validación del método analítico para la cuantificación de bacitracina ...

i

VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO PARA LA CUANTIFICACIÓN DE

BACITRACINA EN EL LABORATORIO DE CONTROL DE CALIDAD DE UNA

INDUSTRIA FARMACÉUTICA VETERINARIA

JOHANNA CAROLINA VELANDIA CASTELLANOS

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS

CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

BOGOTÁ D.C. COLOMBIA

2008

ii

Articulo 23 de la R resolución No 13 de Julio de 1946

¨ La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos

en sus trabajos de tesis. Solo vela por que no se publique nada contrario al dogma y a la

moral católica y por que las tesis no contengan ataques contra persona alguna, antes

bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia ¨.

iii





TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcial

Para adoptar al titulo de

Microbióloga Industrial

DIRECTORA

VIVIANA PEÑA PÁEZ

Microbióloga Industrial

CO-DIRECTORA

JANETH ARIAS PALACIOS

Bacterióloga M.Sc- M.Ed

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS

CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

BOGOTÁ D.C. COLOMBIA

2008

iv




AUTOR


APROBADO

Viviana Peña Páez

Microbióloga Industrial DIRECTORA

Cindy Fernández López Microbióloga Industrial

JURADO

Janeth Arias Palácios Bacterióloga M.Sc- M.Ed

CO-DIRECTORA

Jazmín Andréa Castellanos

Química JURADO

v




AUTOR


APROBADO

Ingrid Schuler Ph.D

Bióloga Decana Académica

Janeth Arias Palacios

Bacterióloga M.Sc - M.Ed Directora de Carrera

vi

AGRADECIMIENTOS

A mis padres y hermana, gracias por su constante, incondicional e invaluable apoyo

emocional, intelectual y económico, que me permitió llevar a cabo este proyecto.

Buscando en todos y cada uno de los segundos de mi vida nunca defraudar su

confianza. Gracias por que me han dado todo, desde la vida, educación, formación

intelectual, personalidad creativa y competente.

A la Microbiologa Industrial Viviana Peña Páez, por ser una gran directora de tesis.

No me habría sido posible llevar a cabo esta investigación sin su ayuda, sus

conocimientos, su orientación, guía, perspicacia, su apoyo, dedicación y por su gran

amistad.

A la Doctora Janeth Arias Palacios, por sus conocimientos, orientación, apoyo y

respaldo durante el tiempo de realización de este trabajo y por creer en este proyecto.

A los Doctores Sergio Enrique Castro Ureña y Sergio Castro Brandon, de la

empresa VICAR FARMACEUTICA S.A., por su incondicional respaldo, apoyo

económico, por permitirme hacer uso del laboratorio y los implementos en el,

hospitalidad y amabilidad.

A la Química Farmacéutica Johanna Garcia, por su oportuna e invaluable

colaboración en textos guía y sus conocimientos, por ser ficha clave y esencial en la

realización y conclusión de esta investigación y por su gran amistad.

A la Química Sofía Mariana Riaño Torres, por su incondicional apoyo, orientación y

ayuda. Por su oportuna e invaluable colaboración, sus conocimientos, siendo ficha clave

y esencial en la realización de esta investigación y por su gran amistad.

vii

TABLA DE CONTENIDO

Pagina

1. RESUMEN 1

ABSTRACT 2

2. INTRODUCCIÓN 3

3. REVISIÓN DE LITERATURA 6

3.1 ANTIBIÓTICOS 6

3.1.1 Definición 6

3.1.2 Clasificación de los antibióticos 7

3.1.2.1 Espectro de acción 7

3.1.2.2 Mecanismo de acción 7

3.1.2.2.1 Antibióticos que interfieren con la biosíntesis de la pared celular 7

3.1.2.2.2 Antibióticos que actúan sobre la membrana celular 8

3.1.2.2.3 Antibióticos que inhiben la síntesis de proteínas 9

3.1.2.2.4 Antibióticos que actúan sobre la síntesis de ácidos nucleicos. 9

3.1.2.3 Estructura química 10

3.1.2.3.1 Aminoglucosidos 10

3.1.2.3.2 Anfenicoles 10

3.1.2.3.3 Antimicobacterianos 10

3.1.2.3.4 Cefalosporinas y otros B-lactamicos 11

3.1.2.3.5 Glucopeptidos 11

3.1.2.3.6 Lincosaminas 11

3.1.2.3.7 Macrólidos 11

3.1.2.3.8 Penicilinas 11

3.1.2.3.9 Quinolonas 12

3.1.2.3.10 Sulfamidas y diaminopirimidinas 12

3.1.2.3.11 Tetraciclinas 12

viii

3.1.2.3.12 Polipeptidicos 13

3.2 BACITRACINA 13

3.2.1 Descubrimiento 13

3.2.2 Sinónimos 13

3.2.3 Formula empírica 14

3.2.4 Formula estructural 14

3.2.5 Peso molecular 14

3.2.6 Descripción, Solubilidad, Conservación, Estabilidad 14

3.2.7 Espectro antimicrobiano de acción 15

3.2.8 Tipo y mecanismo de acción 16

3.2.9 Farmacocinética 16

3.2.10 Indicaciones y administración 17

3.2.11 Interacciones 17

3.2.12 Efectos adversos 17

3.3 BACITRACINA ZINC 18

3.3.1 Descripción, solubilidad, conservación 18

3.3.2 Estabilidad 18

3.3.3 Incompatibilidades 18

3.3.4 Acción farmacológica 18

3.3.5 Indicaciones de uso, dosis recomendadas, vías de aplicación 19

3.3.6 Condiciones de almacenamiento 19

3.4 BACITRACINA METILEN DISALICILATO 19

3.4.1 Descripción, solubilidad, conservación 19

3.4.2 Indicaciones de uso 19

3.5 Micrococcus luteus 20

3.5.1. Clasificación científica 20

3.5.2 Características 20

ix

3.5.3 Bioquímica 21

3.5.4 Patogénesis 21

3.5.5 Usos industriales 21

3.6 VALIDACION DE METODOS ANALITICOS 22

3.6.1 Definición 22

3.6.1.1 Definición General 22

3.6.1.2 Definición Analítica 22

3.6.2 Métodos Susceptibles a ser Validados 22

3.6.3 Entorno Legal 23

.6.3.1 Norma de Correcta Fabricación de Medicamentos 23

3.6.3.2 Farmacopeas 23

3.6.4 Fases en el desarrollo de un método analítico y criterios de validación 23

3.6.4.1 Definición de las características de practicabilidad 23

3.6.4.2 Estudios de estabilidad de la muestra preparada para análisis 24

3.6.4.3 Puesta a punto. Características de idoneidad 24

3.6.4.4 Características de fiabilidad 25

3.7 CARACTERÍSTICAS DEL DESEMPEÑO ANALÍTICO 26

3.7.1 SELECTIVIDAD 27

3.7.1.1 Definición 27

3.7.1.2 Ámbito de aplicación 28

3.7.1.2.1 Según el objetivo de ensayo 28

3.7.1.2.2 Según la técnica analítica aplicada 28

3.7.2 LINEALIDAD 29



3.7.3 PRECISION 30

3.7.3.1 Definiciones 30

x

3.7.3.2 Diferentes tipos de estudio en la precisión 31

3.7.3.2.1 Repètibilidad 31

3.7.3.2.1.1 Repetibilidad del sistema instrumental 32

3.7.3.2.1.2 Repetibilidad del método 32

3.7.3.2.2 Precisión inmediata 32

3.7.3.2.3 Reproducibilidad 32


3.7.4 EXACTIDUD 33



3.7.4.3 Procedimiento de determinación de la exactitud 33

3.7.4.4 Determinación 34

3.7.5 LIMITE DE DETECCION Y LÍMITE DE CUANTIFICACION 35



3.7.5.3 Procedimientos de determinación del LD y LQ 36

3.7.6 ROBUSTEZ 36



3.7.7 ESPECIFICIDAD 38


3.7.7.2 Determinación 38

3.8 VALORACION MICROBIOLOGICA DE ANTIBIOTICOS 39

3.8.1 Generalidades 39

3.8.2 Definiciones 39

3.8.2.1 Valoración de antibióticos 39

3.8.2.2 Potencia real 40

3.8.2.3 Potencia asignada 40

xi

3.8.2.4 Potencia estimada 40

3.8.2.5 Limites de confianza (Intervalo de confianza) 40

3.8.3 METODO 40

3.8.4 Validación 41

3.8.4.1 Linealidad 41

3.8.4.2 Repetibilidad (Precisión) 41

3.8.4.3 Exactitud 42

3.8.4.4 Selectividad 42

4. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA 43

5. JUSTIFICACION 45

6. OBJETIVOS 47

7. MATERIALES Y METODOS 48

7.1 Estándar de Referencia 48

7.2 Muestras de estudio 48

7.3 Preparación y estandarización de la suspensión del microorganismo de ensayo 49

7.3.1 Cultivo bacteriano 49

7.3.2 Preparación del inoculo 49

7.3.3 Determinación de la cantidad de suspensión madre para inoculo 49

7.4 Preparación del estándar (Método de la curva patrón) 50

7.4.1 Diluciones del patrón 50

7.4.2 Diluciones finales del patrón 50

7.5 Preparación de la muestra 51

7.5.1 Dilución de la muestra 51

7.5.2 Dilución de prueba de la muestra 51

7.6 Obtención del placebo 51

7.7 Preparación de placas de valoración 52

7.8 Validación del método de cuantificación del principio activo (USP, 30) 52

7.8.1 Especificidad 52

xii

7.8.2 Selectividad 53

7.8.3 Linealidad del sistema 54

7.8.4 Linealidad del método 54

7.8.5 Precisión del método 55

7.8.6 Exactitud 55

7.8.7 Limite de detección 55

7.8.8 Limite de cuantificación 56

8. RESULTADOS Y DISCUCION 57

8.1 Especificidad del método 57

8.2 Selectividad del método 57

8.3 Linealidad del sistema 59

8.4 Linealidad del método Bacitracina Zinc 59

8.5 Linealidad del método Bacitracina Metilen Disalicilato 60

8.6 Precisión del método 61

8.7 Exactitud del método 64

8.8 Limite de detección 65

8.9 Limite de cuantificación 65

9. CONCLUIONES 67

10. RECOMENDACIONES 69

11. REFERENCIAS 70

12. ANEXOS 74

xiii

LISTA DE FIGURAS Pagina

Figura 1. Bacitracina (Según Maier y Groger, 1972) 14

Figura 2. Diferentes tipos de estudio en la precisión 30

xiv

LISTA DE TABLAS Pagina

Tabla 1. Espectro de acción de la Bacitracina (Según Wege, 1969) 16

Tabla 2. Datos Requeridos para la Validación de Métodos Analíticos (USP 30) 26

Tabla 3. Variación de factores en el estudio de la precisión 31

Tabla 4. Diluciones de la curva patrón (intervalo de concentraciones 0.1 a 0.25 UI/ml) 50

Tabla 5. Diluciones de la curva patrón (intervalo de concentraciones 0.5 a 2.5 UI/ml) 51

Tabla.6 Diluciones del las muestras para la evaluar la Exactitud 55

Tabla. 7 Diluciones del las muestras para determinar el limite de detección 56

xv

LISTA DE ANEXOS Pagina

ANEXO 1. CALDOS, MEDIOS DE CULTIVO Y BUFFERS 74

ANEXO 2. LINEALIDAD DEL SISTEMA 75

ANEXO 3, LINEALIDAD DEL MÉTODO BACITRACINA ZINC 80

ANEXO 4. LINEALIDAD DEL MÉTODO BACITRACINA METILEN DISALICILATO 85

ANEXO 5. ESPECIFICIDAD BACITRACINA ZINC 90

ANEXO 6. ESPECIFICIDAD BACITRACINA METILEN DISALICILATO 91

ANEXO 7. SELECTIVIDAD BACITRACINA ZINC 92

ANEXO 8. SELECTIVIDAD BACITRACINA METILEN DISALICILATO 96

ANEXO 9. PRECISIÓN DEL METODO BACITRACINA ZINC 100

ANEXO 10. PRECISIÓN DE METODO BACITRACINA METILEN DISALICILATO 110

ANEXO11. PRECISION DEL SISTEMA 120

ANEXO 12. EXACTITUD METODO BACITRACINA ZINC 121

ANEXO 13. EXACTITUD DEL METODO BACITRACINA METILEN DISALICILATO 127

ANEXO 14. LIMITE DE CUANTIFICACION 133

ANEXO 15. LIMITE DE DETECCIÓN 136

1

1. RESUMEN

Se realizo la validación del método analítico para la cuantificación de Bacitracina, para ser

utilizado en el control de calidad de materias primas y en los productos farmacéuticos con

este principio activo. En el presente trabajo se describió y desarrollo el proceso de

validación de la valoración microbiológica de antibióticos en cilindro-placa (difusión en

agar), para la determinación cuantitativa de Bacitracina Zinc al 15% y Bacitracina Metilen

Disalicilato al 11%, que incluye los requisitos exigidos en la determinación de parámetros

analíticos de linealidad del sistema, linealidad del método, especificidad, exactitud,

selectividad, limite de detección, limite de cuantificación y la precisión expresada en sus dos

formas: repetibilidad y reproducibilidad.

Se demostró mediante el diseño experimental, con la evaluación estadística de los

resultados experimentales y teniendo como base los criterios de aceptación permitidos, que

el método analítico es específico, selectivo, lineal (r2 0. 993 linealidad del sistema, r2 0.995

linealidad del método Bacitracina Zinc y r2 0.99 linealidad del método Bacitracina Metilen

Disalicilato), preciso (CV< 5%), exacto (Sesgo < 3% y texp.<ttab.) en el intervalo de

concentraciones estudiadas. Se obtuvo el límite de cuantificación en la concentración 0.02

UI/ml y el límite de detección en la concentración 0.005 UI/ml.

De esta forma mediante los estudios realizados se establece que las características de

desempeño analítico cumplen con los requisitos para la aplicación analítica propuesta

siendo confiable para ser utilizado en la comprobación de las especificaciones de calidad.

2

ABSTRACT

The validation of the analytical methods method for the quantitative of Bacitracin was carried

out to be used in the quality control in a raw material and the pharmaceutical products

finished with this active principle. In this work was described and developed the validation

process of microbiological cylinder-plate determination method for antibiotics (diffusion in

agar) for the quantitative determination of Bacitracin Zinc 15% and Bacitracin Methylene

Disalicylate 11%, it includes the necessary requirements in the determination of the analytic

parameters: method linearity, system linearity, specificity, exactness, selectiveness,

detection limit, quantification limit and accuracy, which was expressed in its 2 forms:

repeatability and reproducibility.

It was demonstrated by through experimental design, with the statistical evaluation of the

experimental data and having like base the allowed approaches of acceptance that the

analytic method is specific, selective, lineal (r2 0. 993 system linearity, r2 0.995 method

linearity of Bacitracin Zinc y r2 0.99 method linearity Bacitracin Methylene Disalicylate),

precise (CV< 5%), exact (Sesgo < 3% y texp.< ttab.) in the interval of studied concentrations.

The quantification limit and detection limit was 0.02 UI/ml and 0.005 UI/ml respectively. For

that reasons, states that the characteristics of analytic acting fulfill the requirements for the

application analytic proposal, therefore, they are reliable and may be used in the checking of

the quality specifications of the raw material and the pharmaceutical products finished with

this active principle.

3

2. INTRODUCCIÓN

La validación es el proceso establecido para la obtención de pruebas documentadas,

mediante estudios sistemáticos de laboratorio y demostrativos, de que un método de

análisis es lo suficientemente fiable y reproducible para producir el resultado previsto

dentro de intervalos definidos. El proceso de validación permite el conocimiento de las

características de funcionamiento del método y proporciona un alto grado de confianza

en el mismo y en los resultados obtenidos al aplicarlo. (AEFI, 2001)

Se define como método analítico a la adaptación específica de una técnica analítica

para un propósito de medición seleccionado. La validación de un procedimiento analítico

es un procedimiento para establecer por medio de estudios laboratoriales una base de

datos que demuestren científicamente que un método analítico tiene las características

de desempeño (exactitud, precisión, especificidad, límite de detección, límite de

Cuantificación, linealidad y intervalo de linealidad) que son adecuadas para cumplir los

requerimientos de las aplicaciones analíticas pretendidas. Implica la demostración de la

determinación de las fuentes de variabilidad y del error sistemático y al azar de un

procedimiento, no solo dentro de la calibración sino en el análisis de muestras reales.

(USP, 30)

La valoración microbiológica de antibióticos es un método analítico que permite bajo las

condiciones adecuadas demostrar la actividad (potencia) de los antibióticos por medio

de su efecto inhibidor sobre los microorganismos. Se utilizan dos métodos generales: la

valoración en difusión en gel de agar (cilindro placa) y la valoración turbidimetrica en

tubo. (USP, 30) básicamente en los dos métodos la potencia de un antibiótico se estima

mediante la comparación de la actividad de un producto (problema) y la de un muestra

Estándar de referencia (patrón) en presencia de un microorganismo testigo. (AEFI,

2001)

VICAR FARMACEUTICA S.A. fabrica y comercializa productos farmacéuticos

veterinarios, posee una línea de más de cuarenta productos en el mercado para la

sanidad animal. Dentro de estos productos se encuentra Bactran, antibiótico cuyo

principio activo dependiendo su presentacion es la Bacitracina Zinc o Bacitracina Dimetil

Salicilato.

Posee un espectro antimicrobiano de acción activa frente algunas bacterias Gram

Positivas como estafilococo, estreptococo (particularmente el estreptococo del grupo A)

4

y clostridio. Es también activa frente a Actnomyces, Treponema pallidum y algunas

especies Gram negativas, como Neisseria y Haemophilus influenzae; sin embargo, la

mayoría de los microorganismos Gram. Negativos son resistentes. (Sweetman, C.

2003). Su espectro de acción abarca también, algunos corinebacterias, espiroquetas,

Nocardidia, Entamoeba histolytica. (Trolldenier, 1985). Las salmonellas, E.coli, Proteus,

los hongos y los virus son resistentes. Los gérmenes sensibles son inhibidos por una

concentración comprendida entre 0,005 y 2,0 UI/mg. Los que necesitan 50 UI/mg o mas

se consideran resistentes. (Trolldenier, 1900). La acción de la bacitracina es

bacteriostática y bactericida. La dosis requerida para que sea bactericida es 5 – 10

veces mayor. La bacitracina influye sobre importantes sistemas enzimáticos. Impide la

construcción de la pared celular bloqueando la desfosforilizacion (Parthier, 1969). La

Bacitracina interfiere en la síntesis de la pared celular bacteriana al bloquear las

funciones de las moléculas transportadoras de lípidos que transfieren las subunidades

de la pared celular a través de la membrana. La Bacitracina se une al undecaprenol-

pirofosfato, bloqueando su desfosforilación, e impidiendo por lo tanto, la regeneración

del transportador de membrana.. (Sweetman, C. 2003). En los estafilococos inhibe la

incorporación del acido glutámico durante la fase de proliferación. (Trolldenier, 1984)

La Bacitracina y la Bacitracina zinc se aplican por vía tópica, a menudo junto con otros

antimicrobianos como la Neomicina o Polimixina B, y algunas veces con

corticosteroides, en el tratamiento de las infecciones locales. La bacitracina se emplea

en infecciones de piel (piodermitis, heridas infectadas, Impetigo contagioso, foliculitis,

furunculosis, ulcera decubitus, dermatitis infecciosa eczematoid, escabiosis, y

dermatofitosis), conjuntivas (causadas por S. aureus, S. pyogenes, entre otros),

sinusitis, faringitis, traqueobronquitis, infecciones mandibulares (actinomicosis),

oculares, entre otros. La bacitracina ha sido efectivamente usada oralmente para el

manejo de amebiasis intestinal, pero se encuentran disponibles otros amebicidas más

potentes. (Remington´s. 1980)

La misión de VICAR FARMACEUTICA S.A. es contribuir al progreso de la Sanidad

Animal y de la Medicina Veterinaria en los países hispanoamericanos, suministrando a

los médicos veterinarios productos farmacéuticos de la más alta calidad en el momento

oportuno. Para alcanzar el propósito de la misión, la validación de cada uno de los

métodos analíticos (como por ejemplo la valoración microbiológica de Bacitracina)

aplicados en un laboratorio específico, podrá demostrar con un alto grado de confianza,

por medio de evidencia documentada que el proceso producirá de forma consistente y

permanente productos que poseen las características de calidad predefinidas,

5

compitiendo y generando valor al cliente. Con métodos de análisis validados se

alcanzan las metas de calidad que se haya trazado como parte de los procesos de

mejoramiento continúo del sistema de calidad, formando una empresa cada vez más

líder en la industria farmacéutica veterinaria del país.

El presente trabajo tiene como objetivo describir el proceso de validación del método

analítico para la cuantificación de Bacitracina efectuado en el laboratorio de VICAR

FARMACEUTICA S.A. mediante estudios de laboratorio que permitan la determinación

y el estudio de las característica de desempeño analítico para la validación del método.

6

3. REVISION DE LITERATURA

3.1. ANTIBIÓTICOS

3.1.1 Definición

El primero que expresó el concepto de antibiótico fue Waksman (1942): los antibióticos

son sustancias de acción antimicrobiana producidas por microorganismos o plantas

superiores en el curso de su metabolismo normal, sustancias que inhiben el crecimiento

de otros microorganismos en concentraciones mínimas. Esta definición ha sido

ampliada posteriormente en virtud de los conocimientos adquiridos sobre su obtención,

y con objeto de deslindar otros productos metabólicos: un antibiótico es una sustancia

químicamente definida, producida en el metabolismo de células vivas y aislada de ellas

por primera vez, o uno de sus derivados producidos por métodos sintéticos o

biosintéticos, el cual ejerce su acción bacteriostática o bactericida en pequeña

concentración contra microorganismos vegetales y animales.( Brunner y Machek,

1962).

Algunos de los antibióticos mas empleados son producidos por actinomicetales

(Estreptomicina, Cloranfenicol, Tretraciclinas, Eritromicina), hongos (Penicilina,

Griseofulvina) y bacterias (Polimixinas, Bacitracina). (Trolldenier, 1900)

Bacteriostatico: Inhibición o interrupción de la multiplicación microbiana tras un periodo

variable de latencia, en general reversible Estos antimicrobianos inhiben la

multiplicación, no destruyen, son antibióticos bacteriostáticos de tal manera que cuando

el microorganismo desaparece puede volver a crecer, el fin es que el sistema inmune

acabe con ellos después de haber tomado el antibiótico. (Thrum y Bocker, 1971)

Bactericida: Eliminación irreversible de los gérmenes en periodo de reproducción o

reposo sin daño para el microorganismo. Las condiciones previas son: dosificación

óptima, necesaria duración terapéutica, concentración suficiente donde esté localizada

la infección.

