Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
of 67
-
Upload
kriistian-rene-quintana -
Category
Documents
-
view
217 -
download
0
Transcript of Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
1/67
UNIVERSIDAD
AUT NOMA
DE
BAJA
CALIFORNIA SUR
` REA
INTERDISCIPLlNARIA
DE
CIENCIAS
DEL
MAR
DEPARTAMENTO
DE
BIOLOGIAMARINA
Validaci n
de tcnicas colorimrico enzimicas
y
del
biuret
para
medir
la
concentraci n de
metabolitos
y
pro te nas
totales en
plasma
de camar n blanco
Penaeus
vanname
TESS
QUE PARAOBTENER EL
TITULO
DE
B i L O G O MARINO
PRESENTA
Jorge
Soto Herndez
La Paz S C S
Agosto
de 999
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
2/67
4 758
f
j
j5
e
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
3/67
Dedicatorias
A
mis
padres Jorge
S Soto
y
Graciela Herndez
por
todo
su
apoyo que
me
brindaron
ya
Martha
K
Arias
mi
compaera
de
siempre
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
4/67
Agradecimientos
Quiero
agradecer
de forma
muy
especial
todo lo
que
he
aprendido
a lado de un
gran
amigo
y
maestro
Jorge
Herndez
L p ez
Agradezco
a
mis maestros
revisores de
tesis
QFB
Aurora
Rebolledo
L p ez
M
en
C
Jorge
Herndez
L pez
director
de
tesis M
enC
Sergio
F Mart nez
Daz
M
en
C Coralia
Mores
Gut errez
y
IOB Diana P
Carreno
Le n
por
haber
participado
enla correcci n
del escrito
A
las
instituciones
de
las cuales
me
apoye
para
llevar
a
cabo
la
realizaci n
de
todo el
trabajo
de
tesis
Al
Consejo
Nacional de Ciencia
y
Tecnolog a
proyecto
NO
25242 B intitulado Marcadores
Bioqu micos
del
Estado
Fisiol gico
del
Camar n
por
el
apoyo
econ mico
que
me
brind
Al
Centro
de
Investigaciones
Biol gicas
del Noroeste donde realic
todos
los
experimentos
con
apoyo
del
M
en
C
Francisco
Magallon
y
el
Bi logo
Guillermo
Portillo
quienes
me
proporcionaron
los
ejemplares
de camar n
a
la Coordinaci n
de Estudios de
Posgrado por
las becas
que
recib
Al
Centro de
Investigaci n
en
Alimenaci n
y
Desarrollo
en
especial
al
Laboratorio
de
Biotecnologa
Marina donde
pude
terminar la escritura de mi tesis
y
la
presentaci n
de
mi
trabajo
A
mi escuela la UABCS
por
haberme
permitido
realizar
una
de
mis metas la
de
estudiar
una
de las
mejores
carreras
Bio log a
Marina
y
a
todos mis
amigos que
en
cualquier
momento
me
brindaron
su
ayuda
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
5/67
CONTENIDO
DEFIN
ICI N
DE T RMINOS POCO
COMUN
ES 2
ABREVIA
TURAS
2
U N
IDAD
ES D
E
MED
ICt N
O O 3
RESUM
EN 4
ABSTRACT
5
INTRODUCCi N
6
ANTECEDENTES
9
J
USTI
F
ICAC
I N
4
OBJ
ETIVOS
7
MATERIAL Y
M TODOS
8
RESULTADOS 25
DiSCUSi N
37
CONCLUS
ION
ES
49
REF
ERENClAS
5
ANEXO
56
AN
EXO
2
6
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
6/67
Definci n de tminos
poco
comunes
Anecdisis
Per odo de
crecimiento
tisular
y acumulaci n
de
reservas
alimenticias
encrusteos
Ecdisteroides
Grupo
de hormonas esteroideas
que
estimulan la muda
en
los
crusteos
Esterol Esteroide
que
posee
unoo m
grupos
hidroxilo
y
carece
de
grupos
carbonlo
y
carboxilo
Exactitud Correcci n de
una
medida
o
la
concordancia
de las medidas
con
el
verdadero valor de la cantidad
medida
Glucano Pol mero
de
glucosa
Kit
Caja
con
reactivos
para
medir la concentraci n de
una molcula en
particular
algunos
contienen la soluci n estdar Fabricada
en
un laboratorio
ej
Sigma
o Merck
Laminarina Glucano extraido de la
pared
celular de Laminaria
digitata
Metabolito Molculas
orgicas
intermediarias
en
la
bios ntesis o
degradaci n
de
molculas de construcci n
y
macromolculas
Pir genos
Polisacidos de
origen
microbiano
que producen
un
incremento
en
la
temperatura
corporal
Plasma
Porci n
l quida
de la hemolinfa
Precisi n
Expresa
la
reproductibilidad
de
una
medida
es
decir la concordancia
entre
varias
medidas de
la
misma
sustancia
o
propiedad
Proecdisis Perodo
de
cambios
morfol gicos
y
fisiol gicos
en
preparaci n
de
la
pr xima
muda
Abreviaturas
a
a
Aminoidos libres
AGs
Acilglicridos
ANDEVA Anisis de variancia
CHH
Hormona
hiperglucemiante
de
crusteos
CHOD
PAP Modo colorimrico enzimico
de
c o l e s t e r o lx i d a s a
Jorge
Soto Herndez Defmici n de tminos
poco
comunes 2
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
7/67
EDTAAcido Etilenediaminotetraacico
GLC
Cromatog ra f a
de
gas
l quido
GOD
PAP Modo
colorimrico
enzimico
de
g l u c o s ax i d a s a
GPO PAP Modo colorimrico enzimico de
glicerol
peroxidasa
HEPESAcido 2
hidroxietilpiperazino
2
etanosulf nico
SIC
Soluci n isot nica
para
camar n
T
AGs
Triglicridos
Unidades
de
medici n
cm
ent metros
L Litro
9
Gramos
minMinuto
mg
mL
Miligramopor
mililitro
IlL
Microlitros
mMMilimolar
nmNan metros undad
de
longitud
de
onda
hrs Horas
Partes
por
mil
RPMRevoluciones
por
minuto unidad
de velocidad
angular
xg
tantas
veces la
fuerza
gravitacional
tiene
su
equivalente
en
RPM
Jorge
Soto
Herndez Unidades demedici n
3
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
8/67
RESUMEN
Debido
a
que las
concentraciones
salinas
en
el
plasma
del camar n NaCI 45
mM
son tres veces
mayores
que
las existentes en
el
plasma
humano NaCI 5
mM
se
compar
la eficiencia de los kits comerciales
para
la medici n de
glucosa
colesterol
acilglicidos
y
lactato
as
como
la
eficiencia
de
la
medici n
de
p r o te n a s
por
el modo
del biuret
diluyendo
las
soluciones estndar
en
las
dos
salindades
mencionadas
De acuerdo a los resultados el
uso
de concentraciones
salinas
semejantes
a las
existentes
en la hemolinfa
NaCI
45 mM no
alteraron
la
eficiencia de las
pruebas
colorimrico enzimicas
de los kits De la misma
forma
la determinaci n de
p ro te n a
prueba
colorimrica nofue afectada cuando la
reacci n
se
realiz
a
45
mM de NaCI
Adicionalmente
se
adaptaron
estas
tcncas
a
microplaca
eon
la
intenci n
de
reducir
gasto
de
reactivos
y
aumentar
la
manobrabilidad
Adem
el
uso
de la
mcroplaca
permite
analizar
varias muestras
en
forma
simultea
Cuando
se
compararon
los
valores obtendos
en
mcroplaca
y
encelda
de
cm
de
espesor
se
observ
una
alta
correlaci n
en
el
intervalo
de
anisis
No
se
encontraron
diferencias
significativas
entre ambas tcnicas cuando
se
analizaron
muestras
de
plasma
de
camar n
en forma
simultea
y
repetida
con cluynd os e
que
es
factible el
uso
de este micromodo El
modo
en
microplaca
result
ser
funcional
para
la
medici n
de
glucosa
eolesterol
lactato
AGs
y
p r o te n a s plasmieas
de Penaeus vannamei Utilizando
este modo se
compararon
las
concentraciones
de los
componentes plasmicos
encamarones
alimentados
y
en
ayuno
tratados
con
laminarina e inoculados
con
par t cula
inertes
Se
detect
que
los
