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UNIVERSIDAD ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD
ESCUELA DE CIENCIAS BASICAS, TECNOLOGIA E INGENIERIA
ACTIVIDAD:14
TRABAJO PRÁCTICO
SIMULADOR HPLC
ESTUDIANTE:
ELIZABETH MUÑOZ
LUCY VIVIANA DUQUE
DORIS ADRIANA VEGA. 46453711
TUTORA:
JENNY PAOLA ORTEGA
INGENIERIA DE ALIMENTOS
JUNIO 2014
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INDICE
pag
SECCION A. Reconocimiento de los parámetros cromatograficos en
cromatografía liquida de alta eficiencia (CLAE)
Factor de separación………………………………………………………………….3
Resolución………………………………………………………………………………3
Eficiencia…………………………………………………………………………………4
Factor de retención………………………………………………………………………4
Tiempo de retención……………………………………………………………………..5
Tiempo muerto…………………………………………………………………………….5
Ancho de banda…………………………………………………………………………5
Cromatografía liquida en fase normal………………………………………………….6
Cromatografía liquida en fase reversa…………………………………………………6
Gradiente de elución…………………………………………………………………….7
Elución socrática…………………………………………………………………………..7
SECCION B. efecto de la estructura e los compuestos (solutos) y de la
composición de la fase móvil sobre la retención y la resolución.
Dibujos de las estructuras de los compuestos indicados……………………………8
Usos de cada uno de estos compuestos indicados…………………………………9
Registro para cada compuesto…………………………………………………………12
Sección c: Efecto por porcentaje del modificador en la composición de la fase
móvil sobre la retención y la resolución.
Regustro datos obtenidos de los compuestos Acetophenone (acetofenona) y
Ethylparaben (etilparabeno)……………………………………………………………15
Bibliografíag………………………………………………………………………………..
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SECCION A. Reconocimiento de los parámetros cromatograficos en
cromatografía liquida de alta eficiencia (CLAE)
Defina y explique cómo se relacionan los siguientes conceptos. Incluya cuando
corresponda, el símbolo y ecuación que representa al concepto
1. Factor de separación. (α)
Define que tan selectiva es una columna para separar dos picos. La columna
puede ser selectiva a una separación, que se identifica por un valor alto de este
factor.
En términos tomados a partir de un cromatograma α se puede calcular:
2. Resolución. (Rs)
La resolución de una columna constituye una medida cuantitativa de su
capacidad para separar dos analitos, en este término si se toma en cuenta el
ensanchamiento de los picos, así que la magnitud de este valor si permite
asegurar la separación de dos picos.
Donde WA y WB son los anchos de banda de A y B respectivamente
La resolución expresada en términos teóricos es:
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3. Eficiencia. (N)
Para realizar una separación cromatografica optima, debe evitarse en lo posible, el
ensanchamiento de las bandas debido a la dispersión; en efecto cuanto más
anchas sean las bandas, menor número de ellas podrán ser resueltas en un
espacio de tiempo dado; es decir cuánto más agudos sean los picos que emergen
de una columna mejor estará actuando dicha columna. Las anchuras de las
bandas cromatograficas dependen de las características de la columna (tamaño
de las partículas del lecho estacionario, homogeneidad de este, velocidad de la
fase móvil, etc.). Se expresa como el número de platos teóricos:
El número de platos de una columna depende de su longitud, por lo que se debe
tener en cuenta la altura equivalente de un plato teórico, que relaciona la eficacia
de una columna con su longitud y se define como el cociente entre la longitud de
la columna y su número de platos teóricos
4. Factor de retención.
Este factor ( ) es adimensional expresa la retención de un compuesto por la fase
estacionaria, independiente del caudal de la fase móvil.
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5. Tiempo de retención.
Es el tiempo que transcurre después de la inyección de la muestra para que el
pico del analito alcance el detector y se le da el símbolo . O en otras palabras es
el tiempo que tarda cada sustancia en abandonar el sistema cromatografico
6. Tiempo muerto.
Es el tiempo para que la especie no retenida alcance el
detector
Ancho de banda (sigma total)
Corresponde al intervalo de longitudes de onda comprendido entre los puntos en
donde la transmitancia (de la radiación emitida por la fuente y que llega a la rendija
de salida) alcanza la mitad de su máximo de transmisión o el intervalo de
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longitudes de onda que contiene el 75% de la energía radiante que proviene del
monocromador. La anchura de banda se puede expresar en términos de la
apertura o amplitud de las rendijas, S, y la dispersión lineal recíproca del
monocromador como:
SBW = S.D-1
Cromatografía liquida en fase normal.