La acción bactericida in Vitro se desarrolla en tres fases:

1. fase de latencia: generalmente corta, dura unos 5 – 15 minutos. Es probable que

entonces tenga lugar la penetración en la célula bacteriana.

7

2. fase de muerte: inhibición del crecimiento o muerte de los gérmenes. El número de

bacterias que sobreviven disminuye espontáneamente mientras dura la acción letal si la

concentración es constante.

3. fase tardida: la reducción de gérmenes disminuye, pero sin que cesé por completo.

Esta fase también se puede llamar persistencia. (Thrum y Bocker, 1971)

3.1.2 Clasificación de los antibióticos

3.1.2.1 Espectro de acción

Todos los antibióticos poseen un espectro de actividad conocido sobre los gérmenes

patógenos en virtud a su mecanismo de acción específica. Por los microorganismos o

agentes afectados, dividimos los antibióticos en bacteriostáticos, bactericidas,

fungistáticos, virostáticos, rickettsiostáticos y citostáticos. En cuanto al número de

especies o familias sensibles el espectro de los antibióticos puede ser reducido, medio o

amplio. El espectro es muy variable siendo la mayoría de tipo amplio el mayor en

cefalosporinas de 4ª generación, carbapenemas y piperacilina-tazobactam, seguido de

cefalosporinas de 3ª generación incluyendo Gram Negativos, Gram Positivos y

espiroquetas. De espectro más reducido destacan la bencilpenicilina y

fenoximetilpenicilina (estreptococos y Neisseria), cloxacilina (antiestafilococo) y

aztreonam (sólo Gram negativos) y los de espectro medio suelen ser activos frente a

gérmenes Gram Positivos y Gram negativos y a ellos pertenecen las penicilinas, los

antibióticos macrólidos, algunos polipeptídicos y los aminoglucosídicos, la amoxicilina-

clavulánico y cefalosporinas de 1ª y 2ª generación.(Trolldenier, 1900)

3.1.2.2 Mecanismo de acción

Otra forma de agrupar los antibióticos es en función de las "dianas" sobre las que

actúan y con las que interfieren:

3.1.2.2.1 Antibióticos que interfieren con la biosíntesis de la pared celular

Su acción esta limitada a la fase de proliferación. La mayoría de los antibióticos inhibe la

síntesis de diferentes compuestos celulares. Algunos de los fármacos más empleados

interfieren con la biosíntesis de peptidoglicanos (PG), el principal componente de la

pared celular. Ejercen su efecto bactericida sobre bacterias en crecimiento. Inhibe

determinados pasos en el ciclo de la síntesis y ensamblaje del PG, provocan la

acumulación de precursores de PG desencadenando autolisinas de la bacteria, que

degradan el PG provocando la lisis celular por ingreso de agua a la célula. Estos

8

antibióticos no lesionan las células humanas ya que éstas no poseen pared celular.

(Pareja Iañez, 1998)

En conclusión esta clase de antibióticos, inhiben la síntesis de peptidoglicanos . Una

vez que se inhibe la síntesis de la pared celular puede ocurrir autolisis enzimática de la

pared celular. Sin la influencia restrictiva de la pared celular, la elevada presión osmótica

dentro de la célula hace estallar a la membrana interna y/o externa de la bacteria. Por lo

tanto estos antibióticos son generalmente bactericidas. (Figueroa , P y Luna Torres, L.

2006).

Algunos antibióticos que presentan esa actividad son:

- Betalactámicos que dependiendo de su estructura química, se clasifican en penicilinas,

cefalosporinas o carbapénem. Todos los antibióticos betalactámicos comparten una

estructura química similar en forma de anillo. Este anillo impide la unión de los péptidos

a las cadenas laterales en el proceso de formación de la pared celular. Estos

compuestos inhiben la síntesis de peptidoglicanos pero no interfieren con la síntesis de

componentes intracelulares. De este modo, continúan formándose materiales dentro de

la célula que aumentan la presión sobre la membrana hasta el punto en que ésta cede,

el contenido celular se libera al exterior, y la bacteria muere. (Pareja Iañez, 1998).

- Fosfomicina: Inhibe el primer estadio de la síntesis de peptidoglicano al competir por

analogía estructural con el PEP. (Pareja Iañez, 1998).

- Cicloserina: Se comporta la D-alanina, inhibiendo la actuación de la racemasa que

convierte la L-ala a D ala, así como la reacción de unión de dos D-ala. (Pareja Iañez,

1998).

- Vancomicina y ristocetina: inhiben la segunda transglucosidación, es decir la unión de

diversas unidades

disacarídicas. (Pareja Iañez, 1998).

- Bacitracina: se une al undecaprenol-pirofosfato, bloqueando su desfosforilación, e

impidiendo por lo tanto, la regeneración del transportador de membrana. (Pareja Iañez,

1998).

3.1.2.2.2 Antibióticos que actúan sobre la membrana celular

A diferencia de los antibióticos que actúan a nivel de pared, los que interfieren con la

membrana celular ejercen sus efectos independientemente de que el microorganismo

9

esté o no creciendo. Suelen carecer de especificidad (afectan a membranas de

procariotas y de organismos superiores), por lo que resultan más o menos tóxicos para

los mamíferos y, en general, han encontrado escasa aplicación clínica. Algunos de los

antibióticos que pertenecen a este grupo son: Polienos, Polimixinas, Imidazoles, entre

otros. (Pareja Iañez, 1998). La Estreptomicina, la Polimixina B y la Colistina, perturban

las funciones de la membrana citoplasmática que regula las condiciones de

permeabilidad, de tal modo que puede producirse la muerte de la célula por

desregulaciones osmóticas. Esta acción no exige división celular y es posible también

en la fase de reposo. (Trolldenier, 1984)

3.1.2.2.3 Antibióticos que inhiben la síntesis de proteínas

Los antibióticos que interfieren en la síntesis de proteínas son muy variados y

abundantes, y la mayoría de ellos funcionan interfiriendo con el ribosoma, sobre todo los

que se unen a proteínas ribosómicas y/o a alguno de los ARN ribosómicos. Los más

útiles son aquellos que tienen efectos selectivos frente a los ribosomas 70S

procarióticos, pero no sobre los 80S eucarióticos. Dentro de ellos y siguiendo el orden

natural del funcionamiento de la elongación de la cadena polipeptídica, podemos

agruparlos según la fase concreta de la elongación sobre la que actúan:

Inhibición del reconocimiento de un aminoacil-ARNt (aa-ARNt) hacia el sitio A del

ribosoma;

Introducción de errores en la lectura de los ARNm;

Inhibición de la reacción de formación del enlace peptídico;

Inhibición de la traslocación del peptidil-ARNt (pp-ARNt) desde el sitio A al sitio P.

Bloqueo de los factores de elongación.

Esta acción inhibidora del metabolismo no depende tampoco de la división celular, pero

se desarrolla con mayor rapidez y seguridad durante la fase de proliferación.

(Trolldenier, 1900). Algunos de los antibióticos que pertenecen a este grupo son:

Tetraciclinas, Aminoglucósidos, Anfenicoles, Lincosamidas, Macrólidos, entre otros.

(Pareja Iañez, 1998)

3.1.2.2.4 Antibióticos que actúan sobre la síntesis de ácidos nucleicos.

Son antibióticos de síntesis química, su toxicidad selectiva es baja y son

bacteriostáticos. Estos antibioticos operan sobre las enzimas que actúan en el proceso.

10

Sus mecanismos de acción son: a). Por bloqueo de la trascripción:- Impide que actué la

ARN polimerasa bacteriana que es la que sintetiza el ARN. - Rifampicina. b). Por

bloqueo de la duplicación del ADN:- Actúan inhibiendo la acción de las enzimas que

enrollan y desenrollan la cadena de ADN, estos antibióticos impiden que la cadena se

desenrolle. - Quinolonas: Oflozacino, cinoxacino, norfloxacino. - Novobiocina:

Benzamida. c) Por interferencia en la síntesis de bases nitrogendas:- Impiden la síntesis

de bases nitrogenadas, Adenina, timina, etc. (método exclusivo de las bacterias). -

Sulfamidas - Diaminopirimidinas. Algunos de los antibióticos que pertenecen a este

grupo son: Quinolonas, Ansamicinas, Sulfonamidas, entre otros. (Pareja Iañez, 1998)

3.1.2.3Estructura química

Una forma de estudiarlos es agrupándolos por clases según su naturaleza química.

Desde el punto de vista químico, se clasifican en grandes familias:

3.1.2.3.1 Aminoglucosidos

Grupo de antibióticos bactericidas estrechamente relacionados, derivados de bacterias

del orden Actinomicetales o, mas concretamente, del genero Streptomyces(

Framicetina, Kanamicina, neomicina, paromomicina, estreptomicina y tobramicina) y del

genero Micromonospora (gentamicina y sisomicina). Los aminoglucosidos poseen un

espectro antimicrobiano similar y actúan interfiriendo en la síntesis proteica bacteriana.

Son más activos frente a bacilos gramnegativos que en los grampositivos. (Sweetman,

2003)

3.1.2.3.2 Anfenicoles

El cloranfenicol (y tianfenicol) son inhibidores de la síntesis proteica por acción en el

ribosoma a nivel de la subunidad 30S y 50S respectivamente. El cloranfenicol por el

contrario está limitado a su uso en preparados tópicos, pero en el pasado fue utilizado

para el tratamiento de múltiples cuadros infecciosos, desde banales hasta muy graves,

pero se ha ido retirando por la potencial toxicidad hematológica. (Delgado-Iribarren,

2001).

3.1.2.3.3 Antimicobacterianos

Constituyen un grupo variado de antibacterianos cuyo espectro de actividad incluye

Mycobacterium spp. Forman parte del grupo, las rifamicinas, también conocidas como

ansamicinas, un grupo de antibióticos aislados a partir de una cepa de Amycolatopsis

mediterranei (Nocardida mediterranei;Streptomyces mediterranei).Estos antibióticos se

11

utilizan para el tratamiento de tuberculosis, la lepra y otras infecciones micobacterianas.

(Sweetman, 2003).

3.1.2.3.4 Cefalosporinas y otros B-lactamicos

Las cefalosporinas son antibacterianos semisinteticos derivados de la cefalosporina C,

un antibiótico natural producido por el moho Cephalosporium acremonium. Las

cefalosporinas son bactericidas y actúan inhibiendo la síntesis de la pared bacteriana.

Las nuevas generaciones de cefalosporinas generalmente poseen un incremento de

actividad frente a las bacterias gramnegativas y grampositivas.

3.1.2.3.5 Glucopeptidos

Poseen una estructura glucopeptidica. Actúan interfiriendo la síntesis de la pared

bacteriana y es activa frente a cocos grampositivos. Algunos antibióticos que pertenecen

a este grupo son: Avoparcina, ramoplanina, teicoplanina, vancomicina, entre otros.

(Sweetman, 2003) Actúan sobre la segunda fase de la síntesis de la pared bacteriana

inhibiendo la formación de peptidoglucano, interfieren en la formación del precursor D-

alanyl –D-alanina, afectan la permeabilidad de la membrana citoplasmática de los

protoplastos y alteran la síntesis de RNA. (Pareja Iañez, 1998).

3.1.2.3.6 Lincosaminas

Es un antibiótico producido por una cepa de Streptomyces lincolnensis. Las

lincosaminas son bacteriostáticas o bactericidas, según la concentración, y son activas

principalmente frente a bacterias grampositivas y Bacteroides spp. Al parecer tambien

poseen cierta actividad antiprotozoaria. Las lincosamidas poseen una actividad

antimicrobiana actuando sobre el ribosoma bacteriano para suprimir la síntesis proteica.

(Sweetman, 2003).

3.1.2.3.7 Macrólidos

Es un amplio grupo de antibióticos, principalmente producidos por Streptomyces spp.

Los macrólidos pueden ser bacteriostáticos o bactericidas, según su concentración y el

tipo de microorganismo y se cree que interfiere en la síntesis proteica bacteriana. Son

activos frente a microorganismos como Legionella pneumophila,Micoplasma

pneumoniae y algunas rickettsias y clamidias.

3.1.2.3.8 Penicilinas

La penicilina fue el primer antibiótico utilizado terapéuticamente y se obtuvo en un

12

principio como una mezcla de penicilinas conocidas como F, G, X y K, a partir del moho

Penicillium notatum. Se obtuvieron mejores rendimientos utilizando P. chrysogenum.

Son bactericidas por medio de su acción inhibitoria sobre la síntesis de la pared

bacteriana. La bencilpenicilina puede considerarse el compuesto original de las

penicilinas y es activa principalmente frente a bacterias grampositivas y Neisseria spp.

Algunas penicilinas son activas frente algunos microorganismos gramnegativos (ejemplo

ampicilina, mecilinam, temocilina, entre otros). (Sweetman, 2003).

3.1.2.3.9 Quinolonas

Inhiben la girasa (topoisomerasa II, genes gyrA y gyrB) y la topoisomerasa IV (genes

parC y Par E, con mayor importancia en gram positivos) por unión al complejo ADN-

girasa. Si bien estos compuestos se obtienen por síntesis química su mecanismo de

acción no es nuevo en la naturaleza puesto que existen también algunos compuestos

naturales que la presentan como por ejemplo la Novobiocina (producida por

Streptomyces), cumermicinas y ciclotilidina. Las topoisomerasas son enzimas

implicadas en el desarollamiento y decatenación del ADN lo que es necesario para su

replicación. El espectro de estos antimicrobianos ha evolucionado desde una limitación

a infecciones del tracto urinario y actividad limitada a gramnegativos hasta los

compuestos actuales con actividad en grampositivos y anaerobios, menor selección de

mutantes y mejora en la farmacocinética. (Delgado-Iribarren, 2001)

3.1.2.3.10 Sulfamidas y Diaminopirimidinas

Son normalmente bacteriostáticas e interfieren en la síntesis de ácido fólico de

microorganismos sensibles. Estos se emplean en el tratamiento de la profilaxis de

algunas infecciones por protozoos. El empleo clínico de las sulfamidas es sumamente

reducido, en general están indicadas únicamente para el tratamiento de las infecciones

de las vías urinarias y algunos trastornos como la nocardiosis. Las sulfamidas como la

sulfaguanidina, el succinilsulfatiazol y el ftalilsulfatiazol se han utilizado para el

tratamiento de infecciones gastrointestinales. (Sweetman, 2003).

3.1.2.3.11 Tetraciclinas

Son un grupo de antibacterianos, inicialmente derivados de ciertos Streptomyces spp.

Interfieren en la síntesis proteica en organismos sensibles, poseen un amplio espectro

de actividad frente a bacterias grampositivas y gramnegativas, clamidias, rickettsias

(rickettsias tificas y maculosas), micoplasmas (neumonía atípica, enfermedad

inflamatoria pélvica, la enfermedad de Lyme, la brucelosis, la turalemia, la peste, el

13

colera, acne), espiroquetas, algunas micobacterias y algunos protozoos. (Sweetman,

2003)

3.1.2.3.12 Polipeptidicos

Es un grupo de antibióticos que se diferencia de los demás en cuanto a su mecanismo

de acción y su espectro antibacterial. Son antibióticos producidos por especies de

Bacillus durante las primeras fases de la esporulación. Se trata de moléculas con

aminoácidos en configuraciones L y D, y con presencia de ciertos aminoácidos "raros"

(no proteinogenéticos). Algunos de estos antibióticos son polipéptidos cíclicos. Su

síntesis no se realiza en los ribosomas, sino que se produce por una secuencia de

reacciones enzimáticas que nada tienen que ver con el proceso de traducción de los

mensajeros genéticos. Suelen ser antibióticos de efecto bactericida. Su mecanismo

consiste en que se unen a la cara externa de la membrana citoplásmica y, además, a la

membrana externa de las bacterias Gram.-negativas, alterando su estructura y su

permeabilidad osmótica; ello condiciona la inhibición de procesos básicos de la

membrana, así como la salida de metabolitos del citoplasma. Algunos antibióticos que

pertenecen a este grupo son: polimixina, tirocidina-a y gramicidina-s. (Pareja, 1998)

3.2 BACITRACINA

3.2.1 Descubrimiento

En Junio de 1943, Una niña de 7 años llamada Margaret Tracy, ingreso a la sala de

urgencias del Hospital Presbiteriano de Columbia de la ciudad de Nueva York, pues la

había atropellado un coche, ocasionándole una fractura abierta en la tibia. De esta

herida se tomo una muestra y en el análisis microbiológico inicial se determino la

presencia de Staphylococus aureus. Sin embargo, a su vez otras muestras fueron

enviadas al laboratorio de bacteriología, donde su directora, Balbina Jonson, describió

que el Staphylococus aureus visto en el examen inicial microscópico había

desaparecido de la noche a la mañana. Con la ayuda de Fran L. Meleney y H. Anker,

consiguieron aislar a partir de la muestra de la herida una cepa de un bacilo muy activo

frente S. Aureus, al que dominaron ¨Tracy I¨. Tras filtrar el caldo de cultivo se detecto la

presencia de un potente antibiótico a este antibiótico le dieron el nombre de Bacitracina,

de la combinación del termino ¨bacilo¨ y ¨tracy¨, apellido de esta niña. (Martín, 2005)

3.2.2 Sinónimos

Aifivina, Baxi-max, Penitracina, Zutracina (Negwer, 1971). Asociación con neomicina:

Nebacetina. (Trolldenier, 1900)

14

3.2.3 Formula empírica

Bacitracina A: C66H103N17O16S

Bacitracina B: C71H112 N18O17S

Bacitracina F: C66H97N15O17S

(Trolldenier, 1900)

3.2.4 Formula estructural

Figura 1. Bacitracina (Según Maier y Groger, 1972)

3.2.5 Peso molecular

Bacitracina (mezcla): ˜ 1500 Daltons

Bacitracina A: 1470 Daltons

(Trolldenier, 1900)

3.2.6 Descripción, Solubilidad, Conservación, Estabilidad

Según Farmacopua Europea 2002: la Bacitracina esta compuesta de uno o mas

polipéptidos antimicrobianos producidos por ciertas cepas de Bacillus lincheniformis y B.

subtilis var. Tracy. La potencia no es inferior a 60 UI/mg, calculándola con respecto a la

sustancia seca. Según USP 30 tiene una potencia no inferior a 40 UI/mg.

Es un polvo higroscópico de color blanco a amarrillo pálido, inodoro o con ligero olor.

Fácilmente soluble en agua; soluble en alcohol, acido acético glacial y metanol; la

solución en disolventes orgánicos a menudo presenta un residuo insoluble; insoluble en

acetona cloroformo y éter. Estas soluciones se deterioran fácilmente a temperatura

ambiente. Precipita en estas soluciones y se inactiva por sales de algunos metales

15

pesados. (USP 30). Forma sales estables con el cinc y el manganeso, las cuales son

relativamente insolubles (0,23 – 0,45 % a 25oC). (Trolldenier, 1984)

En solución de pH 5-7 es estable a 4 oC durante 4 semanas (Jawets 1956), y a 20 oC

pierde del 33 al 50% de su actividad en 14 días. (Meyer- Jones. 1956). Posee máxima

estabilidad en medio acido pH 4 – 5. La actividad biológica disminuye rápidamente a

pH >9. (Trolldenier, 1984)

De la mezcla se han aislado diversas (5 – 10) bacitracinas: A, A´, B, C, D, E, F1, F2, F3,

G. La conservación requiere ausencia de aire y oscuridad. La sustancia seca se

conserva durante 1,5 y 2 años a baja temperatura. (Patsch, 1975). En solución acuosa

al 1% presenta un pH entre 6 y 7. Conservar a temperatura entre 8 y 15 oC en envases

herméticos. (F. EUR). El pH en una solución acuosa que contiene 10.000UI/ml oscila

entre 5,5 y 7,5. (USP 30).

3.2.7 Espectro antimicrobiano de acción

Es activa frente algunas bacterias Gram Positivas como estafilococo, estreptococo

(particularmente el estreptococo del grupo A) y clostridio. Es también activa frente a

Actinomyces, Treponema pallidum y algunas especies Gram negativas, como Neisseria

y Haemophilus influenzae; sin embargo, la mayoría de los microorganismos Gram

Negativos son resistentes. (Sweetman, C. 2003). Su espectro de acción abarca

también, algunos corinebacterias, espiroquetas, Nocardidia, Entamoeba histolytica.

(Trolldenier, 1900) Las salmoneras, E.coli, Proteus, los hongos son resistentes. Los

gérmenes sensibles son inhibidos por una concentración comprendida entre 0,005 y 2,0

UI/mg. Los que necesitan 50 UI/mg o mas se consideran resistentes. (Trolldenier, 1900).

En la tabla 1 se muestra el espectro de acción de la Bacitracina.

16

Tabla 1. Espectro de acción de la Bacitracina (Según Wege, 1969)

Microorganismo Espectro de acción




Estreptococos +++ Salmonelas / Clostridios ++ Haemophilus +

Estafilococos +++ E. coli / Pasterelas / Actinomyces israeli

++

Neumococos ++ Shigelas / Brucelas + Treponemas ++

Corinebacterias ++ Aerobacter aerogenes

/ Fusobacterium necrophorum

/ Leptospiras +

Listeria monocytogenes

/ klebsielas / Vibriones / Toxoplasmas /

Erysipelothrix insidiosa

/ Proteus / Mycobacterium tuberculosis

/ Coccidias /

Bac. Anthracis + Pseudomonas aeruginosa

/ Rickettsias /

+ = Grados de sensibilidad / = Resistencia o inactividad

3.2.8 Tipo y mecanismo de acción

La acción de la Bacitracina es bacteriostática y bactericida. La dosis requerida para que

sea bactericida es 5 – 10 veces mayor a la concentración mínima inhibitoria (la menor

concentración capaz de inhibir el crecimiento). La Bacitracina influye sobre importantes

sistemas enzimáticos. Impide la construcción de la pared celular bloqueando la

desfosforilizacion (Parthier, 1969). La Bacitracina interfiere en la síntesis de la pared

celular bacteriana al bloquear las funciones de las moléculas transportadoras de lípidos

que transfieren las subunidades de la pared celular a través de la membrana la

Bacitracina se une al undecaprenol-pirofosfato, bloqueando su desfosforilación, e

impidiendo por lo tanto, la regeneración del transportador de membrana.(Sweetman, C.

2003). En los estafilococos inhibe la incorporación del acido glutámico durante la fase de

proliferación. (Trolldenier, 1900)

3.2.9 Farmacocinética

La Bacitracina no se absorbe de forma apreciable en el tubo digestivo. Cuando se

administra en inyección intramuscular se absorbe rápidamente. Entre el 10 y el 40% de

una dosis única inyectada se excreta por la orina en 24 horas. La Bacitracina difunde

fácilmente hacia el líquido pleural y ascético, pero pasa en poca cantidad el LCR. Se

ha descrito que la absorción es despreciable tras la aplicación tópica, pero puede

producirse después de un lavado peritoneal. (Sweetman, C. 2003).

