Dr. Claudio Martínez DebatVersión Original: Dra Mónica Marín

Año 2o19Sección Bioquímicaclau@fcien.edu.uy

Módulo III:Vías de la información

genética

Transcripción

ADN ARN PROTEINAS

Transcripción Traducción

Replicación

retrotranscripción

ARNs

ARNm (ARN mensajero)ARNt (ARN de transferencia)ARNr (ARN ribosomal)Otros…snRNAs, siRNAs, miRNAs

Funciones: informativas y catalíticas

¿QUÉ, DÓNDE, CÓMO, CUÁNDO y CUÁNTO se transcribe cada secuencia?

● ¿Qué región del ADN transcribir? ¿cómo se identifica el sitio de iniciación y el de terminación de la transcripción?

Qué es un Gen?

● ARN ribosomales bacterianos 5S 16S y 23S enmascaraban al ARNm

S: unidades Svedberg. Se refiere a la

velocidad de sedimentación en la centrifugación

ARNARNm (ARN mensajero) 1- 3 % del ARN total celularARNt (ARN de transferencia)ARNr (ARN ribosomal)

Dificultad para mostrar la existencia del ARNm

ARNm es muy inestable

Transcripción: síntesis del ARN, ADN dependiente

5’ 3’Siempre

Requiere un molde de ADN

ADN hebra codificante o sentido (+)idéntica secuencia que el ARN (U x T) ADN hebra molde o antisentido (-)complementaria al ARN

Transcripción en procariotas

● Una única ARN polimerasa ● Todos los promotores son reconocidos

por la misma enzima● Los ARNm tienen:

– Extremo 5’: ppp (tri fosfato) (pppG o A)– Extremo 3’ : estructura de un terminador o

nada en particular– Principal modificación post transcripcional de

los ARNm: su propia degradación (vida media 2-3 min)

● Inicialmente se identificó una enzima capaz de polimerizar ARN in vitro, pero sin molde!!

● Mas adelante se encontró la ARN polimerasa ADN dependiente:Mg++(NMP) n + NTP (NMP) n+1 + PPi

La reacción de polimerización

Tres etapas:- Iniciación- Elongación- Terminación

Etapas de la Transcripción

Transcripción

Estructura de la ARN polimerasa de E. coli

ARNm ARNtARNr

Sintetiza los diferentes tipos de ARNs

2α, β, β’, σ, ω

Holoenzima

α: regulador β: se une al moldeβ´: une NTPs y forma enlaces fosfodiésterσ : reconoce el promotor

PM (kDa)

@ 500

core

ARN Pol Core

Inhibidor de la ARN polimerasa de E. coli

RIFAMPICINA

Iniciación de la transcripciónRequiere:

Reconocimiento de la señal específica en el ADN que indique el inicio. Formación del complejo “cerrado”

Selección de la hebra molde

Separación de las hebras, (formación del complejo abierto)

Inicio de la síntesis del ARN

Promotor:

● Es una secuencia de ADN de cadena doble

● Que no se transcribe● Forma un complejo estable con la ARN

pol ● Contiene la información necesaria para

que la ARN pol inicie la síntesis del ARN y la definición del extremo 5’ del ARN

● Promotores fuertes y débiles, según cuántos ARN se sintetice a partir de ellos.

● Constitutivos o inducibles por “activadores”

Promotor: señal de iniciación de la transcripción en el ADN

¿Cómo identificar y aislar los promotores?

ADN purificado + ARN polimerasa + ADNasa (endonucleasa)

Fingerprint o “huella”

Huella (Footprinting)

La localización de los sitios de unión de proteínas en el ADN puede ser ubicada con precisión.

∓ Proteína de unión al ADN

*

*

Análisis comparativo de la secuencia de los promotores aislados

(@ 2000, ∼ 80 pb)

● No hay una homología de secuencia significativa entre ellas en su totalidad

● Solo hay 2 pequeñas regiones mas conservadas (consenso) :

Situadas en - 10 y - 35

- 35 - 10 +1 ►

4 elementos comunes identificados en promotores de E. coli :

+1: una purina, G o A

En – 10 : T80 A95 T45 A60 A50 T96

En – 35: T82 T84 G78 A65 C54 A45

Separación entre ambos sitios: 17 ∓ 1

Efecto de mutaciones

Reconocimiento del promotor:subunidad σ de la ARN pol

● Aumenta la afinidad de la holoenzima en 10.000x

● Reconoce ADN doble hebra

● KM (holoenz.) = 1010 M-1 s-1

● Varias σs: σ70, σ32 (HS), σ54, etc.

∀ σ se libera después de la formación del primer enlace fosfodiéster

Etapa limitante de la reacción de Iniciación de la Transcripción

● Transición del complejo promotor cerrado (ARN pol en -35, ADN en doble hebra) a complejo promotor abierto (ARN pol en -35 y -10, ADN SE-)

►

ββ´

α

Mg++

Elongación: “Burbuja” de la transcripción

Sobre la terminación de la transcripción:

Hay dos formas de terminación: ρ − independiente ρ − dependiente

No es tan exacta como la iniciación

Terminadores independientes

del factor ρ

Se caracterizan por :

-la presencia de una región rica en AU / AT y - la formación de una estructura en horquilla, en el ARN recién sintetizado

Terminación de la transcripción

ρ -dependiente

Fidelidad…• corrección de prueba1. Edición pirofosforolítica2. Edición hidrolítica

• 1 error / 104-5 nucleótidos

Célula procariota / célula eucariota

La membrana nuclear en eucariotas hace necesaria la existencia de un intermediario núcleo-citosol

ARN pols de Procariotas y Eucariotas: Similitudes y Diferencias

(CTD)

3 ARN polimerasas que dan diferentes productos:

• ARN pol I : ARN r • ARN pol II : ARNm• ARN pol III : ARN pequeños: ARNr 5S y

ARNt

Con diferente sensibilidad a la α-amanitinaImportante procesamiento de los transcriptos: modificaciones post transcripcionales

Transcripción en células eucariotas

% Trxn Nº subs. Dónde? Transcritos Sens. α-amanitina

70 14 Nucleolo ARNr 5.8, 18 y 28S -

20 12 Nucleoplasma ARNhn (-> ARNm), ARNsn

++

10 17 Nucleoplasma ARNt, ARNr 5S, SINEs

+ (altas concs.)

