Bioq. Julia Irene Ariagno Hospital de Clinicas “José de San Martín”

FFyB - UBA

Estudio de la cinemática y

morfología espermática por el

método objetivo

Curso de Actualización en Laboratorio

Novedades en el Diagnóstico Bioquímico

Análisis del semen

Los parámetros analizados en el semen:

Reflejan la función exocrina de las glándulas sexuales masculinas

Orientan sobre patologías del sistema genital

Definen la fertilidad potencial del hombre

Análisis del semen

• Examen macroscópico:

– Licuefacción, color, aspecto, volumen, viscosidad, pH

• Examen microscópico:

– Concentración de esp. y otras células

– Movilidad

– Vitalidad

– Morfología espermática

Ferttilidad potencial del hombre

Se define por

– Concentración espermática

– Movilidad espermática

– Morfología espermática

Gran variabilidad biológica

Las causas son

• Subjetividad de los métodos

Desarrollo de métodos automatizados (objetivos)

• Falta de estandarización

de los procedimientos

Adherir a las normatizaciones de OMS 1999 o ESHRE 2002

(Sociedad Europea de Reproducción Humana)

OMS 2010

OMS 2010

Movilidad OMS 1999 – ESHRE 2002

Temperatura de transporte y conservación de la muestra

Platina termostatizada a 37°C

Tamaño de la gota de semen utilizada (10 µl)

Tamaño del cubreobjetos (22 x 22 mm)

Realizar por duplicado (2 alícuotas) contando 200 Ez en 5 campos c/vez

Clasificar solo a los Ez. Enteros (con cabeza y cola)

Errores en movilidad

• El error estándar del porcentaje (p) es

Ej: Si cuento 200 Ez y el % de Ez normales o móviles

progresivos da 20% entonces:

ES= 2.8

IC ( 95%)= p 1.96 x ES = 14.5% - 25.5%

Manual on Basic Semen Analysis (2002): Comparison of Proportions

% Promedio

Diferencia límite

0

1

1

2

02 -03

3

04 - 06

4

07 - 09

5

10 - 13

6

14 - 19

7

20 - 27

8

28 - 44

9

45 - 55

10

56 - 72

9

73 - 80

8

81 - 86

7

87 - 90

6

91 - 93

5

94 - 96

4

97 - 98

3

99

2

100

1

Clasificacion de la movilidad espermática

• MOVILES – GRADO a (movilidad progresiva lineal rápida)

– GRADO b (movilidad progresiva lineal lenta y/o no lineal)

– GRADO c (movilidad no progresiva, Ez. móviles “in situ”)

• INMOVILES – GRADO d

» Vivos

» muertos (eosina positiva)

OMS 1999

OMS 2010

• MOVILES (PR o NP) – MOVILES PROGRESIVOS (PR): movilidad progresiva

lineal lenta o rápida o no lineal

– MOVILES NO PROGRESIVOS (NP): movilidad no progresiva

• INMOVILES (IM) » Vivos

» Muertos (eosina positiva)

CLASIFICACION DE LA MOVILIDAD ESPERMATICA

CASA (COMPUTER ASISTED SEMEN ANALYSIS)

Sistemas automatizados

para el análisis objetivo de

la calidad del esperma.

Técnicas de análisis de imagen asistido por computadora

Antecedente: Sistemas computarizados semiautomáticos (80s)

Estudio de la cinemática espermática (CASA)

Los sistemas CASA reducen el error técnico,

presentando un bajo CV

Permiten la estandarización de resultados entre

laboratorios

Los parámetros aportados por estos sistemas

podrían tener un mayor poder predictivo

Permiten analizar semen de diferentes especies

El CASA digitaliza y recontruye el movimiento de

la cabeza de los Ez. (x imagenes/seg)

Imagen digitalizada de 1 espermatozoide

J. Androl. 2000 Jul-Aug;21(4):515-24. CASA--practical aspects. Mortimer ST

Limitaciones del método

Cruce de trayectorias quedando ambas indefinidas. (Editar la imagen)

Incapacidad para procesar imágenes con gran cantidad de trayectorias

(Diluir el semen con PS autólogo)

Confunde debris o células pequeñas con Ez. Inmóviles. (Editar la imagen)

Gran dependencia con las condiciones lumínicas del MO.