17

3.2.10 Indicaciones y administración

La Bacitracina y la Bacitracina zinc se administra por vía tópica, en algunos casos se

combina junto con otros antimicrobianos como la Neomicina o Polimixina B, y con

corticosteroides, para el tratamiento de las infecciones locales. La Bacitracina se utiliza

en infecciones de piel (piodermitis, heridas infectadas, Impetigo contagiosa, foliculitis,

ecthyma, furunculosis, ulcera decubitus, dermatitis infecciosa eczematoid, scabies, y

dermatofitosis), conjuntivas (causadas por S. aureus, S. pyogenes, entre otros),

sinusitis, faringitis, traqueitis, traqueobronquitis, infecciones mandibulares

(actinomicosis), oculares, entre otros. La Bacitracina ha sido administrada efectivamente

de forma oral para el manejo de amebiasis intestinal, pero se encuentran disponibles

otros amebicidas más potentes. Se pueden presentar o producir efectos adversos a

partir de la absorción de esta en heridas abiertas y desde la vejiga o la cavidad

peritoneal; sin embargo la toxicidad de la dosis restrictiva de preparaciones combinadas

se considera que es debida a la Neomicina. (Sweetman, 2003)

Bacitracina también ha sido usado de forma oral como un antiséptico intestinal. Su

administración oral como suplemento alimenticio en algunas especies animales (pollos,

pavos, cerdos y conejos) actúa como promotor del crecimiento y terapéutico para

infecciones entéricas. La dosis de 2000 U/Kg de p.v. reduce moderadamente la flora

intestinal y una dosis de 10000 U/Kg de p.v. ( peso vivo) la destruye en gran parte. La

Bacitracina se elimina con la heces en el curso de hasta 3 días después de la ultima

administración. (Trolldenier, 1900)

3.2.11 Interacciones

Puede producirse nefrotoxicidad adicional si se administra Bacitracina de forma

sistemática con otros fármacos nefrotoxicos. Se ha descrito que la Bacitracina aumenta

la acción de bloqueo neuromuscular de otros fármacos. (Sweetman, 2003)

3.2.12 Efectos adversos

Cuando se administra Bacitracina de forma sistemática puede producir nefrotoxicidad

grave. Pueden aparecer repercusiones cutáneas, anorexia, nauseas y vómitos, así

como dolores el lugar de inyección. Pueden producirse reacciones de hipersensibilidad,

entre ellas exantemas y anafilaxia, tanto con administración sistémica como con

administración tópica, aunque esta ultima es excepcionalmente. (Sweetman, 2003)

18

3.3 BACITRACINA ZINC

3.3.1 Descripción, solubilidad, conservación

Según la Farmacopea Europea es un complejo de Bacitracina y zinc. Su potencia no

es inferior a 60UI/mg, calculada con respecto a la sustancia seca. Polvo higroscópico

blanco o ligeramente verde amarillento. Poco soluble en agua o alcohol, muy poco

soluble en éter. El filtrado de una solución saturada tiene un pH entre 6 y 7.5. Y según

la USP 30, es una sal de zinc de un tipo de Bacitracina o mezcla de dos o más sales

similares. Tiene una potencia no inferior a 40UI/mg. Contiene no menos de 2,0 por

ciento y no mas de 10,0 por ciento de zinc. (Zn), calculado con respectó a la sustancia

seca. Polvo higroscópico blanco o de ligero color marrón, inodoro o con un ligero olor.

Bastante soluble en agua. El pH en una solución acuosa saturada oscila entre 6 y 7.5.

Se Conserva en envases herméticos a una temperatura entre 8 y 15 oC.

3.3.2 Estabilidad

La Bacitracina zinc es más estable que la Bacitracina y puede conservarse durante 18

meses a una temperatura superior a 40 oC sin pérdidas apreciables. Las tabletas de

Bacitracina zinc, pomadas y comprimidos que contiene Bacitracina zinc con Neomicina

son mas estables que las correspondientes preparaciones de Bacitracina. La Bacitracina

zinc es más amarga que la Bacitracina y el sabor se enmascara más fácilmente.

(Sweetman, 2003)

3.3.3 Incompatibilidades

La Bacitracina se inactiva ligeramente en bases que contienen alcohol este arílico,

colesterol, derivados de polioxietileno y laurinsulfato sódico y se inactiva rápidamente en

bases que contienen agua, macrogoles, propilenglicol, glicerol, cloruro de cetilpiridinio,

cloruro de benzalconio, ictamol, fenol y acido tanico. (Sweetman, 2003)

3.3.4 Acción farmacológica

Antibiótico polipeptídico. Inhibe la síntesis del mucopéptido que forma la pared celular.

De esta manera, impide la formación de la pared celular y hace a la bacteria

osmóticamente sensible, llevándola a la lisis.

Su acción exige la presencia de cationes bivalentes como el Zinc.

19

3.3.5 Indicaciones de uso, dosis recomendadas, vías de aplicación.

La Bacitracina de Zinc es el antibiótico más comúnmente utilizado en patologías

digestivas, por ser activa frente a bacterias Gram positivas y por ser escasamente

absorbible en el tracto digestivo. Para su actividad, este antibiótico precisa de cationes

bivalentes como el Zinc. (King et al.1980),

Existe la hipótesis de que la Bacitracina no se limita al control de patógenos intestinales,

sino que también puede actuar sobre la cinética de absorción de nutrientes (Abecia et

al. 2004), dado que en otras especies se ha observado que aquellos animales que la

han ingerido presentan un menor grosor de su pared intestinal (King et al.1980), y por

tanto pudieran favorecer la absorción de nutrientes

Especies a las que se destina (Pollos, pavos, cerdos, conejos, entre otros) se emplea

como promotor de crecimiento y terapéutico para infecciones entéricas y superficiales.

Para mejorar la producción de huevo, la eficiencia alimenticia en la gallina y el peso de

la carcasa o canal. (Abecia et al. 2004), (King et al.1980).

Dosis indicativa en especies a las que se destina: 5 a 10 g por tonelada de alimento.

(Abecia et al. 2004),

3.3.6 Condiciones de almacenamiento

En recipientes de cierre perfecto y al abrigo de la luz se mantiene estable. Mantiene su

estabilidad hasta dos años a temperatura de 25°C

3.4 BACITRACINA METILEN DISALICILATO

3.4.1 Descripción, solubilidad, conservación

Antibiótico polipeptídico producido por ciertas cepas de Bacillus lincheniformis y B.

subtilis var. Tracy.

Es un polvo granular de color amarrillo a café, olor tenue, de sabor amargo, es insoluble

en agua y soluble en alcohol y metanol. (Tianjin XinXing, 2007). Debe almacenarse en

un lugar frío y seco protegido de la luz solar directa y la humedad. (Alpharma Inc. 2007).

3.4.2 Indicaciones de uso

La Bacitracina Metilen Disalicilato se ha administrado a pollos de engorde, pavos en

crecimiento y cerdos sin presentar efectos adversos. En pollos de engorde para la

prevención y control de la enteritis necrótica causada por Clostridium perfringens,

agente sensible a la Bacitracina. En pavos se utiliza para el control de la enteritis

20

contagiosa (cresta azul, fiebre del lodo) en pavos, complicada por organismos

susceptibles a la Bacitracina. En cerdos se administra para el tratamiento de la

disentería porcina asociada a Treponema hyodysenteriae. También se está indicado su

uso como mejorador del desempeño y para prevenir o controlar la enteritis necrótica en

pollo de engorde, gallinas de postura y reproductoras, aves de reemplazo y pavos. Es

eficaz en el control de bacterias Gram Positivas y altamente efectivo contra Clostridium

perfringens, causante de enteritis necrótica. (Alpharma Inc. 2007).

Como promotor del crecimiento y para mejorar la conversión alimenticia. Para el

tratamiento de la enteritis necrótica de las aves por clostridios. (Alpharma Inc. 2007).

No se absorbe a partir del tracto intestinal y no desarrolla residuos detectables en los

tejidos. No causa resistencia transferible entre las bacterias contra el medicamento,

Se administra en Broiler y pavos para mejorar la ganancia de peso, la conversión

alimenticia y para el control de enteritis necrótica. En aves de postura: Aumenta la

eficiencia en la producción de huevos, con un mejoramiento en la conversión alimenticia

y aumenta el número de huevos producidos por ave. Se utiliza en cerdos produce un

aumento en la ganancia de peso y mejora la conversión alimenticia, con un aumento en

la uniformidad de los cerdos. Controla cuadros de enteritis producidos por Clostridium

perfringes y en combinación con clortetraciclina se utiliza para la prevención y control de

ileitis. En vacunos para aumentar la ganancia de peso diaria y reducción de abscesos

hepáticos. (Farquímica, 2004)

3.5 Micrococcus luteus

3.5.1 Clasificación científica

Dominio: Bacteria

Phylum Actinobacteria

Orden: Actinomycetales

Familia: Micrococcaceae

Genero: Micrococcus

Especie: M. luteus

3.5.2 Características

Micrococcus luteus es una bactéria Gram positiva de forma esférica, es un

microorganismo saprófito, aeróbio obligado. M.luteus se encuentra en ambientes

21

diversos como en el suelo, polvo, agua, aire, como parte de la flora normal de la piel de

mamíferos. Esta bacteria también coloniza en la boca, mucosa, en la parte superior del

tracto respiratorio de los humanos. Se ha aislado de animales y productos lácteos y de

cerveza. (Sciencenet Multimedia Publishing, 2003).

M.luteus tolera ambientes secos y altas concentraciones de sal. M.luteus no puede

sobrevivir mucho tiempo en el suelo. (Sciencenet Multimedia Publishing, 2003).

M. luteus es coagulasa negativo, susceptible a la Bacitracina, forma colonias de color

amarillo pálido al crecer en medios de cultivos nutritivos. Se a demostrado que M. luteus

sobrevive en ambientes oligotróficos por largos periodos de tiempo. (Sciencenet

Multimedia Publishing, 2003).

3.5.3 Bioquímica

M.luteus produce pigmentos insolubles en agua de amarrillo crema. Puede crecer sobre

agar de nitrógeno inorgánico y pocos pueden reducir nitrato. Son oxidasa positiva.

M.luteus no produce ácido a partir de glucosa o glicerina bajo condiciones aeróbicas y

no produce arginina hidrolasa o galactosidasa. Los carbohidratos son oxidados a CO2 y

a agua. (Sciencenet Multimedia Publishing, 2003).

3.5.4 Patogénesis

Genera Infecciones intestinales e infecciones extraintestinales. M. luteus no se

considera específicamente como un microorganismo patógeno, pero es visto como

patógeno oportunista asociado particularmente con pacientes inmunocomprometidos.

Se han reportado infecciones del tracto unitario. (Sciencenet Multimedia Publishing,

2003).

3.5.5 Usos industriales

Mientras algunas especies son utilizadas para el mejoramiento del sabor y olor de

productos carnicol fermentados M.luteus han sido usado en la producción económica de

hidrocarburos alifáticos de cadenas largas (C21 - C34). Éstos podrían ser útiles como

aceites de lubricación y poder ser sustitutos de productos del petróleo. (Sciencenet

Multimedia Publishing, 2003)

22

3.6 VALIDACION DE METODOS ANALITICOS

3.6.1 Definición

El termino validación ha sido definido en la literatura, de diversas maneras y por

numerosos autores. Aunque los términos dados son diferentes el significado de las

mismas es siempre el mismo: a) especificar e implementar, b) aprobar y c) documentar.

(AEFI, 2001)

Definición General

Según las Normas de Correcta Fabricación (edicion 99):

Validación: obtención de pruebas con arreglo a las Normas de Correcta Fabricación, de

que cualquier procedimiento, proceso, equipó, material, actividad o sistema produce en

realidad el resultado previsto. (AEFI, 2001)

Definición Analítica

Validación: es el establecimiento de la evidencia documental de que un procedimiento

analítico conducirá, con un alto grado de seguridad, a la obtención de resultados

precisos y exactos, dentro de las especificaciones y los atributos de calidad previamente

establecidos. (AEFI, 2001)

3.6.2 Métodos Susceptibles a ser Validados

Son validables los métodos analíticos clasificados en la siguiente forma (AEFI, 2001):

Ensayos de identificación

Ensayos para la identificación del analito de interés de una materia prima o de una

especificidad farmacéutica.

Ensayos para la determinación de características inherentes. (Ejemplo test de

disolución).

Ensayos de límite de impurezas y de cuantificación de impurezas.

Ensayos para la determinación de analitos en líquidos biológicos y en productos

naturales.

Ensayos microbiológicos.

23

3.6.3 Entorno Legal

3.6.3.1 Norma de Correcta Fabricación de Medicamentos

Las Norma de Correcta Fabricación de Medicamentos de la CEE en el capitulo de

Control de Calidad indico que los métodos de análisis deben estar validados. De igual

forma las Good Manufacturing Practice de los EEUU indican que deben establecerse y

documentarse la exactitud, sensibilidad, especificidad y reproducibilidad de los métodos

analíticos utilizados. (AEFI, 2001)

3.6.3.2 Farmacopeas

Validación frente a los Métodos Oficiales y/o de Farmacopeas:

Se puede diferenciar entre validación de métodos de análisis de principios activos y

especialidades farmacéuticas.

Principios activos de síntesis: los métodos oficiales o de farmacopeas se consideran

validados siempre y cuando se apliquen a principios activos con la misma ruta de

síntesis y por lo tanto el mismo perfil de impurezas que aquellos para los que fuera

redacta la Monografía.

Especialidades: No es recomendable considerar ningún método oficial o de farmacopea

totalmente validado para una especificación, puesto que difícilmente tendrá los mismos

componentes ni la misma proporción de estos.

No obstante pueden emplearse como punto de partida métodos desarrollados para

especialidades tipo, como pueden ser los de Farmacopea Europea (EP), Farmacopea

Americana (USP) o Farmacopea Británica (BP), que permitirán obviar una gran parte del

desarrollo analítico.

3.6.4 Fases en el desarrollo de un método analítico y criterios de validación

No existe una guía oficial que indique la optima secuencia de experimentos analíticos

necesarios para el desarrollo de un método, ya que esto depende del método en si

mismo. No obstante, el desarrollo lógico de un método analítico transcurre en diferentes

fases.

3.6.4.1 Definición de las características de practicabilidad

Han de evaluarse parámetros de practicabilidad del método analítico: precisión exigible,

sensibilidad deseable, grado de selectividad, tiempo, coste, tamaño de muestra,

24

calificación del personal, tipo de equipo e instrumentación, condiciones de seguridad,

entre otras. (AEFI, 2001)

3.6.4.2 Estudios de estabilidad de la muestra preparada para análisis

La estabilidad de la muestra preparada para analizar se evalúa durante la fase de

desarrollo del método junto con la robustez. La estabilidad de las disoluciones de la

muestra, después de su preparación según los métodos de análisis, debe ser evaluada

de acuerdo al tiempo requerido para su realización. Muchos laboratorios utilizan equipos

automáticos que procesan muestras durante largos periodos de tiempo, con lo que la

muestra puede permanecer horas preparada antes de ser analizada. De la misma forma

deben demostrarse la estabilidad de las muestras y patrones preparados si se utilizan

durante varios días. (AEFI, 2001)

3.6.4.3 Puesta a punto. Características de idoneidad

La puesta a punto del método analítico, incluye desde los primeros estudios de tanteo

con patrones, hasta la utilización del método en muestras reales que garanticen el buen

funcionamiento del sistema en el momento de análisis. (AEFI, 2001)

El estudio de robustez se utiliza para optimizar y ver la criticidad del valor de los

parámetros del método antes de validar. A partir de este estudio se definirán las

características de idoneidad o conjunto de parámetros que garantizan que el sistema

responde, en el momento del análisis, a los requisitos fijados. Dichas características se

reúnen en un ensayo conocidas como ensayo de idoneidad. (System Suitability Test).

(AEFI, 2001)

La comprobación de la idoneidad forma parte integral del método y debe realizarse

cada día al inicio del análisis (dependiendo de la duración de este, será conveniente

realizarlo a intervalos de tiempo), para comprobar el correcto funcionamiento del

sistema. Los requisitos y parámetros a evaluar en un ensayo de idoneidad dependerán

del tipo de método. (AEFI, 2001)

La idoneidad del sistema, es el conjunto de ensayos que permiten comprobar en el

momento de utilización del método que el sistema (analista, reactivos, e instrumentos)

es adecuado para llevar a cabo la determinación para la que se ha establecido y

validado dicho método. (AEFI, 2001)

25

3.6.4.4 Características de fiabilidad

Esta última permitirá conocer las características de fiabilidad del método para su

aplicación rutinaria. Dichas características son las que demuestran la capacidad de un

método analítico para mantener a lo largo del tiempo ¨ los criterios fundamentales de

validación¨. Las características de fiabilidad comprenden los cinco criterios

fundamentales de validación. (No necesariamente aplicados a todos los casos) y de los

que derivan en la práctica todos los parámetros de validación (AEFI, 2001):

Selectividad

Linealidad

Rango

Precisión

Exactitud

Limite de Cuantificación

Limite de Detección

Los requisitos de las pruebas farmacopeicas varían desde valoraciones analíticas muy

rigurosas hasta evaluaciones de tributos subjetivos. Considerando esta amplia variedad,

es lógico que diferentes procedimientos de prueba requieran diferentes esquemas de

validación. A continuación se indican las categorías de pruebas más habituales para

las que se exigen datos de validación según la USP 30:

Categoría I: los procedimientos analíticos para la cuantificación de los componentes

principales de fármacos a granel o ingredientes activos (incluyendo concertantes) en

productos farmacéuticos terminados.

Categoría II: los procedimientos analíticos para la determinación de impurezas en

fármacos a granel o de productos de degradación en productos farmacéuticos

terminados. En estos análisis incluyen análisis cuantitativos y pruebas de límite.

Categoría III: los procedimientos analíticos para la determinación de las características

de desempeño (por ejemplo, disolución, liberación del fármaco).

Categoría IV: pruebas de identificación

26

Para cada categoría se requieren diferente información analítica. En la Tabla 2 se

indican los elementos de datos que normalmente se requieren para cada una de estas

categorías.

La validez de un procedimiento analítico puede verificarse solo mediante estudios de

laboratorio, por lo tanto, la documentación de la finalización con éxitos de dichos

procedimientos constituye un requisito básico para determinar si un procedimiento es

adecuado para su aplicación prevista.

Tabla 2. Datos Requeridos para la Validación de Métodos Analíticos (USP 30)

Categoría II

Características de Desempeño

Analítico

Categoría I

Pruebas de Limite Cuantitati

vas

Pruebas de Limite

Cualitativas y Limite

Categoría III

Categoría IV

Exactitud Si Si * * No

Precisión Si Si No Si Si

Repetibilidad Si No Si No

Precisión Inmediata

Si No Si No

Especificidad Si Si Si * Si

Limite de Detección

No No Si * No

Limite de Cuantificación

No Si No * No

Linealidad Ni Si No * No

Intervalo Si Si * * No

* Pueden requerirse, dependiendo de la naturaleza de la prueba especifica.

27

3.7 CARACTERÍSTICAS DEL DESEMPEÑO ANALÍTICO

La validación de un procedimiento analítico es un proceso que establece, mediante

estudios en el laboratorio, que las características de desempeño del procedimiento

cumplen con los requisitos para las aplicaciones analíticas previstas. Las características

de desempeño analítico habituales que deben considerarse en la validación de los tipos

de procedimientos farmacopeicos, se indican y describen a continuación (USP 30):

3.7.1 SELECTIVIDAD

3.7.1.1 Definición

La capacidad de un método para determinar el analito sin interferencias de impurezas,

productos de degradación, excipientes u otras sustancias presentes en la muestra, se

relaciona con el término de selectividad. La selectividad es la capacidad de un método

analítico para medir y/o identificar simultánea o separadamente los analitos de interés

de forma inequívoca, en presencia de otras sustancias químicas que pueden estar

presentes en la muestra. (AEFI, 2001)

Frecuentemente el termino especificidad se utiliza como sinónimo del anterior, aunque

debería reservarse para aquellas situación donde la respuesta obtenida solo se puede

producir con una única entidad química, algo que no es posible cuando se refiere

procedimientos analíticos que emplea instrumentación no especifica. Como hay pocos

métodos que den respuesta sólo a un único analito, el termino selectividad es

normalmente mas apropiado. (AEFI, 2001)

La presencia de interferencias puede tener distintos efectos en la determinación del

analito como:

Imposibilitar su inequívoca identificación (aparición de falsos positivos).

Distorsionar la respuesta del analito (afecta normalmente a la pendiente y ordenada en

el origen de la recta de calibrado). Este efecto puede delatar la presencia de

interferencias desconocidas, aunque también puede ser consecuencia de

recuperaciones no lineales.

La selectividad de un método analítico se debería determinar antes de iniciar el estudio

de cualquier otro parámetro de validación, dado que debe conocerse en que grado la

respuesta del método es únicamente proporcionada por el analito, sin interferencia de

otras sustancias relacionadas con él de una u otra forma. (AEFI, 2001)

28

3.7.1.2 Ámbito de aplicación

En el análisis farmacéutico la tendencia mayoritaria es la utilización de métodos lo mas

selectivas posibles, en los que la presencia de otros componentes tiene escasa

influencia en los resultados. De hecho es muy difícil declarar que no existe interferencia

en la determinación de un analito por que siempre existe la posibilidad de encontrar

alguna sustancia, hasta el momento desconocida, que interfiera. También se puede dar

el caso contrario, de hallar alguna posible interferencia que en la práctica diaria sea

improbable que se produzca. (AEFI, 2001)

Para efectuar estudios de selectividad se precisa la máxima información sobre

impurezas y productos de degradación potencialmente presentes en la muestra, así

como posibles interferencias debidas a excipiente u otros componentes. (AEFI, 2001)

Los criterios de selectividad que debe satisfacer un método puede diferir dependiendo

de la finalidad con la que se aplique. El grado de selectividad asociado a un método

adquiere mayor relevancia según su finalidad. En un método de control de calidad de

rutina la exigencia de alguna interferencia se podría aceptar si esta es conocida y de

magnitud aceptable. En estos casos la selectividad puede entrar en conflicto con el

coste y el tiempo necesario para la determinación del analito. (AEFI, 2001)

Las conclusiones de los estudios de selectividad están vinculadas al origen de la

muestra, la optimización de la preparación, la especificidad de la medida y las

condiciones instrumentales. (AEFI, 2001)

3.7.1.2.1 Según el objetivo de ensayo

El estudio de la selectividad varia según el objetivo del ensayos; ensayo de

identificación, ensayos de pureza y/o determinación cuantitativa de un compuesto o

riqueza de un principio activo.