parmetros que
son
afectados
con
estos
tratamientos
son
las
p r o te n a s
la
gl
cosa el colesterol
y
losAGs
Jorge
Soto Hemdez RESUMEN 4
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
9/67
ABSTRAeT
In
spite
of
salinity
concentrations
of
shrimp
blood 45
mM
NaCI
that are
three
times
higher
than human
plasma
5
mM NaCI
the
efficiency
of
tests
for
quantitation
of
glucose
lactate cholesterol
triglycerides
and total
protein
biuret
assay
were
analyzed
in
high
salinity
concentration Sandard solutions were
dissolved with
Salt
Solution
5 mM
NaCI
and
Shrimp
Salt Solution SSS
containing
45
mM
NaCI The
use
of SSS
did
not interfere with the
reaction
in
any
case
The five
tests
were
adapted
to
microplate
in order
to
save
reagents
and
increase manoeuvre The
use
of
microplate permites
test several
simultaneous
samples
9
When
measures
obtained
by
microplate
and cm
thickness
cells
were
compared
significat
differences
were
not observed This micromethod
turned
out to
be functional for
quantitation
of
glucose
lactate
cholesterol
acilglycerides
and
total
protein
in
the
plasma
of
white
shrimp
penaeus
vanname
By
using
this
micromethod the mentioned
assays
were
performed
in
shrimps
treated with
laminarin
sephadex
and in starvation 24
hrs Results
indicate
that
glucose
cholesterol
acilglycerides
and total
protein
were
affected
by
the
treatments
Jorge
SotoHemdez ABSTRACf
5
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
10/67
INTRODUCCi N
En
Mxico
y
en
todo
el
mundo
el
camar n
es
un
producto
altamente
demandado
como fuente
de alimento
Para
los acuicultores el
camar n es una
especie
comercialmente exitosa
y
su
expansi n
es tal
que
se
pronostica
un
crecimiento
hasta
6 millones
de
toneladas mricas durante los
pr ximos
aos Newman
995
Debido
a
la creciente demanda el cultivo de
camar n
se est
perfilando
hacia sistemas intens
lIos
los cuales
generan
una
alta
producci n
Sin
embargo
enlos
cultivos intensivos
las enfermedades
y
las
deficiencias nutricionales
pueden
producir grandes
pdidas
econ micas
Lightner
983
Las enfermedades
que
causan
mortalidades
masivas
en la
acuacultura
se
origininan
por
bacterias
hongos
y
virus Hunter
985 Para
poder
controlar estas
poblaciones
microbianas
se
utilizan
medicamentos
que
pueden
daar
tanto
a
los
organismos
cultivados
comoa los
consumidores
de
estos
Wheaton
985
Para
prevenir
las infecciones del cultivo
es
necesario
conocer
el estado de salud
de
los
camarones cultivados
Para ello se
requiere
de
modos
prticos que
permitan
medir
parmetros bioqu micos
que
puedan
serusados como indicadores
del estado
fisiol gico
Si consideramos
que
en
el
camar n
la hemolinfa es el medio de
transporte
de
nutrientes
productos
de desecho hormonas
y
otras
sustancias
cualquier
cambio
Jorge
SotoHerndez
INTRODUCCI N
6
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
11/67
en
su
composici n
estarrelacionado
a
los
procesos
f is io l g icos
como
sucede en
mamferos
donde
la alimentaci n el
ejercicio
la maduraci n
y
el
crecimiento
entre otros
modifican
la
concentraci n
de
los
componentes
de la
sangre
enel
transcurso de unmismo d a o
m Kolmer
963
Debido a su
importancia
biol gica
algunos
componentes
plasmicos
como
las
p r o te n a s
la
glucosa
el colesterol los
triglicidos
TAGs
y
el lactato
pueden
servir como
indicadores del estado
fisiol gico
en
crusteos
Las
p r o te n a s
del
alimento
sonun
continuo suminstro de aminoidos
para
el
camar n
Akiyama
et
al 989
y
en los
mamferos
estas
p r o te n a s
tienen
funciones estructurales catal ticas de
transporte
reconocimiento
y
defensa
pero
en
caso
necesario tambin
pueden
servir
como
aporte
energico
Macarulla et al
994
En
la
sangre
de
los
mamferos
las
p r o te n a s
poseen
muchas funciones
fisiol gicas
como
el mantenmiento de la
p re si n
osm tica
el
equilibrio
ido
base
del
plasma
el
mantenmiento de
la
capacidad
normal
de
coagulaci n
defensa
y
transporte
Kolmer 963
Para
los
crusteos
las
p r o te n a s
son
principalmente
nutrientes
necesarios
para
el
crecimiento
y
participan
en los
mecansmos de
osmo regulaci n
Claybrook
983 Anbarasu
y
Ramalingam
992
La
glucosa
al
igual
que
en los mamferos
Ganong
986
es
el carbohidrato
m
abundante enel
p lasma
de los
invertebrados
y
su
concentraci n
en
el
plasma
est
correlacionada
con
la
tasa
metab lica
pero
su
concentraci n
es m
baja
y
Jorge
Soto
Hemdez INTRODUCCI N 7
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
12/67
raramente
sobrepasa
los
2
mg
mL
Urich
994
Los TAGs
componen
casi
exclusivamente
los
dep sitos
de
grasa
tejido adiposo
de los
mamferos
y
constituyen
la
principal
reserva
de
combustible
Lehninger
986 Talaska
989 Macarulla et
al 994
En el
camar n
los
TAGs se
almacenan
en
el
hepatopcreas y
funcionan como
fuente de
ene rg a
durante el
ayuno
Jeckel
et
al 99
Suck
et
al
996
El colesterol
en
crusteos
es
precursor
de hormonas esteroides
incluyendo
la
hormona de control de muda
y
hormonas sexuales
y
en
las membranas
bio l g icas
tiene funciones estructurales de
permeabilidad
y transporte Aguirre
99
El lactato es
el
principal producto
final
del
metabolismo
anaer bico
de los
crusteos
Thorpe
et
al 995
De
et al
997
Una
de las
especies
preferidas por
los
camaroncultores
por
sus
condiciones de
crecimiento
supervivencia y
valor
econ mico es
el
camar n
blanco
del
Pac fico
Penaeus
vanname
Esta
especie
crece
adecuadamente
en
intervalos
amplios
de
temperatura
de 25
a 33
C
y
salindad
de 6
a
42
Maz n
et
al 996
Adem
tiene
un
porcentaje
de
supervivencia
en
cultivo
entre
6
y
8
Mart nez
993
Este crusteo
es
un
decodo
de la familia Penaeidea
y
se
distribuye
de
manera
natural desde las
costas de
Sonora hasta las
costas de
Per
Hendrickx 996
Jorge
Soto Herndez
INTRODUCCI N 8
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
13/67
Cuando
es
postlarva y juvenil
habita enestuarios
y
como adulto
se
puede
encontrar
en
aguas
marinas
profundas
Mart nez
993
El
camar n blanco al
igual
que
otras
especies
de
camar n est
cambiando de
nombre
cient fico
debido
a
que
Prez Farfante
y
Kensley
997
proponen
elevar a
rango
de
gneros
los
subgne ros
de Penaeus hasta
hoy
citados
En
este
caso
para
la
especie
citada
en
el
presente trabajo
el
nuevo
nombre
corresponde
a
Litopenaeus
vannamei Debido a
que
la
aceptaci n
formal de esta
propuesta
noes
reconocida hasta la fecha
en
esta
tesis
se
referir al
camar n
blanco
como
Penaeus vannamei
ANTECEDENTES
Hasta ahora
los
modos
usados
para
la cuantificaci n
de
p r o te n a s
totales
glucosa
colesterol
TAGs
y
lactato
son
modos
a
colorimricos
para
medir