La forma de la

trayectoria se altera

considerablemente

por el número de

imágenes tomadas

por segundo, por lo

que puede parecer

relativamente simple

cuando se

reconstruye con 30

imágenes por

segundo, pero es

mucho mas compleja

si se toman 60

imágenes por

segundo.

Exactitud de la trayectoria

CASA (COMPUTER ASISTED SEMEN ANALYSIS)

Hamilton Thorne: IVOS, CEROS, HELOS

Microptic: Integrated Semen Analysis System (ISAS®)

Proiser: Sperm Class Analyzer (SCA)

Medical Electronic System: SQA-V Gold Automated Semen Analyzer

SCA Captura entre 1 y 100 imágenes/ muestra

Captura entre 25 y 100 imágenes/seg

Contraste de fases positivo o negativo.

Cámara Leja, Makler, Neubauer,

Microcell, Proiser, porta y cubre u otras.

Se puede calibrar para 10x o 20x.

Captura manual o automática

(posibilidad de trabajar con platina

motorizada)

Visualización conjunta e individual de

trayectorias

CAMARA LEJA (Leja slide)

Comparación de métodos Análisis de regresion

• Carlos Aulesa, et al. Evaluación del sistema automatizado Sperm Class Analyzers

(SCA) para análisis del semen. Rev Lab Clin.2009;2(1):8–16

r = 0,98

P=0,001.

Comparación de métodos: Análisis de regresión de Passing-Bablock y diferencias de medias de Bland Altman

0 100 200 300 400 500

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

CC Neubauer

CC

SC

A

0 100 200 300 400 500 600

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

CC Neubauer

CC

Ne

ub

au

er

- C

C S

CA

Mean

-0,0

-1.96 SD

-39,6

+1.96 SD

39,5

Recuento espermático

r= 0.9734

p <0.0001

• Chenlo P.H. et al. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana 2013; 47 (1): 00-00.

Recuento y movilidad (grado a y móviles progresivos) por el SCA vs. el método tradicional subjetivo

Recuento (Cámara de Neubauer)

Moviles Grado a

Moviles Progresivos

Ecuación de la recta

y= 6,008833+0,940119 X

y= 0,40000+1,073333 X

y= -7,275000+1,199000 X

r (p)

0.9734 (p<0.0001)

0.8167 8p<0.0001)

0.8355 (p<0.0001)

N

50

101

101

Pendiente

(IC 95%)

0,940119

(0,8361;1,0184)

1,073333

( 0,9470;1,2000)

1,199000

(1,0735;1,3562)

Ordenada al origen

(IC 95%)

6,008833

(2,0386;12,6371)

0,400000

(-1,0000;2,1363)

-7,275000

(-12,8625; -2,0176)

• Chenlo P.H. et al. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana 2013; 47 (1): 00-00.

Linealidad del recuento Linealidad recuento

y = 1,027x + 0,768

R2 = 0,997

0

20

40

60

80

100

120

140

0 20 40 60 80 100 120 140recuento teórico esperado

recu

en

to o

bte

nid

o S

CA

• El Intervalo de medición del método fue lineal. (r: 0.99, p<0.001)en el

rango de concentraciones estudiadas (0,98 a 125 x106/ml).

• Chenlo P.H. et al. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana 2013; 47 (1): 00-00.