Cuando el objetivo del ensayo es la determinación cuantitativa de un compuesto o

riqueza de un principio activo, el método debe evitar la interferencia de excipientes,

productos de degradación y/o impurezas en la respuesta proporcionada por el

compuesto o el principio activo objeto de la evaluación analítica. (AEFI, 2001)

3.7.1.2.2 Según la técnica analítica aplicada

El estudio de la selectividad varía también según la técnica analítica aplicada; ensayos

específicos, ensayos absolutos y ensayos separativos. (AEFI, 2001)

29

3.7.2 LINEALIDAD

3.7.2.1 Definición

La linealidad es la capacidad del método para proporcionar resultados que son

directamente (o promedio de transformaciones matemáticas) proporcionales a la

concentración del analito en la muestra dentro de un rango establecido. Siempre que

sea posible se busca una respuesta de tipo lineal que facilitara su trazado, interpolación

e interpretación. (AEFI, 2001) La linealidad en un procedimiento analítico es su

capacidad para obtener resultados de prueba que sean proporcionales ya sea

directamente, o por medio de una transformación matemática bien definida, a la

concentración del analito en muestras en un intervalo dado. La linealidad se refiere a la

relación entre la concentración y la medida de valoración. El objetivo es obtener un

modelo que describa con precisión la relación de la concentración versus respuesta, ya

sea lineal o no. (USP 30).

El rango se define como el intervalo entre la concentración superior e inferior de analito

para el cual se ha demostrado la correcta precisión, exactitud y linealidad del método

descrito. (AEFI, 2001)

Aunque el proceso lógico consistiría en evaluar cuales son los limites de concentración

en los que el método analítico pierde su linealidad, normalmente se toma como punto de

partida un intervalo de concentraciones ya establecido de acuerdo con la experiencia, el

conocimiento analítico de la técnica empleada y principalmente en función de las

especificaciones. (AEFI, 2001)

El intervalo de un procedimiento analítico es la amplitud entre las concentraciones

inferiores y superior de analito en el cual se puede determinar al analito con un nivel

adecuado de precisión, exactitud y linealidad utilizando el procedimiento según se

describe por escrito. El intervalo normalmente se expresa en las mismas unidades que

los resultados de la prueba obtenidos mediante el procedimiento analítico. (USP 30)

El intervalo del procedimiento se valida verificando que el procedimiento analítico

proporciona precisión, exactitud y linealidad aceptables cuando se aplica a las muestras

que contienen el analito en los extremos del intervalo al igual que dentro del intervalo.

La ICH recomienda que, para establecer la linealidad se utilicen normalmente un mínimo

de cinco concentraciones. También recomienda que se consideren los intervalos

especificados mínimos que se indican a continuación (USP 30):

30

Valoración de un fármaco o de un producto terminado: de 80% a 120% de la

concentración de la prueba.

Determinación de una impureza: de 50% a 120% del criterio de aceptación.

Para uniformidad del contenido: un mínimo de 70% a 130% de la concentración de la

prueba, a no ser que justifique un intervalo mas amplio o mas apropiado, basándose en

la naturaleza de la forma farmacéutica.


Según la guía ICH Q2A se estudia la linealidad en todos los métodos de tipos

cuantitativo:

Valoración del contenido de principio activo

En la especialidad farmacéutica los límites de especificaciones suelen establecerse

entre 95 – 105% a liberación, 90 – 110% a caducidad, respecto al valor nominal. En

materia prima los límites son 98 – 102% o 99 – 101%. Debido a esto se suele evaluar la

linealidad de los métodos en un rango más amplio, las ICH recomiendan del 80- 120%.

3.7.3 PRECISION

3.7.3.1 Definiciones

La precisión expresa el grado de concordancia (grado de dispersión) entre una serie de

medidas de tomas múltiples a partir de una misma muestra homogénea en las

condiciones prescritas. La procedencia de las muestras destinadas al estudio de

precisión puede ser de muestras reales o preparadas en el laboratorio.

El objeto del estudio de la predicción es conocer la variabilidad o el mas-menos del

método de ensayo. Esta variabilidad es debida a errores aleatorios inherentes a todo

método de ensayo. Como consecuencia de la existencia de estos errores, los análisis

efectuados sobre muestras idénticas, en las mismas circunstancias, no conducen

generalmente a resultados idénticos. Los factores susceptibles a influir sobre los

resultados de un ensayo no pueden ser siempre controlados (analista, equipo

instrumental, reactivos, tiempo, entre otros.) de aquí la importancia del estudio de la

precisión (AEFI, 2001)

31

3.7.3.2 Diferentes tipos de estudio en la precisión

Figura 2. Diferentes tipos de estudio en la precisión

En la tabla (Huber, 1999) se resumen los factores que pueden o no variar en el estudio

de repetibilidad, precisión intermedia y reproducibilidad.

Tabla 3. Variación de factores en el estudio de la precisión

Precisión Repetibilidad Inmediata

Reproducibilidad

Instrumento Igual diferente diferente DIA de análisis Igual diferente diferente

Analista Igual diferente diferente

Otros factores Igual diferente diferente

Laboratorio igual Igual diferente

3.7.3.2.1 Repetibilidad

Estudia la variabilidad del método efectuando una serie de análisis sobre la misma

muestra en las mismas condiciones operativas (por un mismo analista, con los mismos

aparatos y reactivos, entre otros), en un mismo laboratorio y en un periodo de tiempo

corto. (AEFI, 2001)

La repetibilidad se expresa matemáticamente por el coeficiente de variación (desviación

estándar relativa) de una serie de medidas.

Uno de los factores que pueden influir en la repetibilidad del método de análisis es la

concentración del analito, ya que la desviación estándar de las respuestas obtenidas

aumenta al disminuir la concentración del analito. Por otro lado el valor aceptado del

coeficiente de variación depende del intervalo de aceptación especificado en el método

de análisis. El numero de replicas se deduce a partir del coeficiente de variación de

repetibilidad del método. (AEFI, 2001)

PRECISION

Repetibilidad Del M étodo

Reproducibilidad Precisió n inmediata Repetibilidad

Repetibilidad Instrumental

32

3.7.3.2.1.1 Repetibilidad del sistema instrumental

Este parámetro estudia la variabilidad debida únicamente al instrumento y se determina

analizando repetidamente una misma muestra de forma consecutiva de 6 a 10 veces.

En el caso que se analice el principio activo de una materia prima o de una

especificación farmacéutica se prepara la muestra a la concentración nominal. (AEFI,

2001)

3.7.3.2.1.2 Repetibilidad del método

El ensayo de repetibilidad del método se efectúa sobre una serie de alícuotas de una

muestra homogénea que se analiza independientemente desde el principio (preparación

de la muestra) hasta el final (lectura de resultados) por el mismo instrumento y mismo

analista. Se proponen dos alternativas para realizar este estudio: un mínimo de 6

muestras a la concentración nominal. (AEFI, 2001)

3.7.3.2.2 Precisión inmediata

Estudia la variabilidad del método efectuado una serie de análisis sobre la misma

muestra pero en condiciones operativas diferentes (diferentes analistas, aparatos, días,

entre otros) y en un mismo laboratorio. El objeto del estudio de precisión inmediata es

determinar la variabilidad del método efectuando una serie de análisis sobre la misma

muestra, en un mismo laboratorio pero en condiciones operativas diferentes. (AEFI,

2001)

3.7.3.2.3 Reproducibilidad

Estudia la variedad del método bajo condiciones operativas diferentes y en distintos

laboratorios. La reproducibilidad de dicho método de análisis se determina analizando

una serie de alícuotas procedentes de lotes homogéneos en diferentes laboratorios,

diferentes analistas y utilizando condiciones operativas y ambientales distintas pero

siguiendo el procedimiento descrito en el método. (AEFI, 2001)

La reproducibilidad también es definida como la medida de la precisión de los resultados

de ensayos realizados sobre la misma muestra homogénea, pero ejecutados por

diferentes analistas en días diferentes. (Calpena AC. et al, 1991)


Según la ICH Q2B el estudio de precisión se debe realizar únicamente para la

determinación cuantitativa de principios activos y cuantificación de impurezas. Por lo

33

tanto la evaluación de la precisión no es necesaria ni en el ensayo de identificación ni

en el test limite de impurezas. (AEFI, 2001)

3.7.4 EXACTITUD

3.7.4.1 Definición

La exactitud de un procedimiento analítico expresa la proximidad entre el valor que es

aceptado convencionalmente como el valor verdadero o un valor referencia y el valor

experimental encontrado. No debe confundirse la exactitud y predicción, la precisión

esta relacionada con la dispersión de una serie de mediciones, pero no da ninguna

indicación de lo cerca que esta del valor verdadero. Se puede tener mediciones muy

precisas pero poco exactas; sin embargo, para que un método sea exacto se requiere

un cierto grado de precisión. (AEFI, 2001)

De la definición de exactitud surge el principal problema: cual es el valor verdadero del

analito en la muestra?, el valor verdadero en muchos casos se desconoce. No obstante,

cuando se dispone de patrones de referencia certificados, el valor de dicho patrón es el

que se acepta como valor verdadero y la exactitud puede evaluarse aplicando el método

sobre dicho patrón, o bien analizando muestras de placebo o de problema a las que se

ha añadido una cantidad conocida de dicho patrón. También se acepta la comparación

de resultados con un método de referencia validado del que ya se ha demostrado su

exactitud; entonces el valor verdadero es el que se obtiene con dicho método de

referencia y se compara con el valor hallado con el método nuevo que se quiere validar.

(AEFI, 2001)


Según la guía (ICH, Q2A) debe ensayarse la exactitud en métodos de análisis para la

valoración en materia prima y en producto terminado y en métodos de análisis de

cuantificación de impurezas, según la USP 30 también debe evaluarse en métodos de

análisis de estudios de la velocidad de disolución.

3.7.4.3 Procedimiento de determinación de la exactitud

La exactitud debe demostrarse en todo el rango especificado para el método analítico

Se recomienda un mínimo de 9 determinaciones sobre 3 niveles de concentración del

analito que cubran el rango especificado. En función del tipo de método a validar y de

cada caso concreto se deberá tener en cuenta el rango de concentraciones de trabajo:

Riqueza de un principio activo en materia prima o en producto acabado: 80 – 120%

34

Impurezas: desde el 50% del nivel de especificación hasta el 120% de dicho nivel.

La exactitud se expresa como porcentaje de recuperación en la valoración de una

cantidad conocida de analito añadida sobre la muestra o como la diferencia entre la

media obtenida y el valor aceptado como verdadero junto con los intervalos de

confianza. (AEFI, 2001)

3.7.4.4 Determinación

En la valoración de un fármaco, la exactitud puede determinarse mediante la aplicación

del procedimiento analítico con respecto a un analito de pureza conocida (por ejemplo

un estándar de referencia), o comparando los resultados del procedimiento con los de

un segundo procedimiento bien caracterizado, cuya exactitud se haya comprobado o

definido. En la valoración de un fármaco en un producto formulado, la exactitud puede

determinarse mediante la aplicación del procedimiento analítico a mezclas sintéticas de

los componentes del producto farmacéutico al que se hayan añadido cantidades

conocidas de analito dentro del intervalo de procedimiento. Si no resulta posible obtener

muestras de todos los componentes del producto farmacéutico, se puede aceptar tanto

el agregado de cantidades conocidas del analito al producto farmacéutico (¨Spike¨)

como la comparación de los resultados con los de un segundo procedimiento bien

caracterizado, cuya exactitud haya sido comprobada o definida. (USP 30)

En el análisis cuantitativo de impurezas, la exactitud debe evaluarse en muestras (del

fármaco o producto farmacéutico) a las que se les hayan agregado cantidades

conocidas de impurezas. Cuando no sea posible obtener muestras de algunas

impurezas o de productos de degradación, los resultados deben compararse con los

obtenidos mediante un procedimiento independiente. En ausencia de otra información,

puede resultar necesario calcular la cantidad de una impureza basándose en la

comparación de su respuesta con la del fármaco, pero el cociente entre las respuestas

de cantidades iguales de la impureza y del fármaco (factor de respuesta relativo) debe

ser utilizado siempre que se le conozca. (USP 30)

La exactitud se calcula como el porcentaje de recuperación de la cantidad valorada con

respecto a la cantidad conocida de analito añadida a la muestra, o como la diferencia

entre la medida de la valoración y el valor verdadero aceptado, considerando los

intervalos de confianza. (USP 30)

La evaluación de la exactitud puede efectuarse de varias maneras, incluyendo la

evaluación de la recuperación del analito (porcentaje de recuperación) en todo el

35

intervalo de la valoración, o evaluando la linealidad de la reacción entre las

concentraciones estimadas y las reales. El criterio estadístico de preferencia es que el

intervalo de confianza para la pendiente este comprendido dentro de un intervalo

definido al rededor de 1.0; o alternativamente, que el valor de la pendiente sea cercano

a 1.0. En ambos casos, tanto el intervalo como la definición de cercanía deberían

especificarse respectivamente en el protocolo de validación. El criterio de aceptación

dependerá de la valoración, de su variabilidad y del producto. No es aceptable basar un

criterio de aceptación basado en la falta de significancía estadística para la hipótesis

nula de que la pendiente es 1.0. (USP 30)

3.7.5 LIMITE DE DETECCION Y LÍMITE DE CUANTIFICACION

3.7.5.1 Definición

Dado un método analítico determinado, se entiende por límite de cuantificación (LQ) de

dicho método, la mínima cantidad de analito presente en la muestra que se puede

cuantificar, bajo las condiciones experimentales descritas, con una adecuada predicción

y exactitud. El límite de cuantificación es una característica de las valoraciones

cuantitativas de compuestos que se encuentran en baja concentración en la matriz de

una muestra. (AEFI, 2001)

El límite de detección (LD) se define como la mínima cantidad de analito en la muestra

que se puede detectar aunque no necesariamente cuantificar bajo dichas condiciones

experimentales. El límite de detección es una característica de las pruebas de límite. La

cantidad mínima de la muestra que puede detectarse, aunque no necesariamente

cuantificarse, en las condiciones experimentales indicadas. Las pruebas de límite

simplemente comprueban que la cantidad del analito se encuentra por encima o por

debajo de un nivel determinado. El límite de detección se expresa habitualmente en

forma de concentración de analito (por ejemplo, porcentaje, partes por millón, entre

otras). (AEFI, 2001)

El limite de cuantificación es por lo tanto un termino cuantitativo mientras que el limite de

detección es solo cualitativo, encontrándose en ambos términos un rango de

concentraciones en el que si bien no se puede cuantificarse el analito en cuestión con

razonable certeza, si puede detectarse su presencia sin incurrir en falsos positivos.

(AEFI, 2001)

36


Se establece necesaria la determinación del límite de detección en métodos de análisis

destinados a la evaluación de impurezas mediante ensayos límite. Esto es ensayos en

los que simplemente se determina si la cantidad de impurezas presente en la muestra

es superior o no al límite establecido en especificaciones, sin dar un valor numérico. Se

trata de demostrar de esta forma que el método es realmente capaz de detectar la

concentración límite y superiores. Por el contrario se considera necesario establecer

únicamente el limite de cuantificación en métodos destinados a la determinación

numérica de impurezas; y es aquí donde puede surgir la primera duda, puesto que hoy

en día la pureza de gran parte de los principios activos farmacéuticos se define a partir

de una serie de test limites de impurezas conocidas y desconocidas junto, con la suma

total de estas, y parece obvio que si se a de dar finalmente una suma porcentual del

contenido de impurezas, previamente estas se han de haber cuantificado con suficiente

precisión y exactitud; siempre que se deba dar un valor numérico al total de impurezas

se reconoce implícitamente la necesidad de determinar el limite de cuantificación para

cada una de ellas.

Cuando el método se define como un método de análisis de valoración de contenido

en el cual siempre se trabaja en rangos muy alejados de la mínima cantidad detectable

o cuantificable por el equipo, no seria necesaria la determinación de estos parámetros(

AEFI, 2001)

3.7.5.3 Procedimientos de determinación del límite de detección (LD) y límite de cuantificación (LQ)

Método basado en el examen visual

Según ICH Q2B, tanto el LD como el LQ podrían determinarse a partir del análisis de

muestras con concentraciones conocidas y decrecientes del analito, estableciéndose

visualmente la mínima concentración detectable como aquella concentración limite que

permite cuantificar con razonable precisión y exactitud la señal obtenida. (AEFI, 2001)

3.7.6 ROBUSTEZ

3.7.6.1 Definición

La guía ICH, Q2A define la robustez de un método analítico como la medida de su

capacidad para permanecer inalterado ante pequeñas pero deliberadas variaciones en

ciertos parámetros, proporcionando idea de su fiabilidad o estabilidad durante su

37

empleo. Es por lo tanto la capacidad que demuestra el procedimiento de análisis para

proporcionar resultados validos en presencia en presencia de pequeños cambios

respecto de las condiciones descritas en el método, susceptibles de producirse durante

su utilización. (AEFI, 2001)

La robustez de un procedimiento analítico es una medida de su capacidad para no

resultar afectando por variaciones pequeñas pero deliberadas en los parámetros

enumerados en la documentación del procedimiento, y a la vez, da una idea de su

aptitud durante su uso normal. La robustez puede determinarse durante la etapa de

desarrollo del procedimiento analítico. (USP 30)

La robustez (Robustness) no debe confundirse con el termino Ruggedness. Este ultimo

no se menciona en las guías ICH, pero si en la farmacopea USP. Esta define el termino

Ruggedness como el grado de reproducibilidad de los resultados mediante el análisis

de las mismas muestras bajo una variedad de condiciones tales como diferentes

laboratorios, diferentes analistas, diferentes instrumentos, lotes de reactivos, días,

tiempos diferentes temperaturas, entre otros. (AEFI, 2001)


Aunque la USP define la robustez junto con los parámetros de validación de un método

analítico, no es considerado, todavía, un requisito necesario para registro de

especialidades, sino que se trata de un estudio que sugirió con el fin de resolver los

problemas que se planteaban en la transferencia de métodos analíticos entre

laboratorios. Las guías ICH recomienda incluir la robustez en una fase apropiada del

desarrollo del método y no en la validación propiamente dicha , dado que si la robustez

del método no se comprueba con anterioridad a iniciar la validación, puede suceder que

se intente validar un método poco robusto, con lo consiguientes malos resultados y

perdida de tiempo y dinero. Incluso después de realizar el estudio de robustez podría

concluirse que se debe modificar algún parámetro del método, obligando a la

consiguiente revalidación de los puntos necesarios. De hecho la consecuencia directa

de los resultados del estudio de robustez ha de ser la definición razonada del test de

idoneidad del método, que en muchas ocasiones es fijado de una forma arbitraria y sin

saber la ciencia cierta si los requisitos que impone son realmente necesarios o limitan la

realización del método a unas condiciones escasamente reproducibles.(USP, 30)

Todos los métodos, sea cual sea la técnica empleada, son susceptibles a ser sometidos

a un estudio de robustez. Algunos pueden tener muchos parámetros sobre los que

38

actuar y otros menos. Además estos no tienen por que ser solo factores relacionados

con la medida final, sino que pueden ser de cualquier etapa del procedimiento analítico,

Por esto la primera etapa del estudio es precisamente analizar todo el método y definir

que factores son los que se espera que influyan mas en el resultado final. (AEFI, 2001)

3.7.7 ESPECIFICIDAD

3.7.7.1 Definición

Los documentos ICH definen especificidad como la capacidad de evaluar de manera

inequívoca el analito en presencia de aquellos componentes cuya presencia resulta

previsible, como impurezas, productos de degradación y componentes de la matriz. La

falta de especificidad de un procedimiento analítico individual puede compararse

utilizando otros procedimientos analíticos complementarios otras autoridades

internacionales de reconocido prestigio (IUPAC, AOAC-I) han preferido el termino

selectividad reservando especificidad para procedimientos que resulten completamente

selectivos. Para las pruebas que se indican a continuación, la definición anterior tiene

las siguientes consecuencias (USP 30):

Pruebas de identificación: garantiza la identidad del analito.

Pruebas de Pureza: garantiza que todos los procedimientos analíticos efectuados

permiten declarar con exactitud el contenido de impurezas de un analito.

Valoraciones: proporcionan un resultado exacto, que permitan una declaración exacta

del contenido o potencia del contenido en una muestra.

