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TEJIDOTEJIDO VECTORESVECTORES

mRNA DNAmRNA DNA

cDNA DNA digeridocDNA DNA digerido(doble cadena metilado)(doble cadena metilado)

DNA CLONABLE LIGACION DNA-VECTOR DNA CLONABLE LIGACION DNA-VECTOR

DNA RECOMBINANTEDNA RECOMBINANTE

INTRODUCCION EN CELULA HUESPEDINTRODUCCION EN CELULA HUESPED

LIBRARYLIBRARY cDNA o genómicacDNA o genómica

Bibliotecas Bibliotecas

Bibliotecas cDNA BM 2009

2

Vectores usadosVectores usados:gt10gt11ZAPTriplEx

Bibliotecas cDNA BM 2009

Paso 1Paso 1

Paso 2Paso 2

Paso 4Paso 4

Paso 5Paso 5

Paso 6Paso 6

Paso 8Paso 8Paso 7Paso 7

Paso 3Paso 3

Paso 9Paso 9

Estrategia general construcción biblioteca de expresiónEstrategia general construcción biblioteca de expresión

Paso 10Paso 10

(if necessary)

3Bibliotecas cDNA BM 2009

Pasos 1 y 2: Fuente y purificación del mRNA Pasos 1 y 2: Fuente y purificación del mRNA

Preparación de poliA+ mRNA

T T T(30)

•Fuente de mRNA:

Alta relación secuencia interés/ mRNA total.

Baja tasa de degradación.

•Métodos de enriquecimiento:

Uso de drogas para selección de líneas celulareso estímulos específicos.

Fraccionamiento del mRNA o cDNA.

Clonado sustractivo. 3´A A A

5´

4Bibliotecas cDNA BM 2009

Paso 3: Síntesis de la primera cadena de cDNA Paso 3: Síntesis de la primera cadena de cDNA

Transcriptasas reversas (RT): DNA pol RNA dependiente ALV (Avian leukemia virus) y MoMLV (Moloney strain of murine leukemia virus)

AAAAAA(A)nA

AAAAAA(A)nA

5´cap

mRNA

Transcriptasa reversa

dATP

dTTP

dGTP

dCTP

AAAAAA(A)nA 3´

AAAAAA(A)nA

cDNA:mRNA

TTTTTT(n)T

Oligo dT

5´cap

mRNA

Transcriptasa reversa

dATP

dTTP

dGTP

dCTP

AAA(A)nA 3´

AAA(A)nA

AAA(A)nA

AAA(A)nA

cDNA:mRNA

Random primers

Random primers

5Bibliotecas cDNA BM 2009

Paso 4: Síntesis de la segunda cadena de cDNA Paso 4: Síntesis de la segunda cadena de cDNA

RNAasa H: nicks mRNA en mRNA:DNA

DNA pol

dNTPs

cDNA doble cadena

AAAAAA(A)nA AAAAAA(A)nA

RT con oligo dT

AAAAAA(A)nATTTTTTTTTT

TTTTTTTTTT

Degradación RNA

TTTTTTTTTT

Transferasa terminal dCTP

CCCCC

Fragmento KlenowdNTP´s + oligo G

TTTTTTTTTTCCCCCGGGGG

cDNA doble cadena

AAAAAAAAA

Transferasa terminalPor reemplazo

6Bibliotecas cDNA BM 2009

Paso 3,4 y 6: Síntesis de cDNA clonado. Uso de adaptadores. Paso 3,4 y 6: Síntesis de cDNA clonado. Uso de adaptadores.

7Bibliotecas cDNA BM 2009

Paso 3,4 y 6: Síntesis de cDNA clonado direccionado. Oligo dT-primer adaptador. Paso 3,4 y 6: Síntesis de cDNA clonado direccionado. Oligo dT-primer adaptador.

8

Paso 3,4,5 y 6: Síntesis de cDNA clonado direccionado. Metilación. Uso de adaptadores. Paso 3,4,5 y 6: Síntesis de cDNA clonado direccionado. Metilación. Uso de adaptadores.

