BUENAS PRACTICAS EN CROMATOGRAFÍA DE GASES

Serie de seminarios web sobre Buenas Practicas Instrumentales de Agilent

Jose Juan RiveroEspecialistas de producto

Agilent Technologies, Spain

14 de abril de 2020

Co

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b

La cromatografíaes un métodode separaciónfísico.

En cromatografía de gases, los componentes a separar se distribuyen entre dos fases: una fase estacionaria y una fase móvil .

Los componentes se separan debido a la diferencia de afinidadcon la faseestacionaria.

La fase móvil introducelos analitos en la columna y a través del sistema.

Como fáse móvil se utilizan gases inertes (gas portador).

Cromatografía de gases

Cromatografía de gases

Técnica que separa mezclas en componentes individuales.

Objetivo: Identificar componentes y medir sus concentraciones

Es una separación en el tiempo: este tiempo de separación es característico del compuesto.

El Area o la Altura de este pico da idea de su concentración

B

Separación de

compuestos, y

Flujo

A

C

D

Requirimientos de la muestra en cromatografía de gases

Suficiente Volatilidad:

Las macro moléculas generalmente no tienen suficiente volatilidad (no pasan a fase gas

en las condiciones instrumentales).

Libre de residuos:

Esta es una extensión del primer requerimiento. Las impurezas no

volátiles en la matriz de la muestra puede derivar en contaminación

del inyector y columna que degradará rápidamente la

cromatografía.

Estabilidad térmica:

Los compuestos de interés no se deben degradar cuando se

introducen en el inyector a alta temperatura (por encima de 300°C) o en la columna (por

encima de 350°C).

• El 10-20% de todos los compuestos son adecuados para análisis por GC

Cromatografía de gases❑ Tipo de gas portador❑ Tipo de inyector de la muestra❑ Tipo de columna❑ Tipo de detector

La muestra determina la configuracióndel instrumento, es decir:

Gases

Sistema para introducción de la muestra

Columna

Detector

Adquisición de datos

Componentes de un cromatógrafo de gases

GASES PORTADORES

Para la utilización del gas comprimido con seguridad: Seguir las normas de seguridad del Dpto. de seguridad de la empresa

o las suministrada por el proveedor local

Los gases portadores más comunes son:

• Elegirse considerando el tipo de detector utilizado

• Ser inertes

• Secos

• Puros

Los gases deben:

Gases portadores y de soporte del detector

Su selección y velocidad influye en la eficiencia y el tiempo de retención.

Tipos de gases portadores

Antiguamente se utilizaban controladores manuales

Actualmente se utiliza Controladores electrónicos de la presión:

•Mayor precisión en la presión

•Trabajo más sencillo

Control del gas portador

INYECTORES

Slide 11

Función: Introducir la muestra en el cromatógrafo de manera repetitiva y reproducible.

La inyección debe ser rápida, para evitar ensanchamiento del pico y la discriminación

La muestra debe ser representativa y debe inyectarse sin que haya cambiosquímicos.

Tipos de inyectores:

•Split/Splitless

•Empaquetadas con purga (Purged Packed)

•Refrigeración en columna (Cool on-column)

•Vaporización a temperatura programada PTV y MMI

• Interfase de volátiles

Inyectores

Inyector “Split/Splitless” (con/sin división)

Modo “Split”

Análisis de comp. principales

Modo “Splitless”

Análisis de trazas de comp.

(ENTRADA)

(SEPTUM)

SALIDA DE SPLIT

FLUJO TOTAL

COLUMNA

= GAS PORTADOR

= MOLECULAS DE MUESTRA

= MOLECULAS DISOLVENTE

SALIDA DE PURGA

VALVULA DE PURGA

La vaporización tiene lugar cuando se

transfiere suficiente energía térmica a la

muestra. Esto puede ocurrir en el gas

portador, pero es más probable durante el

contacto con una superficie sólida, como el

liner o el medio de mezcla.