p ro te n a s
donde estos
compuestos
forman
un
complejo
coloreado
b
colorimrico enzimicos donde la
determinaci n
es
enzimica
pero
la
reacci n
produce
un
color
que
se
puede
medir
y
c de
cromatograf a
de
gas
l quido
donde la determinaci n
es
por
adsorci n de la muestra
que
est
enuna
fase
m vil
o
gaseosa
a
una
fase
fija
o
l quida
tabla
Los estudios relacionados
con la
medici n
de la concentraci n de
p r o te n a s
totales
glucosa
triglicidos
colesterol
y
lactato en
plasma
de
camar n
se
han
Jorge
Soto Herndez ANTECEDENTES 9
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
14/67
dirigido
a
evaluar sus
variaciones durante el ciclo
de muda Chan
et
al
988
Horst
989
Y
variaciones
por
estrs
Cuzon
et
al
98 Shukla
y
Shukla 984
Chen y
Cheng
993
Anderson
994 Chen et
al
994
Van
y Hall 998
Hall
y
Van
998
Tabla
Modos usados
para
la
determinaci n
de
la concentraci n
de
metabolitos
y
p r o te n a s
en
plasma
de
camar n
Compuesto
Protenas
Modo
Bradford
Bradford
Bradford
Bradford
Biuret
Glucosa oxidasa
Glucosa oxidasa
Glucosa oxidasa
Colesterol oxidasa
Cromatograf a
gas
l quido
Cromatograf a
gas
l quido
Lactato
oxidasa
Glucosa
Colesterol
TAGs
Lactato
PROTEINAS
AutorAo
Rosas
et
al
992
Chan
et
al 988
Chen
y
Cheng
993
Chen et al 994
Cuzon et al 98
Hall
y
Van
998
Hall
y
Van
998a
Van
y
Hall
998
Chan
et
al
988
Shen
et al
994
Fernndez
et
al 995
Spotts y
Lutz 98
Durante el
pe r o d o
de
premuda
la concentraci n de
p r o te n a s
totales
en
la
hemolinfa
Penaeus
vannamei
se
eleva
por
una
reabsorci n
de
las
p ro te n a s
del
comple jo
p ro te n a quitina
del
viejo exoesqueleto
En la
postmuda
los
niveles
de
p ro te nas
disminuyen
debido
a
la
diluci n
de la hemolinfa
por
el
agua
absorbida
durante
y despus
de
la muda Chan
et
al
988
Jorge
Soto
Hemdez
ANTECEDENTES
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
15/67
Bajo
ciertas condiciones comoel
ayuno
p ro longado
el estrs
por
sangrado
y
en
ausencia
de
carbohidratos
y
I p idos
en la dieta
los
camarones utilizan
las
proteinas
para
satisfacer
sus
necesidades
energicas Akiyama
et
al
989
Suck
et
al 996
Las
condiciones extremas
que pueden
darse
enel
cultivo
tambin
influyen
en
la
concentraci n de
p r o te n a s
en
plasma por ejemplo
en
Penaeus
japonicus
Chen
y
Cheng
994
observaron
que
al
exponer
los
camarones
a
un
ambiente
con
altas
concentraciones
de amono
los niveles
de
p r o te n a s
hemolinficas
disminuyen y
los
aminoidos
libres
a
a
e
incrementan
reflejando
un
catabolismo de
p r o te n a s
a a a
Por su
parte
enMacrobrachium lamerrii
Sarojini
et
al
99 observaron
que
los
niveles
de
p r o te n a s
y
a a
de
la hemolinfa
se
incrementan
en
los
primeros
estadios
de
la
vitelognesis
debido al
transporte
de materiales
al ovario
GLUCOSA
La
glucosa
es la
fuente
principal
de
ene rg a
del
tejido
muscular
de Penaeus
aztecus
y
otros crusteos Rosas et al 992
La
glucosa
enhemolinfa
var a
ampliamente
con
la
estaci n
y
el
estadio
de muda
Urich
994
Sin
embargo
Mercaldo
Allen
99
en
Homarus americanus
observ
que
los
cambios en la concentraci n de
glucosa pueden
no
estar
Jorge
Soto Herndez
ANTECEDENTES
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
16/67
correlacionados con la muda
La
glucosa
ha sido
repo r tada
como
un
indicador de
estrs
por
hipoxia
en
P
monodon
Hall
y
Van 998a
y
otros
crusteos
Santos
y
Keller
993 Zou et
al
996
y por
tratamiento
conformaldehdo
en
P
monodon Van
y
Hall 998
Al
parecer
en
crusteos
la
hiperglucemia
tambin
es
una
respuesta
metab lica
general
al
estrs
por
emersi n
Schmitt
y
Santos 993 Santos
y
Keller 993
Anderson
et
al
994
La
glucosa
en
la hemolinfa de
camar n
sigue
un
ritmo circadiano
y
su
concentraci n
puede
serun
indicador
del estado nutricional Hall
y
Van
998
COLESTEROL
El
colesterol
es
el
precursor
obligado
para
la
s ntesis de
la
hormona ecdisteroide
y
todo el colesterol de la hemolinfa est
ligado
a
p r o te n a s
de alta densidad
Kang
y
Spaziani
995
pero
los
crusteos
son
incapaces
de
sintetizar
el
colesterol
y
cualquier
otro esterol
de
novo
Teshima
y
Kanazawa 983
Akiyama
et
al
989
por
tal raz n el colesterol en la
dieta
es esencial
para
el
buen crecimiento
y
sobrevivencia de los camarones
Sin
embargo
en cantidades
elevadas
dependiendo
de
la
especie puede
tener
efectos
t xicos
Sheen et al 994
Samuel
et
al
997
En
P
monodon
se
ha
encontrado
que
los
niveles
de colesterol
se
elevan
Jorge
SotoHerndez ANTECEDENTES
2
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
17/67
considerablemente al
suminstrarles
dietas
con
a lgunos
suplementos
alimenticios
Shiau
y
Chou
994
Por otro lado el
ayuno prolongado
24
das
incrementa
la
concentraci n
de
colesterol
en
P
vannamei debido
al
catabolismo
selectivo
de
componentes
celulares Suck et al 996
TRIGLlC RIDOS
La
mayor
cantidad de
TAGs
en los
camarones se
almacenan en
el
hepatopcreas
y
tienen
variaciones
estacionales en
relaci n al
sexo
al
estado de
madurez
gonadal
y
a
factores
ecol gicos
calidad
y
accesibilidad
del alimento
y
temperatura
Jeckel
et
al 99
En
Penaeus
vannamei Suck et
al
996
reportaron
que
durante un
periodo
de
24
das
sin
alimentaci n
las
reservas
de TAGs
se
agotan
severamente
en
los
primeros
d as
debido
a
que los
TAGs proveen
ene rg a
en
periodos
cortos
de
ayuno
LACTATO
El lactato de la hemolinfa de crusteos alcanza niveles altos durante una
actividad
engica
pero
es
removido
muy
lentamente
comparado
con
lo sucedido
enmamferos
Urich 994 En el
camar n
talasindo
Calocaris
macandreae el
lactato
tardan
hasta 4
hrs
en
regresar
a sus niveles normales
despus
de ser
expuesto
a
un
pe r o d o
de anoxia Anderson
et
al 994
Jorge
Soto Hemdez ANTECEDENTES
3
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
18/67
La
demanda
de
energfa
durante
el
estrs
por
actividad
y
manejo
de los camarones
en
la
acuacultura
muchas veces induce el metabolismo anaer bico causando
acumulaci n
de
lactato
Spotts
y
Lutz
98
De
forma
general
en
todos
los
crusteos el lactato
se
acumula
en
el msculo
y
la hemolinfa como resultado al
estrs
por
anoxia
y
emersi n
Tyler
y
Taylor
988
Schmitt
y
Santos 993 Santos
y
Keller
993
Anderson et al 994
Zuo
et
al
996
Sartoris
y
Poertner 997
El lactato
tiene una
funci n de
seal
de alarma
e
indu
respuestas
metab licas
y
de
comportamento
enlos crust os Deet al 997
as
por
ejemplo
en
la
hemolinfa de
Metapenaeus
monoceros
los niveles
de
este metabolito
se
incrementan
por
el
efecto de insecticidas
Reddy
y
Rao
99 Tambin
puede
ser un indicador de
anaerobiosis Ellis
y
Morris 995
JUSTIFICACi N
En la
tima
decada
la industria camaron cola
