S y P o N.
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Recorrido lineal: es la región sobre la cual la señal del detector es directamente proporcional a la concentración de la muestra.
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2. SECUNDARIAS. Simplicidad Costo Disponibilidad Durabilidad
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DETECTORES MÁS COMUNES
Detector de conductividad térmica, TCD Detector de ionización de llama, FID Detector de captura de electrones, ECD Detector de nitrógeno y fósforo, NPD Detector fotométrico de llama, FPD Detector espectrométrico de masa,
MSD Detector infrarrojo, IRD
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NIVEL MÍNIMO DE DETECCIÓN
Es la cantidad mínima detectable de una sustancia que genera una señal (S) dos veces mayor que su nivel de ruido (N).S/N = 2NMD: g/s, g/mL, moles/s, moles/mL.
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TCD
Utilizado particularmente con Utilizado particularmente con columnas empacadas, detecta Hcolumnas empacadas, detecta H22O, O, CO, COCO, CO22 e H e H22. Mide la conductividad . Mide la conductividad térmica de un analito en un gas térmica de un analito en un gas acarreador.acarreador.
LLa velocidad de pérdida de calor de un a velocidad de pérdida de calor de un cuerpo caliente cuerpo caliente haciahacia un cuerpo más un cuerpo más frío es proporcional a la conductividad frío es proporcional a la conductividad térmica del gtérmica del gaas que separa estos s que separa estos cuerpos.cuerpos.
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TCD
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FID
Consiste de una llama de hidrógeno-aire y una placa colectora. El efluente de la columna pasa a través de la llama, que ioniza las moléculas orgánicas. Los iones se recogen en un electrodo de polarización negativa y producen una señal eléctrica. El FID es extremadamente sensible y es el detector más ampliamente utilizado, su desventaja es que destruye la muestra.
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FID
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ECD Utiliza un emisor beta radioactivo
(electrones) para ionizar parte del gas portador y para producir una corriente entre un par de electrodos. Cuando las moléculas orgánicas que contienen grupos funcionales electronegativos, tales como halógenos, fósforo y grupos nitro, pasan por el detector, capturan algunos de los electrones y reducen la corriente medida entre los electrodos.
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NIVEL MÍNIMO DE DETECCIÓN PARA LOS DETECTORES MÁS
COMUNESDetectores NMD Compuesto
TCD 5 x 10-10 g/mL Propano
FID 10-12 g(C)/s Propano
ECD 10-16 moles/mL Lindano
FPD10-10 g(S)/s Tiofeno
2 x 10-12 g(P)/s Tributilfosfato
NPD5 x 10-14 g(N)/s Azobenceno
5 x 10-15 g(P)/s tributilfosfato
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REGISTRO
La principal función de los aparatos de registro es reproducir gráficamente la salida del detector tan exactamente como sea posible para obtener un registro permanente de los resultados (cromatograma)
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APLICACIONES DE LA CG
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ANÁLISIS CUALITATIVO Y CUANTITATIVO POR
CROMATOGRAFÍA DE GASES
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“La Química Analítica es la ciencia de la producción e interpretación de señales”Erno Pugno.Señal = CROMATOGRAMA
Tres datos importantes del Cromatograma:
1. Tiempo de retención2. Tamaño del pico3. Forma del pico
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Análisis Cualitativo
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1. DATOS DE RETENCIÓN.
El análisis cualitativo por CG se refiere a la comparación de los datos de retención de una muestra problema con los de una muestra conocida.
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Tres aspectos relacionados con los tiempos de retención deben ser conocidos y entendidos:
1. Si los tiempos de retención de los componentes A y X son iguales bajo las mismas condiciones del análisis cromatográfico, esto no indica necesariamente, que el componente A sea X.
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2. Si el tiempo de retención del componente A no es igual al tiempo de retención del componente X, con toda seguridad se puede concluir que los componentes A y X son sustancias diferentes.
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3. Si en el cromatograma no aparece un pico discernible con el tiempo de retención del componente A, se puede concluir con toda certeza que el componente A NO está presente en la mezcla en la concentración detectable (el nivel mínimo de detección) para un sistema cromatográfico dado.
