Produccin de protenas recombinantes en cl eucariotasProblemas que suelen aparecer cuando protenas eucariticas se expresan en cl procariotasinestablessin actividad biolgicacontaminantes procariticos

Sistemas de expresin eucariotasPara eliminar los problemas de expresin en procariotas, se han desarrollado sistemas de expresin eucariotasEsp. importantes para protenas teraputicasNecesidad de que tengan idnticas propiedades a la protena natural : bioqumicas biofsicas funcionales

Sistemas de expresin eucariotasCul es la diferencia?Modificacin post-traduccional de la mayora de las protenas eucariotas Cl procariotas no pueden realizar estas modificaciones

Modificaciones post-traduccionalesFormacin de uniones disulfuro correctasClivaje proteoltico del precursor inactivoGlicosilacin- agregado de residuos de azcarAlteracin de aminocidos en la protenafosforilacinacetilacinagregado de grupos sulfatoAgregado de cidos grasos

Sistemas de expresin en levaduras: ventajasOrganismo unicelularBien caracterizadas gentica y fisiolgicamentePromotores fuertes disponiblesPlsmido natural (2m) Eucariotas, ocurren modificaciones post-transduccionalesSegregan algunas protenasNo patgeno

Vectores de levaduras

YIp: integrativos - una copia integrada a un cromosoma YEp: episomales- ori 2m (alto nmero de copias) YCp: centromricosARS, CEN (1 o 2 copias por cl)Todos tienen marcador de auxotrofia y son shuttle

Vectores episomalesSon ampliamente usadosA menudo inestables en cultivos a gran escala (>10L)

Estrategia - alterar las condiciones de crecimiento para estabilizar el vector episomalusar cepas mutantes que requieren nutrientes especficos.Leucina, Triptofano, Histidinael gen que provee el fenotipo salvaje se encuentra en el plsmido episomal

Promotores de levaduras PromoterStatus

Acid phosphatasePHO5InducibleAlcohol dehydrogenase IADH IConstitutiveAlcohol dehydrogenase IIADH IIInducibleGalctokinaseGAL 1InducibleMetallothioneinCup 1InduciblePhosphoglycerate kinasePGKConstitutiveTriose Phosphate isomeraseTPIConstitutive

Sistemas de expresin en levaduras: desventajasInestabilidad de plsmidos en gran escalaVectores episomalesSuperglicosilacin de glicoprotenas100+ residuos manosa vs. 8-13 normalpuede alterar la actividad de la protenaProtenas secretadas quedan atrapadas en periplasma (entre la membrana y la pared celular)se usan seales peptdicas

Soluciones a los problemas en sistemas de expresin en levadurasLevaduras modificadas genticamente para llevar a cabo glicosilacin = humanosScience Vol 301, p1244-1246 (29 Aug 2003)Delecin de genes de glicosilacin de levadurasAgregado de genes de glicosilacin humanos

Soluciones a los problemas en sistemas de expresin en levadurasUsar otro tipo de levadurasPichia pastorisHansenula polymorphaNo slo Saccharomyces cerevisiaeUsar otros eucariotasCl de insectosCultivos de cl de mamferos