Comparación de métodos: Análisis de regresión de Passing-Bablock y diferencias de medias de Bland Altman

Móviles progresivos

0 20 40 60 80

0

10

20

30

40

50

60

70

80

A+B Subjetivo

PR

SC

A

0 20 40 60 80

-30

-20

-10

0

10

20

30

A+B Subjetivo

A+

B S

ub

jetivo

- P

R S

CA

Mean

0,4

-1.96 SD

-18,6

+1.96 SD

19,4

r= 0.8355

p <0.0001

• Chenlo P.H. et al. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana 2013; 47 (1): 00-00.

Comparación de métodos: Análisis de regresión de Passing-Bablock y diferencias de medias de Bland Altman

Móviles grado (a)

0 10 20 30 40 50

0

10

20

30

40

50

Grado a Subjetivo

Gra

do a

SC

A

0 10 20 30 40 50 60

-40

-30

-20

-10

0

10

20

Grado a Subjetivo

Gra

do a

Subje

tivo -

Gra

do a

SC

A

Mean

-2,7

-1.96 SD

-16,7

+1.96 SD

11,3

r= 0.8167

p <0.0001

• Chenlo P.H. et al Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana 2013; 47 (1): 00-00.

Movilidad

VCL vs. VAP

VCL: Velocidad curvilinea

(Track Velocity) (µ/seg)

Es la velocidad media de todas

las fotos (tracks) tomadas en 1

imagen.

VAP: Velocidad promedio de la

trayectoria del Ez. (µ/seg).

VSL: Velocidad rectilínea (µ/seg) entre su posición inicial

y final.

ALH: Amplitud del

desplazamiento lateral de la cabeza.

Es el desplazamiento de la

cabeza respecto de l trayectoria

promedio.

PARAMETROS DE MOVILIDAD

VCL vs. VAP

Resultados según criterio OMS

Resultados según velocidad

Resultados según progresividad

Resultados según parámetros de velocidad

Informe

Computer-aided sperm analysis: a useful tool to evaluate patient's response to varicocelectomy.

Julia I Ariagno1, Gabriela R Mendeluk1, María J Furlan1, M Sardi1, P Chenlo1, Susana M Curi1,

Mercedes N Pugliese1, Herberto E Repetto1, Mariano Cohen2 1 Clinical Biochemistry Department, Male Fertility Laboratory, Faculty of Pharmacy and

Biochemetry, University of Buenos Aires, Argentina 2 Urology Department, "José de San Martín" Clinical Hospital, University of Buenos Aires, Buenos

Aires, Argentina

Asian J Androl. 2016 Apr 22. doi: 10.4103/1008-682X.173441. [Epub ahead of print]

El varicocele es considerado la causa más fecuente de infertilidad masculina. Esta condición puede ser detectada en el 19-41% de los pacientes con infertilidad primaria y el 45-81% de los hombres con infertilidad secundaria.

El impacto de la varicocelectomía sobre la fecundidad sigue siendo un tema controvertido.

Los parámetros del semen normalmente empleados para evaluar la fertilidad masculina, como el recuento espermático, la movilidad y la morfología, no son lo suficientemente precisos para definir la respuesta clínica al tratamiento quirúrgico según diferentes autores.

OBJETIVO: Evaluar los posibles cambios de los parámetros del semen post varicocelectomía empleando el análisis de semen asistido por computadora (CASA) y el método subjetivo según OMS 2010.

MATERIALES Y METODOS MATERIALES: ¤ Se analizaron 97 muestras de semen de:

• 38 de varones sanos fértiles de edades comprendidas entre 20 y 41 años • 38 de pacientes con varicocele (17-40 años); 6 con varicocele bilateral y 32

con varicocele del lado izquierdo. • 21 post varicocelectomía (17-40 años)

¤ Se analizaron muestras pre y post cirugía (3 a 6 meses) de 10 pacientes a los que

se les realizó varicocelectomía microquirúrgica subinguinal con el técnica de Marmar.