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Algunos factores pueden afectar el tiempo de retención de los componentes:
Control de la temperatura: un cambio en la temperatura de aprox. 30ºC cambia el tr por un factor de 2. Para mantener la repetibilidad en los tr debe mantenerse la temperatura de la columna en un intervalo de 0.3ºC.
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Flujo del gas acarreador: una variación en el flujo de un 1% afecta el tr en aprox. 1%.
Tamaño de la muestra: desplazamiento del tr por sobrecarga o saturación de la columna.
Tiempo de retención relativo: comparación de los tr relativos de un componente dividido por el tiempo de retención ajustado de un material de referencia, corridos en dos columnas diferentes.
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2. GRÁFICO DE log DE RETENCIÓN Vs NÚMERO DE
ÁTOMOS DE CARBONO.
Existe una diferencia lineal entre el logaritmo del tiempo de retención de los compuestos de una serie homóloga y el número de átomos de carbono presente en la molécula.
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Esta relación ha sido demostrada en series homólogas de: alcanos, olefinas, cetonas, alcoholes, acetatos, acetales, ésteres, sulfóxidos, nitroderivados, aminoalifáticos, piridina, hidrocarburos aromáticos, dialquil éteres, tioles, alquilnitratos, tetrahidrofurano sustituidos y furano.
Este método de identificación, es válido solo para miembros de una serie homóloga o una serie pseudohomóloga.
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log tr
400 600 800 1000
600
800
1000
1200
400
n- Alcanos
1,n- Olefinas
2,n- Cetonas
1,n- Alcoholes
Índice de Kovats
No. de carbonos4 6 8 10
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3. ÍNDICE DE KOVATS.
El índice de retención: Ayuda a confirmar la estructura de
las moléculas orgánicas. Utiliza una serie de alcanos
normales como referencia base y un compuesto problema como en el método de la retención relativa.
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En la identificación se utiliza el índice de retención:
ntNt
ntxtnIx
'log'log
'log'log100100
n y N es la parafina mas pequeña y más grande respectivamente y x es el analito.
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Los índices de retención para n- alcanos son definidos como 100 veces el número de átomos de carbono de la molécula para cada temperatura y para cada líquido. Ejemplo: Octano = 800, Decano= 1000.
En la práctica, el índice de retención es derivado de un gráfico del log t’r Vs 100 veces el número de átomos de carbono (Índice de Kovats).
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600500 700 800
log t'r
Índice de Kovats
IK= 78.0
5 6 7 8 No. de carbonos
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4. COLUMNAS MÚLTIPLES
El uso de dos o más columnas mejoran la probabilidad de identificar un componente desconocido si presenta el mismo tiempo de retención de un compuesto conocido. Sin embargo, estos datos no son pruebas concluyentes.
La confiabilidad de la identificación de la eficiencia y la polaridad de la columna y la polaridad de la columna usada (selectividad).
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5. RESPUESTA RELATIVA DEL DETECTOR.
Detectores Selectivos:La comparación de la respuesta relativa de dos o más detectores puede ayudar a la clasificación o identificación de un componente desconocido.Generalmente, el componente es cromatografiado sobre una columna y el efluente se divide y se hace pasar por dos o más detectores al mismo tiempo.
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Las clases de detectores comúnmente usados son:
FPD – ECD, FID – RADIOACTIVIDAD, FID – NPD.ECD: P, O, N y XFPD: P, SFID: compuestos orgánicos (CH).
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6. ACOPLAMIENTO GC Y OTRAS TÉCNICAS INSTRUMENTALES.
GC – MS Disminución del costo de los equipos. Incremento de la sensibilidad. Reducción del tiempo de barrido del
espectrofotómetro. Obtención del espectro de masa de un
pico y de porciones del pico. Comparación del espectro con el de un
estándar.
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GC – IR La segunda técnica instrumental
más usada es el espectro IR.
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Análisis Cuantitativo
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La cromatografía de gases tiene los siguientes atributos:
Fácil operación Técnica analítica simple Relativo bajo costo del instrumento Capacidad de analizar amplio
rango de tipos de muestra Proporciona una respuesta a
¿Cuánto hay?