ha estado demandando
herramientas
que permitan
conocer
el estado
fisiol gico
y
de
salud
de
los
camarones
Debido
a lo anterior
se
hace necesario establecer modos
que
permitan
el
diagn stico temprano
del estado
fisiol gico
del camar n
y que
sean
accesibles
para
los
camaroncultores
Una
alternativa
para diagnosticar
el estado
fisiol gico
del camar n es
determinar
la
composici n bioqu mica
del
plasma y
observar
sus
cambios
en
diferentes
Jorge
Soto
Hemdez JUSTIFICACI N 4
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
19/67
condiciones
para
poder
detectar
molculas
que
puedan
usarse como
indicadores
de
ese
estado
Algunos componentes plasmicos pueden
ser
utilizados
como
indicadores de
desequilibrios fisiol gicos
Por
ejemplo
la
glucosa
el colesterol
y
las
p ro te n a s
pueden
estar
involucrados
en
deficiencias nutricionales
Akiyama
ef
al
989
Suck
et
aL 996 Hall
y
Van
998
Por
otro
lado
ellactato
y
la
glucosa pueden
servir
como
indicadores
de
estrs en
los
camarones
Spotts y
Lutz 98 Hall
y
Van 998a
Los
modos
para
medir estos
componentes
plasmicos
mencionados
arriba
en
el camar n var an
en
relaci n
a
la
biomolcula
que
se
dese analizar
e
incluyen
a
tcnicas colorimricas
para p r ot e n a s
totales
b
colorimrico enzimicas
para
colesterol
glucosa
y
lactato
y
c
de
c roma tog ra f a
de
gas l quido para
TAGs
y
colesterol
En las tcncas
para
glucosa
lactato
y
colesterol sehan usado kits comerciales al
igual
que para
la tcnica
del
biuret
pero
hasta
hoy
nose
ha
reportado
si estas
tcnicas
presentan
problemas metodol gicos producidos por ejemplo por
las
altas
concentraciones
salinas que
existen
en
la hemolinfa Por
lo
anterior
se
hace
necesario establecer las
condiciones
de
ensayo
para
cada
unade
las
tcnicas
incluyendo
la tcnica
colorimrico
enzimica
para
TAGs
que
se
propone
eneste
trabajo y
determinar
la factibilidad del
uso
de los kits comerciales Cabe sealar
Jorge
Soto
Hemdez JUSTIFICACI N 5
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
20/67
que
enel
caso
de TAGs
la tcnica
no
solo
mide los
TAGs sino
tambin
los
di
y
monoacilgl icridos
pero
como
la concentraci n de
estos
dos
es mucho
meno
a
la
de
los
TAGs casi
insignif icante
se usa como
triglicridos
de
forma
general
Una
alternativa
para
optimizar
el
usode los
kit
y
el
modo del
biuret
para
cuantificar
los
compuestos plasmicos
en
el camar n
podr a
ser
el
aplicar
estas
tcnicas
en
microplaca
La
mcroplaca
comparada
con
las celdas de cuarzo de
cm
de
espesor puede
reducirel
gasto
de reactivos
y
aumentar la manobrabilidad
adem de
que permite
analizar
varias muestras de forma simultea
La
adaptaci n
de
las tcnicas
a
la
mcroplaca
es
una
herramienta
que puede
usarse
para
ir
registrando
de
forma
rpida
y
sencilla los cambios
bioqu micos
del
plasma
que
presenten
los camarones
en
los sistemas de
cultivo
sin la necesidad
de
matar
al
anmal
generando
la
posibilidad
de
realizar
una
vigilancia
peri dica
del
estado
fisiol gico
de
loscamarones
Jorge
Soto Hemdez
JUSTIF ICAC I N
6
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
21/67
OBJETIVOS
Ob je t iv o gene ra l
Estandarizar
un
modo en
microplaca
que
permita
determinar
la
concentaci n
de metabolitos
y
p r o te n a s
totales en
plasma
de
camar n blanco
Penaeusvanname
Objetivos espec fico s
Determinar la factibilidad de utilizar kits comerciales
para
medir la concentraci n
de
glucosa
lactato ealesterol
y
triglicidos
y
la tcnica
del
biuret
para
medir la
concentraci n
de
p r o te n a s
totales
en
el
plasma
del camar n
2
Adaptar
estas
tcnicas
a
mcroplaca
de 96
pozos
3 Evaluar los niveles de
glucosa
lactato colesterol
triglicridos
y p ro te n a s
totales en
plasma
de camarones alimentados
y
en
ayuno
usando las
tcnicas
adaptadas
a
microplaca
4
Investigar
la influencia
del
tratamiento
con
laminarina
y
con
pa r t cula s
inertes
sobre
la concentraci n
de
metabolitos
y p ro te nas
plasmicas
del camar n
Jorge
Soto
Hemdez
OBJETIVOS 7
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
22/67
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
23/67
Tabla 2 Concentraci n de la
soluci n est ndar
mg
mL
para
elaborar
la
curva
de calibraci n encada tcnica
GLUCOSA
LACTATO TAGs
COLESTEROL
PROTEINAS
2 2
5
8 8
25
6 6 5 5
4 25 25 5
2 2 2 2
6
6
3 A
cada
curva se
ajust
una
regresi n
lineal
para
obtener
el modelo
que
describiera
su
comportamiento
obtenendo
as
los
parmetros
de la
regresi n
para
cada una
2
Adaptaci n
de
las
tcncas
a
microplaca
Para
determinar si exist a
alguna
diferencia
enusar
celdas
para espectrofot metro
de
mL
y
microplacas
de 96
pozos
se
elaboraron
curvas
pa tr n
para
cada
metabolito utilizando
en
uno
de los
casos
celdas
de
cm
de
espesor
SIGMA
y
en
el
otro
microplacas
de
policarbonato
Corning
Modo
Recomendado
Se coloc
mL
de
soluci n reactiva
de acuerdo
a
la
prueba
enun
tubo
de
ensayo
Jorge
Soto Hemdez MATERIAL
YM TODOS 9
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
24/67
2 Se
agreg
la
cantidad
de muestra sealada enel
instructivo
de cada kit En el
casode la
prueba
del
biuret
se
tom de referencia el
protocolo
de Bauer
986
3 Se
agit
y
se incub
a
temperatura
ambiente el
tiempo
sealado
enel
kit
En
el
caso
de
p r o te n a s
el
tiempo
recomendado
es
de mino
4
Se
ley
la absorbancia de la muestra
en
un
espectrofot metro
Beckman
DU6
utilizando
celdas
de
cm
de
espesor
La
longitud
de onda
fue
de
492
nm
excepto
para
p r o te n a s
y
lactato
que
fue
de
56 nm
Modo
en
Microplaca
Se
coloc
enun
pozo
de
mcroplaca
la cantidad de
muestra
sealada
en
la
tabla 3
en
relaci n
a
cada
prueba
2 Se
agregaron
2
IlL
de soluci n reactiva
3 Se
agit
y
se
incub
a
temperatura
ambiente el
tiempo
recomendado
por
la
tcn
ica
4
Se
ley
la absorbancia en
un
lector de
placas
a una
longitud
de
onda
correspondiente
al
metabolito
Sensibilidad de
las
tcncas
adaptadas
a
microplaca
Durante la
elaboraci n
de
las
curvas de
calibraci n
utilizando
mcroplaca
se
Jorge
Soto
Hemdez
MA
TERlAL
Y
M TODOS
2
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
25/67
determin
el
intervalo de
sensibilidad
para
cada
prueba
Para
esto
fue necesario
encontrar
la
parte
de
la curva
en
donde los datos
p o d a n
describir una
l nea recta
con
pendiente
positiva
y
determinar
el
valor
de
correlaci n
lineal
r 2
Precisi n
y
exactitud de
las mediciones realizadas
con
las tcncas
adaptadas
a
microplaca
Se midio la concentraci n
de 4
muestras
de
soluci n
estdar
por
cada
tcnica
utilizando el
modo
en
mcroplaca
Se calculo la
desviaci n
relativa DR
y
el
erro
relativo ER
de
las
medidas
obtendas de
acuerdo
a
Ayres
97
para
evaluar