Típicamente los inlets se mantienen a temperaturas

elevadas (>175°C hasta350°C dependiendo de la

temperatura de vaporización de la muestras

SP

LIT

MO

DE

Para que el concepto de SPLIT RATIO (Relación

de Split) sea válido, la muestra (disolvente +

analito) debe mezclarse con el gas portador y

generar una mezcla homogénea.

Al fondo del puerto de inyección, una pequeña

parte de esta mezcla se transferirá a la columna,

mientras el exceso de la mezcla salga del

cromatógrafo por la Salida de “SPLIT”

Split

1:20

Splitless

•La válvula de purga está cerrada durante la inyección (no hay flujo enla válvula de split)•En un tiempo específico después de la inyección, la válvula de purga se abre para eliminar vapores remanentes en el inlet.

SP

LIT

LE

SS

MO

DE

Solvent Effect:

SOLVENT BOILING POINT INITIAL OVEN TEMP

( ºC) ( C)o

DICHLOROMETHANE

CHLOROFORM

CARBON DISULFIDE

DIETHYL ETHERPENTANEHEXANE

ISO-OCTANE

40

61

46

35

36

69

99

10-30

25-50

10-35

10-25

10-25

40-60

70-90

S

SS

SS S

S S SS

S S

SS

S SS S

S

S

S

S

S

S SS

SS

S

S

S

SS

SS

S S SS

S

SSS

S

S

S

S

S

S

S

S SS

S SS

S

S

SS

S

AA

A AA

A

A

A AAA

A

A

AA

A = ANALYTE

S = SOLVENT

Temperatura inicial del horno se mantiene

CONSTANTE por debajo del punto de ebullición del

disolvente para condensar y FOCALIZAR la muestra

Cuando se requiere Máxima

Sensibilidad ➔ Trabajar en

modo “Splitless”

(Trace Component Analysis)

Inlet Modo “Splitless” (sin división)

Volumen del liner normalmente menor de 900 microlitros.

Si el volumen de expansión del disolvente excede este volumen tendremos problemas de reproducibilidad.

Liners

https://www.agilent.com/en/support/gas-chromatography/sslinerselect

Expansión de disolventes comunes

Solvent Vapor Volume Calculator

https://www.agilent.com/en/support/gas-chromatography/gccalculators

Procedimiento:

• Elegir el disolvente

• Elegir el liner

• Jugar con:

• Volumen de inyeccion

• Temperatura inyector

• Presion de inyector

Capacidad de programación de temperatura

Flexibilidad en los volúmenes de inyección

Análisis de muestras termolábiles y mínima discriminación en la inyección para compuestos con alto peso molecular

Mayor sensibilidad en inyecciones de gran volumen

Disminuye pasos de preparación de muestra

Mayor productividad

Compatibilidad con Tecnología de flujo Capilar

Venteo de disolventes y uso de Backflush

Otros tipos de inyección: Inyector Multimodo (PTV)

Mismas precauciones que SSL

COLUMNA

El Corazon de la cromatografía

Eficiencia de columna (N, número deplatos teóricos) Más eficiente, picos másestrechos

Resolución de columna Una columnade alta resolución separa los picos hastala línea base. La columna largaproporciona más resolución (pero mástiempo y más costo).

Selectividad de columna. Depende dela columna

Objetivo principal de la columna

Producir picos estrechos y bien separados en una mezcla compleja

Columna

Empaquetadas Capilares

Recubiertas

PACKED MEGABORE 530 NARROW BORE

Length (m) 0.5-10 5-100 5-100

I.D. (mm) 2-4 0.53 0.1-0.25

Tubos rellenos

Tipos de columna

Polysiloxane polymers: ex: HP-5. Separa

apolares y moderadamente

polares

(Separacion porpuntos de ebullidcion)

Polyethylene glycol: WAX columns. Separacompuestos polares, acidos, alcoholes, etc

(Columnas polares)

PLOT Columns: Columnas para separaciones

especiales, gases a temperatura ambiente

Fases estacionarias

http://selectgc.chem.agilent.com/

Temperatura y FlujoPoder

programar cambios de

flujo.

