MC Roxana Regalado Rafael

Médico Patólogo Clínico

Complejo Mayor de

Histocompatibilidad

HLA

Trasplante de Médula Ósea: Un largo camino

Siglo XIX, el médico hematólogo alemán Arthur Pappenheim propuso concepto de Célula Precursora como el origen de todas las líneas celulares hematopoyéticas.

En 1956, Lorenz et. al define la colonización de la médula ósea del receptor por las células progenitoras hematopoyéticas (CPH) del donador.

Revista de Investigación Clínica/Vol.57, Num. 2 / Marzo – Abril 2005/ pp. 129-131

En 1959, Jean Dausset (Francia) describe el sistema del Complejo Mayor de Histocompatibilidad – HLA. “Si los leucocitos de dos personas son compatibles, sus tejidos también lo son”, deducción que permitió el estudio de histocompatibilidad del HLA entre el donante y el receptor para lograr un trasplante exitoso.

Premio Nobel de Medicina - 1980

Fundación Jean Dausset

(CEPH)

PERÚ ONDT -2013 501 Trasplantes,- diversos órganos, 95% riñón 3.2 x millón de habitantes son donantes

Tipaje de HLA en TPH con doble objetivo • Construir registros de donantes voluntarios • Desarrollar la búsqueda de pacientes que

precisaran un donante compatible

24 845 466 24 225 182 donantes y 620 284 CBU's

En 1969, el médico estadounidense Donald Thomas comunicó el primer trasplante en un paciente adulto con Leucemia Aguda.

En Perú, se crea en 1990 la primera unidad de trasplante de médula ósea en el Hospital Edgardo Rebagliati EsSALUD. En 1994 se realiza el primer trasplante autólogo en un paciente con enfermedad de Hodgkin.

Revista de Investigación Clínica/Vol.57, Num. 2 / Marzo – Abril 2005/ pp. 129-131

SALAVERRY GARCÍA, Oswaldo. Historia de la medicina peruana en el siglo XX, Vol.1

CLASIFICACION DE LOS TRASPLANTES

Naturaleza del tejido trasplantado

Rol Funcional e Importancia de Cèlulas Madre Hematopoyèticas

1. Supervivencia: Reconocimiento de los Propio y lo Extraño.

2. Respuesta y Regulación Inmunológica.

3. Tolerancia Inmunologica: Transplante, Aloinmunización, Refractariedad.

4. Autoinmunidad y predisposición a Enfermedades (Resistencia o suceptibilidad)

5. Estudio de poblaciones y Paternidad.

1. TPH Autólogo:

Se colectan

células madre

del paciente

Las células madre

autodonadas se reinfunden

en el paciente

El paciente recibe

quimioterapia o radiación

TRASPLANTE DE PROGENITORES HEMATOPOYETICOS

2. TPH Alogénico: Relacionado – No Relacionado El paciente recibe

quimioterapia o radiación Se colectan las

células madre del

donante

Las células madre son

infundidas en el paciente

TRASPLANTE DE PROGENITORES HEMATOPOYETICOS

3. TPH Singénico o Isotrasplante:

4. Xenotrasplante:

TRASPLANTE DE PROGENITORES HEMATOPOYETICOS

Hermanos gemelos Tejido de animales

Un receptor y un donante deben ser HLA compatibles

• De la misma forma que en una transfusión de sangre el donante y el receptor necesitan ser compatibles en el grupo sanguíneo del Sistema ABO.

• En un trasplante de órganos o de médula ósea, ambos necesitan ser compatibles en el Sistema HLA, o de Antígenos Leucocitarios Humanos.

Sistema Principal de Histocompatibilidad

¿Qué es el Sistema HLA?

• Los Antígenos Leucocitarios Humanos – HLA son moléculas que se encuentran en los glóbulos blancos (o leucocitos) de la sangre y en la superficie de casi todas las células de los tejidos de un individuo.

• Tienen la función de reconocer lo propio y lo ajeno y aseguran la respuesta inmune, capaz de defender al organismo de algunos agentes que generan infecciones.

• Ese conjunto de moléculas y las formas en que son transmitidas de padres a hijos constituyen un Sistema también denominado de Histocompatibilidad (histo = tejidos) o de la individualidad (lo propio y lo ajeno).