3.7.7.2 Determinación

En análisis cualitativos (pruebas de identificación), debe demostrarse la capacidad de

distinguir compuestos de estructura estrechamente relacionada cuya presencia resulta

probable. Esta capacidad debería confirmarse mediante la obtención de resultados

positivos a partir de muestras que contengan el analito (quizás mediante comparación

con un material de referencia conocido), junto con los resultados negativos de dicha

muestra que no contengan dicho analito y mediante la confirmación que no se obtiene

una respuesta positiva de materiales con estructura similar o estrechamente relacionada

a la del analito. (USP 30)

En un procedimiento analítico para impurezas, la especificidad puede establecerse

mediante la adición al fármaco o producto farmacéutico de una cantidad conocida de

39

impurezas en concentraciones adecuadas y la demostración de que esas impurezas se

determinan con exactitud y precisión adecuadas. (USP 30)

En una valoración, la demostración de especificidad requiere evidencia que el

procedimiento no resulta afectado por la presencia de impurezas o excipientes. En la

práctica esto puede hacerse agregando al fármaco o producto farmacéutico una

cantidad conocido de excipientes o de impurezas en concentraciones adecuadas y

demostrando que el resultado del análisis no resulta afectado por la presencia de estos

materiales extraños. (USP 30)

Si no dispone de estándares de impurezas o de los productos de degradación, puede

demostrarse la especificidad comprobando los resultados de las muestras que

contengan impurezas o productos de degradación con los de un segundo procedimiento

bien caracterizado (por ejemplo un procedimiento farmacopeico u otro procedimiento

validado). Estas comparaciones deberían incluir muestras sometidas a condiciones

forzadas relevantes (por ejemplo, luz, calor, humedad, hidrólisis acida, hidrólisis alcalina,

oxidación, entre otros.) en una valoración deben comparece los resultados; en pruebas

de impurezas cromatoqraficas, deben compararse los perfiles de impurezas. (USP 30)

3.8 VALORACION MICROBIOLOGICA DE ANTIBIOTICOS

3.8.1 Generalidades

Bajo las condiciones adecuadas, la actividad (potencia) de los antibióticos puede

demostrarse por su efecto inhibidor sobre los microorganismos. En consecuencia las

valoraciones microbiológicas o biológicas siguen siendo, por lo general, el estándar para

disipar dudas en cuanto a la posible perdida de la actividad. (USP 30)

La potencia de un antibiótico se estima mediante la comparación de la actividad de un

producto (problema) y la de una muestra de referencia (patrón) en presencia de un

microorganismo testigo. (AEFI, 2001)

3.8.2 Definiciones

3.8.2.1 Valoración de antibióticos

La valoración de antibióticos se puede efectuar por difusión en agar o turbimetria,

dependiendo de la naturaleza de la muestra a ensayar. La base de los ensayos por

difusión en agar, es que la respuesta obtenida frente a distintas dosis de antibióticos

son proporcionales a los diámetros de los halos de inhibición; en los ensayos

turbimetricos la respuesta se mide en forma de turbidez. (AEFI, 2001)

40

Básicamente la valoración de antibióticos por difusión en agar se fundamenta en la

difusión del antibiótico desde un cilindro vertical (o desde una perforación circular en el

agar) a través de una capa de agar solidificada en una placa de petri hasta inhibir

totalmente el crecimiento del microorganismo añadido, en un área circular o zona de

inhibición entorno al cilindro que contiene una solución antibiótico. El método

turbidimetrico se basa en la inhibición del crecimiento de un cultivo microbiano en una

solución uniforme del antibiótico en un medio líquido que promueva su rápido

crecimiento en ausencia del antibiótico. (USP 30)

3.8.2.2 Potencia real o verdadera

La potencia de la materia o producto acabado cuando se realiza el ensayo. (AEFI, 2001)

3.8.2.3 Potencia asignada

Es el valor nominal asignado a un producto acabado a partir de la potencia de la

materia prima. (AEFI, 2001)

3.8.2.4 Potencia estimada

Potencia calculada a partir de los datos del ensayo. (AEFI, 2001)

3.8.2.5 Limites de confianza (Intervalo de confianza)

La Farmacopea aplica como intervalo de confianza el que se calcula con probabilidad

de 95% sobre el valor real obtenido, no obstante, se puede calcular con otro nivel de

probabilidad. (AEFI, 2001)

3.8.3 METODO

El diseño mas simple para esta prueba es un ensayo con una curva estándar. Para ello

se prepara el patrón a 5 concentraciones o dosis (A, B, C, D, E) que mantengan entre si

una relación logarítmica, y una solución de la preparación a ensayar a una

concentración teórica equivalente a la intermedia del patrón (C). Se considera el ensayo

como preliminar si la potencia de la muestra una vez interpolada en la curva construida

con las respuestas del patrón es inferior al 80% o superior al 120%. En tal caso se

debe preparar la muestra a una concentración teórica mas centrada a la del patrón y

repetir el ensayo. Otro diseño seria del cuadrado latino, en el que la potencia del

problema se determina por comparación entre una recta constituida por el patrón y otra

constituida por el problema. (AEFI, 2001)

41

Los sistemas biológicos presentan una variabilidad que obliga a tener diferentes criterios

para verificar y realizar ensayos. Realmente la verdadera potencia se puede encontrar

dentro de un rango de valores que vendrá definido por los límites de confianza de error

calculados para el ensayo, que nos dará los valores de los extremos con una

probabilidad de un 95%.( AEFI, 2001)

El grado de precisión requerido depende de los límites de aceptación. Una especialidad

acabada con un intervalo de aceptación del 95-105% o del 90-110% requiere un numero

de replicas bajo (n= 2-3). Si los limites de aceptación son mas estrechos (98-102%) el

numero de replicas debe ser mucho mayor (n≥ 6). (AEFI, 2001)

3.8.4 Validación

El ensayo debe diseñarse de tal forma que permita examinar la validez del método

matemático en el que se basa la ecuación de la potencia. Si se escoge el modelo de

líneas paralelas, las dos líneas de logaritmos de dosis-respuesta deben ser paralelas, y

lineales en el rango de dosis usadas en el cálculo. Estas condiciones deben verificarse

por ensayos de validación con una probabilidad P= 0.05. Pueden usarse otros modelos

matemáticos si se demuestra su validez. (AEFI, 2001)

Los pasos a seguir para la validación de una valoración de antibióticos son según la

USP 30

3.8.4.1 Linealidad

Demostrar que la recta de regresión constituida con el logaritmo de la dosis de

antibiótico patrón y la respuesta cumple con los parámetros de regresión lineal y análisis

de la varianza.

Demostrar que la recta de regresión construida con la muestra de producto acabado que

contiene el antibiótico a las mismas dosis que la recta patrón, presenta una relación Log.

Dosis-respuesta que cumple con los parámetros de regresión lineal y análisis de

varianza.

3.8.4.2 Repetibilidad (Precisión)

Se determina a partir de un blanco de excipientes al que se le añade la cantidad de

antibiótico correspondiente al 100% teórico. Después de realizar la valoración (9

replicas) se obtienen unos resultados con los cuales se calcula:

La media, la desviación estándar (variabilidad del método), la desviación estándar de la

42

media, coeficiente de variación, limites de confianza de la media y la tolerancia, que

expresa la variabilidad del método respecto al intervalo entre las especificaciones

superior e inferior.

3.8.4.3 Exactitud

Para determinar la exactitud se preparan tres alícuotas de un blanco con los excipientes,

se añaden a una de ellas la cantidad de antibiótico correspondiente al limite inferior de

aceptación, en la otra alícuota se añade la cantidad correspondiente al 100% y en la

tercera la cantidad correspondiente al limite superior de aceptación. Se efectúan las

valoraciones de cada una de las alícuotas y con los resultados obtenidos se comprueba

que se cumplan los parámetros estadísticos que definen la exactitud:

Homogeneidad de varianzas, Test t de Student y determinación del sesgo o error

determinado

3.8.4.4 Selectividad

Se determina analizando por duplicado el blanco de excipientes. Si el resultado no es

cuantificable se demuestra la selectividad del método. Si la respuesta es cuantificable,

se deberá tener en cuenta la misma en la obtención de resultados. En estos casos se

debe determinar cual es el producto que interfiere, y tratar de eliminarlo (por dilución o

por neutralización) o bien añadirlo a los patrones, de forma que tanto los patrones como

los problemas tengan la misma concentración de sustancia interferente. (AEFI, 2001)

43

4. FORMULACION DEL PROBLEMA

La vocación de la industria farmacéutica permanentemente ha sido producir

medicamentos de calidad y con total garantía de seguridad. La calidad de los

medicamento se logra en todos y cada uno de los pasos de su proceso de producción,

desde su investigación hasta el último análisis sobre el producto final, debido a que al

elaborar un producto destinado a curar la enfermedad, salvar vidas o mejorar la calidad

de vida ya sea humana o animal, no puede haber el mínimo margen para el error (García,

M. 2001).

Alcanzar un alto nivel de calidad de los medicamentos requiere garantizar que cada una

de las etapas de la producción se realice de forma adecuada y cumpliendo aquellos

parámetros de calidad que se han establecido previamente. Con los años, se han ido

desarrollando recomendaciones e incorporando requerimientos que han evolucionado

hasta una reglamentación estricta. Sin embargo, a pesar de los esfuerzos de control y

fabricación, se exige una mejora continua y máximas garantías de la calidad y este

máximo grado de seguridad tan solo lo proporcionan los procesos de validación (García,

M. 2001).

Para el desarrollo químico-farmacéutico de un medicamento es necesario e indispensable

la utilización de un método analítico que permita cuantificar el producto mayoritario en

forma de materia prima o como ingrediente activo de una formulación. (Rampazoo P,

1990) La valoración microbiológica de antibióticos es un método analítico que nos

proporciona información del contenido o potencia del analito de interés en una muestra,

su implementación en el control de calidad de productos farmacéuticos terminados

permite cumplir con las exigencias legales, asegurar la calidad y eficacia del producto

para salir al mercado. Razón por la cual se debe asegurar que el métodos analíticos sea

sometido a un proceso de validación, por medio del cual se compruebe si el método es lo

suficientemente confiable, adecuado para el propósito y aplicación analítica propuesta y si

los resultados previstos se obtienen dentro de las condiciones prefijadas.

La utilización de métodos analíticos, adecuados para el propósito, permite obtener

resultados trazables con un nivel apropiado de incertidumbre; dichos resultados

generalmente son usados como base para la toma de decisiones financieras, regulatorias,

entre otros., relacionadas con el desarrollo y fabricación de productos, así como con la

prestación de servicios y otras actividades de importancia en las economías nacionales,

regionales e internacionales.

44

El laboratorio que implementa un método analítico seleccionado para un propósito

determinado, sean éstos normalizados, no normalizados o desarrollados por el

laboratorio, es responsable de verificar su desempeño contra las especificaciones de la

validación, tanto antes de ponerlo en uso como durante su utilización rutinaria, para

demostrar que lo domina y usa correctamente.

Para el cumplimiento del Sistema de Garantía de Calidad la validación es un requisito

imprescindible que está establecido por los entes reguladores en Colombia (INVIMA e

ICA) y por comisiones de Farmacopeas (United States Pharmacopeial Convention USP).

45

5. JUSTIFICACION

VICAR FARMACEUTICA S.A. fabrica y comercializa productos farmacéuticos

veterinarios, posee una línea de más de cuarenta productos en el mercado para la

sanidad animal, dentro de estos productos encontramos antibióticos (Bactran que

poseen como principio activo Bacitracina) a los cuales se les debe garantizar su

efectividad y calidad para lo cual son destinados. La efectividad de estos productos

antimicrobianos, se evalúa para determinar la capacidad de los mismos de otorgar la

protección necesaria o su efecto inhibidor contra cualquier tipo de infección, viral o

bacteriana. Para esto se realiza la valoración microbiológica de antibióticos que nos

permite cuantificar la concentración y la potencia de un principio activo en el fármaco

para obtener una medida del efecto de este comparado con la misma dosis de un

estándar y de esta forma salir al mercado con las características predeterminadas.

En el control de calidad de antibiótico se requiere del análisis específico por medio de

la valoración microbiológica del antibiótico, que sometido a un proceso de validación

garantice de forma consistente y permanente la confiabilidad y validez de los datos

obtenidos y poder así juzgar de la seguridad (calidad) del producto para su

comercialización.

Al validar este método analítico, se obtendrá un procedimiento específico para el

análisis en las condiciones descritas. Se crea evidencia documentada de un alto grado

de confianza, que el procedimiento descrito suministra una serie de direcciones precisas

y definitivas del método analítico que deben seguirse al realizarse y efectuarse en el

laboratorio para garantizar y cumplir los requerimientos de la aplicación analítica

propuesta. La validación de técnica permite no solo el conocimiento del método analítico

que proporciona resultados y datos validos sino también el cumplir con las exigencias

legales tanto del registro de especialidades farmacéuticas como de las Buenas

Prácticas de manufactura de productos farmacéuticos vigentes, que garantizan la

calidad y eficacia del producto. (WHO Technical Report Series, No 823, 1992)

Se buscara la optimización y estandarización del procedimiento de proceso de la técnica,

al estudiar las características de desempeño analítico y al minimiza el número de fallos y

repeticiones permitiendo un importante ahorro de costos. De esta forma se podrá prestar

un servicio a terceros como un laboratorio que establece procesos con procedimientos

46

consistentes, que se llevan a cabo por medio de técnicas y métodos exactos,

reproducibles y sólidos. (WHO Technical Report Series, No 823, 1992)

La norma ISO/IEC 17025 no requiere la validación de los métodos normalizados

aplicados en un laboratorio específico, pero sí establece que se deberán obtener datos

sobre el rendimiento de su propio uso, es decir que siempre resulta apropiado contar

con algún grado de validación, incluso cuando se utilicen métodos normalizados.

Normalmente se asume que los métodos normalizados se pueden aplicar directamente

y que se alcanzarán los niveles de rendimiento publicados por quienquiera que utilice el

método, pero este no es un supuesto seguro. Se debe al menos practicar con el método

a través de un proceso de capacitación para alcanzar una competencia aceptable.

Razón por la cual laboratorio de microbiología de VICAR FARMACEUTICA S.A. debe

establecer el grado de validación requerido de acuerdo con las necesidades del cliente,

con las políticas de calidad, con la naturaleza de los cambios realizados a un método

previamente validado, o con las metas de calidad que se haya trazado como parte de

los procesos de mejoramiento continuo del sistema de calidad, con la finalidad de ser

competente y líder en la industria farmacéutica veterinaria del país. (Sánchez, .2003)

Por otra parte se encuentran las normas ISO 9000 presentes en un manual de calidad

conciso que establece políticas básicas fundamentadas en la descripción de

procedimientos de procesos que reflejen en pocas palabras lo que se hace en la

industria. La norma ISO 9000 busca mejorar y certificar las industrias de manufactura en

el ámbito nacional e internacional mediante la estandarización de cada uno de los

procesos de producción (Teormina, 1997). Al ir realizando la validación de cada uno de

los métodos analíticos que se desarrollan en esta industria farmacéutica se estan

alcanzando las pautas para la certificación de la empresa, alcanzando un alto nivel de

calidad que tiene como resultado el desarrollo, crecimiento y alto grado de

competitividad en la industria farmacéutica a nivel nacional e internacional, ser líder en

prestación de servicios de análisis de laboratorio, tener reconocimiento del alto nivel de

calidad de los productos que ofrece al consumidor, logrando su misión y visión.

47

6. OBJETIVOS

6.1 OBJETIVO GENERAL

Validar el método analítico para la cuantificación de Bacitracina en el laboratorio de

control de calidad de VICAR FARMACEUTICA S.A.

6.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS

6.2.1 Desarrollar el proceso de validación del método analítico para la cuantificación de

Bacitracina Zinc.

6.2.2 Desarrollar el proceso de validación del método analítico para la cuantificación de

Bacitracina Metilen Disalicilato.

6.2.3 Evaluar cada una de las características de desempeño analítico para la validación

del método.

6.2.4 Crear evidencia documentada de la declaración de validez de que el método

analítico se ajusta al uso propuesto

48

7. MATERIALES Y METODOS

7.1 Estándar de Referencia

La potencia de los antibióticos en el estudio se estableció en ¨Unidades¨ de actividad.La

¨Unidad¨ de actividad de Bacitracina que se empleo es la establecida y definida según

el maestro federal designado para este antibiótico. De esta forma para el desarrollo del

estudio se empleo el Estándar de Referencia USP de Bacitracina calibrado según el

estándar maestro, de Lote N1E200 y potencia de 75.1 UI/mg, obtenido de la U.S.

Pharmacopeial Convention, Inc.

7.2 Muestras de estudio

La primera muestra que se utilizo en el análisis fue Bacitracina Zinc al 15% como

principio activo, de Lote 20071102-6 y potencia asignada 6006 U/g en base seca

(indicada en el certificado de Análisis por el fabricante).

La segunda muestra utilizada en el análisis fue Bacitracina Metilen Disalicilato al 11%

como principio activo, de Lote LO70701 y la potencia asignada 4.49 U/g en base seca.

(Indicada en el certificado de Análisis por el fabricante).

La planificación y ejecución de las valoraciones microbiológicas de los antibióticos

muestra y la validación de la técnica de cuantificación de Bacitracina se realizó según lo

establecido en la USP con respecto a las especificaciones para Bacitracina descritos en

la técnica de valoraciones microbiológicas de antibióticos y en las especificaciones

descritas para la realización de la validación de los procedimientos farmacopeicos. (USP

30, Antibióticos – Valoraciones Microbiológicas (81) pag.111 y Validación de

Procedimientos Farmacopeicos (1225) pag. 749) También se realizo según la

metodología y parámetros descritos en el Procedimiento Operativo Estándar para

validación de métodos analíticos empleado por Vicar Farmaceutica

Los análisis estadísticos para la Validación del Método Analítico se realizaron utilizando

Statgraphics Plus for Windows 2.0 (1996). Statistical Graphics Corp. Serial Number:

3862216 para la linealidad del sistema y las linealidades del método y se utilizo

Microsoft Office Exel 2007 para el análisis de datos de la precisión, exactitud,

selectividad, especificidad, limite de cuantificación, limite de detección, linealidad del

sistema y linealidad del método.

49

7.3 Preparación y estandarización de la suspensión del microorganismo de ensayo

Basados en la técnica de valoraciones microbiológicas descrita en la USP 30, se

determino:

Microorganismo de prueba para el antibiótico Bacitracina: Micrococcus luteus ATCC

10240

Medio de cultivo (Agar) a emplear para los repiques: tripticasa soya

Método de valoración: difusión en placa

7.3.1 Cultivo bacteriano: la cepa de Micrococcus luteus liofilizada se obtuvo de las

colecciones estandarizadas de la American Type Culture Collection (ATCC). Se

reconstituyo el vial liofilizado y a partir de este cultivo de origen se sembró por

agotamiento en placas con agar tripticasa soya (TSA) (Anexo 1) y en caldo BHI (Anexo

1.) para su recuperación, los medios se incubaron de 32 a 35 oC durante 24 horas.

A partir de los aislamientos del cultivo primario se realizo su identificación a través de

métodos microscópicos mediante tinción de Gram y macroscópicos mediante la

observación de las características de las colonias. Para mantener la viabilidad del

microorganismo durante la validación a partir del cultivo primario se realizaron

subcultivos en placas con TSA cada 3 dias.

7.3.2 Preparación del inoculo: Se preparo una suspensión madre en la que se

adiciono con un asa estéril colonias del microorganismo provenientes de un subcultivo

de Micrococcus luteus ATCC 10240 en 10 ml de solución salina 0.9% estéril utilizando

vortex para homogenizar la muestra hasta que se obtuvo una suspensión con una

turbidez igual al patron de MacFarland con valor de trasmitancía de 25%.Para facilitar la

comparación del patrón de MacFarland y la suspensión de microorganismo se trazo una

línea negra gruesa sobre una hoja de papel y sobre esta se colocaron simultáneamente

los dos tubos, para observar la línea con la misma nitidez en los dos tubos. La población

bacteriana se estimó comparando el grado de turbidez de la solución madre de

Micrococcus luteus ATCC 10240, con el patrón de turbidez de la escala de MacFarland

que presento trasmitancía de 25%.

7.3.3 Determinación de la cantidad de suspensión madre para inoculo: la cantidad

de suspensión madre del microorganismo que se utilizo como inoculo se determino

inoculando diferentes volúmenes de la suspensión madre, comenzando con el volumen

50

sugerido (0.3ml / 100ml medio) para inoculo por la USP 30. Los volúmenes de prueba

que se utilizaron de suspensión madre fueron: 0.3, 0.5, 1.0 y 2.0 ml por cada 100 ml de

medio antibiótico No 1 (Anexo 1). Cada volumen de prueba se hizo por triplicado. Se

agrego 6ml de inoculo sobre cada una de las cajas petri con capa de agar base. Se

dejaron las cajas 45 minutos sobre una superficie plana hasta que el inoculo se

solidificara para perforarlas con el sacabocados de 6 perforaciones y se retiro el residuo

de agar de cada uno de los pozos, en cada pozo se sembró 100 microlitros del la

dilución media del estándar de referencia en una concentración de 1.0 UI/ml. Se

incubaron las placas de 32 a 35 oC durante 18 horas. Después del periodo de

incubación se determino la cantidad de suspensión madre para el inoculo que mostró

una demarcación satisfactoria de las zonas de inhibición obtenida por la relación dosis-

respuesta optima a partir de la cantidad de cultivo del microorganismo en las placas.

(USP, 30)

7.4 Preparación del estándar (Método de la curva patrón)

7.4.1 Diluciones del patrón: La preparación de la solución madre y diluciones de

prueba del estándar se realizaron según lo establecido por la USP 30 en la valoración

microbiológica de antibióticos. Se tomo una muestra del estándar de Bacitracina y se

sometió a secado a 60oC durante 3 horas en horno. Para la solución madre del patrón

se utilizo acido clorhídrico 0.01N como solvente inicial. Se disolvió una cantidad de

16.66mg de Bacitracina seca equivalente 1250UI (Estándar de Referencia USP) en

acido clorhídrico 0.01N en balón aforado de 25ml. La solución se sometió durante 15

minutos a ultrasonido

7.4.2 Diluciones finales del patrón: la valoración se realizo con 10 niveles (desde A

hasta J) del Estándar. Se preparo a partir de la solución madre 10 diluciones en

concentraciones de: 0.05 UI/ml , 0.1 UI/ml , 0.15 UI /ml , 0.20 UI/ml , 0.25 UI/ml , 0.50

UI/ml , 1.0 UI/ml, 1.5 UI/ml, 2.0 UI/ml y 2.5 UI/ml utilizando solución amortiguadora No 1,

1%, pH 6 (Anexo 1) como diluyente ( tabla.4 y 5). La dilución media utilizada fue de 1.0

UI por ml según lo especificado en la USP 30.

Tabla 4. Diluciones de la curva patrón (intervalo de concentraciones 0.1 a 0.25 UI/ml)

Volumen de 0.5 UI/ml (ml) Volumen de Diluyente (ml) Concentracion Final (UI/ml)

2 8 0.13 7 0.154 6 0.25 5 0.25

51

Tabla 5. Diluciones de la curva patrón (intervalo de concentraciones 0.5 a 2.5 UI/ml)

Volumen de Solucion Madre (ml) Volumen de Diluyente (ml) Concentracion Final (UI/ml)1 99 0.51 49 1.03 97 1.52 48 2.0

2.5 47.5 2.5

7.5 Preparación de la muestra

7.5.1 Dilución de la muestra: se determino la cantidad de muestra a pesar para la

valoración del antibiótico presente en el producto a partir de información que

proporciono el fabricante de la potencia asignada al producto en el certificado de

análisis. La primera muestra contiene Bacitracina Zinc al 15% como principio activo, la

potencia calculada es de 5.753 UI/g en base húmeda. La potencia de la muestra se

dividió en el equivalente del estándar para obtener la cantidad de 0.21g de muestra a

pesar para preparar la solución madre. Se disolvió los 0.21g en acido clorhídrico 0.01N

en balón aforado de 25ml. La segunda muestra contiene Bacitracina Metilen Disalicilato

al 11% como principio activo, la potencia calculada es de 4.283 UI/g en base húmeda.

Se determino la cantidad de 0.29g de muestra a pesar para preparar la solución madre.

Se disolvió la cantidad de 0.29g de muestra en acido clorhídrico 0.01N en balón aforado

de 25ml. Las diluciones madre de las muestras se sometieron por 15 minutos a

ultrasonido. Terminado los 15 minutos las soluciones se utilizaron para preparar la

dilución de prueba de la muestra.

7.5.2 Dilución de prueba de la muestra: La valoración se realizo con 10 niveles del

estándar requiriendo un solo nivel de la muestra. De esta forma se diluyo la solución

de la muestra para obtener una concentración igual al nivel medio del estándar (dilución

G de concentración 1.0 UI/ml). La dilución de prueba de la muestra se preparo con 1ml

de solución madre de muestra que se preparo anteriormente aforando en balón de 50 ml

con el mismo diluyente final utilizado para el Estándar de Referencia (solución

amortiguadora No 1, 1%, pH 6). La dilución de prueba de cada una de las muestras se

trabajó en concentración de 1.0 UI/ml igual al nivel medio del estándar.