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Para responder a la pregunta ¿Cuánto hay? a partir de la información suministrada en el cromatograma, la CG se sustenta en el principio de que el tamaño del pico cromatográfico es proporcional a la cantidad de sustancia.
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Los conceptos básicos que se usan en la determinación del tamaño (área) del pico son:
Medida de la altura del pico Medida del área del pico La relación entre estas dos
magnitudes y la cantidad de componente en la muestra.
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MEDIDA DEL ÁREA DE LOS PICOS
El tamaño (área) de los picos se pueden medir por:
Métodos manuales Integración automática
(integradores mecánicos ó eléctricos)
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Altura del pico Altura y ancho a la mitad de la
altura Triangulación Planimetría
MÉTODOS MANUALES
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1. Altura del Pico. La altura del pico es proporcional a
la cantidad de soluto o del componente que contribuye al pico. Si no hay ningún cambio en el sistema, que pudiera producir cambios en el ancho del pico, la altura será proporcional a la cantidad de soluto.
124
2. Altura y ancho a la mitad de la altura.
El método consiste en considerar que el área de un pico es proporcional al producto de su altura por su ancho a una fracción constante, generalmente a la mitad de su altura.
El método es fácilmente aplicado a curvas Gaussianas.
125
Como los picos normales se asemejan a un triángulo, se obtiene el área aproximada multiplicando la altura por la base a la mitad de la altura.No se usa la base normal del pico debido a las “colas”.Esta técnica es rápida y sencilla.
126
E
C
KH
J
D G M BA L F
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3. Triangulación. En el método de la triangulación se supone
que el área del pico es proporcional al producto de su altura por el ancho de la base.
Este procedimiento exige la construcción geométrica de un triángulo trazando la tangente a los puntos de inflexión de cada rama del pico.
Se calcula el área mediante la fórmula del área del triángulo: 2
bxaA
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4. Planimetría. El método consiste en medir los áreas de
los picos en un planímetro. El planímetro es un dispositivo mecánico
que mide superficies recorriendo el perímetro el pico. Las superficies son las reales aunque el pico esté distorsionado. La superficie se registra digitalmente sobre un cuadrante.
La técnica es tediosa, lenta y es poco práctica en los análisis de sustancias que implican muchas medidas.
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5. Cortado y pesado del papel.
El método consiste en pesar los picos en una balanza analítica después de recortarlos del cromatograma.
No exige la condición de simetría de los picos.
El método es lento, pero puede ser bastante preciso, está limitado por la falta de uniformidad del papel.
No es recomendable porque se destruye el cromatograma.
130
Como la CG exige la realización rápida de medidas de áreas, se ha fomentado el desarrollo de métodos de integración automática, que son los preferidos por su rapidez y precisión.
INTEGRADORES
131
Integradores Mecánicos El más extendido es el de disco,
cuyo funcionamiento está basado en transformar el desplazamiento de la aguja del registro gráfico en un movimiento oscilatorio trazado en el papel. El movimiento es más frecuente pero las desviaciones más elevadas corresponden a mayores alturas de picos.
132
Integradores Electrónicos. Los integradores electrónicos emplean
un convertidor de voltaje a frecuencia, que transforma en impulsos la señal de salida del detector, a una velocidad que es proporcional al área de los picos.
La integración de los impulsos da un valor proporcional al área de los picos que se registra con un impresor.
133
Los integradores diferencian las fluctuaciones de la red y el ruido del detector de las señales correspondientes a los picos y corrigen automáticamente ka deriva de la línea base.
Estos integradores miden las áreas de los picos parcialmente resueltos y también los tiempos de retención.
Su mayor inconveniente es su precio, más elevado que el de los demás tipos de integradores.
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INTEGRADORES ELECTRÓNICOS Y COMPUTADORES
La mayor ventaja del integrador electrónico, es la velocidad y exactitud con que es medida el área.
Operan con la señal del detector y son limitados solamente por el detector.
Amplio rango dinámico (trazas y componentes).