La fase estacionaria es polar (gel de sílice, grupos ciano, amino y diol) y la fase
móvil es no polar (hexano o isopropileter). El componente menos polar es el que
eluye primero
Cromatografía liquida en fase reversa
La fase móvil es polar (agua, metanol o acetonitrilo). El componente más polar es
el primero en eluir y la fase estacionaria es no polar (cadena hidrocarbonada que
puede ser:
Cadena larga: C:18
Cadena intermedia: C:8
Cadena corta: C:2
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7. Gradiente de elución.
Se utilizan dos o más disolventes de distinta polaridad y se varía la composición
de forma continua o mediante etapas escalonadas
8. Elución socrática.
Es la separación con disolvente de composición constante
SECCION B. efecto de la estructura e los compuestos (solutos) y de la
composición de la fase móvil sobre la retención y la resolución.
Dibuje estructuras de los siguientes compuestos utilizando las convenciones de
cuña/slash representando los ángulos de enlace
Nombre Imegen propiedades fisicas Formula
molecular
8
Acetofenona
Benzofenona
Butilparabeno
C11H14O3
Propiofenona
Etilparabeno
Propilparabeno
9
Ketoprofeno
3-nitrofenol
C6H5NO3
4-nitrofenol
C6H5N
O3
b. ¿Cuáles son los principales usos de cada uno de estos compuestos
Acetofenona
Se usa como precursor en la preparación de fragancias que se asemejan a
la almendra, la cereza, la madreselva, el jazmín y la fresa.
También se usa para preparar resinas y como aditivo en las gomas de
mascar y en cigarrillos.
A finales del siglo XIX se vendía como hipnótico y anti convulsionante con el
nombre hipnona (Hypnone™). Sus efectos sedantes se consideraban
superiores a los del paraldehído y a los del hidrato de cloral.
Benzofenona
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La benzofenona es una cetona aromática que ayuda a filtrar las
radiaciones. Esta cetona absorbe la radiación y la disipa en forma de calor.
Por esa principal característica es utilizada en la producción de perfumes,
jabones y protectores solares.
En el caso de los perfumes y jabones, la benzofenona provoca que ni el olor
ni el color, pierdan sus propiedades debido a la exposición con los rayos
UV, mientras que en los protectores solares tienen como función absorber
la radiación y transformarla en energía no nociva para la salud de la piel.
Fabricación de productos farmacéuticos (antihistamínicos, hipnóticos,
pantallas solares), cosméticos e insecticidas, en análisis, química fina, etc.
Butilparabeno
Se utiliza muchísimo en muchos productos del cuidado de la piel e incluso
en medicinas tan comunes como el ibuprofeno.
Es el anti fúngico más potente de entre los parabenos. De hecho, su
potencial microbiano es mayor que el del metilparabeno, el propilparabeno
o el etilparabeno. Es particularmente eficaz contra mohos y levaduras, y
menos contra bacterias. En cuanto a cómo funciona, parece que inhibe la
capacidad de síntesis del ADN y el ARN y con ello la capacidad de
transporte de sustancias entre membranas, lo cual retarda el crecimiento
microbiano porque les impide desarrollarse al ritmo habitual. Aún así, es
frecuente encontrárselo combinado con otras sustancias biocidas como
liberadores de formaldehido, isotiazolinonas y fenoxietanol para aumentar
sus capacidades conservadoras, así como con otros tipos de parabenos.
Propiofenona
Se utiliza en la síntesis de efedrina y derivados de propiofenona tales como
metcarinona y catinona.
Es un intermediario útil para la preparación de medicamentos que actúan
sobre el sistema nervioso central tales como los hipnóticos, ansiolíticos
Se puede también utilizar en la síntesis de alquenos arilo tales como
fenilpropanoides
Etilparabeno
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Son utilizados como conservadores protegiendo a los productos de las
levaduras y los hongos. No obstante, no son muy efectivos contra las
bacterias. Su actividad es independiente de la acidez, y adicionalmente, son
poco solubles, lo que limita sus aplicaciones (antimicrobianos y ciertas
propiedades antioxidantes) en formas farmacéuticas liquidas como jarabes,
soluciones, suspensiones e inyectables.
son usados en una gran variedad de alimentos y cosméticos.