7.6 Obtención del placebo

Para el estudio no fue posible obtener el placebo de cada uno de los productos a

analizar de esta forma se realizo la inactivación del principio activo para poder analizar

los excipientes presentes en la muestra. Para la desactivar el principio activo se

52

realizaron diluciones madres de cada una de las muestras y se les adiciono 5ml de HCl

1N posteriormente se sometieron 60 minutos a 90 0C en baño de termostatado. Pasado

el periodo de tiempo se adiciono 5 ml de NaOH 1N con el fin de neutralizar la muestra.

Finalmente se afora el balon de 50ml con Buffer 1 al 1% pH6. Se realizaron estudios

para la confirmación de que no existiera actividad ni presencia de la molécula del

principio activo.

7.7 Preparación de placas de valoración

Se prepararon placas de valoración utilizando cajas petri de 90 x 15 mm a las que se

les adiciono 20ml de medio antibiótico No 1.(Anexo 1) se dejo solidificar el medio

durante 40 minutos para formar una capa de agar base lisa. Se agrego 6 ml de inoculo

como capa de siembra, sobre la superficie de la capa de agar base. El inoculo se

preparo adicionando un volumen de 0.5 ml de suspensión madre del microorganismo

Micrococcus luteus ATCC 10240 por cada 100 ml de medio agar antibiótico No 1

fundido a una temperatura de 45 a 50 oC. Se dejo solidificar durante 1 hora. Pasado el

tiempo se perforaron las placas con el sacabocados de 6 perforaciones equidistantes

entre ellas. El residuo de agar en cada perforación fue retirado con pinzas dejando el

pozo disponible para la siembra de muestras a analizar. Las placas de valoración se

rotularon de tal forma que 3 pozos alternos de los seis fueran para la muestra de la

concentración de referencia del patrón del estándar (serie de concentración 1.0 UI/ml) y

los tres pozos restantes se rotularon como muestra. Las placas de valoración una vez

sembradas con la muestra se incubaron de 32-35 oC durante 18 horas para realizar la

lectura del diámetro que presento la zona de inhibición con un calibrador.

7.8 Validación del método de cuantificación del principio activo (USP, 30)

Todos los parámetros y características del desempeño analítico de la validación se

evaluaron para cada tipo de Bacitracina (Bacitracina Zinc y Bacitracina Metilen

Disalicilato)

7.8.1 Especificidad: se verificó la especificidad del método analítico observando la

capacidad de este, de detectar el analito de forma inequívoca sin interferencias de otro

compuesto y/o sustancias químicas diferentes que pueden estar presentes en una

misma muestra. Se prepararon diluciones de las muestras y del estándar de referencia

hasta obtener una concentración de 1.0 UI/ml. Se sembró por separado 100 microlitros

de las muestras, el estándar, el placebo y el diluyente en cajas de valoración. El análisis

53

se realizo con 3 replicas para cada uno. Se observo si existió o no la formación de halo

de inhibición.

7.8.2 Selectividad: se verifico la selectividad del método analítico preparando muestras

al 100% del estándar de referencia y de las muestras. Se prepararon 3 replicas

independientes para el estándar y las muestras. A cada una de ellas se le verifico los

posibles interferencias de metabolitos de degradación sometiendo la molécula a

condiciones externas de temperatura, condiciones acidas, condiciones alcalinas y a

fotolisis por luz UV. Las muestras y el estándar a una concentración del 100% se

sometieron a condiciones acidas para esto se adiciono 1ml de cada una de las muestras

y el estándar (concentración al 100%) en balón de 50 ml. Se preparo una muestra para

hidrólisis acida empleando HCL 1N, se adiciono 5ml a cada una de las muestras en el

balón de 50ml, posteriormente se sometieron por una hora a 90oC en baño termostatado

finalizado el tiempo se adiciono 5ml de NaOH 1N a cada una de las muestras en el

mismo balón de 50ml para neutralizar la muestra y se aforo con Buffer 1 al 1% pH6.

Para someter las muestras a condiciones básicas se adiciono 1ml de cada una de las

muestras y el estándar (concentración al 100%) en balón de 50 ml. Se preparo muestra

para hidrólisis básica empleando NaOH 1N, se adiciono 5ml a cada una de las

muestras en el balón de 50ml posteriormente se sometieron por una hora a 90 oC en

baño termostatado finalizado el tiempo se adiciono 5ml de HCl 1N a cada una de las

muestras en el mismo balón de 50ml para neutralizar la muestra y se aforo con Buffer 1

al 1% pH6.

Para evaluar las muestras en condiciones externas de temperatura se adiciono 1ml de

cada una de las muestras y el estándar (concentración al 100%) en balón de 50 ml

posteriormente se sometieron a 90 oC en baño termostatado durante una hora.

Transcurrido el periodo de tiempo se realizaron diluciones para obtener una

concentración de 1.0 UI/ml.

Para observar la degradación por acción de la luz las muestras se colocaron bajo luz

UV por un tiempo de 8 días a luz solar, transcurrido el periodo de tiempo se realizaron

diluciones para obtener una concentración de 1.0 UI/ml. Una vez que se obtuvieron los

datos de la valoración de cada una de las condiciones a las que se sometieron las

muestras, se realizo una segunda prueba en la que se llevó acabo los mismos

procedimientos solo que el periodo de exposición a la temperatura cambio siendo de 30

minutos a 90 oC, en las condiciones acidas y básicas únicamente. Se realizo esta

segunda prueba ya que los resultados que se obtuvieron mostraron una degradación

54

total de la molécula del principio activo al ser sometidas a 90oC en baño de maría

durante 1 hora en las diferentes condiciones, por esta razón se analizo en un periodo de

tiempo mas corto para determinar si la respuesta de la molécula era la misma en un

periodo de tiempo mas corto en las mismas condiciones de prueba.

Se determinó por medio de un estudio estadístico, el porcentaje de degradación de cada

una de las moléculas sometidas a las diferentes condiciones de estrés.

7.8.3 Linealidad del sistema: Para el estudio de la linealidad del sistema se preparó

una curva de calibración en un intervalo de concentración desde 0.05 hasta 2.5 UI/ml,

que incluyó 10 niveles de concentraciones diferentes (0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.5,

1.0, 1.5, 2.0 y 2.5 UI /ml) del Estándar de Referencia USP Bacitracina (Ver Tabla. 6). El

análisis se realizó por triplicado en cada concentración. Los niveles de concentración se

encuentran dentro de los intervalos establecidos para el tipo de análisis (80% 100%

120% 140%).

A partir de los datos obtenidos de la prueba, se realizo un análisis estadístico

determinando las siguientes especificaciones: ecuación de la recta de regresión,

representación grafica de la recta de regresión, coeficiente de correlación, coeficiente de

determinación y análisis de variancia para la regresión lineal.

7.8.4 Linealidad del método: para esta determinación se analizo el método preparando

10 muestras de diferentes niveles de concentración de analito de muestra. Las

concentraciones verificadas previamente, son las mismas que se utilizaron en la

linealidad del sistema. El intervalo de concentraciones se utilizo desde 0.05 hasta 2.5

UI/ml que incluyó 10 niveles de concentraciones diferentes (0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25,

0.5, 1.0, 1.5, 2.0 y 2.5 UI /ml) del Estándar de Bacitracina mas placebo. De cada una de

las concentraciones se realizaron 3 replicas. A cada una de las diluciones se le adiciono

1ml de placebo antes de aforar los balones con Buffer 1 al 1% pH6. El placebo se

obtuvo sometiendo una solución madre de muestra a una hidrólisis acida con 5ml de

HCl 1N posteriormente se sometió a 60 minutos a una temperatura de 90 oC en baño

termostatado transcurrido el tiempo se neutralizo con 5ml de NaOH 1.0N. De esta

forma se inactivo el principio activo y la muestra represento el placebo.

A partir de los datos obtenidos de la prueba, se realizo un análisis estadístico

determinando las siguientes especificaciones: ecuación de la recta de regresión,

representación grafica de la recta de regresión, coeficiente de correlación, coeficiente de

determinación y análisis de variancia para la regresión lineal.

55

7.8.5 Precisión del método: a una muestra de concentración única que representó el

100,0% de la cantidad teórica declarada se le realizo dilución hasta obtener una

concentración de 1.0 UI/ml; se efectuaron las valoraciones por 2 analistas en 2 días

diferentes en la que cada analista realizo diluciones para obtener muestras de

concentración de 1.0UI/ml del estándar y las muestras para ser analizadas. Para su

evaluación se realizó un análisis de varianza. De la muestra se realizaron 3 replicas por

analista y para cada día de análisis.

En el caso de la precisión del sistema se determino 10 lecturas de la concentración

central del estándar.

Los datos obtenidos se estudiaron introduciéndolos en el programa de validación

determinando las siguientes especificaciones: media, desviación estándar, coeficiente

de variación, intervalo de confianza y los límites de confianza de la media.

7.8.6 Exactitud: Para establecer la exactitud del método analítico se prepararon 3

soluciones de cada muestra mas placebo a concentraciones de 80, 100,120% (Tabla 6)

para cada nivel de concentración se prepararon tres muestras independientes. Los

datos obtenidos se analizaron introduciéndolos en el programa de validación

determinando las siguientes especificaciones: el porcentaje de recuperación,

homogeneidad de variancias (Test Cochran), determinación del sesgo y test de t

Student.

Tabla.6 Diluciones del las muestras para la evaluar la Exactitud

Muestra % Exactitud

Cantidad a Pesar (g)

Volumen de Diluyente (ml)

Volumen de Solucion Madre

(ml)

Volumen de Diluyente (ml)

Bacitracina Zinc 80 0.17 25 1 49Bacitracina Metilen 80 0.22 25 1 49Bacitracina Zinc 100 0.22 25 1 49Bacitracina Metilen 100 0.28 25 1 49Bacitracina Zinc 120 0.26 25 1 49Bacitracina Metilen 120 0.33 25 1 49

DILUCION FINALSOLUCION MADRE

7.8.7 Limite de detección: se determino el limite de detección preparando diluciones de

estándar de referencia en un intervalo de concentraciones de 0.005, 0.01, 0.015 y 0.025

UI/ml. (Tabla 7) Cada concentración se realizo por triplicado para su valoración. En la

valoración de las muestras se determino cual era la concentración en la que no se

observo halo de inhibición que correspondió al límite de detección ya que es el nivel

mínimo del analito que puede detectarse confiablemente.

56

Tabla. 7 Diluciones del las muestras para determinar el limite de detección

Volumen de Solución Madre (ml)

Volumen de Diluyente Buffer 1%

ph 6 (ml)

Concentración Final (UI/ml)

Volumen de Solución Madre (ml)

Volumen de Diluyente Buffer 1% ph 6 (ml)

Concentración Final (UI/ml)

1 99 12.76 1 49 0.011 99 12.76 1.5 48.5 0.0151 99 12.76 2.5 47.5 0.025

PRIMERA DILUCION SEGUNDA DILUCION

7.8.8 Límite de cuantificación: el límite cuantitativo se determino preparando una

dilución que represento más o menos tres o cuatro veces el límite de detección. Se

estableció como concentración de trabajo 0.02 UI/ml preparando seis replicas

independientes a esta concentración para ser valoradas. Con los datos obtenidos se

estableció el límite mínimo del analito que se puede determinar con exactitud y precisión

aceptables.

Una vez finalizado el análisis se genero informe de validación y de acuerdo con los

resultados obtenidos se concluyo y se demostró estadísticamente que el método es

adecuado para el propósito determinado, es decir que posee un alto grado de

confiabilidad que puede ser aplicado a un amplio numero de muestras y matrices que

es practico con respecto al costo y el tiempo requerido en el análisis.

57

8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Validación del Método Analítico para de Cuantificación de Bacitracina Zinc y Bacitracina Metilen Disalicilato 8.1 ESPECIFICIDAD El método tiene la capacidad de diferenciar precisa y específicamente el principio activo

de Bacitracina Zinc y Bacitracina Metilen Disalicilato, en presencia de los demás

componentes como lo son el diluyente utilizado y el placebo, que se espera estén

presentes en la matriz de la muestra. (WHO Technical Report Series, No 823, 1992)

A partir de los resultados obtenidos de la especificidad presentados en el Anexo 5 y 6

se muestra evidencia de que el procedimiento no resulta afectado por la presencia del

diluyente o excipientes, ya que al sembrar el placebo y el diluyente en las placas de

valoración no se observo formación de halo lo que demuestra que estos no intervienen

en la formación de halo al cuantificar el principio activo. Al sembrar la concentración

central del principio activo en las placas de valoración se observo la formación de halos

de inhibición en de Bacitracina Zinc y en Bacitracina Metilen Disalicilato.

8.2 SELECTIVIDAD En el Anexo 8 y 7 se presentan los porcentajes de degradación de cada una de las

muestras (M1 estándar, M2 muestra y M3 placebo) en los tratamientos con Bacitracina

Zinc y Bacitracina Metilen Disalicilato sometidas a condiciones externas de temperatura,

radiación UV, condiciones acidas y condiciones alcalinas. .

Se observo una degradación química apreciable en medio acido y básico ya que al

termino de una hora a 90oC con tratamiento con HCl 1N y con NaOH 1N

respectivamente se obtuvo un porcentaje de degradación del principio activo de: en el

Estándar Bacitracina (M1) un 99.9% de degradación en condiciones acidas y básicas,

en la muestra Bacitracina Zinc (M2) y muestra Bacitracina Metilen Disalicilato (M2)

mostraron una degradación un poco mas acentuada presentando un 100% de

degradación en condiciones acidas y básica. De esta forma se determina que el

principio activo es susceptible a la degradación en medio acido y básico siendo un

interferente que hay que tener en cuenta a la hora de su fabricación, almacenamiento y

en realización de pruebas en los análisis de calidad (prueba de potencia).

58

A partir de los porcentajes de degradación se observa como la molécula al ser expuesta

a condiciones acidas y básicas presenta degradación coincidiendo con la información

obtenida en cuanto a la estabilidad de la Bacitracina, determinando que esta es

rápidamente inactivada en soluciones que tienen un pH mayor a 9 y menores de 4.

(McEvoy, G.K., 1993)

Se observo una degradación apreciable al someter las muestras durante ocho días a

radicación solar directa, el Estándar Bacitracina (M1) presento un porcentaje de

degradación de 18.4%, a partir de este se determina que el principio activo es afectado

por la radiación UV. La muestra Bacitracina Zinc (M2) y muestra Bacitracina Metilen

Disalicilato (M2) mostraron una degradación mucho mas acentuada presentando un

82.6% y 76.6% de degradación correspondientemente siendo mas sensibles a la

exposición de luz solar durante un periodo mayor o igual a 8 días. Al someter las

muestras a una temperatura de 90oC durante un periodo de una hora se obtuvo un

porcentaje de recuperación de: 22.1% en el Estándar Bacitracina (M1), 75.5% en

Bacitracina Zinc (M2) y 73.0% en Bacitracina Metilen Disalicilato (M2). Se determino

que los principios activos son susceptibles o pierden su estabilidad al someterlos a altas

temperaturas, aunque el Estándar de Bacitracina presento un porcentaje de

degradación mas bajo es afectada igualmente. Los dos tipos de Bacitracina tuvieron un

porcentaje de degradación muy cercano lo cual nos muestra que las dos se ven aun

mas afectadas al someterlas a altas temperaturas y que las dos responden de igual

manera al someterlas a 90oC por una hora.

A partir de los datos anteriores se determina que el principio activo es susceptible a la

degradación cuando se somete o se encuentra expuesto a radiación UV y a

temperaturas iguales o mayores de 90oC durante un periodo de tiempo. Estas

condiciones resultan siendo un interferente que hay que tener en cuenta a la hora de su

fabricación, almacenamiento y en realización de pruebas en los análisis de calidad

(prueba de potencia). Por esta razón el principio activo debe almacenarse a temperatura

ambiente y protegido de la luz solar para evitar la perdida de la potencia del antibiótico.

Muestra evidencia de que el procedimiento resultara afectado por la presencia de

productos y condiciones drásticas de degradación del principio activo, en este caso cada

una de las Basitracinas muestra degradación si se trabaja en presencia de condiciones

acidas, básicas, radiación UV y altas temperaturas siendo estos los productos que

interfieren al querer cuantificar nuestro principio activo. Se observo mayor degradación

en Bacitracina Zinc y Bacitracina Metilen Disalicilato que en la Bacitracina Estándar,

59

esto puede deberse a la presencia de una sustancia de degradación en los excipientes

del producto farmacéutico, que hace que la muestra genere un mayor halo de inhibición

y por lo tanto un porcentaje mayor de degradación.

8.3 LINEALIDAD DEL SISTEMA Al realizar el estudio estadístico de los datos obtenidos se obtuvo los siguientes

resultados:

La curva de calibración realizada entre el logaritmo de la concentración en la variable

dependiente (Y) y el diámetro del halo (mm) en la variable independiente (X) resultó ser

lineal en el intervalo de concentraciones comprendidas entre 0,05 y 2,55 UI/ml. Al

aplicar la regresión lineal a los datos se obtuvo la ecuación de la recta que se expresó

según y = 0,127843 x – 3,13256 (LogConc = -3,13256 + 0,127843*Diametro). El

coeficiente de correlación fue de 0,996924. (R-squared = 99,3857 percent). (Anexo2)

La regresión lineal obtenida es el diseño del modelo matemático, representado como

una ecuación, que permite establecer o simular el comportamiento de la variable

dependiente con respecto a la variable independiente. En el Anexo 2. se muestra la

cuerva de calibración para Bacitracina (Estandar) teniendo una regresión lineal y un

coeficiente de correlación de 0.996924 hasta una concentración de 2.55 UI/ml arriba de

esta concentración el sistema puede perder su respuesta lineal (Reyes Aguero C.,

2007). Dentro del intervalo de concentraciones 0.05 y 2.55 mg/ml se puede construir

una curva de calibración lineal es el rango lineal.

El coeficiente de correlación obtenido es nuestro índice estadístico que mide la relación

lineal entre las dos variables cuantitativas (log de concentración y diámetro). Este mide

la correlación entre la variable dependiente xi (Diámetro halo) y una variable

independiente yi (Log de concentración), El coeficiente de correlación obtenido es muy

cercano a 1 existiendo una correlación positiva casi perfecta. El índice indica que existe

una dependencia total entre las dos variables denominada relación directa: cuando el

halo tiene un mayor diámetro (mm) la concentración (UI/ml) del principio activo es

mayor, es decir cuando una de las variables aumenta, la otra también lo hace en

idéntica proporción, es decir hay una relación directamente proporcional.(Reyes Aguero

C., 2007).

8.4 LINEALIDAD DEL METODO BACITRACINA ZINC Al realizar el estudio estadístico de los datos obtenidos se obtuvo los siguientes

resultados:

60



lineal en el intervalo de concentraciones comprendidas entre 0,05 y 2,55 UI/mL. Al


según y = 0.168504x – 4.19447 (LogConc= -4.19447 + 0.168504*Diámetro). El

coeficiente de correlación fue de 0,997576. (R-squared = 99.5158 percent). (Anexo 3)




curva de calibración para Bacitracina (Estandar) teniendo una regresión lineal y un



2007). Dentro del intervalo de concentraciones 0.05 y 2.55 UI/ml se puede construir una

curva de calibración lineal en el rango lineal.




independiente yi (Log de concentración), El coeficiente de correlación obtenido es muy

cercano a 1 existiendo una correlación positiva casi perfecta. El índice indica que existe

una dependencia total entre las dos variables denominada relación directa: cuando el

halo tiene un mayor diámetro (mm) la concentración (UI/ml) del principio activo es

mayor, es decir cuando una de las variables aumenta, la otra también lo hace en

idéntica proporción. (Reyes Aguero C., 2007).

8.5 LINEALIDAD DEL METODO BACITRACINA METILEN DISALICILATO Al realizar el estudio estadístico de los datos obtenidos se obtuvo los siguientes

resultados:



lineal en el intervalo de concentraciones comprendidas entre 0,05 y 2,55 UI/mL. Al


según y = 0.187593x – 4.52561 (LogConc= -4.52561 + 0.187593*Diámetro). El

coeficiente de correlación fue de 0,980127. (R-squared = 96.0649 percent). (Anexo 4)



61


curva de calibración para Bacitracina (Estandar) teniendo una regresión lineal y un



2007). Dentro del intervalo de concentraciones 0.05 y 2.55 UI/ml se puede construir una

curva de calibración lineal en el rango lineal.




independiente yi (Log de concentración), El coeficiente de correlación obtenido es

cercano a 1 existiendo una correlación positiva. El índice indica que existe una

dependencia total entre las dos variables denominada relación directa: cuando el halo

tiene un mayor diámetro (mm) la concentración (UI/ml) del principio activo es mayor, es

decir cuando una de las variables aumenta, la otra también lo hace en idéntica

proporción. (Reyes Aguero C., 2007).

Se observo como la recta de la regresión constituida con el diámetro del halo y su

respuesta en la concentración cumple con los parámetros establecidos del coeficiente

de correlación. En los resultados obtenidos (Anexo 2, 3 y 4) del coeficiente de

correlación ninguno fue menor o igual a 0.95, de esta forma se encuentra en los criterios

de aceptación.

Los valores obtenidos en el P-value en los análisis de varianza (ANOVA) (Anexo 2, 3 y

4) realizados a cada una de las Bacitracinas es menor a 0.01, lo que muestra evidencia

estadísticamente significativa de la relación entre el logaritmo de la concentración y el

diámetro del halo con un nivel de confianza del 99%. De esta forma cumple con los

criterios de aceptación.

En el Anexo 2, 3 y 4 se muestra el análisis de la varianza de cada una de las

Bacitracinas, a partir de estos resultados se puedo concluir que existen diferencias

significativas entre las concentraciones establecidas dentro de un intervalo de 0.05

hasta 2.55. Es decir que las concentraciones que se trabajaron presentaron diferencia

en sus halos y de esta forma se puede establecer diferencia entre las concentraciones

para así poder realizar una cuantificación del principio activo.

