Post on 14-Apr-2017
Bioq. Julia Irene Ariagno Hospital de Clinicas “José de San Martín”
FFyB - UBA
Estudio de la cinemática y
morfología espermática por el
método objetivo
Curso de Actualización en Laboratorio
Novedades en el Diagnóstico Bioquímico
Análisis del semen
Los parámetros analizados en el semen:
Reflejan la función exocrina de las glándulas sexuales masculinas
Orientan sobre patologías del sistema genital
Definen la fertilidad potencial del hombre
Análisis del semen
• Examen macroscópico:
– Licuefacción, color, aspecto, volumen, viscosidad, pH
• Examen microscópico:
– Concentración de esp. y otras células
– Movilidad
– Vitalidad
– Morfología espermática
Ferttilidad potencial del hombre
Se define por
– Concentración espermática
– Movilidad espermática
– Morfología espermática
Gran variabilidad biológica
Las causas son
• Subjetividad de los métodos
Desarrollo de métodos automatizados (objetivos)
• Falta de estandarización
de los procedimientos
Adherir a las normatizaciones de OMS 1999 o ESHRE 2002
(Sociedad Europea de Reproducción Humana)
OMS 2010
OMS 2010
Movilidad OMS 1999 – ESHRE 2002
Temperatura de transporte y conservación de la muestra
Platina termostatizada a 37°C
Tamaño de la gota de semen utilizada (10 µl)
Tamaño del cubreobjetos (22 x 22 mm)
Realizar por duplicado (2 alícuotas) contando 200 Ez en 5 campos c/vez
Clasificar solo a los Ez. Enteros (con cabeza y cola)
Errores en movilidad
• El error estándar del porcentaje (p) es
Ej: Si cuento 200 Ez y el % de Ez normales o móviles
progresivos da 20% entonces:
ES= 2.8
IC ( 95%)= p 1.96 x ES = 14.5% - 25.5%
Manual on Basic Semen Analysis (2002): Comparison of Proportions
% Promedio
Diferencia límite
0
1
1
2
02 -03
3
04 - 06
4
07 - 09
5
10 - 13
6
14 - 19
7
20 - 27
8
28 - 44
9
45 - 55
10
56 - 72
9
73 - 80
8
81 - 86
7
87 - 90
6
91 - 93
5
94 - 96
4
97 - 98
3
99
2
100
1
Clasificacion de la movilidad espermática
• MOVILES – GRADO a (movilidad progresiva lineal rápida)
– GRADO b (movilidad progresiva lineal lenta y/o no lineal)
– GRADO c (movilidad no progresiva, Ez. móviles “in situ”)
• INMOVILES – GRADO d
» Vivos
» muertos (eosina positiva)
OMS 1999
OMS 2010
• MOVILES (PR o NP) – MOVILES PROGRESIVOS (PR): movilidad progresiva
lineal lenta o rápida o no lineal
– MOVILES NO PROGRESIVOS (NP): movilidad no progresiva
• INMOVILES (IM) » Vivos
» Muertos (eosina positiva)
CLASIFICACION DE LA MOVILIDAD ESPERMATICA
CASA (COMPUTER ASISTED SEMEN ANALYSIS)
Sistemas automatizados
para el análisis objetivo de
la calidad del esperma.
Técnicas de análisis de imagen asistido por computadora
Antecedente: Sistemas computarizados semiautomáticos (80s)
Estudio de la cinemática espermática (CASA)
Los sistemas CASA reducen el error técnico,
presentando un bajo CV
Permiten la estandarización de resultados entre
laboratorios
Los parámetros aportados por estos sistemas
podrían tener un mayor poder predictivo
Permiten analizar semen de diferentes especies
El CASA digitaliza y recontruye el movimiento de
la cabeza de los Ez. (x imagenes/seg)
Imagen digitalizada de 1 espermatozoide
J. Androl. 2000 Jul-Aug;21(4):515-24. CASA--practical aspects. Mortimer ST
Limitaciones del método
Cruce de trayectorias quedando ambas indefinidas. (Editar la imagen)
Incapacidad para procesar imágenes con gran cantidad de trayectorias
(Diluir el semen con PS autólogo)
Confunde debris o células pequeñas con Ez. Inmóviles. (Editar la imagen)
Gran dependencia con las condiciones lumínicas del MO.