• Su descubrimiento ha permitido a la medicina dar un salto cualitativo en las posibilidades de éxito de un trasplante.

¿Qué es el Sistema HLA?

¿Cuál es la función del CMH?

• Presentar peptidos

Restricción CMH

• ¿Todos los antígenos

deben ser

presentados por CMH ?

• El trasplante como tratamiento de ciertas enfermedades es relativamente reciente.

• Los primeros se efectuaron en los años 60’ siendo el gran problema el rechazo.

• Posterior a la década de los 70’ el descubrimiento del Sistema HLA se pudo valorar mejor el fenómeno del rechazo, EICH y realizar TAMO con menor riesgo medidos por los criterios de compatibilidad.

¿Cómo ayuda el Sistema HLA?

DISTRIBUCIÓN DIFERENCIAL DE LAS MOLÉCULAS CMH

TEJIDO CMH- I CMH-II LT +++ +/- LB +++ +++ Macrofagos +++ ++ CD +++ +++ Células epiteliales Tímicas + +++ Neutrofilos +++ - Hepatocito + - Riñón + - Cerebro (neurona no) + - Eritrocito - - Sincitio trofoblástico - -

CMH = HLA CMH-I: • se expresa constitutivamente en todos los tejidos

• niveles altos: células linfoides

• niveles moderados: mayoría

• bajos: hígado

• Se incrementa por IFN-I VIRUS

¿Cuántas moléculas de CMH-I se expresan en

cada célula nucleada ?

Más de 100.000 de cada CMH-I

CMH-II: • Distribución restringida

• Inducido por IFNg

• Existen «lugares estratégicos» en el Sistema HLA que sirven para examinar si una persona puede ser compatible con otra en caso de injerto: HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DR y HLA-DQ.

• El tipo de molécula – antígeno – presente en A, B, C, DR y DQ es lo que determina la posibilidad de aceptación del tejido (órgano o médula ósea) de un donante por el organismo de un receptor.

¿Qué significa ser HLA compatible?

Programa de MO – SINDOME Uruguay 2014

• Para que dos personas sean compatibles los antígenos presentes en cada uno de esos lugares deben ser idénticos o tener ciertas coincidencias.

• Se detecta a través de un análisis de sangre en el que la muestra es sometida a varias técnicas de laboratorio que incluye el análisis de ADN.

¿Qué significa ser HLA compatible?

Los antígenos se identifican por un número y pueden ser enormemente variados. • Se reconocen más de 300 para lugar A. • Alrededor de 500 para el lugar B. • Más de 150 para el C. • 400 para el lugar DR. • Más de 50 para el DQ. • Bajo la lupa de la investigación estos números seguirán

incrementando de forma constante. • Esto nos permite evidenciar un alto número de

COMBINACIONES posibles y por ello lo difícil que ellas sean COINCIDENTES.

¿Qué significa ser HLA compatible?

Programa de MO – SINDOME Uruguay 2014

Enfermedad Gen HLA Riesgo relativo Síndrome de Reiter B27 37 Espondilitis anquilosante B27 86 Tiroiditis de Hashimoto B47 15 Esclerosis Múltiple DR2 5 Artritis Reumatoide DR4 4 Diabetes Juvenil DR3/DR4 3 – 6 Enfermedad Celíaca DQ2 / DQ8 48

Asociaciones HLA-Enfermedad

• El ADN es el material genético heredado de padres a hijos.

• Se halla en el cromosoma del núcleo de la célula de todo el organismo … GB de la sangre.

• Están químicamente constituidos por un encadenamiento de ELEMENTOS BÀSICOS que se podrían comparar con las letras de un alfabeto.

• Estos EB se combinan para constituir un TEXTO organizado que trasmite un mensaje.

• En este texto se reconocen diferentes secciones que son los GENES.

¿Qué significa ser HLA compatible?

Programa de MO – SINDOME Uruguay 2014

• El ADN se hereda de los padres en una combinaciòn peculiar para cada hijo.

• Los genes del Sistema HLA se trasmiten siempre en BLOQUE.

• Cada bloque se denomina HAPLOTIPO.

