XV CURSO DE MICROBIOLOGIA CLINICA: NUEVOS DESAFIOS DE LA MICROBIOLOGIA CHILENA

Virus papiloma humano

Dra. María José Martínez G.

Programa Virología I.C.B.M. Facultad de Medicina, Universidad de Chile.

Dermatología Clínica Las Condes.

Condilomas acuminados

Requena L, Requena C. Actas Dermo Sifilográficas 2010 Hematoxilina-eosina A x10 B x40 C x200 D x400

CONDILOMA ACUMINADO

Mitosis Células vacuolizadas

Acantosis Papilomatosis Epitelio más

basófilo

Thomas R. Broker

University of Alabama at Birmingham

Biochemistry & Molecular Genetics

Virus papiloma humano

•Familia Papillomaviridae

•DNA ds, icosaédricos, sin

envoltura, 55nm

•Se han identificado mas de

100 genotipos en el humano

•Ampliamente distribuidos en

el mundo

•Infectan epitelios escamosos

•Contagio por contacto directo

Thomas R. Broker

University of Alabama at

Birmingham

Biochemistry & Molecular Genetics

Genoma HPV

Organizado en tres regiones:

Genes Tempranos (E1 a E7): Codifican proteínas asociadas a la replicación viral y algunas a la transformación celular.

Genes Tardíos (L1 y L2): Codifican proteínas estructurales.

Región Regulatoria (UTR): No codificante. Unión de represores y activadores transcripcionales.

DETECCION DE VIRUS PAPILOMA HUMANO

Detección Genoma Viral

PCR genérico

• Género: 45-60% • Especie: 60-70% • Tipo: 70-90% • Subtipo: 90-98% • Variante: >98%

Arbol filogenético HPV

Lesiones mucosas

Lesiones cutáneas

Epidemiología

DETECCION DE VIRUS PAPILOMA HUMANO

PCR genérico

Detección del genoma de HPV

150 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 100pb C+ G50 G51 G52 A149 A150 A151 A153 P29 P30 Cneg C neg

Figura 7. Detección de VPH (150p) en muestras ANF en gel de agarosa al 2% teñido con BrEt. Se

colocó un marcador de tamaño molecular de 100pb como se indica en la figura. En los otros carriles se

cargaron los amplificados de la PCR de VPH con partidores GP5+/GP6+ de muestras TLR4 positivas

(G50, G51, G52, A149, A150, A151, A153, P29 y P30). El control positivo se cargó en el segundo carril y

el negativo en el último carril.

Gutierrez D, Ampuero S y cols.

RFLP de una PCR HPV

genérica

Con partidores MY09-MY11

PCR partidores específicos

para HPV16

Detección del genotipo de HPV

450 bp

208 bp

Evidencia Epidemiológica en la relación causal de HPV y cáncer

• Cáncer cervicouterino

IARC estudia 1000 mujeres CaCu

invasor de 22 países; se detecta

DNA de HPV en 99,7%. (1)

Principales tipos detectados en

meta-análisis de aprox. 10.000

casos: (2)

HPV 16,18, 45, 31, 33, 52, 58, 35.

Thomas R. Broker

University of Alabama at Birmingham

Biochemistry & Molecular Genetics

(1) Bosch FX et al J Natl Cancer Inst 1995;87:796-802.

(2) Clifford GM et al.Br J Cancer 2003;88:63-73.

Epidemiología

• Chile

– prevalencia de la infección cervical en mujeres 15 a 69 años, 14%.

– genotipos de alto riesgo más frecuentes

16

56

31

58

59

18

52

HR

LR

Ferreccio C. y cols. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2004.

Epidemiología

• En Chile

Adultos VIH ( - ), atendidos centro ETS.

El 88,9% de los condilomas acuminados estudiados fueron positivos para HPV-6 o HPV-11.

El 31,1% con HPV de alto riesgo establecido; sólo 8,8% por HPV-16 o HPV-18. Más prevalente fueron HPV 45 y 59.

(Giacaman P. y cols.)

¿Por qué una vacuna contra virus papiloma humano?

• Dificultad en el diagnóstico.

Múltiples genotipos.

No replican en cultivos celulares.

• Dificultad en el tratamiento.

No hay antivirales disponibles.

Infección puede persistir por largo tiempo, sin dar manifestación

clínica.

• Epidemiología.

Rol en el cáncer cervico-uterino (CCU).

Vacuna VPH

• Las partículas tipo virus (VLP)

recombinantes.

• Estructura y características

antigénicas del virión.

• Expresión de proteína L1 en

sistemas eucarióticos (levaduras o

células de insectos).

• Vacunas actualmente en uso en

diversos países.

Prevalencia de HPV cervical en mujeres

Lancet Infect Dis 2007; 7:453–59

Los ensayos de genotipificación de HPV son usados en:

Estudios de prevalencia poblacional de tipos específicos de HPV, en la evaluación de vacunas y en la implementación y monitoreo de programas de vacunación.

Se ha recomendado la identificación de HPV-16 y HPV-18 adicionalmente para programas de tamizaje.