Propilparabeno
se usa con frecuencia en cosméticos, productos de cuidado para la piel y
comida. Tiene una toxicidad generalmente baja por ingestión
Es muy poco soluble en agua fría, por lo que se trabaja en procesos con
calor. Es anti fermentativo, tiene amplio espectro antimicrobiano es
bacteriostático y antioxidante, combate mohos y levaduras. Es muy utilizado
en cosméticos (es el segundo producto de este tipo más utilizado), pero
también es empleado en la industria alimenticia, se recomienda utilizarlo del
0,05 al 0,1%; en la preservación de grasas en una proporción del 0.1%.
Ketoprofeno
El ketoprofeno de prescripción se usa para aliviar el dolor, sensibilidad,
inflamación (hinchazón) y la rigidez causada por la osteoartritis (artritis
causada por un deterioro del recubrimiento de las articulaciones) y la artritis
reumatoide (artritis causada por la hinchazón del recubrimiento de las
articulaciones). También se usa para aliviar el dolor, incluyendo el dolor
menstrual (dolor que se presenta antes o durante el período menstrual). El
ketoprofeno sin prescripción o de venta libre se usa para aliviar dolores
leves causados por cefaleas (dolor de cabeza), períodos menstruales, dolor
de muelas, resfrío común, dolores musculares, dolor de espaldas y para
reducir la fiebre. Pertenece a una clase de medicamentos llamados
antiinflamatorios sin esteroides. Funciona al detener la producción de una
sustancia que causa dolor, fiebre e inflamación.
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El ketoprofeno por vía oral es efectivo y bien tolerado como tratamiento
agudo en los ataques de migraña.
3-nitrofenol
Se utiliza en peletería como fungicida,
4-nitrofenol
Es usado principalmente en la manufactura de medicamentos, fungicidas, tinturas
y para oscurecer el cuero.
3. Abra el HPLC simulador (http://www.hplcsimulator.org/)
4. configure el simulador así:
c. posteriormente, registre para cada compuesto:
Tiempo de retención ( )
Factor de retención (K’)
Ancho de banda (sigma total – )
Adjunte imagen del cormatograma obtenido
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5. cambie la composición de la fase móvil de metanol a acetonitrilo
e. posteriormente, registre para cada compuesto:
Tiempo de retención ( )
Factor de retención (K’)
Ancho de banda (sigma total – )
Adjunte imagen del cormatograma obtenido
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f. explique por que se da el cambio en los tiempos de retención y en la
separacion de los compuestos cuando el metanol es sustituido por el
acetonitrilo.
Los solventes polares arrastran mas eficazmente los compuestos mas
retenidos en la fase estacionaria
Los solventes menos polares, arrastran muy lentamente a los compuestos los
compuestos más polares estarán menos retenidos que los menos polares.
Los tiempos de retención disminuyen cuando menor sea la proporción de
agua, cuando menos polar sea el disolvente empleado.
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El tiempo de retención aumenta con la adición de disolvente polar a la
fase móvil y disminuye con la introducción de disolventes más
hidrológicos.
En que caso se obtiene una mejor separación
En el primer caso, cuando utilizamos metanol, ya que se observan 8 de las 9
muestras y con picos bien definidos y separados, solo encontramos un
compuesto que sale al mismo tiempo con otro. Mientras que en el segundo
caso, utilizando acetonitrilo, vemos 7 de 9 compuestos y en algún caso están
integrados varios picos en 1
g. ¿Cuál es la importancia del agua en la composición de la fase móvil?
El agua puede contener tampones, sales, o compuestos como el ácido
trifluoroacético, que ayudan a la separación de los compuestos
La cromatografía de fase reversa se basa en el principio de las
interacciones hidrofóbicas que resultan de las fuerzas de repulsión entre
un disolvente relativamente polar (el agua es altamente polar) , un
compuesto relativamente apolar, y una fase estacionaria apolar.
Sección c: Efecto por porcentaje del modificador en la composición de la
fase móvil sobre la retención y la resolución.
1. En el listado de compuestos, elimine 7 solutos dejando solo a
Acetophenone (acetofenona) y Ethylparaben (etilparabeno).
2. Fije las condiciones del simulador de acuerdo con las indicaciones de la guía: a) Registre el tiempo de retención, el factor de retención y el sigma total para
los dos compuestos. Adjunte una imagen del cromatograma obtenido.