su
reproductibilidad
y
concordancia
conel estdar
Valoraci n de los modos
Fue
necesario
probar
el modo
conmuestras
de
plasma
de
camar n Se
usaron
6
organismos
de
4g
de
peso y
3
5cm
de
talla
promedio
Fueron
mantendos
durante dos d as en
el laboratorio a 25
oe
y
salindad de 36
o
Se obtuvieron
6 llL
de hemolinfa
diluida
3 de cada uno El
plasma
se
separ por
centrifugaci n y
se cuantific
la concentraci n
plasmica
de metabolitos
y
p r o te n a s
siguiendo
el
procedimiento
descrito anteriormente
para
cada
tcnica
3
Uso de las
tcncas
adaptadas
a
microplaca
para
la evaluaci n de
los
nveles
demetabolitos
y
protenas
totales en
plasma
de camar n
en
ayuno
y
alimentado
Se
us
un
lote de 36
organismos
8 hembras
y
8
machos
de 3
t
5
cm
de
longitud pa tr n
y
4 5
t
6
g
de
peso
Semantuvieron
durante
unasemana
bajo
Jorge
Soto
Herndez
MATERIAL
YM TODOS
2
O
758
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
26/67
condiciones
controladas
36
de salindad
y
25 oC de
temperatura
ambiental
Para el
experimento
el
lote
original
se
dividi
en
2
grupos
de
8
o rgan ismos
9
hembras
y
9
machos cada
uno
Los anmales de un
primer
grupo
se
sangraron
dos
horas
despus
de haberles suminstrado el alimento Los
organismos
del
segundo
grupo
se
sangraron
despus
de 24
horas en
ayuno
A
las muestras
de
plasma
de
los
36
organismos
se les midi la concentraci n
de
metabolitos
4
Uso
del
modo
en
microplaca
en
camarones
tratados
con
laminarina
Se
us
un
lote de
4
organismos
de
las
mismas caracter sticas
de los utilizados
en
el
experimento
3
bajo
las
mismas
condiciones Se dividi
el lote
en
dos
grupos
de
7
organismos
cada
uno Un
grupo grupo
A
semantuvo
3
min enun
estanque
de
6 litros
con
agua
marina
filtrada
que
conten a
una
concentraci n
de 5
mg
mL
de
laminarina
Sigma
Al
mismo
tiempo
el
segundo grupo grupo
B se utiliz
como
control mantenindolo
en
las mismas condiciones del
grupo
A s lo
que
sin
laminarina
Despus
del
tratamiento
los
dos
grupos
se
colocaronen
agua
marina
36
25 OC Todos los
organismos
fueron
sangrados
a
las dos
horas
y
2 4
Y
8
das
despus
del
tratamiento En cada
ocasi n
se
midi
la concentraci n
plasmica
de metabolitos
S
Uso
del modo
en
microplaca
en
camarones
tratados con
part culas
inertes
Se utilizaron
tres
grupos
de 9
organismos
cada
uno
Los
organismos
de cada
grupo
fueron
inoculados
con
diferentes
pa r t cula s
Sigma
suspendidas
en
SIC
Jorge
Soto Hemdez MATERIAL
YM TODOS
22
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
27/67
estril
de la
siguiente
manera
Part culas
Carga
Positiva
Tamao de
pa r t cu la
m
3
4 25
Sephadex
G 25
DEAE
Sephadex
Sin
carga
SIC
sin
par t culas
Las
par t culas
se
pesaron para
obtener
5
mgmL
y
se
preparo
una
diluci n
para
llegar
a
una concentraci n
de
5
mgmL
Los
organismos
fueron inoculados con L de la
suspensi n
en
la
re gi n
pleolal
en
la
parte
lateral
Se mantuvieron en
reposo
durante cinco horas
y
despus
se
sangraron
para
medir
las
concentraciones de
los
metabolitos en
el
plasma
Anisis
Estad stico
Se
graf icaron
algunos
datos con su
valor
promedio
ta desviaci n o
erro
estdar En
todos
los
casos
que
fue
necesario
se
aplic
la
prueba
de
igualdad
de
varianza
y
la
prueba
de
ajuste Kolmogorov
Smirnov
para
determinar la normalidad
de
los datos Se
realizaron
pruebas
de
regresi n
t
pareada
y
una
evaluaci n de
pendientes
y
elevaciones
La
evaluaci n
de
pendientes y
elevaciones
seuso
para
comparar
lascurvas
de
calibraci n La
prueba
t
pareada
se
aplic para
determinar
diferencias
entre los
dos
modos usando
plasma
de
camar n
El
anisis
de
Jorge
Soto
Hemdez
MA
TERIAL
YM TODOS 23
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
28/67
regresi n
se
aplic
a las curvasde calibraci n
El
anisis de variancia
bifactorial
seus
para
el
bioensayo
de camarones
en
ayuno
y
alimentados El
anisis
de
variancia
se
aplic
para
determinar
el
efecto
de
la
laminarina
y las
par t culas
inertes
sobre
la concentraci n
de
metabolitos
y
p r o te n a s
en
plasma
de
camar n
Cuando los datos
no
segu a n
una
distribuci n
normal
o la varianza
era
diferente
se
usaron estad sticos
de
pruebas
no
paramricos
como el
de
Kruskal Wallis
y
Mann
Whitney
Las
gricas
se elaborar n utilizando el
programa
computacional Sigma
Plot
995
y
los
anisis
estad sticos con
el
programa
Sigma
Stat
Satistical
Analiysis
Versi n
Jorge
Soto
Hemdez MATERIAL
Y
M TODOS
24
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
29/67
RESULTADOS
Determinaci n
de
la
factibilidad
de
la
tcnica
Cuando
se
compararon
las
curvas
de calibraci n utilizando
soluci n
salina NaCI
5
mM
y
soluci n isot nica NaCI 45 mM
no
se
observaron diferencias
significativas
P 7
para
detalles
ver anexo
2
entre
sus
pendientes y
elevaciones
en
todos los
componentes
plasmicos
analizados
fig
Los
resultados
sugieren
que
las
condiciones
de
mayor
salindad
y
pH
ligeramente
alcalino del
SIC
condiciones
semejantes
al
plasma
del
camar n
no
afectan la
tcnica de los kits
comerciales
para
medir
glucosa
colesterol lactato
y
AGs
De
la
misma
manera
la
prueba
de
p ro te n a s
por
biuret
noseafect
por
la
utilizaci n
de
NaCI45
mM P 76
2
Adaptaci n
de
las
tcncas
a
microplaca
Una
vez
observado
que
la condici n
de
45 mM
de
NaCI
en
el
plasma
de
camar n
no
afecta los
ensayos
se realiz la
curva
de calibraci n
para
cada tcnica
adaptdola
a
mcroplaca
de 96
pozos
Como
primer
paso
se
busc
el meno
volumen
de
muestra
necesario
para
obtener
una
absorbancia
mayor
de 5
y
meno
de
El
tiempo
y
la
temperatura
de incubaci n se
tomaron
del
protocolo
original
para
cada kit En el casode las
p ro te n a s
totales la
temperatura
y
el
tiempo
de incubaci n setomaron
de
Dunn 995
Jorge
Soto
Hemdez RESULTADOS 25
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
30/67
E
6
c
5
en
r
Cll
Cll
3
c
Cll
D
2
o
o
D
O O
8 2
6
2
Concentraci n
de
Acilglicidos mg
mL
E
2
e
o
O
LO
ro
8
ro
6
c
ro
o
2 4 6
8
Concentraci n
de
lactato
mg
ml
E
c
8
en
r
Cll
6
Cll
c
4
Cll
D
o
2I
D
8
E
c
5
N
en
O
t
2
Cll
ro
9
c
Cll
6
o
V
3
O O
O O
8
2
6 2
Concentraci n
de
Colesterol
mg
mL
8
E
c
o
6
Cll
Cll
c
lI
D
2
VI
D
O
2 3
4
5
Concentraci n
de Protenas
mg
mLO
2
4
6 8
Concentraci n de Glucosa
mg
mL
Figura
Curvas de
calibraci n
utilizando
Soluci n
salina
y
Sc EOTA
las
barras
representan
el
erro
estandar
Jorge
Soto
Hemdez 26
ESULTADOS
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
31/67
Posteriormente
la sensibilidad de
cada una
de las tcncas
se
determin
con
base
al intervalo
log s t ico
de las curvas donde la medida
del
ajuste
de
la recta
de
re gre si n
a
los
datos observados
era
grande
97
Y
99
tabla
3