Poder trabajar a flujo

constante

Columna 25m*0.2mm - He 141 Kpa

• flujo a 50ºC: 1.0 ml/min

• flujo a 150ºC: 0.6 ml/min

• flujo a 300ºC: 0.4 ml/min.

Poder reducir tiempos de

análisis

Trabajando a flujo constante o incrementando flujo

El sistema EPC ofrece la posibilidad de autoprogramar cambios de

presión de acuerdo con la programación de temperatura para

mantener flujo constante.

Mejorar la sensibilidad

de picos muy retenidos

Salen antes y por consiguiente más finos y con mayor altura.

Poder cromatografiarproductos más

pesados

Incrementando el flujo en la zona final.

La separación depende mucho de la temperatura de la columna. Se realizan rampas para acelerar el análisis.

La columna tiene una temperatura máxima: isotérmica y programada.

No dejar la columna más de 10 minutos de la tempprogramada

PV=nRT

DETECTORES

Un detector es un dispositivo que modifica un

comportamiento a la presencia de un

componente diferente del gas portador, y convierteesa información en una

señal eléctrica.

Detector de conductividad térmica (TCD)

Detector de ionización de llama (FID)

Detector de captura electrónica (ECD)

Detector de nitrógeno - fósforo (NPD)

Detector fotométrico de llama (FPD)

Detector de conductividad electrolítica (ELCD, HALL)

Detector de fotoionización (PID)

Detector selectivo de masas (MSD)

Detector de infrarrojo (IRD)

Detector de emisión atómica (AED)

Detector

Sensibilidad:

• Respuesta por cantidad de muestra, es decir, la pendiente de la curva respuesta/cantidad. La cantidadmínima en la curva se define como el nivel mínimo detectable (MDL).

Selectividad:

• Es una medida de que categorías de compuestos darán respuesta del detector.

Rango dinámico:

• El rango de concentraciones de la muestra para las que el detector puede suministrar una cuantificaciónprecisa.

Respuesta del detector

pptrillón ppb ppm ppmil porcentaje

1 ppm = 1 ng

1 Lm

1 mg

Litro

1 L m

Litro= =

NPD (P)

10-15

fg

10-12

pg

10-9

ng

10-6

m g

10-3

mg

TCD

FID

ECD

NPD

(N)

MSD (SIM)

FPD (S)

Tipos de detectores

El rango dinámico es una medida de la Respuesta vs.

Cantidad. La respuesta es la señal producida por la muestra

La respuesta no lineal, mientras sea reproducible, puede

tratarse utilizando técnicas de calibración no lineal.

Cantidad

Cantidad

Respuesta

Respuesta

Rango dinámico

La respuesta aumenta repetidamente a

medida que aumenta la cantidad.

Rango dinámico lineal

La respuesta aumenta

proporcionalmente a medida que

aumenta la cantidad.

Rango dinámico

Condiciones operativas para los detectores

Detector Muestras típicas Rango sensibilidad Vel. Flujo gas (ml/min.)

Portador + Hidrógeno Aux.

FID Hidrocarburos 10-100 pg 20-60 30-40 200-500

10 ppm-99%

TCD Cualquier otra 5- 100 ng 15-30 n.a n.a.

que gas portador 100 ppm-100%

ECD Organohalógenos 0.05-1 pg 30-60 n.a. n.a.

Disolventes clorados 50 ppt-1 ppm

& pesticidas

NPD Organonitrógeno & 0.1-10 pg 20-40 1-5 70-100

Organofósforo

Resolución de problemas y Mantenimiento en Cromatografía

de Gases (GC)

Resultados Cromatográficos ¿Cómo?

Tener un GC con la configuración

adecuada

Realizar un Mantenimiento

periódico controlado del equipo.

Optimización meticulosa de los

Métodos.