135
Muchos integradores tienen la capacidad de almacenar datos de calibración y emiten reportes que dan información de la altura del pico, de los tiempos de retención, del área de los picos y de la concentración final de uno o más componentes de la muestra, utilizando cualquiera de los técnicas presentadas anteriormente.
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COMPARACIÓN DE LAS MEDIDAS DEL TAMAÑO DEL
PICO
McNair y Bonelly. (Basics Gas Cromatography, Varian Aerograph. Walnut Creek, C.A. 1968. p. 156),
Reportaron un estudio comparando diversas técnicas de medida de áreas en un sistema cromatográfico.
Ellos analizaron una mezcla de ocho componentes (hidrocarburos).
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La desviación estándar de 10 réplicas utilizando los diferentes técnicas se registró en el cuadro siguiente.
Mezcla: propano, isobutano, n-butano, 1-buteno, isobuteno, trans-2- buteno, cis-2-buteno, 1,3-butadieno.
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Técnica de medida PrecisiónDesviación estándar
relativa (%)
Tiempo (minutos)
Planímetro 4.06 45-60
Triangulación 4.06 45-60
Altura por ancho a la mitad de la altura
2.58
50-60
Cortado y pesado 1.74 100-200
Integración de disco .29 10-20
Integrador electrónico 0.44 5-10
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ANÁLISIS CUANTITATIVO
CÁLCULOS
140
1. Medida del tamaño (área o altura) de los picos (por cualquier técnica).
2. Convertir el tamaño del pico en una medida de la cantidad de soluto o componente particular en la muestra.
3. Conocer la cantidad de muestra inyectada para ser analizada.
4. La composición de la muestra se determina relacionándola con el tamaño del pico de una cantidad conocida de patrón o estándar.
141
Tres técnicas analíticas de estandarización son utilizadas y en cada una se utilizan estándares.
142
1. Normalización de áreasNormalización interna
2. Estandarización interna3. Estandarización externa
143
1. NORMALIZACIÓN INTERNA.
Por normalización interna o normalización de área, se entiende el cálculo de la composición porcentual de la mezcla, mediante la medición del área de cada pico referida al área total de los picos:
ii
i
Ap x100
A
144
donde Pi representa el tanto por ciento de cada componente en la mezcla, y Ai el área de cada pico.
145
La aplicación de este método supone dos situaciones:
1. En el cromatograma se encuentran registrados los picos de todos los componentes de la muestra problema, por lo tanto la suma de sus áreas es 100.
2. La respuesta del detector a todos los componentes de la muestra es la misma.
146
Como en la práctica esto no ocurre así, se hace necesario compensar las diferencias, introduciendo un factor de corrección:
donde fi es el factor de área en mg/cm2
i i
i i
f Ax100
f Aip
147
Los factores de corrección o factores de respuesta, se determinan inyectando cantidades conocidas de compuestos puros o estándares y calculando la relación porcentual en peso para cada componente:
ii
i
pf
A
148
En la práctica se registran cromatogramas de una mezcla patrón que contiene un peso wi de cada componente que da lugar a un área Ai
i ii
i i
w Af
w A
149
A partir de los factores de corrección de cada componente, se calcula el tanto por ciento corregido:
'i ifip p
150
Ejemplo: Supongamos una muestra que
contiene 4 componentes A, B, C y D de la cual queremos calcular su concentración, o sea su composición porcentual.
En primer lugar se prepara un estándar por adición de pesos conocidos de los componentes A, B, C y D puros, se calcula su porcentaje en peso.
151
Luego, se corre el cromatograma del estándar, en el cual se registra el área de cada pico, según los datos siguientes:
152
ESTÁNDARComp
.Peso(g) Área del
pico %Peso %Áre
a%Peso-
áreaFactor de respuesta
(f)
A 0.3786 4231 21.74 22.41 0.005138
1.000
B 0.4692 5087 26.94 26.94 0.005296
1.031
C 0.5291 5691 30.38 30.14 0.005338
1.039
D 0.3648 3872 20.94 20.51 0.005408
1.053
Total 1.7414 18881 100.00 100.00
153
Ahora se inyecta la muestra problema y se obtiene el cromatograma, el cual registra las áreas de los picos, según los datos siguientes:
154
MUESTRA
Comp. Área del pico
Factor de respuesta (f)
Área x f %Peso
A 3862 1.000 3862 19.66
B 5841 1.031 6022 30.66
C 4926 1.039 5118 26.06
D 4406 1.053 4639 23.62
Total 19035 _______ 19641 100.00
155
Otro ejercicio:
Calcular el % en peso de cada componente para una mezcla de alcoholes n-butílico, iso-butílico, sec-butílico y ter-butílico, de cuyo cromatograma se obtuvieron las siguientes áreas de picos: 1.731, 3.753, 2.845 y 1.117 cm2.