8.6 PRECISIÓN

La precisión obtenida expresa la cercanía de coincidencia (grado de dispersión) entre

los datos de las mediciones de halos (mm) de los múltiples muestreos de una misma

muestra homogénea bajo condiciones establecidas. Se evaluó la precisión por medio de

62

la repetibilidad que es la precisión obtenida bajo las mismas condiciones de operación

en un intervalo de tiempo (mismo día), por un mismo analista, en la misma muestra

homogénea y con los mismos eguitos (Taylor, 1993). La repetibilidad se evaluó en los

Grupos 1, 2, 3 y 4 que se muestran en el Anexo 9 y 10. Y la reproducibilidad que es la

precisión obtenida dentro del laboratorio por diferentes analistas, diferentes equipos,

días distintos con la misma muestra homogénea. (Calpena AC. et al, 1991) La precisión

inmediata se evaluó en el Grupos 5 que se muestran en el Anexo 9 y 10.

La desviación estándar obtenida en cada uno de los Grupos nos muestra la medida del

grado de dispersión de los datos del valor promedio o media. Valores grandes de la

desviación estándar indican que los datos (puntos) están lejos de la media y valores de

la desviación estándar pequeños indica que los datos están agrupados cerca de la

media. (AEFI, 2001) En todos los grupos la desviación estándar obtenida es

relativamente pequeña indicando que existe una agrupación de datos muy cercanos

alrededor de la media. La desviación estándar de cada uno de los grupos de medidas

nos indican la precisión de estas, ya que se muestra que tan lejos están estas del valor

real o media al ser realizado en diferentes condiciones (día, analista, equipó) pero con

una misma muestra. Las desviaciones estándar que se obtuvieron fueron de valores

pequeños lo que indico que no se observo una diferencia significativa entre los datos de

los grupos siendo un método preciso.

El coeficiente de variación (CV) en cada una de los grupos de datos para la repetibilidad

y para la reproducibilidad no fue mayor al 5% mostrando que el método cumple con los

parámetros establecidos, siendo el ensayó repetitivo.

El coeficiente de variación (CV) nos indica la relación existente entre la desviación de

una muestra y su media. Al dividir la desviación típica por la media se convierte en un

valor de unidad de medida. Si comparamos la dispersión en varios Grupos de

mediciones, tendrá menor dispersión aquella que tenga menor coeficiente de variación.

(AEFI, 2001) En los Anexos 9 y 10 se muestran los valores obtenidos de los coeficientes

de variación de cada uno de los Grupos. En el análisis con Bacitracina Zinc el analista

1 en el día 1 obtuvo el valor mas bajo del coeficiente de variación CV= 0.127 y CV=

0.911 teniendo la menor dispersión entre los valores del diámetro del halo de inhibición

y en el porcentaje de recuperación respectivamente, por otro lado se observo el valor

mas alto del coeficiente de variación CV= 0.389 y CV= 2.72 en el Grupo 5 (Analista 1 y 2

Días 1 y 2) presentando la mayor dispersión entre sus datos, pero aun así no se

encuentran por fuera de los criterios de aceptación.

63

En el análisis con Bacitracina Metilen Disalicilato el analista 2 en el día 1 obtuvo el valor

mas bajo del coeficiente de variación CV= 0.055 Y CV= 0.261 teniendo la menor

dispersión entre los valores del diámetro del halo de inhibición y en el porcentaje de

recuperación respectivamente, por otro lado se observo el valor mas alto del coeficiente

de variación CV= 0.464 y CV= 3.421 en el Grupo 4 (Analista 2 Días 2) presentando la

mayor dispersión entre sus datos, pero aun así no se encuentran por fuera de los

criterios de aceptación.

Las medias de cada uno de los analistas en dos días, de cada uno del analista en un

mismo día, los dos analistas en un mismo día, o presentaron diferencias significativas lo

cual muestra la buena repetitibilidad del método y reproducibilidad. No se observaron

diferencias significativas entre las medias de ambos analistas, por tanto el método

analítico fue reproducible por ambos analistas, de igual forma no se detectaron

diferencias significativas entre las medias de ambos días siendo el método analítico

reproducible en diferentes días. De esta forma el método analítico posee repetibilidad

en diferentes días y por diferentes analistas, al igual que diferentes días por el mismo

analista.

Con un nivel de confianza de 95% que se corresponde con valores α de 0.05 informa

con un 95% de seguridad que nuestro valor estimado se encuentra en un intervalo de

confianza. Los valores obtenidos de los intervalos de confianza (Anexo 9 y 10),

muestran los valores que componen el intervalo dentro de la cual se considera que se

encuentra el verdadero valor de aquella característica que se esta estimando, el

diámetro del halo en mililitros con respecto a la concentración del principio activo.(AEFI,

2001)

El coeficiente de variación obtenido en la precisión del sistema fue menor al 5%, de esta

forma se encuentra dentro del criterio de aceptación establecido. La desviación estándar

obtenida muestra la dispersión de los 10 datos obtenidos con respecto a su media.

(Anexo 11).

La precisión del método en Bacitracina Zinc y Bacitracina Metilen Disalicilato cumple

con los parámetros establecidos de esta forma el ensayo es repetitivo y reproducible.

64

8.7 EXACTITUD Como forma de medir la dispersión de los datos hemos determinado la homogeneidad

de variancias. La varianza es una medida de dispersión que nos permite conocer que

tanto se dispersan los datos alrededor de su promedio o media. Los valores obtenidos

de la variancia de cada uno de los tratamientos con Bacitracina se muestran en los

Anexos 12 y 13, estos valores nos permiten identificar la diferencia promedio que hay

entre cada uno de los valores respecto a su punto central (la media). En el tratamiento

con Bacitracina Zinc los datos que presentaron la menor dispersión alrededor de su

media fue la concentración 120% con una variancia de 0.311 y en el tratamiento con

Bacitracina Metilen Disalicilato los datos que presentaron la menor dispersión alrededor

de su media fue la concentración 120% con una variancia de 0.062.

A partir del estudio de la homogeneidad de variancias por medio del test de Cochran, se

obtuvo el Valor Gexp=0.682 en Bacitracina Zinc y Gexp=0.790 en Bacitracina Metilen

Disalicilato que son inferiores al G3-.2-.0.05 (0.8709) (Anexos 12 y 13). Se acepta la

hipótesis de homogeneidad (igualdad) de variancias de las 3 poblaciones de origen, ya

que Gexp=0.682 en Bacitracina Zinc y Gexp=0.790 en Bacitracina Metilen Disalicilato es

inferior a G3-.2-.0.05 ( 0.8709).es decir que las variancias son homogéneas. La hipótesis de

igualdad de variancias no se rechaza por que el valor G obtenido no es superior al

correspondiente valor G (K,v,α) dado por la tabla e la prueba de COCHRAN. Los valores

optenidos de Gexp son mayores a 0.05 lo que indica que no hay diferencias significativas

en las variancias por lo que hay homogeneidad de variancias.

Los valores obtenidos del sesgo (e%) en cada uno de los tratamientos con Bacitracina

se muestran en los Anexos 12 y 13. Los valores obtenidos del sesgo es el error

sistemático, que se produce de igual modo en todas las mediciones que se realizan de

la magnitud. Este puede estar originado en un defecto del instrumento, en una

particularidad del operador o del proceso de medición, entre otros. (Vaqué. J, 2007).

Ninguno de los valores que se obtuvieron del e% fue mayor al 3% lo que nos indico que

se encuentran dentro de los criterios de aceptación. El tratamiento que presento menor

error sistemático fue el tratamiento de Bacitracina Zinc con un e%=1.24, el tratamiento

con Bacitracina Metilen Disalicilato presento un e%= 2.2 también entra en los criterios

de aceptación pero con un mayor error sistemático que el tratamiento con Bacitracina

Zinc.

De acuerdo con la prueba t de Student se obtuvo un Valor texp 1.208 para Bacitracina

Metielen Disalicilato y un Valor texp 0.39 para Bacitracina Zinc valores son menores a lo

que indica para p= 0.05/2 y v= 8 tiene un valor de 2.306: no hay diferencia significativa

65

entre la recuperación de la media obtenida y el 100% por lo que la exactitud es

conforme.

La exactitud es la capacidad que tiene el método para generar mediciones que se

acerquen al valor verdadero (USP, 30), por esta razón se analizan tres concentraciones

diferentes del analito para observar su porcentaje (%) de recuperación en cada una de

ellas. El porcentaje de recuperación esperado de acuerdo con la experiencia

experimental debe encontrarse entre un 90% - 110%, con un error relativo de ± 10%. En

cada uno de los tratamientos con Bacitracina los porcentajes de recuperación (Anexos

12 y 13). Se encuentran dentro del rango establecido, ninguno es mayor a 110% o

menor de 90%, en cada una de las concentraciones.

La Exactitud de Bacitracina Zinc y Bacitracina Metilen Disalicilato cumplen con los

parámetros establecidos. En los dos casos concentraciones extremas de problema

(principio activo) se detectan como tales.

8.8 LIMITE DE DETECCION

A partir del análisis cualitativo se determino el limite de detección en la concentración de

0.005 UI/ml de Bacitracina, en esta concentración no se detecto la formación de halo. Es

la cantidad mínima de Bacitracina en una muestra que puede detectarse, aunque no

necesariamente cuantificarse, en las condiciones experimentales indicadas. (USP,30)

De esta forma; en la concentración de 0.005 UI/ml se observo el nivel mas bajo de la

concentración de Bacitracina que pudo determinarse como estadísticamente diferente

del blanco analítico. (WHO Technical Report Series, No 823, 1992) Se determina que el

método es capas de detectar cantidades mínimas de Bacitracina en una muestra,

siempre que estén por encima de la concentración de 0.005 UI/ml.

Los resultados obtenidos del análisis estadístico se muestran con más detalles en el

Anexo 15.

8.9 LIMITE DE CUANTIFICACIÓN

La concentración mínima de Bacitracina (analito), que puede ser determinada

cuantitativamente con precisión y exactitud aceptables en condiciones experimentales

indicadas es de 0.02 UI/ml. (Anexo 14)

A partir del análisis cuantitativo se determino el limite de cuantificación en la

concentración de 0.02 UI/ml de Bacitracina, en esta concentración se detecto y

cuantifico la formación de halo de inhibición. Es la cantidad mínima de Bacitracina en

66

una muestra que puede cuantificarse en las condiciones experimentales indicadas. De

esta forma; se determina que el método es capaz de cuantificar en forma confiable

cantidades mínimas de Bacitracina en una muestra, siempre que tengan una

concentración igual o mayor a 0.02 UI/ml .

En la Tabla 18 se muestran los datos obtenidos del análisis estadístico. La desviación

estándar obtenida de 0.223 muestra el nivel de dispersión de los resultados con

respecto a la media obtenida , esta refleja que los resultados obtenidos de los diámetros

de los halos de inhibición son similares o homogéneos ya que es un valor bajo cercano

a cero. El coeficiente de variación (CV) obtenido es de 1.272% este es menor a 5%

(porcentaje del CV que se acepta en la precisión del método). Este valor pequeño del

CV obtenido muestra que la distribución de la variable medida es muy homogénea. Con

un nivel de confianza del 95% se definió los limites de confianza 17.33 -17.68 (Anexo

14) que determinan el intervalo dentro del cual se considera que se encuentra el

verdadero valor de medida para el halo de inhibición de principio activo en la

concentración que se trabajo 0.02 UI/ml. (AEFI, 2001)

Los resultados obtenidos del análisis estadístico se muestran con más detalles en el

Anexo 14.

67

9. CONCLUSIONES

9.1 Se comprobó el cumplimiento de la linealidad del sistema y la linealidad del método

en el intervalo de concentraciones que se estudiaron por su elevado valor del coeficiente

de correlación alcanzado que es muy cercano a 1.

9.2 Se debe tener presente a la hora de realizar el método analítico para la

cuantificación de Bacitracina que no debe realizarse en condiciones que exista la

presencia de soluciones acidas o básicas este seria un interferente a la hora de realizar

la cuantificación de principio activo.

9.3 La molécula de Bacitracina Zinc y Bacitracina Metilen Disalicilato en soluciones

acidas y básicas es inestable perdiendo su potencia.

9.4 Las moléculas del principio activo disminuyen su actividad al someterlas a una

temperatura de 90oC por periodos mayores o iguales a una hora y al someterlas a

radicación solar UV durante un periodo de ocho días, por esta razón se debe mantener

el principio activo a temperatura ambiente y protegido de la luz solar.

9.5 La exactitud del método analítico cumple con los parámetros y/o criterios de

aceptación, concluyendo que los resultados de la prueba obtenidos mediante el

procedimiento establecido bajo condiciones descritas posee una proximidad al valor

verdadero.

9.6 El método analítico para la cuantificación de Bacitracina es preciso dentro del

ensayo al ser efectuado cualquier día, por cualquier analista y cualquier muestra. Es un

procedimiento analítico preciso ya que posee un grado de concordancia entre los

resultados de las pruebas individuales cuando se aplica el procedimiento repetidamente

en el laboratorio.

9.7 Los resultados en la precisión mostraron que los coeficientes de variación son

aprobados, si el valor aceptable debe ser menor o igual que 5%, los coeficientes de

variación resultaron ser menores que 5%, lo cual demuestra la buena repetibilidad del

método de cuantificación..

9.8 No se observaron diferencias significativas entre las medias de ambos analistas y

ambos días por lo tanto el método analítico fue reproducible por ambos analistas.

68

9.9 A partir del análisis cuantitativo se determino el limite de cuantificación en la

concentración de 0.02 UI/ml de Bacitracina, esta concentración corresponde a la mas

baja cantidad de Bacitracina que puede determinarse cuantitativamente con precisión y

exactitud aceptables observando claramente la formación de halo.

9.10 Los resultados permiten concluir que el método analítico para la cuantificación de

Bacitracina presenta resultados de linealidad, especificidad, precisión y exactitud

satisfactorios que permiten obtener resultados seguros y confiables en la detección y

cuantificación de Bacitracina en las muestras al 15% y 11%.

69

10. RECOMENDACIONES

Para la correcta cuantificación del analito de interés se requiere que la señal producida se

deba inequívocamente a su presencia y que no existan interferencias de sustancias y/o

compuestos de degradación ácidos o básicos que puedan estar presentes en la muestra, su

preparación, condiciones instrumentales y/o material de trabajo. Es importante verificar que

estas sustancias interferentes y compuestos de degradación estén ausentes para no generar

interferencia significativa en el resultado.

El estudio de muestras de principio activo a condiciones de estrés, tales como exposición a

altas temperaturas y radiación UV, permitió identificar la presencia de compuestos de

degradación potencialmente interferentes, razón por la cual es importante que durante los

procesos de fabricación, empaque, almacenamiento y en los análisis de control de calidad

no se exponga el producto a ambientes con temperaturas superiores a 90ºC y a radiaciones

UV.

Si se desarrolla el método analítico dentro del rango de concentraciones 0.05 UI/ml hasta

2.55UI/ml se obtendrá una respuesta de tipo lineal, obteniendo resultados que son

directamente proporcionales a la concentración del analito dentro de la muestra.

Por medio de este método analítico bajo las condiciones experimentarles descritas, la

mínima cantidad de analito presente en una muestra que se puede cuantificar con razonable

certeza, precisión y exactitud es de 0.02 UI/ml. Y la mínima cantidad de analito en una

muestra que se puede detectar pero no cuantificar es de 0.005 UI/ml, razón por la cual se

sugiere realizar la cuantificación del analito en muestras que contienen concentraciones

iguales o mayores a 0.02 UI/ml evitando así falsos positivos.

Para las posteriores validaciones en la prueba de exactitud tener en cuenta para la

preparación y montaje de las muestras a valorar, el volumen de placebo que debe

adicionarse en las muestras con el analito a concentraciones coincidas sean iguales a los

porcentajes en los cuales este se encuentra en la formulación del producto acabado. Con el

fin de optimizar la preparación de la muestra para mejorar el factor de recuperación.

70

11. REFERENCIAS

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74

11. ANEXOS

ANEXO 1. CALDOS, MEDIOS DE CULTIVO Y BUFFERS

CALDO BRAIN HEART BROTH (BHI)

Substrato alimenticio ( extracto de cerebro, estracto de corazon) 27.5g/L

Peptona 27.5 g/L

D-glucosa 2.0 G/L

Cloruro sódico 5.0 g/L

Agar-agar 15.0 g/L

AGAR TRIPTICASA SOYA (TSA)

Peptona de caseína

Peptona de arina de soja

Cloruro sódio

Agar-agar

MEDIO ANTIBIOTICO No1.

Peptona 6.0 g/L

Digerido pancreático de caseína 4.0 g/L

Extracto levadura 3.0 g/L

Extracto de carne 1.5 g/L

Dextrosa1.0 g/L

Agar 15.0 g/L

pH despues de la esterilizacio 6.6 +/- 0.1

SOLUCION AMORTIGUADORA DE FOSFATO No 1. POR CIENTO, Ph 6.0

2.0 g/L fosfato dibasico de potasio

8.0 g/L fosfato monobasico de potasio

Ajustar pH com acido fosfórico 18N o hidróxido de potasio 10N a 6.0 +/-0.05

75

ANEXO 2. LINEALIDAD DEL SISTEMA

• Regresión lineal de la linealidad del sistema generado por el programa Statgraphics Plus for Windows 2.0

Regression Analysis - Linear model: Y = a + b*X

-----------------------------------------------------------------------------

Dependent variable: LogConc

Independent variable: Diametro

-----------------------------------------------------------------------------

The linearity of the method is tested with the following data :

Puntos Diámetro Concentración Log (Conc.) (mm) (UI/ml)

S1 14,75 0,05 -1,2919 S2 16,13 0,10 -0,9908 S3 17,73 0,15 -0,8147 S4 19,50 0,20 -0,6898 S5 20,24 0,26 -0,5929 S6 24,90 1,02 0,0092 S7 25,96 1,53 0,1853 S8 26,68 2,04 0,3102 S9 27,51 2,55 0,4071

------------------------------------------------------------------------------

Standard T

Parameter Estimate Error Statistic P-Value

-----------------------------------------------------------------------------

Intercept -3,13256 0,0834659 -37,5311 0,0000

Slope 0,127843 0,0037989 33,6526 0,0000

----------------------------------------------------------------------------------------------------

76

Analysis of Variance

----------------------------------------------------------------------------------------------------

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

----------------------------------------------------------------------------------------------------

Model 3,08248 1 3,08248 1132,49 0,0000

Residual 0,0190529 7 0,00272185

----------------------------------------------------------------------------------------------------

Total (Corr.) 3,10153 8

Correlation Coefficient = 0,996924

R-squared = 99,3857 percent

Standard Error of Est. = 0,0521713

The StatAdvisor

---------------

The output shows the results of fitting a linear model to describe

the relationship between LogConc and Diametro. The equation of the

fitted model is

LogConc = -3,13256 + 0,127843*Diametro

Since the P-value in the ANOVA table is less than 0.01, there is a

statistically significant relationship between LogConc and Diametro at

the 99% confidence level.

The R-Squared statistic indicates that the model as fitted explains

99,3857% of the variability in LogConc. The correlation coefficient

equals 0,996924, indicating a relatively strong relationship between

the variables. The standard error of the estimate shows the standard

deviation of the residuals to be 0,0521713. This value can be used to

construct prediction limits for new observations by selecting the

Forecasts option from the text menu.

77

-----------------------------------------------------------------------------Plot of the residuals

Diámetro

Log

conc

entra

ción

0 2 4 6 8 10-0,09

-0,06

-0,03

0

0,03

0,06

0,09

-----------------------------------------------------------------------------

Test for the existence of a significant slope (F1)

Confidence level 95.00

Degrees of freedom (1,2) 8

F table 113.49

78

BACTRANLINEALIDAD DEL SISTEMA BACITRACINA

ACTIVO: BACITRACINA ZINCConcentracion: 15g/100g LOTE N1E200Curva Estandar

Caja 1 Caja 2 Caja 3 Total Promedio Promedio corr.S7-G 25,17 24,84 25,12 24,52 25,16 25,63 25,84 25,85 26,08 228,21 25,36S1-A 15,07 15,49 15,20 14,54 15,23 14,69 15,17 14,84 16,59 136,82 15,20 14,75S7-G 26,31 26,33 26,46 26,71 25,50 26,00 26,08 26,10 26,06 235,55 26,17S2-B 17,93 16,78 18,01 17,22 17,33 18,00 16,80 17,06 17,46 156,59 17,40 16,13S7-G 26,23 26,00 26,12 25,12 25,62 25,33 25,89 26,01 25,23 231,55 25,73S3-C 20,01 19,22 18,12 18,63 18,80 17,52 17,75 18,07 18,86 166,98 18,55 17,73S7-G 25,34 26,27 25,81 24,89 25,12 24,56 26,18 25,47 26,24 229,88 25,54S4-D 20,87 21,01 20,87 20,58 19,14 19,36 19,67 19,43 20,38 181,31 20,15 19,50S7-G 23,78 25,14 24,64 24,49 23,93 24,07 24,26 24,13 23,99 218,43 24,27S5-E 19,72 19,98 18,92 20,10 19,15 20,17 18,75 20,00 19,78 176,57 19,62 20,25S7-G 23,03 24,79 24,14 24,21 23,11 24,44 24,84 23,81 24,55 216,92 24,10S6-F 21,66 23,75 23,64 23,50 23,78 23,73 23,62 24,00 23,46 211,14 23,46 24,26S7-G 24,81 24,07 23,72 24,29 24,65 23,40 24,62 23,96 24,85 218,37 24,26S8-H 25,53 24,61 25,36 25,67 25,97 25,10 25,27 24,65 25,70 227,86 25,32 25,96S7-G 23,68 24,60 23,76 25,07 24,26 25,15 23,69 24,22 24,09 218,52 24,28S9-I 26,14 25,98 25,11 26,25 26,33 27,00 25,60 26,38 25,72 234,51 26,06 26,68S7-G 25,17 24,80 24,79 24,12 24,57 24,37 23,29 24,74 23,75 219,60 24,40S10-J 27,19 27,21 26,93 26,54 27,25 27,19 26,71 27,55 26,51 243,08 27,01 27,51

XS7 24,90CURVA ESTANDAR

Puntos Diametro Concentracio Log ( Conc.)(mm) (mg/ml) DATOS ESTANDAR

S1 14,75 0,05 -1,2919 Peso (mg) 17S2 16,13 0,10 -0,9908 Potencia (P) UI/mg 75,1S3 17,73 0,15 -0,8147 Fecha de Vencimiento N.AS4 19,50 0,20 -0,6898 Lote N1E200S5 20,25 0,26 -0,5929 DATOSS6 24,26 0,51 -0,2919 Pendiente 0,1278 Pr T (X S3)es mayor que Pr R= SumaS7 24,90 1,02 0,0092 Intercepto -3,1322 Pr T (X S3)es menor que Pr R= RestaS8 25,96 1,53 0,1853 Factor de Dilucion (D) 1250S9 26,68 2,04 0,3102 Promedio General

S10 27,51 2,55 0,4071 Concentracion Central 24,90

79

• Análisis de la Varianza de la Linealidad del Sistema

Shapiro Wilk Ho: Si hay normalidad

si p<0.05 rechazo la Ho

si p>0.05 acepto la Ho

Levene Ho: Si hay homogeneidad de varianzas

Si p< 0.05 rechazo la Ho

Si p >0.05 acepto la Ho

ANOVA Ho: No hay diferencias significativas

Si p<0.05 rechazo la Ho

Si p > 0.05 acepto la Ho

KruskalWallis Ho: No hay diferencias significativas


Si p>0.05 acepto la Ho

Bartlett Ho: Si hay homogeneidad de varianzas


------------------------------------------------------------------------------------------

Shapiro-Wilk normality test

data: resultado$residuals

W = 0.9845, p-value = 0.3839

Bartlett test of homogeneity of variances

data: values by ind

Bartlett's K-squared = 20.5401, df = 9, p-value = 0.01486

Si hay normalidad, No hay homogeneidad de varianzas

Kruskal-Wallis rank sum test

data: values by ind

Kruskal-Wallis chi-squared = 83.1197, df = 9, p-value = 3.87e-14

Si hay diferencias significativas entre los tratamientos con el estandar (Kruskal-Wallis p< 0.05)

80

ANEXO 3. LINEALIDAD DEL MÉTODO BACITRACINA ZINC

• Regresión lineal de la linealidad del método Bacitracina Zinc generado por

el programa Statgraphics Plus for Windows 2.0


-----------------------------------------------------------------------------

Dependent variable: LogConc


-----------------------------------------------------------------------------



S1 16,91 0,05 -1,3010 S2 19,32 0,10 -1,0000 S3 19,87 0,15 -0,8239 S4 20,69 0,20 -0,6990 S5 21,41 0,25 -0,6021 S6 23,50 0,51 -0,2924 S7 24,66 1,02 0,0086 S8 26,23 1,53 0,1847 S9 26,52 2,04 0,3096 S10 27,21 2,55 0,4065

Standard T


-----------------------------------------------------------------------------

Intercept -4,19447 0,0950577 -44,1255 0,0000

Slope 0,168504 0,00415557 40,5489 0,0000

---------------------------------------------------------------------------------------------------

81


----------------------------------------------------------------------------------------------------


---------------------------------------------------------------------------------------------------

Model 3,13721 1 3,13721 1644,21 0,0000

Residual 0,0152642 8 0,00190803

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr.) 3,15247 9




The StatAdvisor

---------------


the relationship between LogConc and Diametro. The equation of the

fitted model is

LogConc = -4,19447 + 0,168504*Diametro


statistically significant relationship between LogConc and Diametro at



99,5158% of the variability in LogConc. The correlation coefficient






82

---------------------------------------------------------------------------Plot of the residuals

Diámetro (mm)

Log

conc

entra

ción

0 2 4 6 8 10-0,07

-0,04

-0,01

0,02

0,05

0,08

0,11

-----------------------------------------------------------------------------


Confidence level 95


F table 1644.21

83

ACTIVO Bacitracina Zinc

Concentración 15g/100g Lote 200711026

Curva EstándarTotal Promedio Promedio corr.