Agilent GC Series

GC6890 A /

Plus / NGC7890 A

GC7890 B

GC7820

GC9000

“Intuvo”

GC6850

GC8890 GC8860

35

Modos de interacción en la nueva era de la Cromatografía

Mantenimiento de los inyectores

36

Uso Inyector Automático (ALS)

Cambiar Periódicamente Septum

Cambiar Periódicamente “Liner”

Cambiar Periódicamente los Filtros de Gases

Gold Seal

Split Vent Trap

Inyector de Capilares o Split/Splitless (S/SL)

Cambio de Septum

Bajar Temperatura del Inlet

Acceder al Septum, quitando Septum Retainer Nut.

Con la ayuda de unas pinzas cambiar el septum, para evitar contaminación.

No apretar en exceso este punto.

Tuerca del

septum

Septum

El anillo debe estar 1 mm

por encima de la tuerca;

más está demasiado

apretado.

Realizar la mejor vaporizacion: Consejos sobre el liner

El inserto de vidrio o Liner proporcionaun espacio inerte donde las muestras

líquidas se pueden vaporizar de manerauniforme y pasar a la columna.

El cambio de fase líquida a gas implica un importante aumento de volumen.

El volumen de expansion depende de:

• Tipo de disolvente

• Presión en cabeza de columna

• Temperatura del portal de inyección

Disolvente Volumen Expansion(1mL, ambiente) (mL a 250°C y 20 psi)

n-Hexano 140

Acetona 245

Acetonitrilo 350

Metanol 450

Agua 1010

Una inyección de disolvente de gran expansión de volúmen puede provocar una sobrecarga del liner del portal de inyección. Esto puede resultar en pérdida de muestra

por la VALVULA DE PURGA así comocontaminación de la línea de gas portador

entrante.

Evitar la sobrecarga del Inlet

Si la muestra vaporizada no cabe en el “liner” :

1.Perdida de repetibilidad cuantitativa.

2.Contaminación (carryover).

Liner sobrecargado

GC Calculators: Vapor Volume Calculator

La muestra vaporizada NOdebe ocupar más del 80% del

volumen del Liner

Liners Recomendados

¿Usar soporte solido?

Expansion de la muestra

en caliente

Problemas:

• Mala resolución entre compuestos

• Línea de base irregular

• Mala simetría en el pico

• Baja respuesta

Resolucion

• Inspeccionar el Liner con frecuencia y reemplazarlopara evitar suciedad retenida.

• Manipularlo con guantes y con pinzas.

• Cambiar el liner una vez hemos bajado la temperature del Inlet.

• Cambio O-Ring del liner.

Liner Troubleshooting y mantenimiento

Muchos problemas cromatográficos pueden ser el resultado de un Liner contaminado

Puntos para evitar fugas en el Inlet

¿Cómo saber cuándo hacer mantenimiento?Filtro de gases

Filtros de limpieza de Gas

con Sensor inteligente

Verde

Naranja

Pureza mínima de los gases superior a 99,999%

Instalación

Filtro de gases

Material de filtro

Material indicativo por colores

ConexionesAire In/Out Carrier In/Out H2 In/Out

Charcoal Oxygen Moisture Charcoal

Presione la válvula para

purgar la línea de gas de

oxígeno y humedad.

Los Gold Seal están diseñados para un

solo uso. La reutilización puede provocar

la superposición de los anillos de sellado,

lo que puede provocar una fuga.

Gold Seal (Sello de oro)

Reemplazar anualmente, como mínimo.

Cambiar con más frecuencia si la muestra es sucia y/o el ratio de split es Elevado.

El kit para el cambio de trampa incluye 2 o-ringsy la trampa.

Split Vent Trap

Consideraciones de los Inyectores automáticos

49

SISTEMAS DE INTRODUCCIÓN DE MUESTRAS

HeadSpace Purge&Trap ThermalDesorption

SPME/ARROW/

TWISTER

Cometido de un autosampler

Slide 51

Función: Introducir la muestra en el cromatógrafo de manera repetitiva y reproducible.

La inyección debe ser rápida, para evitar ensanchamiento del pico y la discriminación

La muestra debe ser representativa y debe inyectarse sin que haya cambios químicos.