La forma de la
trayectoria se altera
considerablemente
por el número de
imágenes tomadas
por segundo, por lo
que puede parecer
relativamente simple
cuando se
reconstruye con 30
imágenes por
segundo, pero es
mucho mas compleja
si se toman 60
imágenes por
segundo.
Exactitud de la trayectoria
CASA (COMPUTER ASISTED SEMEN ANALYSIS)
Hamilton Thorne: IVOS, CEROS, HELOS
Microptic: Integrated Semen Analysis System (ISAS®)
Proiser: Sperm Class Analyzer (SCA)
Medical Electronic System: SQA-V Gold Automated Semen Analyzer
SCA Captura entre 1 y 100 imágenes/ muestra
Captura entre 25 y 100 imágenes/seg
Contraste de fases positivo o negativo.
Cámara Leja, Makler, Neubauer,
Microcell, Proiser, porta y cubre u otras.
Se puede calibrar para 10x o 20x.
Captura manual o automática
(posibilidad de trabajar con platina
motorizada)
Visualización conjunta e individual de
trayectorias
CAMARA LEJA (Leja slide)
Comparación de métodos Análisis de regresion
• Carlos Aulesa, et al. Evaluación del sistema automatizado Sperm Class Analyzers
(SCA) para análisis del semen. Rev Lab Clin.2009;2(1):8–16
r = 0,98
P=0,001.
Comparación de métodos: Análisis de regresión de Passing-Bablock y diferencias de medias de Bland Altman
0 100 200 300 400 500
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
CC Neubauer
CC
SC
A
0 100 200 300 400 500 600
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
CC Neubauer
CC
Ne
ub
au
er
- C
C S
CA
Mean
-0,0
-1.96 SD
-39,6
+1.96 SD
39,5
Recuento espermático
r= 0.9734
p <0.0001
• Chenlo P.H. et al. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana 2013; 47 (1): 00-00.
Recuento y movilidad (grado a y móviles progresivos) por el SCA vs. el método tradicional subjetivo
Recuento (Cámara de Neubauer)
Moviles Grado a
Moviles Progresivos
Ecuación de la recta
y= 6,008833+0,940119 X
y= 0,40000+1,073333 X
y= -7,275000+1,199000 X
r (p)
0.9734 (p<0.0001)
0.8167 8p<0.0001)
0.8355 (p<0.0001)
N
50
101
101
Pendiente
(IC 95%)
0,940119
(0,8361;1,0184)
1,073333
( 0,9470;1,2000)
1,199000
(1,0735;1,3562)
Ordenada al origen
(IC 95%)
6,008833
(2,0386;12,6371)
0,400000
(-1,0000;2,1363)
-7,275000
(-12,8625; -2,0176)
• Chenlo P.H. et al. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana 2013; 47 (1): 00-00.
Linealidad del recuento Linealidad recuento
y = 1,027x + 0,768
R2 = 0,997
0
20
40
60
80
100
120
140
0 20 40 60 80 100 120 140recuento teórico esperado
recu
en
to o
bte
nid
o S
CA
• El Intervalo de medición del método fue lineal. (r: 0.99, p<0.001)en el
rango de concentraciones estudiadas (0,98 a 125 x106/ml).
• Chenlo P.H. et al. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana 2013; 47 (1): 00-00.