Tabla 3 Condiciones de
ensayo
e intervalo inicial obtendos
para
cada tcnica
proximidad
del
ajuste
de la recta de
regresi n
a
las
observaciones de la muestra
Tcnica
Volumen Sensibilidad
Temperatura
Tiempo
de
Muestra
mg
mL
incubaci n incubaci n
IJL
OC
min
Prote nas 2 5
75 25 97
Glucosa
2
25
37 3
99
Colesterol 2 6 25
99
AGs
6 2 25
99
Lactato
25
37 3
99
Precisi n
y
exactitud
de las
mediciones
realizadas
con
las
tcncas
adaptadas
a
microplaca
Los
resultados indican
que
todas
las tcnicas
adaptadas excepto
la de lactato
tienen
buena
precisi n
y
exactitud
porque
los
valores
de la
desviaci n
relativa
DR
Y
el
erro
relativo ER
de
las
mediciones realizadas
son
pequeos
tabla
4
Valoraci n
de los modos
La concentraci n de los metabolitos
y
p ro te n a s
de 6
plasmas
fue
analizada
usando el
modo
de
celdas
de
cm
de
espesor
y
el
modo
en
mcroplaca
Los
Jorge
Soto Hemdez RESUL
TADOS
27
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
32/67
resultados fueron
muy
similares
y
nomostraron diferencias
signif icat ivas
entre
estos
dos modos t
pareada
95 de confianza Estos
resu l tados
sugieren que
los dos modos
pueden
ser
usados
de
modo indistinto Tabla
5
Tabla 4
Precisi n
y
exactitud
de
las tcnicas
adaptadas
a
microplaca
para
medir
concentraciones
mg
mL
de metabolitos
y
p r o te n a s
totales
en
plasma
de
camar n
n
4
Concentraci n Concentraci n DR ER
Estdar Calculada
mg
mL
mg
mL
mediat
s
Prote nas 2
2
7 4
86
4
O 74 3
Glucosa 5
5 7
3 2
Colesterol
4 t
4
3
2
AGs
4 8 4
3
48
Lactato
2
4 2
3
58 29
Tabla
5
Concentraci n
promedio
tesviaci n estdar
mg
mL
de
metabolitos
y
p r o te n a s
totales
en
plasma
de
camar n
utilizando
los
dos
modos
95 de
confianza
Modo Modo Valor
de
t
Valor
de P
Recomendado
Microplaca
Prote nas
29
26
65 34
529
73 93
Glucosa
29
2 2 22
6
73
Colesterol
3 2 38 4 3
47
O 4 6 3
653
AGs
2 5 6
98 8 2
9
258
Lactato
84
58
2 2 6
22
76 3
Jorge
Soto Herndez
RESULTADOS
28
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
33/67
3 Uso de las tcncas
adaptadas
a
microplaca
para
la evaluaci n de los
nveles
de
metabolitos
yprotenas
totales en
plasma
de
camar n en
ayunoy
alimentado
Cuando
se
analizaron
plasmas
obtendos de camarones
en
ayuno y
alimentados
se
observaron diferencias
significativas
en
la
concentraci n de
p r o te n a s
P 4
y glucosa
P
Los
niveles
de colesterol
lactato
y
AGs enlos
anmales
alimentados no
tuvieron
diferencias
signif icat ivas
P
76
3
7 6
en
relaci n
con
los
organismos
alimentados
sin
embargo
tienden
a
ser
mayores
en
los camarones alimentados
tabla 6
Por
otro
lado la concentraci n de metabolitos
y
p r o te n a s
en
plasma
de
camar n
blanco
Penaeus
vanname no
present
diferencias
significativas
con relaci n
al
sexo
P
5
para
detalles
ver
anexo
2
Tabla 6 Niveles de
p ro te n a s
totales
y
metabolitos
plasmicos
de
camar n
blanco
Valor
promedio
t
esviaci n estdar
mg
mL
Ayuno
Alimentados
Protenas
25 8
t
2 26 49 9
t
39
Glucosa
2
t
7 2
t
24
Colesterol
4 9
t
9 8
t
TAGs
8 7
t
25 586
t
34
Lactato
53
t
3
89
t 7
Diferencias
significativas
P
O
2
Jorge
Soto Herndez RESULTADOS
29
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
34/67
Para
tener
un
intervalo
de
confianza
para
el
valor
promedio
de la
concentraci n de
p r o te n a s
glucosa
colesterol
AGs
y
lactato en
plasma
de
P vannamei
se
calcul
el
valor
mimo y
mnimo
para
cada
caso
usando
camarones
en
condiciones
de
ayuno
24
hrs
aparentemente
sanos
y
enestado
de intermuda tabla 7
Tabla
7 Intervalo
para
el
promedio
de la concentraci n de
p ro te n a s
y
metabolitos
plasmicos
de
P
vannamei
en
condiciones de
ayuno
95 de confianza
n 8
Valor
mnimo
Valor
mimo
mg
mL
mg
mL
Protenas
82
7
6 92
Glucosa
35 239
Colesterol
253 645
AGs 97
Lactato 3 3
4
Uso
del
modo en
mcroplaca
encamarones
tratados
con
amnar na
Cuando
se
midi la
concentraci n de metabolitos
y
p r o te n a s
plasmicas
en
camarones
tatados
con
laminarina
se
observ
un
efecto de
este
glucano
sobre
los
niveles de
glucosa
T
24
P
2
y
colesterol T 469 P 35 La
concetraci n de
glucosa
se
increment
poco
m
del
doble
en
los
camarones
tratados
con
laminarina
a
partir
del
segundo
d a
del
experimento
fig
2 La
concentraci n de colesterol
plasmico dismnuy
durante los
primeros
cuatro
d as
del
tratamiento
y
despus sigui
un
comportamiento
similar al
que
se
observ
en
el
grupo
control
fig
3
Jorge
Soto Hemdez
RESULTADOS
3
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
35/67
3
E
25
E
2
o
o
5
t
O
e
o
f
e
5
o
e
o
O 2 4 6 8
Tiempo
d as
Figura
2
Niveles
promedio
de
glucosa plasmica
encamarones
tratados
con
laminarina
y
sin laminarina
control
Las barras
representan
el
erro
estdar
Prueba de Mann
Whitney
P
2
E
e
E
8
o
Q
6
o
Q
e
o
2
e
Q
o
e
O 2 4 6 8
Tiempo
das
Figura
3 Concentraci n
promedio
de colesterol
plasmico
en
camaronestratados
con
laminarina
y
sin laminarina control Mann
Whitney
P 35 las barras
representa
el erroestndar
Jorge
Soto Hemdez RESULTADOS
3
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
36/67
Para
las
p r o te n a s
lactato
y
AGs no hub
efecto de
la
laminarina
P
O
742
78
296 sin
embargo
la concentraci n de
p ro te nas
totales AGs
y
colesterol de los dos
grupos
camarones
tratados
con
laminarina
y
los
del
grupo
control
disminuyeron
P
durante
el
periodo
de
prueba
fig
4 5
Y
6
75
E
5
C
E
25
ea
e
Q
a
Q
75
e
o
3
5
ea
e
Q
25
e
o
O
O 2 4 6 8
Tiempo
d as
Figura
4 Concentraci n
promedio
de
p r o te n a s
totales
en
plasma
de
camar n
blanco tratado
con
laminarina
y
sin
laminarina control
las
barras
representan
el erroestndar Prueba de Mann
Whitney
P O 742
Jorge
Soto Hemdez
RESULTADOS
32
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
37/67
E
C
8
o
U
6
U
al
O
4
3
U
2
al
o
c
o
o 2
4
6
8
Tiempo
d as
Figura
5 Concentraci n
promedio
de lactato en
plasma
de
camar n blanco tratado
con aminarina
y
sin
laminarina control Las
barras
representan
el erro
estndar ANDEV
A
P 78
6
E
C
2
al
8
c
U
4
al
o
c
o
O
2
4
6 8
Tiempo
d as
Figura
6 Concentraci n
promedio
de AGs
en
p lasma
de camar n blanco tratado
con
Iaminarina
y
sin laminarina
control
Las barras
representan
el
erro
estdar Mann
Whitney
P 296
Jorge
Soto Hemdez 33
ESUL
TADOS
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
38/67
5 Uso
del modo
en
microplaca
encamarones tratados
con
pa r t culas
inertes
Se
observarondiferencias
significativas
en
la
concentraci n
de
p ro te n a s
glucosa
y
AGs en
plasma
entre
los camarones inoculados con
pa r t cula s
inertes
y
los
organ ismos inyectados
con SIC P 35 Por otro lado
ninguna
de las
par t cu las
probadas
en
este
bioensayo
tiene
un
efecto
significativo