Modo de toma de muestra

Precauciones:

Lavados:

•Usar al menos dos disolventes y de polaridades contrapuestas

•No usar disolventes que sequen.

No exceder del 50% de la capacidad de la jeringa

No bajar por debajo del 10% de la capacidad.

Usar jeringas biseladas

Subir a 2 - 3 segundos para disolventes con una cierta

viscosidad

Solvente A : Metanol, Tolueno, Iso-octano, o mezcla miscible con disolvente inyección.

Evitar “Dry Solvents” : Acetona, Diclorometano o Hexano. Acortan la vida de la jeringa

Solvente B : disolvente de la muestra utilizado en la inyección

ALS (Automatic Liquid Sampler)

Mantenimiento de los Detectores

Si se cambia a menudo de

columna, mejor usar férulas

vespel-grafito vs 100% grafito

Al intercambiar los jets apretar sin forzar en

exceso

Limpiar el jet sólo cuando se

requiera

Mantenimiento de Detector de Ionización de Llama (FID)

Mantenimiento rutinario del FID

Controlar la señal de fondo

Comprobar presiones y flujos

Limpiar o cambiar el jet

Inspeccionar el encendedor (ignitor)

Limpiar el colector

COLUMNA

“No es lo que tu columna pueda hacer por tí, sino lo que tu puedas hacer por tu columna"

Mantenimiento Básico de la Columna GC

Acondicionar la columna antes de usarla

Cortar cuando se requiera (p.e. por colas en picos) un trozo de cabeza de columna (p.e. 50cm). Típico en “splitless”. ¡Uso de RTL!

Los cortes en los extremos de la columna deben ser adecuados

Limpiar térmicamente o con disolvente cuando se requiera

Cortar con cuidado el recubrimiento de poliimida.

No intentar cortar el vidrio.

Herramientas recomendadas:

• Lápiz con punta de diamante o de carburo,

herramienta de zafiro para cortes o cortador

cerámico

• Protección ocular

No usar: Tijeras, lima, etc.

Instalacion de columna Agilent 7890

Para el MMI ajustar a 14

mm entre la punta de la

férrula y la columna

IMPORTANTE

. Instalación de columnas capilares

- Colocar septum, tuerca y ferrula a través de la columna.

- Cortar 2 cm de columna

- Ajustar la distancia entre punta de férrula y extremo de columna

- Apretar manualmente la columna en el inyector

- Ajustar con ½ vuelta más las tuerca usando llave

Después de largos períodos de inactividad de la columna o si ésta no está

limpia convendrá aumentar considerablemente el tiempo de acondicionado.

Acondicionado de la Columna

Incrementar la temperatura de la

columna hasta 20-25 ºCpor encima de la

temperatura máxima de trabajo (sin llegar a

superar la temperatura máxima de la columna) y mantenerla durante 15-

30 min.

Abrir gases del detector y empezar a calentar inyector y detector.

Dejar durante 10-20 minutos la columna a temperatura ambiente

con el gas portador abierto y asegurarse que éste fluye a través de la

columna.

Si el cromatógrafo estaba parado: para

eliminar el oxígeno de su interior,

Las impurezas del gas portador se preconcentran en la columna cuando ésta se mantiene a “bajas” temperaturas durante periodos de inactividad

Causas Comunes de la Degradación del Rendimiento de una Columna

Deterioro del recubrimiento de poliamida

Daño térmico

Oxidación (deterioro por O2)

Daño químico debido a muestras

Contaminación

Dónde encontrar más información:

Conclusiones

Es importante conocer nuestro cromatógrafo de gases: Componentes y función.1

2Estar familiarizado con las variables de dichos componentes y como pueden afectar a los

resultados.

Tener capacidad crítica para modificar dichas variables y poder obtener métodos

analíticos robustos y optimizados.

4Identificar el origen de los problemas asociados a nuestra cromatografía y como pueden

estar afectados por los componentes y variables de nuestro cromatógrafo de gases

3

Gracias por su atención

…por su atención

jose.rivero@agilent.com

Teléfono de atención

902116890