I

II

III

Transcripción en células eucariotas, ARN pols I, II y III

α-amanitina: inhibidor diferencial de ARN

polimerasas eucariotas

amanita

Otros inhibidores de la transcripción

Cordicepina

►

Iniciación: promotores eucariotas reconocidos por la ARNpol II

● Síntesis de ARNm y algunos snRNAs● Las 12 subunidades de la ARNpol II

son insuficientes para iniciar la transcripción

● Se necesitan al menos 5 factores adicionales para iniciar :TFIID, TFIIA, TFIIB, TFIIF, TFIIE, TFIIH (expresión basal)

● Participan otros factores para regular la transcripción

Complejo mínimo de iniciación de la transcripción y elongación en eucariotas (pol II, expresión basal)

Iniciación de la transcripción por la ARN pol II en eucariotas

TBP+TAF=TFIID

CTD: dominio Ctl de una subunidad de la ARN polII

CTD es fosforilado

Estructura de un promotor eucariota (pol II)

+1CAAT

-30-80GC-100¿?

Potenciador

Aparato Básico de Trxn:TFII D, A, B, F + ARN pol II, E, H

*

*

Las ARN pols I y III reconocen diferentes promotores, utilizan diferentes conjuntos de FTs, pero igual requieren TBP

4 Principales modificaciones postranscripcionales en el ARNm de células Eucariotas

En el extremo 5’: CAP o CasqueteEn el extremo 3’: Cola poli AEliminación de intrones Edición

Modificación del extremo 5’ del ARNm en eucariotas

Modificación del extremo 3’ del ARNm en eucariotas

AATAAATTATTT

AAUAAA

ADN

ARNm

AAUAAA

AAUAAA AAAAAAAAAAAA....A

(endonucleasa)

(poliA-polimerasa)

5’ 3’

Poliadenilación y Terminación de la Trxn

El ~1% del genoma de E. coli codifica para estos ARNs, pero constituyen el 99% del ARN total de la bacteria

Procesamiento de ARNr y ARNt

Ambos se transcriben como transcriptos largos (pre-ARNr)

Modificaciones post-transcripcionales● ARNrs Procariotas

Estructura de un transcripto pre-ARNr

en E. coli

RNasa III libera los ARNr 16S y 23 S

Procesamiento de ARN ribosomal en eucariotas

Modificaciones post-transcripcionales• ARNrs Eucariotas

Modificaciones post-transcripcionales• ARNts Proca y Eucariotas

Procesamiento postranscripcional del ARNt Tyr

Ribonucleasa P : una ribozima

Crea el extremo 5’ de los tRNAsSu estructura consiste en:

– Una molécula de ARN de 377 nt– Una cadena polipeptídica de 20 kDa

Ambos componentes son necesarios para una actividad catalítica completa

En condiciones no fisiológicas el ARN puede cortar esas secuencias con precisión.

Algunas de las Bases ModificadasPostranscripcionalmente en ARNs r y t

Ovoalbúmina de polloproteína: 386 aa gen: 7700 pb

Desnaturalización / Hibridación : proceso reversible de los ácidos nucleicos.

Propiedad muy utilizada para identificar secuencias complejas de A. N.:ADN / ADNADN / ARNARN / ARN

Experimentos de hibridación ADN / ARNm analizados por microscopía electrónica

Intrones y exones de la β hemoglobina

¿Cómo se eliminan los intrones sin alterar las secuencias codificantes?

● ¿Cuáles son las señales en los ácidos nucleicos, en el ARN, que indican los límites de los intrones?

● ¿cuál es el mecanismo que lo asegura?

Grupo I

Grupo I

Grupo II

SR, proteínas reguladoras de splicing

● Proteinas SR (ricas en Ser y Arg)● Se unen a elementos reguladores de

splicing, en los exones (ESE, exonic splicing enhancer)

● Son esenciales en el empalme constitutivo y regulan el empalme alternativo, tejido específico

“Corte y empalme” alternativoSub-grupo de exones es conservado en la maduración del ARNm, los otros son procesados como si fueran intrones.

7 formas de la α-tropomiosina (rata)

(sistema contráctil de diversos tipos celulares)

RESUMENModificaciones en los ARNm eucariotas:

Síntesis y maduración de los miRNA

Los ARNs como replicadoresReplicación autoalimentada de una enzima de ARN

cADN

Interacciones ADN-proteína

Motivos de unión al DNA

Represor Lac y trp CRP

Receptor de Glucocorticoides

Nota: todas las imágenes contenidas en este documento son de dominio público y libremente accesibles vía Internet. El presente material refleja el trabajo de preparación de las clases correspondientes por parte de los docentes responsables, no tiene fines de lucro y sí docentes, sin pretender sustituir a la bibliografía recomendada

Demostración de la existencia de ARNm. Experimentos de “marcado por pulsos” y sedimentación.

ApoB-100

CAA

UAA STOP

ApoB-48