Enzimología clínica

Química Clínica II

-2013-

Enzimología clínica

Aplicación del conocimiento de

las enzimas al diagnóstico,

tratamiento y pronóstico de una

enfermedad.

Enzimas

• Moléculas de naturaleza

proteica que catalizan

reacciones químicas,

energéticamente favorables.

• Poseen similar composición

y estructura que las demás

proteínas.

• Son afectadas por los

mismos factores físicos y

químicos.

Generalidades de las enzimas

•Poseen propiedades catalíticas •Aumentan la velocidad de reacciones químicas in vivo e in vitro. •Se encuentran en membrana, núcleo, citoplasma y organelos subcelulares (mitocondrias, lisosomas, núcleo, etc.)

Poder catalítico de las enzimas

Definiciones •Apoenzima: enzima inactiva por falta de componente no proteico.

•Holoenzima: complejo formado por una enzima más un componente no proteico asociado.

•Cofactores: sustancias no proteicas asociadas, necesarias para la actividad catalítica de una enzima (Mg+, Cl-, Zn2+, K+)

•Coenzima: moléculas orgánicas asociadas necesarias para la actividad catalítica de una enzima

Cosustratos: NADP+, fosfato de piridoxal

Grupos prostéticos: grupos fuertemente unidos, considerados parte estructural de la enzima.

...Definiciones

•Metaloenzimas: enzimas con iones metálicos fuertemente unidos. •Sitio activo: lugar en la enzima donde puede llevarse a cabo la catálisis de un sustrato específico. •Sitio alostérico: cavidad distinta al sitio activo que puede enlazar moléculas reguladoras (cofactores).

Propiedades de las enzimas

• Son efectivas en pequeñas

concentraciones

• No son modificadas por la

reacción que catalizan

• Afectan la velocidad de la

reacción para alcanzar el

equilibrio.

• No todas las enzimas son

exclusivas de un solo tejido.

• La alteración de la

concentración sérica de

éstas, orienta sobre los

tejidos afectados

• Cada enzima posee

isoenzimas características.

Desnaturalización

•Uniones de metales pesados al sitio activo •Cambios de temperatura extremos •Adición de ácidos o bases fuertes •Cambios de pH •Cambios de presión •Rayos ultravioleta •Cambios en la concentración de sales •Detergentes •Solventes orgánicos

Clasificación y nomenclatura

de las enzimas

• EC (Enzime commission)

• IUB (International Union of Biochemestry)

• Sistema de nomenclatura (1961)

– Sustrato en el que la enzima actúa

– Reacción catalizada

– Coenzima que participa en la reacción

• Acepta nombres triviales (más prácticos)

Codificación numérica EC

EC 1.1.1.27 (LACTATO DESHIDROGENASA)

• 4 números separados por puntos

– 1. Clase de enzima (oxidorreductasa)

– 1. Grupo sobre el que actúa (-CH)

– 1. Coenzima o aceptor (NAD+ o NADP+)

– 27. Número de orden de la enzima

Clases de enzimas

1. Oxidorreductasas

2. Transferasas

3. Hidrolasas

4. Liasas

5. Isomerasas

6. Sintetasas

Oxidorreductasas

• Transferencia de electrones/redox

A-red + B-ox ↔ A-ox + B-red

• Sus nombres comunes incluyen las

palabras:

• Deshidrogenasas, reductasas, oxidasas,

peroxidasas

Transferasas

• Transferencia de un grupo distinto al

hidrógeno (amino, carboxilo, glucosilo,

metilo o fosforilo) de un sustrato a otro.

• A-X + B ↔ A + B-X

• Ejemplo:

• ALAT, quinasas, transcarboxilasas

Hidrolasas

• Ruptura de enlaces C-O, C-N con la

adición de moléculas de agua

A-B + H2O ↔ A-OH + B-H

• Ejemplo:

• FAL, amilasa, ureasa, pepsina, quimotripsina,

peptidasas y esterasas

Poco uso clínico

Liasas

• Hidrolizan uniones C-C, C-O y C-N por eliminación, con formación de un doble enlace.

• Adición de grupo al doble enlace (sintasa)

A + B ↔ AB (sintasa)

AB ↔ A + B (liasa)

Isomerasas

•Cambios

estructurales o

geométricos en

una molécula.

ABC ↔ CAB

Ligasas (sintetasas)

Dos moléculas son unidas, con la hidrólisis

del pirofosfato del ATP

A + B + ATP ↔ AB + ADP + Pi

Poco uso clínico

Mecanismo catalítico de las enzimas

• Concentración del sustrato

– Constante de Michaelis-Menten (1913) Km

Factores que afectan las

reacciones enzimáticas

Gráfica de Lineweaver-Burk

• Concentración de la enzima

– Siempre y cuando la concentración de

sustrato no sea limitante.