Bibliotecas cDNA BM 2009Fosforilación de los fragmentos antes de ligar al vector

9Bibliotecas cDNA BM 2009

Paso 3 y 4: Síntesis de la primera y segunda cadena de cDNA Paso 3 y 4: Síntesis de la primera y segunda cadena de cDNA

Esquema para la construcción de una biblioteca full-length

10Bibliotecas cDNA BM 2009

Fago Fago Mapa génicoMapa génico

Cos Cos

Brazo izquierdo Región central Brazo derecho

11Bibliotecas cDNA BM 2009

Fago Fago Ciclo de vida Ciclo de vida

C2 proteinActivates

Baja [C1]Alta [C1]

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Fago Fago Formación placas de lisis

Bibliotecas cDNA BM 2009

Ensamblado del bacteriófago

13Bibliotecas cDNA BM 2009

Construcción de vectores

Vectores: dejaron el 60 % del genoma salvaje (crecimiento lítico)Tamaños que se empaquetan eficientemente: 105-78 % del genoma (10-20 kpb)

Elección del vector:• ER empleada.•Tamaño del fragmento a ser insertado.•Expresión del cDNA en bacterias.•cDNA debe ser “rescatado” del vector en forma de plásmido.

14Bibliotecas cDNA BM 2009

Pasos 7 y 8: Esquema preparación biblioteca en vectores derivados de fago Pasos 7 y 8: Esquema preparación biblioteca en vectores derivados de fago

Vector desfosforiladoRelación molar alta [Vector / inserto]Extremos no compatibles

Ligación

Selección-Screening

15

CI

Bibliotecas cDNA BM 2009

gt10: 5-11 kbgt10: 5-11 kb

Cepas E. coli hfl – (mutantes proteasa Hfl) NO degrada CII S! CI lisogenia

Fagos CI forman placas de lisis en cepas hfl-

Marcador de selección de fagos recombinantes: CI

CI

Lisogenia Lisis

gen CI

cDNA- EcoRIgt10-EcoRI

Ligación

Empaquetamiento in vitro

Infección E. coli hfl-

Plaqueo en top agar Formación placas de lisis

Screening hibridización sondas

Esquema:

(amplificación)

16Bibliotecas cDNA BM 2009

Screening biblioteca: Hibridización con sondas

Plaqueo en top agar y formación placas de lisis

17

gt11: 7 kbgt11: 7 kb

Screening biblioteca de expresión: Inmunodetección

Bibliotecas cDNA BM 2009

plac lacZ

EcoRI

Inserción cDNA en EcoRI

Proteína de fusiónCI 857: mutante inactivo del represor a 45ºCS 100: mutación ambar en el gen S lisis

Infección cepa E. coli SupF Incubación 10-15´ a 45ºC

Inducción ciclo lítico

cDNA- EcoRIgt11-EcoRI

Ligación

Empaquetamiento in vitro

Infección E. coli

Plaqueo en top agar. Incubación a 42ºC Formación placas de lisis

Screening inmunodetección-Hibridización sondas

Screening recombinantesIPTG/X-gal

Esquema:

18Bibliotecas cDNA BM 2009

ZAP: 7 ZAP: 7 kbkb pBluescript SK- cDNA (EcoRI/XhoI)ZAP (EcoRI/XhoI)

Ligación

Empaquetamiento in vitro

Infección E. coli

Plaqueo en top agarFormación placas de lisis

Screening inmunodetecciónClones positivos

Esquema:

EcoRI

XhoI

Recuperación de los clones positivos:

Clon recombinante positivo + M13 fago helper mutante

XL1-blue MRF´ SupE

IT

LB-Amp

SupE- R

19

Bibliotecas cDNA BM 2009

TriplEx: TriplEx: expresión en tres marcos de lecturaexpresión en tres marcos de lectura

UAAGGAGGAUUCCUCC

AUG5’ 3’

mRNA

3’ 5’

16S rRNA small ribosomal subunit

Ribosome Binding Site (RBS)

Secuencia 6-8 nt a -10 nt del AUG

20Bibliotecas cDNA BM 2009

Pasos 9 y 10: Screening e identificación de los clones.Pasos 9 y 10: Screening e identificación de los clones.