• El padre aporta un haplotipo (mitad del genotipo) y la madre el otro dando origen al GENOTIPO HLA.

• Este es el PERFIL GENETICO propio del nuevo ser.

¿Qué significa ser HLA compatible?

• Este perfil O «Huella Genética» es la que debe COINCIDIR en los «Lugares estratégicos» para que dos tejidos se acepten.

• Esto es llamado COMPATIBILIDAD.

¿Qué significa ser HLA compatible?

Programa de MO – SINDOME Uruguay 2014

Programa de MO – SINDOME Uruguay 2014

• Un donante es HLA Compatible cuando su «Huella Genética» controlada en A, B, C, DR y DQ presenta una combinación molecular idéntica o con ciertas coincidencias con la combinación del receptor.

• Según el tipo de trasplante, se necesitará diferentes grado de coincidencias.

¿Somos o no Compatibles?

Programa de MO – SINDOME Uruguay 2014

¿Somos o no Compatibles?

Los hijos podrán heredar cualquiera de estas cuatro combinaciones del material genético transferido

por los padres.

¿Cuál heredará cada uno?

Depende del azar.

Existen 50% de posibilidades

de que 2 hermanos

compartan un solo haplotipo,

25 % de posibilidades

de que no compartan ninguno

y 25% de que coincidan

en ambos haplotipos

Autor: Dr. Ausberto Chunga Chunga – Hospital Nacional Edgardo

Rebagliati Martins – Banco de Organos y Laboratorio de

Histocompatibilidad, Lima - Perú

¿Cuál heredará cada uno? Las personas con genotipo

a-c; a-d; b-c, b-d descienden de progenitores que

aportan los haplotipos a y b, por un lado, y c y d, por otro.

Un individuo está siempre constituido

por material genético que provienen de los padres biológicos.

¿Cuál heredará cada uno? • Cualquiera de las cuatro combinaciones posibles indica que el

individuo proviene de los mismos padres.

• Sólo ciertas coincidencias en la combinación heredada hacen que un hermano sea HLA compatible.

• Según el tipo de trasplante, receptor y donante deberán compartir uno o dos haplotipos.

¿Qué es la Tipificación HLA? • La tipificación HLA es un análisis complejo que permite

identificar y comparar receptores y donantes en Sistema HLA, y determinar la compatibilidad - o no - de sus perfiles (para un trasplante).

• La tipificación nos permite establecer qué posibilidades tiene una persona de socorrer a otra, en base a la donación de un órgano o de algunos centímetros cúbicos de su médula ósea.

• Dato de suma importancia para el médico tratante quien debe evaluar la posibilidad de encarar un trasplante y sus posibilidades de éxito.

Identifiquemos la

Compatibilidad

BIOLOGIA DEL TRASPLANTE ÉXITO O FRACASO

HISTOCOMPATIBILIDAD DE HLA

IGUAL - SIMILITUD GENETICA - DONANTE Y RECEPTOR ACEPTACION

AUSENCIA - SIMILITUD GENÉTICA- DONANTE Y RECEPTOR RECHAZO

ESTUDIO DE ANTIGENOS DE HLA PARA

TRASPLANTE EXITOSO

Evitar el riesgo de los dos obstáculos

principales:

o Enfermedad de Injerto contra Huésped

o Rechazo de trasplante

COMPATIBILIDAD HLA

Renal 2° 3°

Hepático

SE EXIGE LA MAXIMA C O M P A

T MODERADA I B I L I D A D

DEPENDE DEL AZAR

Cardiaco Pulmonar

MEDULA OSEA

RENAL 1°

¿Para qué Tipificamos?

1. Estudios de histocompatibilidad para trasplante de órganos vascularizados.

2. Estudios de histocompatibilidad para trasplante de médula ósea.

3. Estudios de paternidad. 4. Estudios antropológicos para establecer posibles

relaciones entre distintas poblaciones o grupos étnicos.

5. Estudios de asociación de alelos del HLA con enfermedades (susceptibilidad)

¿Dónde se realiza la Tipificación? • En los Laboratorios de

Histocompatibilidad a partir de una extracción de sangre.