sobre la concentraci n de
colesterol
y
lactato
P
25
de
los
o rgan ismos
inoculados
figs
Y
6
a
a
E
5
O
E
ctS
J
o
t
J
9
3
QJ
c
o
2
ctS
c
QJ
t
o
SC
Sephadex
DEAE
Seph
Figura
7 Concentraci n
promedio
de
glucosa
plasmica
en
camaronestratados
con
par t cu las
inertes Las barras
representan
la desviaci n estdar letras
diferentes indican diferencias
signif icat ivas
ANDEVA F 6 28 P 9
Jorge
Soto Hemdez 34ESULTADOS
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
39/67
35
b
E
C
3
a
a
E
25
C
c
Q
2
e
a
5
C
c
C
c
5
o
c
o
o
SC
Sephad e xDEAE Seph
Figura
8 Concentraci n
promedio
de
p ro te n a s
totales en
plasma
de
camar n
tratado
con
par t cu las
inertes
Las
barras
representan
la
desviaci n
estdar
letras diferentes
indican
diferencias
significativas
Kruskal
Wallis
H 6
P O 4
8
b
w
7
b
E
C
E
6
C
5
Q
C
e
o
3
C
2
Q
o
e
SC
SephadexDEAE
Seph
Figura
9 Concentraci n
promedio
de
AGs
plasmicos
encamarones
tratados
con
par t culas
inertes Las barras
representan
la
desviaci n
estdar letras
diferentes
indican
diferencias
signif icat ivas
ANDEVA
F 4
6
P
O 33
Jorge
Soto Hemdez
35
ESULTADOS
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
40/67
E
35
e
E
3
o
25
o
2
O
c
5
o
3
ti
c
o
5
o
SC
Sephadex
DEAE
Seph
Figura
Concentraci n
promedio
de colesterol
plasmico
en
camarones
tratados
con
part culas
inertes
Las barras
representan
la
desviaci n
estdar
ANDEV
A
F 35 P 282
4
2
E
O
E
o
ti
8
ti
6
c
o
4
c
l S
2
o
SIC
Sephadex
DEAE
Seph
Figura
Concentraci n
promedio
de lactato
plasmico
en
camarones tratados
con
par t cu las
inertes Las barras
representan
la
desviaci n
estdar ANDEVA
F 9 P
398
Jorge
Soto Herndez 36ESOL
TADOS
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
41/67
Los
resultados muestran
que
los
niveles
de
glucosa disminuyen por
el
efecto
del
DEAE
sephadex
fig
7 Por
su
parte
la concentraci n
de
AGs
se
incrementa en
los
o rgan ismos
inoculados
con
sephadex
y
DEAE
sephadex
fig
9
As mismo
los niveles
de
p r o te n a s
aumentan
en los
camarones inoculados
con DEA
sephadex
fig
8
DISCUSi N
Los modos
utilizados
para
medir
p ro te n a s
glucosa
lactato co
esterol
y
T
AGs
encrusteos
son
colorimricos colorimetrico enzimicos
y
de GLC
El
modo
colorimrico m citado en
los
trabajos
sobre
crusteos es
el de
Bradford o el
de Coomassie
que
se
basa enla tcnica
de
Bradford Sin
embargo
en este
trabajo
el modo
de
elecci n
para
estimar el
contendo de
p r o te n a s
totales en
plasma
de
camar n
fue el del biuret debido a
que presenta
ventajas
tomando
en
cuenta
su
principio
de
acci n Por
un
lado el modo del
biuret
se
basa en
la
quelaci n
de las cadenas
polipept dicas
a
ion
es
cprico
en
una
soluci n
alcalina
y puede
estimar
concentraciones de
a
mg
mL
de
p ro te na pero
para
usar
este modo
se
necesita
una
gran
cantidad
de
proteinas
Dunn
995
Por
su
parte
el modo de Bradford utiliza
un
colorante el
azul
brillante
G25
reactivo de Bradford
que
seune
a
las
p r o te n a s
en
medio
ido
de
dos
maneras
los
grupos
trifenlmetano
se
unena
estructuras
no
polares
y
los
grupos
ani nicos sulfonato interactan con la
cadena
cati nica
de
la
p ro te n a
Este
Jorge
Soto
Hemdez
DISCUSI N 37
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
42/67
modo
permite
estimar concentraciones de
p ro te n a
entre 5
y
75
Ig
mL
Dunn 995
Tomando
en cuenta lo anterior se utiliz el modo del
biuret
porque
las
concentraciones de
p rote n a
en
el
plasma
de camar n
se
encuentran
en
el
intervalo
de
detecci n
de sta tcnica
Esto
tiene la
ventaja
de
que
la muestra
puede
usarse
sin diluir
eliminando
el
erro
que
pudiera
generarse
al
momento
de
hacer la
diluci n
adem
de
evitar
prdida
de
tiempo
Otras
ventajas
adicionales
que
presenta
este
modo son
facilidad
de realizaci n reactivos de fil
p re p a ra ci n
y
unamarcadamente meno
susceptibilidad
a
interferencias
qu micas
comparado
con
otros
modos basados
en
reacci n con
cobre
Para
la cuantificaci n de
glucosa
lactato
y
colesterol sehan
empleado
modos
colorimrico enzimicos donde el fundamento
es
utilizar enzmas
espec f ica s
que
actuan
sobre
un
sustrato enestecaso
es
el
componente que
deseamos medir
se
produce
un
grupo
que
se asocia
con
un colorante el
cual
se oxida una vez
asociado
La
cromatogra f ia
de
gas l quido
se
ha
empleado
para
medir colesterol
y
TAGs
en
el camar n
su
procedimiento
es
muy
laborioso
y requiere
de solventes
para
separar
la biomolcula
que
se desee
analizar
por
lo
que
no
fue
utilizado
en
este
trabajo
El
tiempo que
se
puede
llevar una
medici n
puede
sermucho
pero
va
a
depender
de lo
espec f ico
que
se
pretenda
hacer la
prueba
En este
trabajo
se
Jorge
Soto
Hemdez
D ISCUSI N
38
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
43/67
utiliz un
modo
colorimrico enzimico
para
cuantificar
TAGs
el cual no
mide
uncamente T
AGs
sino
que
mide todos los
acilglicridos
monodi o
t r igl iceroles
porque
su
fundamento
parte
de la
hidr lisis enzimica
de los acidos
grasos
y
una
determinaci n
enzimica
subsiguiente
del
glicerol
formado
reacci n
colorimr ca
Determinaci n
de la
factibilidad de
la
tcnca
En este
trabajo
se
propuso
hacer
las
pruebas
con
los kits
comerciales
usados en
cl nica humana debido a
que
son
reactivos altamente
probados
y
aseguran
una
homogeneidad propiedad importante
cuando
se
utiliza un
reactivo
para
un
nmero elevado de reacciones
Una
ventaja
adicional
es
la facilidad de
uso
ya que
uncamente
hay
que
agregar
el contenido
de
un
frasco
a
otro
y
mezclar
o
tambin
los reactivos sevendenlistos
para
usarse
A
pesar
de
que
los kits
comerciales han sido utilizados
para
cuantificar
p ro te n a s
colesterol
glucosa y
lactato en
hemolinfa
de
crusteos
no
ha
quedado
claro
si
las
condiciones distintas
que
existen
en
el
plasma
de
camar n
afectan
o
no
la
acci n de los reactivos Esto hace necesario
determinar
el efecto de la salinidad
en
las
reacciones
de
cuantificaci n Por
ello
en
este
trabajo
se
probaron
condiciones de salindad
semejantes
a
las
existentes
enel
plasma
de
camar n
con
el fin
de
conocerla
influencia de la salindad
en
la
cuantificaci n de
glucosa
lactato
colesterol
y acilglicridos
De la misma forma se
prob
la influencia de la
alta
salindad
en
la
reacci n del
biuret
para
cuantificaci n de
p r o te n a s
totales
en
Jorge
Soto
Hemdez D ISCUSI N 39
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
44/67
p lasma
de camar n
De
acuerdo
a los resultados el
uso
de
concentraciones
salinas
semejantes
a las
existentes
en
la hemolinfa NaCI
45 mM noalter la
eficiencia
de los kits
comerciales De la misma
forma
la determinaci n de
p ro te n a