PCR Tiempo Real

Por detección de fluorescencia se puede medir durante la amplificación, la cantidad de DNA sintetizado en el momento. La emisión de fluorescencia es proporcional a la cantidad de DNA formado. Los sistemas de detección por fluorescencia empleados en PCR a tiempo real pueden ser de dos tipos : I . AGENTES INTERCALANTES II. SONDAS ESPECÍFICAS ( marcadas con fluorocromos)

Agentes Intercalantes

SYBR Green I

Sondas de Hidrólisis : Sondas Taqman *Fluorcromo donador en el extremo 5” que emite fluorescencia al ser excitado y un

aceptor en el extremo 3” que absorbe la fluorescencia liberada por el donador.

*Mientras la sonda está intacta, la fluorescencia emitida por el donador es

absorbida por el aceptor.

*Por actividad 5“ exonucleasa de

la polimerasa , hidroliza el

extremo libre 5” de la sonda..

*Liberación del fluorcromo donador* *Emisión de fluorescencia del donador*

Sondas FRET

(Transferencia de energía fluorescente mediante resonancia)

*sistema de dos sondas que se unen a secuencias adyacentes del DNA diana*

Detección de HPV genotipo 16

Ampuero S . Programa Virología I.C.B.M. Facultad de Medicina Universidad de Chile. 2013

Pruebas de laboratorio de tamizaje en la prevención del cáncer cervicouterino

Tamizaje de HPV de alto riesgo en mujeres > 30 años, en citología cervical. Ensayos con aprobación FDA: 1) Hybrid Capture 2 (HC2) High-risk DNA test (Qiagen) 2) Cervista HPV HR (Hologic) 3) Amplicor HPV test (Roche)

4) Care HPV Test (Qiagen) 5) Cobas (Roche)

Captura Híbrida de Digene

1. Se realiza en células del cuello uterino conservadas en medio de transporte.

2. La muestra es desnaturalizada para liberar DNA.

3. Se agrega a una mezcla de sondas completas de RNA de 18 genotipos de HPV: Cinco de bajo riesgo ( 6, 11, 42, 43, 44) Trece de alto riesgo (16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68)

4. Un anticuerpo reconoce los híbridos DNA-RNA por grupos y los captura en un soporte sólido

5. El 2° Ac-FA produce una reacción quimioluminiscente, detectada con un luminómetro. Cualitativo.

Desventajas: No genotipifica, no detecta infecciones múltiples y no tiene un control interno.

Captura Híbrida HPV de Alto Riesgo de Digene

1. Se realiza en células del cuello uterino conservadas en medio de transporte.

2. La muestra es desnaturalizada para liberar DNA.

3. Se agrega a una mezcla de sondas completas de RNA de trece genotipos de HPV de alto riesgo (16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68)

4. Un anticuerpo reconoce los híbridos DNA-RNA en grupo y los captura en un soporte sólido. El 2° Ac-FA produce una reacción quimioluminiscente, detectada con un luminómetro. Cualitativo.

Desventajas: No genotipifica, no detecta infecciones múltiples. No tiene control interno.

Cervista HP Hologic Determina 14 genotipos de HPV de alto riesgo: 16,18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68. Amplificación de señal y detección de fluorescencia. Técnica química Invader realiza dos reacciones simultaneas: - Reacción primaria; la sonda se une al DNA blanco y genera una estructura

sobrepuesta. Luego es clivada. Se generan múltiples señales fluorescentes. Un control interno genera fluoróforos rojos si hay DNA en la muestra.

- Reacción secundaria; el dobles de DNA clivado actúa como sonda uniéndose a una zona complementaria del FRET. Un control genera fluoróforos verdes indicando presencia de tipos de alto riesgo. Se amplifica la señal y es medida por un fluorómetro.

Amplicore HPV Test (Roche)

Ensayo basado en la amplificación del ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la hibridación de ácidos nucleicos para la detección de los genotipos de alto riesgo del VPH: 16,18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68. Permite la amplificación simultánea mediate PCR del ADN objetivo del VPH y el ADN de la ß-globina como control celular. La detección del ADN amplificado permite la identificación por separado del ADN de VPH y de la ß-globina.

Cobas

Control interno

Papillocheck hpv-screening test

Microarreglo

Basado en PCR

Detección de 24

genotipos

• Basado en la técnica de hibridación reversa en line blot.

• Detecta 37 genotipos.

• Control interno.

• Permite detección de infecciones múltiples.

• Desventaja: limite en número de genotipos a analizar.

Linear Array

Luminex

Los lásers excitan los fluorocromos: láser rojo para la clasificación de microesferas (fluorocromos internos) y el láser verde para el resultado del ensayo (fluorocromo unido a Ac de detección).

.

.

.

.

LAMP Loop-mediate isothermal amplification

• Metodología de amplificación de ácido nucleico.

• Simple, rápida, efectiva, más barata.

• Asociada a colorante HNB permite visualización rápida a ojo

desnudo. Cualitativo.

• Medición de turbidez OD 650 nm.

• Número limitado de genotipos.

Luo L et al. J Clin Microb 2011

Nota finales

• No existe una técnica diagnóstica Gold standard

• Distintas técnicas para diferentes objetivos clínicos

• Considerar epidemiología local

• Actualmente el diagnóstico está centrado en detección

de genotipos asociados a cáncer