Comparación de métodos: Análisis de regresión de Passing-Bablock y diferencias de medias de Bland Altman
Móviles progresivos
0 20 40 60 80
0
10
20
30
40
50
60
70
80
A+B Subjetivo
PR
SC
A
0 20 40 60 80
-30
-20
-10
0
10
20
30
A+B Subjetivo
A+
B S
ub
jetivo
- P
R S
CA
Mean
0,4
-1.96 SD
-18,6
+1.96 SD
19,4
r= 0.8355
p <0.0001
• Chenlo P.H. et al. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana 2013; 47 (1): 00-00.
Comparación de métodos: Análisis de regresión de Passing-Bablock y diferencias de medias de Bland Altman
Móviles grado (a)
0 10 20 30 40 50
0
10
20
30
40
50
Grado a Subjetivo
Gra
do a
SC
A
0 10 20 30 40 50 60
-40
-30
-20
-10
0
10
20
Grado a Subjetivo
Gra
do a
Subje
tivo -
Gra
do a
SC
A
Mean
-2,7
-1.96 SD
-16,7
+1.96 SD
11,3
r= 0.8167
p <0.0001
• Chenlo P.H. et al Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana 2013; 47 (1): 00-00.
Movilidad
VCL vs. VAP
VCL: Velocidad curvilinea
(Track Velocity) (µ/seg)
Es la velocidad media de todas
las fotos (tracks) tomadas en 1
imagen.
VAP: Velocidad promedio de la
trayectoria del Ez. (µ/seg).
VSL: Velocidad rectilínea (µ/seg) entre su posición inicial
y final.
ALH: Amplitud del
desplazamiento lateral de la cabeza.
Es el desplazamiento de la
cabeza respecto de l trayectoria
promedio.
PARAMETROS DE MOVILIDAD
VCL vs. VAP
Resultados según criterio OMS
Resultados según velocidad
Resultados según progresividad
Resultados según parámetros de velocidad
Informe
Computer-aided sperm analysis: a useful tool to evaluate patient's response to varicocelectomy.
Julia I Ariagno1, Gabriela R Mendeluk1, María J Furlan1, M Sardi1, P Chenlo1, Susana M Curi1,
Mercedes N Pugliese1, Herberto E Repetto1, Mariano Cohen2 1 Clinical Biochemistry Department, Male Fertility Laboratory, Faculty of Pharmacy and
Biochemetry, University of Buenos Aires, Argentina 2 Urology Department, "José de San Martín" Clinical Hospital, University of Buenos Aires, Buenos
Aires, Argentina
Asian J Androl. 2016 Apr 22. doi: 10.4103/1008-682X.173441. [Epub ahead of print]
El varicocele es considerado la causa más fecuente de infertilidad masculina. Esta condición puede ser detectada en el 19-41% de los pacientes con infertilidad primaria y el 45-81% de los hombres con infertilidad secundaria.
El impacto de la varicocelectomía sobre la fecundidad sigue siendo un tema controvertido.
Los parámetros del semen normalmente empleados para evaluar la fertilidad masculina, como el recuento espermático, la movilidad y la morfología, no son lo suficientemente precisos para definir la respuesta clínica al tratamiento quirúrgico según diferentes autores.
OBJETIVO: Evaluar los posibles cambios de los parámetros del semen post varicocelectomía empleando el análisis de semen asistido por computadora (CASA) y el método subjetivo según OMS 2010.
MATERIALES Y METODOS MATERIALES: ¤ Se analizaron 97 muestras de semen de:
• 38 de varones sanos fértiles de edades comprendidas entre 20 y 41 años • 38 de pacientes con varicocele (17-40 años); 6 con varicocele bilateral y 32
con varicocele del lado izquierdo. • 21 post varicocelectomía (17-40 años)
¤ Se analizaron muestras pre y post cirugía (3 a 6 meses) de 10 pacientes a los que
se les realizó varicocelectomía microquirúrgica subinguinal con el técnica de Marmar.