• Las muestras de pacientes y familiares son sometidas a procedimientos altamente especializados y muy específicos que permiten identificar los antígenos presentes en los “lugares estratégicos” de la sangre analizada.

• Hemos implementado desde el inicio la tipificación de los 5 locus para el TAMO de CPH.

• La tipificación HLA requiere una solicitud del médico tratante y una extracción de sangre en día y hora coordinados.

¿Cómo Tipificamos? • Técnicas Serológicas:

- Microlinfocitotoxicidad en placas de Terasaki

• Técnicas Moleculares:

- PCR con cebadores específicos de secuencia (SSP)

- PCR con cebadores específicos de locus e

hibridización con sondas marcadas, específicas de alelos (SSOP)

- Secuenciación directa (SBT)

- Hibridación reversa

- Luminex

Resolución HLA Molecular

• Baja Resolución Molecular: Resolución de 02 dígitos.

• Mediana Resolución Molecular: *** AD Resolución de un set de posibles alelos.

• Alta Resolución Molecular: Resolución de alelo único: Resolución de 04 dígitos.

Técnica de PCR - SSO Procesos para el marcaje de DNA

Amplificar Denaturar

Hibridar Marcar

2ul DNA

8 ul

primer

0.2 ul Taq

1.8 ul

Buffer

Amplificación

(90min)

Denaturación/

Neutralizació

n

(10min)

Añadir Beads

Hibridización

(15min-50°C)

Lavado

Añadir

SAPE

Lavado

Lectura

Obtención DNA marcado

Nombre Reactivos

característicos

Procesos

característicos

Polimorfismos

detectados

RFLP Endonucleasas de

restricción

bacteriana

Southern blot

Longitud del

fragmento de

restricción

SSP Cebadores de PCR

específicos a

secuencia

PCR/electroforésis

en gel

Genérico a

antígenos HLA a

nível de alelo

SSOP

Sondas de

aligonucléotido

específicas a

secuencia

PCR/hibridación de

sondas con

producto de la

PCR

Alelos HLA

SBT

Cebadores

marcados/terminald

ores de secuencia

marcados

PCR/establecimien

to de secuencia del

producto de la

PCR

Alelos a nivel de

secuencia exacta

Análisis

hetero-

dúplex

DNA desna-

turalizado de tira

simple/generador

UHG

Reunión de tiras

de DNA /electro-

forésis del DNA

recombinado

Complejos del DNA

característicos de

alelos

Resultado e Informe

de estudios de HLA

Informe Final de Resultados

BIOLOGIA DEL TRASPLANTE ÉXITO O FRACASO

HISTOCOMPATIBILIDAD DE HLA

IGUAL - SIMILITUD GENETICA - DONANTE Y RECEPTOR ACEPTACION

AUSENCIA - SIMILITUD GENÉTICA- DONANTE Y RECEPTOR RECHAZO

ESTUDIO DE ANTIGENOS DE HLA PARA

TRASPLANTE EXITOSO

Evitar el riesgo de los dos obstáculos

principales:

o Enfermedad de Injerto contra Huésped

o Rechazo de trasplante

Medicina & Laboratorio, Volumen 16, Números 1-2, 2010

RESPUESTA INMUNOLOGICA EN EL RECHAZO AGUDO

Medicina & Laboratorio, Volumen 16, Números 1-2, 2010

ETAPAS EN EL RECHAZO CRÓNICO

DONANTE RELACIONADO HAPLOIDENTICO

Los problemas principales que se relacionaban a este tipo de donantes se pueden resumir:

1. Con repleción de células T (no modificado): – Alta tasa de EICH.

– Alta mortalidad relacionada al trasplante.

2. Con Depleción de células T. – Alta tasa de recaída.

– Alta mortalidad relacionada a reemergencia de la enfermedad

MC. Roxana Regalado R.

Blga. Gissella Noroña C.

Blgo. César Saravia P.

Blgo. Pável Rubio R.

Blga. Ruth Roncalla M.

Blga. Rosarella Monteza S.

rregalado@inen.sld.pe

lab_tamo@inen.sld.pe

2016500 Anexo 1428

Equipo de Trabajo

Laboratorio de Histocompatibilidad y

Criopreservación