Para la obtención del factor de respuesta se inyectaron las siguientes cantidades de patrones y se obtuvieron de los cromatogramas las áreas relacionadas a continuación: n-butílico 0.1731g, 3.023 cm2; iso-butílico 0.1964g, 3.074 cm2; sec-butílico 0.1514g, 3.112 cm2 y ter-butílico 0.1826g, 3.004 cm
156
2. ESTANDAR EXTERNO Es un método de cuantificación muy
utilizado en Cromatografía en general.
Consiste en preparar estándares de concentración semejante al analito en la muestra y realizar en ensayo cromato-grafico del estándar y de la muestra en las mismas condiciones operativas.
157
Se establece una relación directa entre el área del pico y la composición de uno o mas componentes de la muestra.
La concentración del analito se determina comparando el área del pico en cuestión con el área correspondiente al estándar de referencia.
100m S
S
A Cp
A
158
La concentración del analito en la muestra puede obtenerse matemática-mente, por aplicación de la fórmula, o bien, gráficamente, utilizando para ello una curva de calibración.
El tamaño del pico (área) se grafica contra la cantidad absoluta de cada componente o su concentración en la matriz. CALIBRACIÓN ABSOLUTA
159
CALIBRACIÓN ABSOLUTA
En este método se calcula la relación entre el área o altura del pico y la cantidad de muestra inyectada.
Este tipo de calibración se emplea mucho en la Industria en equipos automáticos y en Laboratorio para calcular recorridos lineales de respuesta de los detectores.
160
El método consiste en construir una curva de calibración a partir de las áreas o alturas de los picos generados por la inyección de cantidades exactas de un compuesto puro o patrón.
Se grafica peso de componente contra área o altura del pico y se obtiene una curva de calibración que debería pasar por el origen (no hay muestra, no hay respuesta).
161
Luego se inyecta una cantidad exacta de la muestra problema, se mide su área o altura del pico y a partir de la curva de calibración se calcula la cantidad de muestra presente en el problema.
100x inyectados gramos
áreag
A xde Área Ade %peso
162
Peso del componente
Área del pico
163
DESVENTAJAS DE LA CALIBRACIÓN ABSOLUTA
Debe conocerse la cantidad de muestra inyectada.
Se requiere algún tiempo considerable para la calibración.
La sensibilidad del detector debe mantenerse constante.
164
3. ESTÁNDAR INTERNO
Calibración Relativa o Indirecta.Cuando no se han registrado todos los picos en el cromatograma, no es válida la normalización de área.
Para la determinación de la composición porcentual de los componentes, entonces se pude utilizar el método del estándar interno, el cual permite calcular exactamente el tanto por ciento de los componentes o de algún componente particular de interés.
165
El método del estándar interno consiste en agregar cantidades exactamente medida de una sustancia así denominada, la cual no se encuentra en la muestra, tanto a la muestra, como a un estándar que contiene el analito, preparado con la misma concentración de la muestra.
166
Con los datos de las áreas de los picos expresados en el cromatograma y conociendo los pesos de la muestra y del estándar, se puede determinar el factor de respuesta o factor de corrección y el porcentaje de un componente determinado en la muestra problema.
167
p es el porcentaje del analito, Rm y Rs son las relaciones de área de analito a estándar interno en la muestra y el estándar respectivamente y Cs es la concentración del estándar.
100m s
s
R Cp
R
168
En el ejemplo anterior: supóngase que solo el componente C es el compuesto de interés y que la muestra problema no contiene el componente A.