METODOS: ¤ Todas las muestras fueron analizadas por el método subjetivo según OMS 2010
(movilidad subjetiva y morfología espermática) y con el sistema CASA (Computer Assisted Semen Analysis – Sperm Class Analyzer® (SCA)) se determinaron los parámetros cinéticos y la concentración espermática.
Análisis estadístico ¤ Se empleó el software SPSS 14.0 para Windows (SPSS, Chicago, IL, USA).
Table 1: Descriptive statistics for semen parameters values for men from RP, pre-S and post-S,
assessed by conventional semen analysis and CASA-SCA
Table 2: Analysis of paired-sample semen parameters for 10 men pre-S and post-S assessed by
conventional semen analysis and CASA-SCA
Tabla 2: Análisis de muestras apareadas de 10 hombres pre y post cirugía.
Pre cirugía Post cirugía
Método subjetivo
Mean ± DS Mean ± DS p
Móviles progresivos (%) 37 ± 9.49 38.5 ± 10.49 0.78
Morfología (%) 4.6 ± 2.27 4.7 ± 2.00 0.91
CASA-SCA
Concentración espermática (106 /mL) 43.32 ± 27.03 43.22 ± 25.93 0.99
Rto total de espermatozoides (106 /eyac) 125.8 ± 115.6 121.4 ± 67.6 0.90
ALH (µm) 2.06 ± 0.55 2.12 ± 0.57 0.58
BCF (Hz) 7.67 ± 1.84 8.5 ± 1.44 0.10
VCL (µm/s) 46.35 ± 14.98 64.79 ± 19.87 0.002
VSL (µm/s) 23.98 ± 10.31 41.43 ± 12.30 0.0004
VAP (µm/s) 30.83 ± 11.43 49.31 ± 17.12 0.0005
LIN (%) 50.0 ± 7.8 63.0 ± 7.6 0.0005
STR (%) 76.0 ± 6.2 83.1 ± 5.6 0.004
WOB (%) 65.5 ± 6.0 75.5 ± 5.3 0.0003
Espermatozoides hiperactivos (%) 5.2 ± 4.3 10.2 ± 7.4 0.06
MP CASA (%) 28.3 ± 11.8 26.4± 12.0 0.73
PR rápidos CASA (%) 13.4 ± 6.7 16.1 ± 10.3 0.42
Tabla 2: Análisis de muestras apareadas de 10 hombres pre y post cirugía.
El análisis de las muestras pareadas reveló que la mayoría de los parámetros
cinéticos: VCL (p=0,002), VSL (p=0,0004), VAP (p=0,0005), LIN (p=0,0005),
STR (p=0,004) y WOB (p=0,0003) mejoraron después de la cirugía siendo estas diferencias estadísticamente significativas.
CONCLUSIONES • El método CASA permitió, a diferencia del método
subjetivo, evidenciar cambios en los parámetros seminales.
• El CASA brinda resultados potencialmente útiles para la evaluación cuantitativa precisa de la respuesta del paciente a la varicocelectomía.
• El valor clínico de los datos cinéticos debe ser probado en la práctica clínica.
Estudio de la morfología espermática por el método objetivo
Sistemas computarizados automáticos: morfología (ASMA)
Area (A)
Acrosoma (%)
Perímetro (P)
Angulo ()
Distancia (d)
Anchura (w)
CABEZA
Pieza Intermedia
Anchura (W)
Longitud (L)
Area (a)
Elipticidad: L/A
Rugosidad: 4S/P2
Elongación: (L-A)/(L+A)
Regularidad: LA/4S
Inconvenientes
Confunde el fondo con los elementos formes
No detecta anomalías d e la cola
Tiene alta dependencia con las condiciones de
iluminación y coloración
Sobrestima las anomalías de la cabeza y del
segmento intermedio por no poder distinguir el borde
citoplasmático del fondo.
No visualiza correctamente el acrosoma
De forma manual insume mucho tiempo
MUCHAS GRACIAS
jiariagno@gmail.com