no
fue afectada
cuando la
reacci n se realiz
a 45 mM de
NaCI
2
Adaptaci n
de
las
tcncas
a
microplaca
El
procedimento
de
las tcnicas
de
medici n se
realizan utilizando
celdas
de
policarbonato
de
cmde
espesor
en
donde se
agrega
unacantidad de
mL
de
reactivo
y
la lectura de la
absorbancia
sehace
en
espectrofot metros
que
pueden
tener una
capacidad
de hasta
muestras
Por
su
parte
el
uso
de
microplacas
para
la
cuantificaci n
de
compuestos plasmicos
en
camar n
puede
reducir
el
gasto
de reactivos
y
aumentar la manobrabilidad
adem
de
que
permte
analizar
varias
muestras
enforma
simultea
9 Debido
a
esto
se
puede aplicar
a
los
sistemas de cultivo
para
llevar
registros
de
forma
rpida
y
sencilla sin la
necesidad
de
personal especializado
de los
parmetros
bioqu micos
en
los
organismos
cultivados
En
este
trabajo
se
estandarizaron las tcnicas
para
medir
glucosa
lactato
colesterol
acilglicridos
y p ro te n a s
totales
en
plasma
de
camar n
blanco
utilizando
microplaca
Para ello fue
necesario
considerar
que
en
espectrofotomera
de acuerdo a la
ley
de Lambert
Beer
el
grosor
de
la columna
Jorge
SotoHemdez
DISCUSI N 4
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
45/67
de absorci n
afecta
de
forma
directamente
p ropo rc iona l
la
absorbancia
de
la
muestra
Lehn inge r
979 Con
el fin de
que
la cantidad de reactivo
a
usarfuera
constante
y
con
base
en
la
capacidad
de
los pozos
se
estableci
un
volumen
de
2
I
para
cada
prueba
De esta forma
s lo
se
requer a
saber el volumen de
muestra
adecuado
para
cada tcnica Analizando
diferentes
vo lJl e ne s
se
buscaron
aquellos
que
permi t ieran
obtener
absorbancias
entre
5
y
De
acuerdo a los resultados
obtendos
el volumen
m
adecuado fue
de O I de
muestra
para
las
pruebas
de
glucosa
acilglicidos
y
lactato mientras
que
para
prote nas
y
colesterol fue
de 2
Con estos volmenes
de reactivos
y
de muestra
se
observ
que
la
absorbancia
fue
directamente
proporcional
a
la concentraci n de la
muestra
le y
de Lambert
Beer Con relaci n
a
esto
se
elaboraron
curvas
de
calibraci n
para
determinar
el
intervalo lineal
Para
cada
caso
se
seleccionaron intervalos
con
uncoeficiente de
re g re s i n
mayor
o
igual
a
97
Cada vez
que
un nuevo modo o una modificaci n al
mismo es
generada
es
necesario
conocer
el
grado
de relaci n
que
existe entre ambos Por ello
una
vez
establecidas las
condiciones
para
usar
el
modo
en
mcroplaca
se
determin
si
las concentraciones de
p r o te n a s
y
metabolitos
en
plasma
de camar n blanco
utilizando el
modo
estandarizado
y
el modo recomendado
La
concentraci n
de cada
uno
de
los
componentes
analizados
se
calcul
a
partir
Jorge
Soto Herndez D ISCUSI N 4
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
46/67
de
lascurvasestndar
previamente
realizadas de acuerdo
a
la
ecuaci n
Concentraci n
del
componente
Am b
Donde
Am lectura
de
la
absorbancia de
la
muestra
y
b
pend ien te
de
la curva
estdar
La
curva
de calibraci n
fue
realizada cada vez
que
seus unreactivo o
kit
nuevo
o
se dud de la estabilidad del reactivo
Cuando
se
midi la concentraci n de metabolitos
y p ro te nas
con el modo
en
microplaca
los
resultados
se
compararon
con los
obtendos usando
celdas
de
cm
de
espesor
se
observ
que
ambos modos
pueden
ser
usados
indistintamente
ya que
nose
observaron
diferencias
significativas
Por otro lado
cuando
se hicieron
pruebas
de
la
reproductibilidad
de
las medidas
para
las tcnicas
adaptadas
a
mcroplaca
se
encontr
que
las
cinco tcnicas
utilizadas
tienen buena
precisi n
al
encontrar
que
la desviaci n relativa DR
de
las mediciones
era
muy
pequea
La exactitud de las tcncas
tambin
fue
buena
a
excepci n
de la tcnica
dellactato
Esta tcnica tiene unerro
negativo
grande
lo
cual
indica
que
las mediciones obtendas
son
inferiores
a
las verdaderas sin
embargo
tiene
la
DR
m
pequea
de las cinco tcncas
y
siempre
va
a estar
midiendo lo
mismo
porque
su
precisi n
es
muy
buena auncuando
su
exactitud
no
sea
tan
buena
Jorge
Soto
Herndez
DISCUSI N 42
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
47/67
3
Uso
de las
tcncas
adaptadas
a
microplaca
para
la evaluaci n
de
los
niveles demetabolitos
y
p r o te n a s
totales
en
plasma
de
camar n
en
ayuno
y
alimentado
Una
vez
que
se
comprob
la factibilidad de los modos estandarizados
para
microplaca
fueron
utilizaron
para
determinar
las
concentraciones
de
p r o te n a s
glucosa
lactato colesterol
y
triglicridos
en
plasma
de camar n blanco Penaeus
vannamei
De
la
misma manera
que
en
los vertebrados las modificaciones de la
concentraci n de
componentes
bioqu micos
del
plasma
producidos
por
la
ingesta
de alimento
pueden
ser
detectadas
en
la
hemolinfa
de invertebrados
incluyendo
crusteos debido
a
que
es
la
v a
de
transporte
de estos
organismos
Esta
situaci n
podr a
alterar
la
interpretaci n
de resultados en
ensayos
donde
las
diferencias
de concentraciones de
componentes
plasmicos
deban
reflejar
la
influencia
de
a lgn
tratamiento
espec f ico
En
este
trabajo
se observ un aumento
significativo
en las concentraciones de
p rot e n a s
totales
y
glucosa
de los
organismos
alimentados
en relaci n
a
los
camaronesmantendos
en
ayuno
durante
24
horas
Adem
el anisis
demostr
una
meno
variabilidad en
los
resultados obtenidos concamaronesmantendos
en
ayuno
Por
otro
lado no
se
observaron diferencias
significativas
en la
concentraci n de los
componentes
plasmicos
analizados
entre machos
y
hembras
J o r g e
Soto
Hemdez
DISCUSI N
43
-
7/24/2019 Valoracion de Tecnicas Calorimetrico Enzimaticas
48/67
Aunque
se
ha
reportado que
la concentraci n de
p r o te n a s
puede
serafectada
por
el
crecimiento
enP
japonicus
Cuzon
et
al
98 Chen
y
Cheng
993a
por
el
ciclo
de
muda
en
P
vannamei
Chan et al
988
y
H
americanus
Mercaldo
Allen 99
Y por
la
temporada
del
ao al
parecer
no
existen
diferencias
relacionadas con el
sexo
como
lo
demostraronChen
y Cheng
993aL
trabajando
con
P
japonicus
quienes
no detectaron
diferencias
en los niveles de
p ro te n a s
plasmicas
entre
hembras
y
machos
Por
su
parte
las concentraciones de
glucosa
plasmica
se
han
visto
afectadas
por
la
alimentaci n
enP monodon Hall
y
Van
998
por
el ciclo circadiano
enP
aztecus Rosas
et
al 992
y por
el
ciclo
de
muda
enP
vannamei Chan et
al
988 Pero en
ningn
caso
incluyendo
el
presente
trabajo
se
han detectado
diferencias relacionadas
con
el
sexo
4
Uso del
modo en
microplaca
en
camaronestratadosconlaminarina
La
laminarina
ha sido utilizada
como
estimulador de
procesos
relacionados
con
la
respuesta
inmune en invertebrados
S derh ll
y
Unestam 979
Smith et
