Evaluación del semen humano

Bioq. Julia I. Ariagno

Laboratorio de Fertilidad Masculina Hospital de Clínicas “José de San Martín”

Facultad de Farmacia y Bioquímica Universidad de Buenos Aires

Análisis del semen

Los parámetros analizados en el semen:

Reflejan la función exocrina de las glándulas sexuales masculinas

Orientan sobre patologías del sistema genital

Definen la fertilidad potencial del hombre

Fertilidad potencial del hombre

Se define por

– Concentración espermática

– Movilidad espermática

– Morfología espermática

Gran variabilidad biológica

Las causas son

• Subjetividad de los métodos

Desarrollo de métodos automatizados (objetivos)

• Falta de estandarización

de los procedimientos

Adherir a las normatizaciones de OMS o ESHRE 2002

(Sociedad Europea de Reproducción Humana)

OMS 2010

Manual OMS 2010

Análisis del semen

• Examen macroscópico: – Licuefacción, color, aspecto, volumen,

viscosidad, pH • Examen microscópico:

– Concentración de espermatozoides – Movilidad – Vitalidad – Morfología espermática – Evaluación citológica

EXAMEN MACROSCOPICO INICIAL

Volumen

Color Aspecto Licuefacción Viscocidad pH

Vesículas seminales y próstata

• Método subjetivo: El método clásico para evaluar la

motilidad espermática ha sido, y sigue siendo, la clasificación subjetiva de espermatozoides en el semen fresco.

Este método sin embargo, es objeto de grandes variaciones inter-laboratorios.

• CASA (Computer Assisted Semen Analysis): La

introducción del CASA ha logrado una más objetiva y sofisticada evaluación de la movilidad.

La técnica CASA aumenta la precisión y reproducibilidad de las mediciones de movilidad espermática.

MOVILIDAD ESPERMATICA

CASA (COMPUTER ASISTED SEMEN ANALYSIS)

Hamilton Thorne: IVOS, CEROS, HELOS

Microptic: Integrated Semen Analysis System (ISAS®)

Proiser: Sperm Class Analyzer (SCA)

Medical Electronic System: SQA-V Gold Automated Semen Analyzer

Movilidad

Parámetros cinéticos

VCL: Velocidad curvilinea (Track Velocity) (µ/seg) Es la velocidad media de todas las fotos (tracks) tomadas en 1 imagen. VAP: Velocidad promedio de la trayectoria del Ez. (µ/seg). VSL: Velocidad rectilínea (µ/seg) entre su posición inicial y final. ALH: Amplitud del desplazamiento lateral de la cabeza. Es el desplazamiento de la cabeza respecto de l trayectoria promedio.

VALIDACION DE LOS RESULTADOS DEL CASA

• Factores de discordancia:

Volumen de semen analizado (CASA: la cámara Leja carga 4µl de semen. Método subjetivo: emplea portaobjetos y cubreobjetos; Ej: cubre de 22x22 mm se cargan 10µl de semen)

Polispermias (requieren dilución con plasma seminal homologo)

Sémenes hiperviscosos

Oligozoospermias severas

Muestras heterogéneas.

La evaluación en simultáneo permite validar el resultado del CASA y en caso de discordancia realizar la inmediata re-evaluación de la muestra y la toma de decisión.

Computer-aided sperm analysis: a useful tool to evaluate patient's response to varicocelectomy.

Julia I Ariagno1, Gabriela R Mendeluk1, María J Furlan1, M Sardi1, P Chenlo1, Susana M Curi1, Mercedes N

Pugliese1, Herberto E Repetto1, Mariano Cohen2 1 Clinical Biochemistry Department, Male Fertility Laboratory, Faculty of Pharmacy and Biochemetry,

University of Buenos Aires, Argentina 2 Urology Department, "José de San Martín" Clinical Hospital, University of Buenos Aires, Buenos Aires,

Argentina

Asian J Androl. 2016 Apr 22. doi: 10.4103/1008-682X.173441.

El análisis de las muestras pareadas reveló que la mayoría de los parámetros

cinéticos: VCL (p=0,002), VSL (p=0,0004), VAP (p=0,0005), LIN (p=0,0005), STR

(p=0,004) y WOB (p=0,0003) mejoraron después de la cirugía siendo estas

diferencias estadísticamente significativas.