169
Estandarización InternaComp. Peso
(g)Área Relación de
peso C/ARelación de área
C/A
f= Relación área/Relació
n peso
A 0.3786 4231
1.398 1.345 0.962
C 0.5291 5691
170
Se observa que:
C
CA
C A C
A
C C
A A
AA WA
W A WW
W A
W A
Af
f
171
donde: WC y WA son los pesos de C y A respectivamente; AC y AA las áreas de C y A respectivamente y f el factor de respuesta.
172
Como el peso del patrón A es conocido, el peso de C en la muestra puede ser calculado:
Y como el peso de la muestra es conocido:
C AC
A
A .W W
A .f
x100muestra la de Peso
W%C C
173
Ejemplo: Suponga que 100 mg de un estándar
interno, se adicionan a 1.00 g de la muestra que contiene tres componentes. El cromatograma muestra las áreas (en unidades arbitrarias) para los componentes y el estándar en el siguiente orden: A1: 27, Aestd: 80, A2: 20, A3: 70 y la suma de las áreas: 197.¿Cuál será la cantidad del componente 3 en la muestra?
174
Solución:
33
70100 mg 87.5
80
87.5 g% del componente 3 100 8.75%
1000 g muestra
estest
AW W
A
W mg
175
El cálculo también se puede hacer gráficamente, construyendo una curva de calibración, en lo que se denomina
CALIBRACIÓN RELATIVA O INDIRECTA.
176
En la práctica se preparan varios estándares del compuesto A y C por ejemplo, y se construye un gráfico de la relación de área en la ordenada y la relación de peso en la abcisa.El gráfico debe ser lineal para el sistema particular y la pendiente de la curva es el factor de respuesta fi .
177
Ejemplo: A una muestra problema de 5mL se
añaden 5mL de una disolución que contiene el patrón a una concentración de 100 g/mL. Después de realizar la cromatografía de la muestra, se observa que la relación de las áreas es 8. Cuál es la concentración de la sustancia en la muestra?
178
Solución: Al construir la curva de calibración, se
observa que si la relación de áreas es 8, la relación en peso es 7.
179
0 2 4 6 7 8 10 12
2
4
6
8
10
12
Peso (componente/patrón)
Área(componente/patrón)
180
Solución: Como la concentración del patrón es
100g/mL, entonces la concentración del componente es 700g/mL.
Como se agregan 5mL de la solución estándar, entonces la cantidad total de la sustancia desconocida es:5 mL x 700 g/mL=3500 g ó 3.5 mg del volumen de la muestra original.
181
El método del estándar interno requiere de patrones de referencia y del uso de otra sustancia, el estándar interno, cuya pureza no tiene que ser tan controlada como la del patrón de referencia, pero debe cumplir algunos requisitos.
182
REQUISITOS PARA EL ESTÁNDAR INTERNO.
El patrón interno debe cumplir las siguientes condiciones:
1. No debe estar presente en la muestra.2. Debe tener similitud estructural con la
sustancia que se determina.3. Debe tener una concentración
aproximada a la sustancia que se determina.
4. Debe resolverse completamente 5. Debe ser estable y químicamente inerte.
1.5SR
183
REQUISITOS PARA EL ESTÁNDAR INTERNO.
6. Debe responder en forma semejante al analito con el detector seleccionado.
7. Eluir lo más cerca posible del componente de interés e idealmente antes del último pico de la muestra.
8. Ser lo suficientemente no volátil para que permita su almacenamiento y conservación cómo estándar por un período de tiempo significante.
184
EJEMPLO DE APLICACIÓN En una separación por CG, se prepararon
estándares cuya composición y áreas obtenidas del ensayo cromatográfico, fueron las siguientes, en el orden de aparición en el cromatograma:
Pico 1: 20.5 g/100 mL, 10580 unidades Pico 2: 11.0 g/100 mL, 5370 unidades Pico 3: 40.5 g/100 mL, 21582 unidades
185
El ensayo cromatográfico de la muestra, mostró las siguientes áreas:Pico 1: 10477 unidadesPico 2: 5293 unidadesPico 3: 24033 unidades
Calcular la composición porcentual de la muestra, haciendo uso de los tres métodos considerados.