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Compuesto 95% Tiempo de retención (Tr)
factor de retención K’
sigma total
Acetofenona
1,1185 0,0516 0,5485
Etilparabeno
1,1196 0,0526 0,5490
b) Calcule el tiempo muerto.
El tiempo muerto es de 65 seg.
c) Calcule la resolución, α, para los dos compuestos.
3. Cambie gradualmente el porcentaje de metanol en intervalos de 10% iniciando en
95% y terminando en 5% (95%, 85%, 75%, 5%).
3. Registre el tiempo de retención, el factor de retención y el sigma total para los dos
compuestos. Adjunte una imagen del cromatograma obtenido.
% Compuesto Tiempo de retención (tR)
factor de retención K’
sigma total
Imagen
95 Acetofenona
1,1185 0.0516 0.5485
Etilparabeno
1,1196 0.0526 0.5490
85 Acetofenona
1.1802 0.1096 0.5654
17
Etilparabeno
1.1987 0.1270 0.5739
75 Acetofenona
1.3109 0.2325 0.6243
Etilparabeno
1.3897 0.3066 0.6601
65 Acetofenona
1,5885 0,4935 0.7571
Etilparabeno
1,8506 0,7399 0.8785
55 Acetofenona
2,1774 1,0472 1,0401
Etilparabeno
2,9628 1,7856 1,4101
45 Acetofenona
3,4272 2,2222 1,6380
Etilparabeno
5,6471 4,3094 2,6934
35 Acetofenona
6,0793 4,7157 2,8960
Etilparabeno 12,1254 10,4002 5,7717
25 Acetofenona
11,7073 10,0070 5,5334
Etilparabeno 27,7601 25,0997 13,1177
15 Acetofenona
23,6504 21,2358 11,0663
Etilparabeno 65,4928 60,5755 30,6429
5 Acetofenona
48,9946 45,0642 22,7749
Etilparabeno 156,5566 146,1926 72,7735
e) Calcule el tiempo muerto. Podemos darnos cuenta que el tiempo muerto va disminuyendo, con el cambio del porcentaje del metanol, en el 95% el tiempo muerto es de 65 seg, y baja gradualmente con el cambio de porcentaje, para el 5% el tiempo muerto es de o,8 milicimas de segundo. f) Calcule la resolución, α, para los dos compuestos.
WA y WB son los anchos de banda de A y B respectivamente.
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Resolución Acetofenona
Resolución Etilparabeno
4. Repita el mismo proceso cambiando el metanol por ACETONITRILO.
Tiempo de retención ( )
Factor de retención (K’)
Ancho de banda (sigma total – )
Adjunte imagen del cromatograma obtenido
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4. Repita el mismo proceso cambiando el metanol por acetonitrilo
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5. Con los hallazgos realizados en esta sección, elabore una conclusión
sobre el efecto del porcentaje del modificador en la composición de la fase
móvil sobre la retención y la resolución.
A medida que se va utilizando mayor cantidad de solvente menos polar los
tiempos de retención son menores, es decir a menor cantidad de agua como
solvente menor tiempo de retención.
Si fuera contratado en un laboratorio para separar, por medio de
cromatografía liquida, de una mezcla los compuestos acetofenona y
etilparabeno. Cual seria la mejor composición de fase móvil a emplear?
Justifique?
Considero que la mejor composición de fase móvil es la mezcla de agua: metanol
en las condiciones 5 ( 45:55 ) y la 6 (55:45) porque los compuestos salen con
diferencia de tiempo prudencial, los picos están bien definidos, y gastaríamos
menos solventes que en otras condiciones. Los dos reactivos tienen el mismo
riesgo de inflamabilidad (3), igual riesgo de reactividad (0) pero tiene menor riesgo
de salud el metanol (2) y el acetonitrilo (3)
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BIBLIOGRAFIA
http://www3.uah.es/mol_play/1.htm http://www.quiminet.com/productos/butilparabeno-6373322859.htm http://www.madrimasd.org/blogs/remtavares/2009/02/20/113222 http://www.hplcsimulator.org/http://www.youtube.com/watch?v=wYEDJu0pJy4 http://www.hplcsimulator.org/index.php http://www.ulpgc.es/hege/almacen/download/39/39360/separaciones_po r cromatografia_1.pdf http://www.mncn.csic.es/docs/repositorio/es_ES/investigacion/cromatogr afia/principios_de_cromatografia.pdffile:///D:/DATOS/Downloads/file.pdfhttp://ocw.uv.es/ocw-formacio-permanent/2011-1-35_Manual.pdf