MOVILIDAD ESPERMATICA Método subjetivo

OMS 2010

Temperatura de transporte y conservación de la muestra

Platina termostatizada a 37°C

Tamaño de la gota de semen utilizada (10 µl)

Tamaño del cubreobjetos (22 x 22 mm)

Realizar por duplicado (2 alícuotas) contando 200 Ez en 5 campos c/vez

Clasificar solo a los Ez. Enteros (con cabeza y cola)

MOVILIDAD ESPERMATICA

• Se deben evaluar como mínimo 5 campos para clasificar 200 espermatozoides (2 veces 100)

• Móviles progresivos (PR)

• Móviles no progresivos (NP)

• Inmóviles (IM)

Límite inferior de referencia: PR ≥ 32%

PR + NP ≥ 40%

OMS 2010

• MOVILES (PR o NP) – MOVILES PROGRESIVOS (PR): movilidad progresiva lineal

lenta o rápida o no lineal

– MOVILES NO PROGRESIVOS (NP): movilidad no progresiva

• INMOVILES (IM) » Vivos

» Muertos (eosina positiva)

CLASIFICACION DE LA MOVILIDAD ESPERMATICA

Estimación del error entre porcentajes

Manual OMS 2010: El error estándar del porcentaje (p) es:

TEST DE VITALIDAD TEST DE EOSINA

• Los espermatozoides necrosados se ven rojos

• Valor de referencia > 58% de Ez vivos

RECUENTO ESPERMATICO • Hemocitómetro

– Cámara de Neubauer improved

Cámara de Makler Cell Vu Microcell

RECUENTO ESPERMATICO

• Homogenizar la muestra

• Inmovilizar y diluir los Ez (Sc. Mc Comber)

• Realizar 2 diluciones con 2 alícuotas de la muestra

• Cargar 2 cámaras y dejar reposar 5’

• Contar alrededor de 100 elementos en cada cámara

• Verificar los replicados en la tabla de error

• Promediar los duplicados

• Calcular la concentración por ml

• Calcular el total de Ez por eyaculado

– ([Ez/ml] x vol de semen)

Estimación del error entre recuentos

Coloraciones recomendadas

• Una vez secados al aire los extendidos se fijan en alcohol (etanol 96) por 24 hs

• Luego se colorean con:

–Papanicolaou

–Shorr

–Diff-Quik

MORFOLOGIA ESPERMATICA

MORFOLOGIA ESPERMATICA

• Observación microscópica

– Aumento de 100 x

– Contar al menos 100 espermatozoides consecutivos 2 veces para aumentar la precisión.

– Para estimar el error utilizar la tabla de Estimación de error entre porcentajes.

CRITERIOS EN MORFOLOGÍA ESPERMÁTICA

Cabeza: Oval Longitud: de 4 a 5 um Ancho: 2.5 a 3.5 um. Long /Ancho = 1.5 a 1.75 Acrosoma: Debe cubrir del 40 al 70% de la cabeza

Pieza intermedia: Delgada

< 1m de ancho

Aprox. 1.5 la long. de la cabeza

Unida axialmente

Gota citoplasmática: No debe ser mayor que la mitad de la cabeza

Cola: Recta

Mas delgada que la pieza intermedia

No enrollada

45 m de long.

Todas las formas que provocan dudas en su clasificación deben ser consideradas anormales

Criterio OMS 2010

• En los PEEC de todo el mundo: La morfología es el parámetro con peor desempeño.

• En los CCI intralaboratorios : También da mal desempeño

• John Mc Leod (1945)

Hay tantas interpretaciones de la morfología espermática como autores y analistas.

MORFOLOGIA ESPERMATICA

Porque la morfología perdió valor predictivo? Susan Rothman PhD - Anna Marie Bort

Andrology Lab Workshop – Abril/2017 American Society of Andrology

• Morbeck D.E et al. Sperm morphology: classification drift over time and clinical implications. Fertil Steril 2011 Dec;96(6):1350-4.

Dificultades al momento de clasificar

• Los Ez humanos son extremadamente pleomorficos

• Gran cantidad de sutiles variaciones de la normalidad

• En el semen de los hombres siempre hay un alto numero de formas anormales

Células no espermatozoides

Leucocitos

Células germinales inmaduras

Células epiteliales

Macrófagos

Neutrófilos

Linfocitos

Del tracto uretral

De glándulas anexas

ESTUDIO CITOLÓGICO

• CÉLULAS INFLAMATORIAS :

< 1.000.000/ ml

• CÉLULAS DE LA PROGENIE ESPERMÁTICA

< 1.700.000/ ml *

< 2.5 células de la progenie / células totales *

* Ariagno J. et al., Shedding of immature germ cells. Arch Androl. 48(2):127-31, 2002

Control de calidad en el estudio del semen

CONTROL DE CALIDAD INTERNO •Determina la precisión del ensayo.

Variaciones dentro del laboratorio

CONTROL DE CALIDAD EXTERNO

• Determina el Error total.

Variaciones entre laboratorios

PROGRAMA DE EVALUACIÓN EXTERNA DE LA CALIDAD EN LABORATORIO DE SEMEN

Parámetros espermáticos evaluados Morfología Movilidad Concentración

Materiales de control Suspensión estabilizada de espermatozoides Filmaciones Fotomicrografías Preparados coloreados Preparados sin colorear

Dra. Julia I. Ariagno Laboratorio de Fertilidad Masculina

FFyB-UBA