– La velocidad de reacción será proporcional a

la concentración de la enzima.

• pH

– Depende del origen fisiológico de la enzima.

– Cualquier cambio de pH puede afectar la

actividad biológica de la enzima por cambios

de estado iónico de los aa en el sitio activo.

Factores que afectan las

reacciones enzimáticas

• Temperatura

– A mayor temperatura mayor velocidad de

reacción (hasta la desnaturalización de la

enzima).

– Por cada 10º C la velocidad de reacción

aumenta un 100%

– La temperatura de reacción óptima depende

del medio fisiológico de cada enzima.

– El proceso de congelación inactiva

reversiblemente a las enzimas.

– 25, 30 y 37º C.

Factores que afectan las

reacciones enzimáticas

• Cofactores

– Entidades no proteicas que deben enlazarse

a las enzimas para que éstas se activen.

– Activadores: iones metálicos (calcio, hierro,

magnesio, manganeso, zinc y potasio); iones

no metálicos (cloro y bromo).

– Si se encuentran en exceso pueden inhibir la

reacción.

– Coenzimas: vitaminas y fosfatos de

nucleótidos.

Factores que afectan las

reacciones enzimáticas

• Inhibidores

– Competitivos: cuando la sustancia se une

físicamente al sitio activo de la enzima y

compite con el sustrato por éste sitio activo.

– No competitivos: cuando la sustancia se une

a la enzima en un lugar distinto al sitio activo.

– Inhibición acompetitiva: la sustancia se une

al complejo enzima-sustrato. A mayor

cantidad de complejos, mayor inhibición.

Factores que afectan las

reacciones enzimáticas

Inhibición

competitiva

Inhibición no

competitiva

Inhibición

acompetitiva

¿Qué se mide en el laboratorio respecto a las enzimas?

A. La cantidad de enzima presente en el suero.

B. La velocidad a la que se lleva a cabo una reacción catalizada por la enzima.

C. La cantidad final de producto formado por la enzima.

RESPUESTA

B. La velocidad a la que se lleva a cabo una reacción catalizada por la enzima.

"...De los varios miles de enzimas presentes en

plasma, la medición de la concentración de una

sola enzima, aún cuando esté presente en un

valor muy elevado, es menor que el límite

detección para la mayoría de los ensayos

químicos de proteínas. El parámetro más fácil de

medir y que está biológicamente relacionado a

muchas condiciones clínicas es la cantidad de

actividad catalítica de la enzima y cómo cambia

con el tiempo." Química Clínica de Kaplan.

Actividad enzimática

•Cantidad de sustrato que es convertida a

producto por unidad de tiempo bajo

condiciones definidas.

•Es un parámetro más fácil de medir que

la concentración de una enzima y está

directamente relacionado con la misma.

•Biológicamente está relacionada a

muchas condiciones clínicas.

Principio del análisis

La concentración de enzimas en suero es muy

baja, sin embargo, dada su eleva capacidad

catalítica, es posible determinar su actividad y

suponer que ésta es proporcional a su

concentración.

El estudio de las enzimas en el laboratorio se basa

en la demostración “in vitro” de la actividad

catalítica.

Medición de la

actividad enzimática

•Se puede medir mediante:

•Cuantificación del incremento en la

concentración de producto.

•Disminución en la concentración de sustrato.

•Reducción en la concentración de coenzima

•Aumento en la concentración de coenzima

alterada.

Medición de la

actividad enzimática

•No debe haber inhibidores

•Controlar variables que afectan la

velocidad de reacción

•pH constante por medio de amortiguadores

•Temperatura constante durante todo el

ensayo dentro del rango de 0.1º C. (25, 30 ó

37º C).

•Tiempos de incubación exactos.

Medición de la

actividad enzimática

•Se utilizan regularmente 2 métodos:

•Tiempo fijo: se incuba la reacción por un

tiempo determinado, luego se detiene

mediante la adición de un ácido débil y se

cuantifica el producto, coenzima, etc.

•Cinético: se hacen mediciones múltiples

(normalmente cambios de absorbancia) a

intervalos de tiempo específicos (30 a 60

segs) o en forma continua.

Medición de la

actividad enzimática

•La EC definió las Unidades Internacionales

para estandarizar un sistema de medición de

enzimas.

•UI = cantidad de enzima que cataliza la

reacción de un micromol de sustrato por

minuto, en condiciones específicas de

temperatura, pH, sustratos y activadores.

•Regularmente se expresa UI/L aunque el

Sistema Internacional utiliza el katal (mol/s).

Fases de la actividad enzimática

• Fase de retardo (fase lag)

– Ocurre justo después de mezclar los reactivos con la

muestra.

– Ocurre el encuentro y acoplamiento de sustrato y

enzima.