METODOS: ¤ Todas las muestras fueron analizadas por el método subjetivo según OMS 2010

(movilidad subjetiva y morfología espermática) y con el sistema CASA (Computer Assisted Semen Analysis – Sperm Class Analyzer® (SCA)) se determinaron los parámetros cinéticos y la concentración espermática.

Análisis estadístico ¤ Se empleó el software SPSS 14.0 para Windows (SPSS, Chicago, IL, USA).

Table 1: Descriptive statistics for semen parameters values for men from RP, pre-S and post-S,

assessed by conventional semen analysis and CASA-SCA

Table 2: Analysis of paired-sample semen parameters for 10 men pre-S and post-S assessed by

conventional semen analysis and CASA-SCA

Tabla 2: Análisis de muestras apareadas de 10 hombres pre y post cirugía.

Pre cirugía Post cirugía

Método subjetivo

Mean ± DS Mean ± DS p

Móviles progresivos (%) 37 ± 9.49 38.5 ± 10.49 0.78

Morfología (%) 4.6 ± 2.27 4.7 ± 2.00 0.91

CASA-SCA

Concentración espermática (106 /mL) 43.32 ± 27.03 43.22 ± 25.93 0.99

Rto total de espermatozoides (106 /eyac) 125.8 ± 115.6 121.4 ± 67.6 0.90

ALH (µm) 2.06 ± 0.55 2.12 ± 0.57 0.58

BCF (Hz) 7.67 ± 1.84 8.5 ± 1.44 0.10

VCL (µm/s) 46.35 ± 14.98 64.79 ± 19.87 0.002

VSL (µm/s) 23.98 ± 10.31 41.43 ± 12.30 0.0004

VAP (µm/s) 30.83 ± 11.43 49.31 ± 17.12 0.0005

LIN (%) 50.0 ± 7.8 63.0 ± 7.6 0.0005

STR (%) 76.0 ± 6.2 83.1 ± 5.6 0.004

WOB (%) 65.5 ± 6.0 75.5 ± 5.3 0.0003

Espermatozoides hiperactivos (%) 5.2 ± 4.3 10.2 ± 7.4 0.06

MP CASA (%) 28.3 ± 11.8 26.4± 12.0 0.73

PR rápidos CASA (%) 13.4 ± 6.7 16.1 ± 10.3 0.42

Tabla 2: Análisis de muestras apareadas de 10 hombres pre y post cirugía.

El análisis de las muestras pareadas reveló que la mayoría de los parámetros

cinéticos: VCL (p=0,002), VSL (p=0,0004), VAP (p=0,0005), LIN (p=0,0005),

STR (p=0,004) y WOB (p=0,0003) mejoraron después de la cirugía siendo estas diferencias estadísticamente significativas.

CONCLUSIONES • El método CASA permitió, a diferencia del método

subjetivo, evidenciar cambios en los parámetros seminales.

• El CASA brinda resultados potencialmente útiles para la evaluación cuantitativa precisa de la respuesta del paciente a la varicocelectomía.

• El valor clínico de los datos cinéticos debe ser probado en la práctica clínica.

Estudio de la morfología espermática por el método objetivo

Sistemas computarizados automáticos: morfología (ASMA)

Area (A)

Acrosoma (%)

Perímetro (P)

Angulo ()

Distancia (d)

Anchura (w)

CABEZA

Pieza Intermedia

Anchura (W)

Longitud (L)

Area (a)

Elipticidad: L/A

Rugosidad: 4S/P2

Elongación: (L-A)/(L+A)

Regularidad: LA/4S

Inconvenientes

Confunde el fondo con los elementos formes

No detecta anomalías d e la cola

Tiene alta dependencia con las condiciones de

iluminación y coloración

Sobrestima las anomalías de la cabeza y del

segmento intermedio por no poder distinguir el borde

citoplasmático del fondo.

No visualiza correctamente el acrosoma

De forma manual insume mucho tiempo

MUCHAS GRACIAS

jiariagno@gmail.com