– Su duración variable (aunque sonpocos segundos).

• Fase lineal

– La formación de producto es constante en esta fase.

– En esta fase se realizan los ensayos.

Fase de agotamiento de sustrato

– La velocidad de reacción disminuye hasta anularse

.

Fases de la actividad enzimática

Actividad enzimática

para el diagnóstico

• La enzima debe estar presente en fluidos

corporales.

• Debe ser fácil de analizar (automatización).

• Deben existir diferencias significativas entre las

concentraciones en estado patológico y no

patológico

• Debe mantenerse estable por un tiempo

prudencial.

Enzimas como marcadores

• Las enzimas del plasma se pueden

clasificar en 2 grupos:

• Enzimas específicas del plasma

• Enzimas no específicas del plasma

• Enzimas de secreción

• Enzimas del metabolismos intermediario

Enzimas como marcadores

• Enzimas específicas del plasma:

• Tienen una función específica en el plasma.

• Están presentes en concentraciones más altas

en el plasma que en los demás tejidos.

• Entre estas se encuentran las enzimas de la

coagulación (pseudocolinesterasa, ferroxidasa

y fosfolipasa).

• Se sintetizan en el hígado y sirven como

marcadores de daño o disfunción hepática

cuando su concentración disminuye.

Enzimas como marcadores

• Enzimas no específicas del plasma:

• No tienen una función específica en el plasma.

• Están presentes en concentraciones más

bajas que en los demás tejidos.

• Regularmente no están activas porque hay

una deficiencia de activadores y cofactores en

el plasma.

Enzimas como marcadores

• Enzimas no específicas del plasma:

• Enzimas de secreción:

• Enzimas secretadas desde las glándulas exocrinas

(páncreas y próstata)

• Algunas provienen de la mucosa gástrica.

• Son de utilidad clínica cuando sus valores se

encuentran fuera del rango de referencia.

• Se elevan en sangre por sobreproducción o por

excreción bloqueada.

• Disminuyen por necrosis del tejido que las produce.

Enzimas como marcadores

• Enzimas no específicas del plasma:

• Enzimas del metabolismo intermediario

• Circulan en concentraciones bajas comparadas

con las concentraciones presentes en los tejidos.

• Regularmente se observan elevaciones cuando

existe daño inflamatorio o necrótico en los tejidos

que las producen.

• Su disminución no tiene significancia clínica.

• Algunos ejemplos de estas enzimas son: CK, LDH,

ALAT y ASAT.

Factores pre-analíticos que afectan

la medición de actividad Tiempo de muestreo adecuado

Las enzimas no poseen ciclos circadianos.

Su concentración varía según el inicio de la condición

clínica (aguda y crónica).

Factores pre-analíticos que

afectan la medición de actividad

Condiciones de almacenamiento

Las muestras deben almacenarse a bajas

temperaturas porque las enzimas tienden a aumentar

su actividad conforme el tiempo

Sexo

Raza

Edad

Ejercicio físico

Factores analíticos que afectan

la medición de actividad

• Evitar ciclos de congelamiento-

descongelamiento.

• Evitar muestras con hemólisis y lipemia.

• Separar sueros rápidamente.

• Evitar estasis venosa durante extracción

sanguínea.

• Transportar a bajas temperaturas.

ISOENZIMAS O ISOZIMAS

• Múltiples formas de una enzima que

catalizan la misma reacción bioquímica

• Diferencias:

– Estructura polipeptídica

– Distinta afinidad por sustratos y cofactores

• Similitudes:

– Tamaño molecular

ISOENZIMAS

Aclaración importante:

• Izoenzimas: se refiere a productos

genéticamente distintos.

• Isoformas: se refiere a las modificaciones

postraduccionales de una misma enzima.

• Propiedades enzimáticas

• Capacidad de ser inhibidas por agentes específicos

• Constantes Km

• Reactividad con diferentes sustratos.

• Propiedades físicas

• Estabilidad térmica y carga.

• Propiedades bioquímicas

• Composición de aminoácidos y reactividad inmunológica

Diferencias entre isoenzimas

• Dímero: proteína compuesta de dos

subunidades.

• Heteropolímero: compuesto polimérico con

más de un tipo de subunidades.

• Homopolímero: compuesto polimérico en el

cual todas las subunidades son idénticas.

Definiciones

Diferentes formas de isozimas

• La enzima puede estar compuesta de 2

subunidades distintas A y B (dímero).

–AA (Homodímero)

–BB (Homodímero B)

–AB (Heterodímero AB)

– Las 3 formas son anteriores son

isoenzimas.

– Este sucede en el caso de CK, la cual

tiene 3 isoenzimas MM, MB, BB

Funciones distintas que

dependen de:

• Factores microambientales

de los organelos

intracelulares en las que se

encuentren.

• Factores macroambientales

por la demanda metabólica

y energética de los tejidos

que las produzcan.

Principales

isoenzimas:

• Creatinkinasa

• Lactato

deshidrogenasa

• Fosfatasa alcalina

• Fosfatasa ácida

Finalidad de las isoenzimas

• Dímero formado de subunidades M o B

• Cataliza en forma reversible la siguiente reacción:

Creatina + ATP ↔ fosfato de creatina + ADP

• Principalmente citoplasmática

• No atraviesa la barrera hematoencefálica (85,000 Da)

– CK-MM: tejido muscular adulto

– CK-BB: cerebro

– CK-MB: miocardio

Creatinkinasa

Creatinkinasa

• CK total:

◦ [ ] en casos de: infarto, traumatismos,

inyecciones IM, intervenciones quirúrgicas,

hipotiroidismo, embolia, diabetes, entre otras.

• CK-MB:

◦ [ ] compatible con daño cardíaco. Inicia el

aumento 3-6 h 12-24 recuperación 24-72

CK-MB

[ ] :

– Necrosis del músculo cardiaco (infarto)

– Falla congestiva cardíaca

– Intervenciones cardíacas

– Distrofia muscular (Duchene)

– Polimiositis

↓ [ ] :

– Sexo: F < M

– Pacientes hospitalizados

• Electroforesis (método de referencia)

• Cromatografía de intercambio iónico

• Inmunoensayos

– Radioinmunoensayo (RIA)

– Inmunoinhibición

Métodos para cuantificar/detectar

isoenzimas de CK

Según el método:

– Unidades por litro (UI/L)

– Kilounidades por litro (KU/L)

– Nanogramos por mililitro (ng/mL)

– Microgramos por mililitro (μg/mL)

– % diferencial entre CK/CK-MB

– Índice de CK-MB (mayor utilidad)

Dimensionales

• Cataliza la reducción de piruvato a lactato

• Tetrámero de subunidades M y H

• 5 isoenzimas

• LD1 y LD2: corazón y eritrocitos

• LD3: corteza renal, pulmón, linfocitos,

bazo y páncreas

• LD4 y LD5: hígado y músculo esquelético.

Lactato deshidrogenasa

Distribución tisular de isoenzimas de LDH

Lactato deshidrogenasa

Su concentración aumenta en casos de:

◦ Lesión miocárdica

◦ Miopatías

◦ Traumatismos musculares

◦ Embolia pulmonar

◦ Hemólisis

◦ Enfermedades hepáticas y renales

◦ Leucemia

◦ Shock

Se expresa en:

– Mucosa intestinal

– Hígado

– Hueso

– Riñón

– Placenta

Posee 3 isoenzimas

ALP-I, ALP-L y ALP-P

• En RN y niños, la

mayor parte de la

FAL serológica

proviene del hueso

• En el adulto: hueso,

hígado, riñón,

intestino

Fosfatasa alcalina

• Causas fisiológicas

de aumento:

– Crecimiento

– Deficiencia de

vitamina D

– Embarazo (2 meses

postparto)

– Post menopausia

• Causas patológicas

de aumento:

– Ictericia obstructiva

– Hiperparatiroidismo

– Osteomalacia

– Raquitismo

– Metástasis óseas

– Fracturas

Fosfatasa alcalina

• Centrifugar la mx antes de 30 minutos

• Procesar el mismo día - 30 %

• Su actividad disminuye con el uso de

anticoagulantes (muestras de plasma).

• Fármacos:

– actividad: alopurinol, anticonvulsivantes,

antineoplásicos, isoniazida, fenobarbital,

anticonceptivos orales,

– ⇊: calcitrol, nitrofurantoína, oxalatos.

Fosfatasa alcalina

Fosfatasa no específica que presenta

máxima actividad alrededor de pH 5.0

Fosfatasa ácida

• Se encuentra en los lisosomas de casi todas las células, pero principalmente en:

Hígado

Bazo

Plaquetas, eritrocitos, leucocitos

Glándula prostática (FAP)

Testículo

Vejiga

Páncreas

Fosfatasa ácida

Se observa aumento en su [ ] en:

– Procesos malignos de próstata

– CA con metástasis ósea (pulmón, páncreas, células

renales, hueso, mama, vejiga)

– HPB (Hipertrofia prostática benigna)

– Anemias: hemolítica-megaloblástica

– Mononucleosis

– Osteoporosis

– Prostatitis

Fosfatasa ácida

Fosfatasa ácida

• Es muy inestable en suero separado y a

temperatura ambiente.

• Se debe congelar si no se va a procesar

inmediatamente.

• Suele elevarse 48 hrs post tacto rectal.

• Se utiliza con fines forenses en los casos de

violación como evidencia legal del asalto

sexual.