S7-G 24,86 24,61 24,39 24,12 24,74 24,81 24,22 25,07 24,47 221,29 24,59S1-A 16,01 16,49 16,48 15,70 17,41 º6.38 16,77 17,02 16,90 132,78 16,60 16,91S7-G 24,80 24,91 24,85 24,56 25,30 24,16 14,72 25,06 24,75 213,11 23,68S2-B 19,10 18,94 18,59 17,81 17,06 18,22 18,29 16,83 18,04 162,88 18,10 19,32S7-G 24,53 24,63 24,77 24,74 24,41 24,34 24,65 24,33 24,69 221,09 24,57S3-C 19,98 19,28 20,27 18,45 18,61 19,37 19,70 20,40 19,79 175,85 19,54 19,87S7-G 24,89 24,85 24,89 25,65 25,81 24,98 25,00 25,10 24,90 226,07 25,12S4-D 21,26 21,47 20,27 20,59 21,28 20,66 21,39 20,78 20,49 188,19 20,91 20,69S7-G 24,77 24,95 24,92 25,30 24,63 25,05 25,02 24,81 24,49 223,94 24,88S5-E 21,50 21,35 21,01 21,03 21,66 21,15 21,69 21,42 21,73 192,54 21,39 21,41S7-G 24,70 25,19 25,23 24,49 24,31 24,27 24,59 25,02 25,30 223,10 24,79S6-F 24,69 24,16 24,18 23,10 22,49 22,29 22,84 22,94 23,78 210,47 23,39 23,50S7-G 25,19 24,72 24,78 24,97 24,87 24,46 24,42 24,36 24,98 222,75 24,75S8-H 25,60 25,89 25,54 26,30 26,55 26,33 26,24 26,45 25,86 234,76 26,08 26,23S7-G 25,08 24,49 24,83 24,80 24,88 24,75 24,83 25,20 24,59 223,45 24,83S9-I 26,52 26,33 26,19 26,54 25,72 26,95 26,63 26,52 26,62 238,02 26,45 26,52S7-G 25,00 25,20 25,04 24,20 24,66 24,40 25,26 24,32 24,88 222,96 24,77S10-J 28,41 27,57 27,60 26,90 26,79 26,43 26,50 27,24 26,30 243,74 27,08 27,21

24.9024.9DATOS 24

Puntos Diámetro Concentración Log (Conc.) Peso (mg) 17,0(mm) (mg/ml) Potencia (P) UI/mg 75,1

S1 16,91 0,05 -1,3010 Fecha de Vencimiento N.AS2 19,32 0,10 -1,0000 Lote N1E200S3 19,87 0,15 -0,8239 DATOSS4 20,69 0,20 -0,6990 Pendiente 0,1278S5 21,41 0,25 -0,6021 Intercepto -3,1322S6 23,50 0,51 -0,2924 Factor de Dilucion (D) 1250S7 24,66 1,02 0,0086 Promedio General S8 26,23 1,53 0,1847 Concentracion Central 24,90S9 26,52 2,04 0,3096S10 27,21 2,55 0,4065 Pr T (X S3)es mayor que Pr R= Suma

Pr T (X S3)es menor que Pr R= Resta

CURVA ESTANDAR ESTANDAR

BACTRAN 15%LINEALIDAD METODO BACITRACINA

Caja 1 Caja 2 Caja 3

84

• Análisis de la Varianza de la Linealidad Bacitracina Zinc















--------------------------------------------------------------------------------------------



W = 0.9903, p-value = 0.7595


data: values by ind


Si hay normalidad, No hay homogeneidad de varianzas

Kruskal-Wallis rank sum test

data: values by ind

Kruskal-Wallis chi-squared = 86.2592, df = 9, p-value = 9.14e-15

Si hay diferencias significativas entre los tratamientos con zinc (Kruskal-Wallis p< 0.05)

(k=86.25 GL=9 N=90 p<0.05)

85

ANEXO 4. LINEALIDAD DEL MÉTODO BACITRACINA METILEN DISALICILATO

• Regresión lineal de Linealidad del método Bacitracina Metilen Disalicilato generado por el programa Statgraphics Plus for Windows 2.0


-----------------------------------------------------------------------------

Dependent variable: LogCon


-----------------------------------------------------------------------------



S1 18,65 0,05 -1,3010 S2 18,74 0,10 -1,0000 S3 19,19 0,15 -0,8239 S4 20,03 0,20 -0,6990 S5 20,50 0,25 -0,6021 S6 22,66 0,51 -0,2924 S7 23,42 1,02 0,0086 S8 25,09 1,53 0,1847 S9 26,08 2,04 0,3096 S10 26,63 2,55 0,4065

------------------------------------------------------------------------------

Standard T


-----------------------------------------------------------------------------

Intercept -4,52561 0,299245 -15,1234 0,0000

Slope 0,187593 0,0134235 13,9749 0,0000

86


----------------------------------------------------------------------------------------------------


----------------------------------------------------------------------------------------------------

Model 3,02528 1 3,02528 195,30 0,0000

Residual 0,123924 8 0,0154905

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr.) 3,1492 9




The StatAdvisor

---------------


the relationship between LogCon and Diametro. The equation of the

fitted model is

LogCon = -4,52561 + 0,187593*Diametro


statistically significant relationship between LogCon and Diametro at



96,0649% of the variability in LogCon. The correlation coefficient






87

Diámetro (mm)

Log

conc

entra

ción

18 20 22 24 26 28-1,4

-1

-0,6

-0,2

0,2

0,6

LogCon = ‐4,52561 + 0,187593*Diametro

---------------------------------------------------------------------------Plot of the residuals

Diámetro

Log

conc

entra

ción

0 2 4 6 8 10-0,15

-0,1

-0,05

0

0,05

0,1

0,15

-----------------------------------------------------------------------------


Confidence level 95


F table 195.30

88

ACTIVO Bacitracina Metilen Disalicilato

Concentración 11g/100g Lote LO70701

Curva EstándarTotal Promedio Promedio corr

S7-G 23,58 23,66 23,76 22,98 23,80 23,66 24,18 23,50 23,57 212,69 23,63S1-A 17,09 17,91 17,37 17,70 16,91 17,40 17,14 17,80 17,09 156,41 17,38 18,65S7-G 22,80 23,54 23,23 24,03 24,33 24,29 23,63 24,50 23,80 214,15 23,79S2-B 16,99 17,30 17,37 18,42 18,10 18,66 16,61 17,68 16,52 141,04 17,63 18,74S7-G 24,04 23,41 23,35 23,19 23,70 23,58 23,60 23,12 23,22 211,21 23,47S3-C 16,98 18,20 18,42 17,50 17,06 17,94 17,87 18,23 17,58 159,78 17,75 19,19S7-G 23,02 23,51 22,82 23,99 23,64 23,46 23,57 22,66 22,40 209,07 23,23S4-D 18,36 18,82 18,22 19,38 18,37 18,26 17,16 17,90 18,81 165,28 18,36 20,03S7-G 23,10 23,18 24,15 23,41 23,82 24,02 23,44 23,20 23,67 211,99 23,55S5-E 18,73 18,87 19,14 18,77 19,41 19,42 18,73 19,70 19,63 172,40 19,16 20,50S7-G 23,20 20,09 23,01 23,77 23,25 24,43 23,26 23,18 23,33 207,52 23,06S6-F 20,84 20,54 21,90 20,11 20,86 21,04 20,54 20,45 21,07 187,35 20,82 22,66S7-G 23,90 23,32 23,68 22,94 23,24 23,20 23,92 23,75 23,54 211,49 23,50S8-H 24,57 23,53 23,03 23,93 23,95 23,58 23,17 23,72 23,72 213,20 23,69 25,09S7-G 24,80 23,62 23,38 23,31 23,60 23,22 23,58 23,06 23,22 211,79 23,53S9-I 24,13 25,01 25,60 24,21 24,18 24,19 24,68 25,50 24,93 222,43 24,71 26,08S7-G 23,29 23,03 22,86 23,21 23,03 23,05 23,13 23,00 22,60 207,20 23,02S10-J 24,79 25,22 24,80 24,60 25,11 24,04 24,90 24,83 24,52 222,81 24,76 26,63

S7-G 23,42 24.9024.9DATOS 24

Puntos Diámetro Concentración Log (Conc.) Peso (m g) 17,0(mm) (mg/ml) Potencia (P) UI/m g 75,1

S1 18,65 0,05 -1,3010 Fecha de Vencim ientoS2 18,74 0,10 -1,0000 Lote N1E200S3 19,19 0,15 -0,8239 DATOSS4 20,03 0,20 -0,6990 Pendiente 0,1278 Pr T (X S3)es mayor que Pr R= SumaS5 20,50 0,25 -0,6021 Intercepto -3,1322 Pr T (X S3)es menor que Pr R= RestaS6 22,66 0,51 -0,2924 Factor de Dilucion (D) 1250S7 23,42 1,02 0,0086 Prom edio General S8 25,09 1,53 0,1847 Concentracion Central 24,90S9 26,08 2,04 0,3096S10 26,63 2,55 0,4065

CURVA ESTANDAR ESTANDAR

BACTRAN 11%LINEALIDAD METODO BACITRACINA


89

• Análisis de la Varianza de la Linealidad Bacitracina Metilen Disalicilato

















W = 0.9903, p-value = 0.7595


data: values by ind


Si Hay normalidad, Si hay homogeneidad de varianzas

ANOVA

Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F)

ind 9 759.33 84.37 347.35 < 2.2e-16 ***

Residuals 79 19.19 0.24

Signif. codes: 0 '***' 0.001 '**' 0.01 '*' 0.05 '.' 0.1 ' ' 1 1 observation deleted due to missingness

Si hay diferencias significativas entre los tratamientos con metilen (ANOVA de una via p< 0.05)

90

ANEXO 5 ESPECIFICIDAD BACITRACINA ZINC


Concentración 15g / 100g Lote 200711026

ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL M UESTRA 217.2 mg 25 HCl 0,01N 1.0 UI/mL1 50 BPH6 1 50 BPH6

Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corrS3 22,81 22,49 22,82 22,29 23,21 23,05 23,11 23,09 23,06 22,88MUESTRA 23,05 23,36 22,89 22,86 23,1 23,21 22,98 23,01 23,09 23,06 25,08

Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio

S3 23,48 22,99 23,76 23,47 23,11 23,29 22,49 22,99 22,76 23,15PLACEBO --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---

Caja 1 Caja 2 Caja 3 PromedioS3 24,67 24,68 24,28 24,42 24,35 24,21 24,52 24,34 23,84 24,37DILUENTE --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---

MUESTRA PLACEBO DILUENTE Peso (mg) 17,025,08 0,00 0,00 Potencia (P) UI/mg 75,1

Concentración (UI/ml) 1,183 Fecha de vencim iento N.A.Log (Concentración) 0,073 N1E200

217,1 217,16,8 --- --- Pendiente 0,1278

Intercepto -3,13221250

Promedio General Concentracion Central 24,90

RESULTADOM1 MUESTRA 6,8 g / 100gM2 PLACEBO NO PRODUCE HALO

M3 DILUENTE NO PRODUCE HALO Pr T (X S3)es mayor que Pr R= Suma


BACTRAN 15%ESPECIFICIDAD

MUESTRAS DATOS ESTANDAR

Diámetro

Lote Cantidad Muestra (mg) DATOSg Bacitracina /100 g

Factor de Dilución (D)

91

ANEXO 6 ESPECIFICIDAD BACITRACINA METILEN DISALICILATO


Concentración 11g / 100g Lote LO70701

ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL M UESTRA 292 mg 25 HCl 0,01N 1.0 UI/mL1 50 BPH6 1 50 BPH6

Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corrS3 24,13 24,99 24,78 24,63 24,69 25,09 25,20 24,53 24,59 24,74MUESTRA 24,66 24,80 24,84 25,50 24,92 24,52 25,62 24,37 24,74 24,89 25,05

Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio

S3 22,73 23,21 22,91 23,01 23,35 22,38 23,12 22,84 22,17 22,86PLACEBO --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---

Caja 1 Caja 2 Caja 3 PromedioS3 24,67 24,68 24,28 24,42 24,35 24,21 24,52 24,34 23,84 24,37DILUENTE --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---

MUESTRA PLACEBO DILUENTE Peso (mg) 17,025,05 0,00 0,00 Potencia (P) UI/mg 75,1

Concentración (UI/ml) 1,17 Fecha de vencimiento N.A.Log (Concentración) 0,07 N1E200

292,30 292,35,01 --- --- Pendiente 0,1278



RESULTADOM1 MUESTRA 5,0 g / 100gM2 PLACEBO NO PRODUCE HALO

M3 DILUENTE NO PRODUCE HALO Pr T (X S3)es mayor que Pr R= SumaPr T (X S3)es menor que Pr R= Resta

BACTRAN 11%ESPECIFICIDAD


Diámetro

Lote Cantidad Muestra (mg) DATOSg Bacitracina /100 g


92

ANEXO 7. SELECTIVIDAD BACITRACINA ZINC


Concentración 15 g / 100g Lote 200711026

ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL M UESTRA 217.2 mg 25 HCl 0,01N 1.0 UI/mL1 50 BPH6 1 50 BPH6

MuestrasPromedio Promedio corr

S3 22,23 21,94 22,01 23,39 22,91 21,52 22,24 23,84 23,80 22,65ESTANDAR --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---

Promedio

S3 22,06 21,51 22,90 22,27 22,83 22,57 22,63 23,16 23,34 22,59MUESTRA --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---

PromedioS3 23,78 25,14 24,64 24,49 23,93 24,07 24,26 24,13 23,99 24,27PLACEBO --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---

ESTANDAR MUESTRA PLACEBO Peso (mg) 17,00,000 0,000 0,00 Potencia (P) UI/mg 75,1

Concentración (UI/ml) recupe 0,001 0,001 Fecha de vencimiento N.A.Log (Concentración) -3,132 -3,132 N1E200

17,00 217,20 217,201,021 0,004 Pendiente 0,12780,072 0,028 --- Intercepto -3,1322

1250Promedio General Concentracion Central 24,90

M UESTRA DEGRADACIONM1 ESTÁNDAR 99,9M2 MUESTRA 100,0

M3 PLACEBO ---- Pr T (X S3)es mayor que Pr R= Suma


BACTRAN 15%SELECTIVIDAD CONDICION ACIDA





Diámetro

Lote Cantidad Muestra mg DATOSUI reales / mg Porcentaje %


93



ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 217.2 mg 25 HCl 0,01N 1.0 UI/mL1 50 BPH6 1 50 BPH6


S3 22,42 22,62 22,90 22,60 21,83 22,72 21,87 22,86 21,92 22,42ESTANDAR --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---

Promedio

S3 23,42 23,38 21,86 22,82 21,50 21,94 22,70 22,29 22,71 22,51MUESTRA --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---



Concentración (UI/ml) recuperada 0,001 0,001 Fecha de vencimiento N.A.Log (Concentración) -3,132 -3,132 N1E200



MUESTRA DEGRADACION

M1 ESTÁNDAR 99,9 Pr T (X S3)es mayor que Pr R= SumaM2 MUESTRA 100,0 Pr T (X S3)es menor que Pr R= RestaM3 PLACEBO ----

BACTRAN 15%SELECTIVIDAD CONDICION BASICA





Diámetro

Lote Cantidad Muestra mg DATOSUI reales / mg Porcentaje


94





S3 24,11 23,53 23,97 23,50 23,52 23,77 23,67 23,27 23,20 23,62ESTANDAR 22,09 22,96 22,47 22,80 22,49 22,36 22,34 22,30 22,21 22,45 23,73

Promedio

S3 23,98 23,42 23,83 23,43 24,50 24,42 24,17 23,54 24,82 24,01MUESTRA 22,48 22,76 22,32 21,21 21,34 21,44 22,16 22,88 22,32 22,10 22,99



Concentración (UI/ml) recuperada 0,795 0,639 0,001 Fecha de vencimiento N.A.Log (Concentración) -0,099 -0,194 -3,132 N1E200

17,0 217,2 217,21,021 3,680 0,000 Pendiente 0,1278

77,886 24,532 --- Intercepto -3,13221250


MUESTRA DEGRADACION Pr T (X S3)es mayor que Pr R= SumaM1 ESTÁNDAR 22,1 Pr T (X S3)es menor que Pr R= RestaM2 MUESTRA 75,5M3 PLACEBO ---

BACTRAN 15%SELECTIVIDAD CONDICION TERMICA





Diámetro



95





S3 23,01 24,38 23,91 24,06 23,76 23,18 24,25 23,40 23,03 23,66ESTANDAR 23,14 22,92 23,40 23,10 22,83 22,24 22,33 22,27 22,36 22,73 23,97

Promedio

S3 24,14 23,76 24,22 23,26 24,88 23,88 23,94 24,66 24,58 24,15MUESTRA 23,94 23,90 24,84 23,76 23,84 23,84 24,61 23,47 24,32 24,06 24,81



Concentración (UI/ml) recuperada 0,853 1,093 0,001 Fecha de vencimiento N.A.Log (Concentración) -0,069 0,039 -3,132 N1E200

17,40 217,90 217,201,045 6,271 Pendiente 0,1278

81,584 17,432 --- Intercepto -3,13221250


MUESTRA DEGRADACION Pr T (X S3)es mayor que Pr R= SumaM1 ESTÁNDAR 18,4 Pr T (X S3)es menor que Pr R= RestaM2 MUESTRA 82,6M3 PLACEBO ----

BACTRAN 15%SELECTIVIDAD CONDICION ULTRAVIOLETA





Diámetro



96

ANEXO 8. SELECTIVIDAD BACITRACINA METILEN DISALICILATO


Concentración 11 g / 100g Lote LO70701

ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL M UESTRA 292 mg 25 HCl 0,01N 1.0 UI/mL1 50 BPH6 1 50 BPH6


S3 22,23 21,94 22,01 23,39 22,91 21,52 22,24 23,84 23,80 22,65ESTANDAR --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---

Promedio

S3 22,72 21,94 22,64 22,29 22,73 22,58 23,07 21,89 21,86 22,41MUESTRA --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---






M UESTRA DEGRADACIONM1 ESTÁNDAR 99,9M2 MUESTRA 100,0

M3 PLACEBO ---- Pr T (X S3)es mayor que Pr R= Suma


BACTRAN 11%SELECTIVIDAD CONDICION ACIDA





Diámetro



97



ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 292 mg 25 HCl 0,01N 1.0 UI/mL1 50 BPH6 1 50 BPH6


S3 22,42 22,62 22,90 22,60 21,83 22,72 21,87 22,86 21,92 22,42ESTANDAR --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---

Promedio

S3 23,67 22,38 23,03 23,31 22,53 23,28 23,34 22,15 22,52 22,91MUESTRA --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---



Concentración (UI/ml) recuperada 0,001 0,001 Fecha de vencimiento N.ALog (Concentración) -3,132 -3,132 N1E200



MUESTRA DEGRADACIONM1 ESTÁNDAR 99,9 Pr T (X S3)es mayor que Pr R= SumaM2 MUESTRA 100,0 Pr T (X S3)es menor que Pr R= RestaM3 PLACEBO ----

BACTRAN 11%SELECTIVIDAD CONDICION BASICA





Diámetro

Lote Cantidad Muestra mg DATOSUI reales / mg Porcentaje


98





S3 24,11 23,53 23,97 23,50 23,52 23,77 23,67 23,27 23,20 23,62ESTANDAR 22,09 22,96 22,47 22,80 22,49 22,36 22,34 22,30 22,21 22,45 23,73

Promedio

S3 22,58 22,40 22,71 22,66 23,14 22,52 21,70 22,36 21,80 22,43MUESTRA 20,62 21,49 21,45 21,46 20,53 21,12 19,36 20,91 20,30 20,80 23,27




17,0 293,1 293,11,021 2,966 Pendiente 0,1278

77,886 26,963 --- Intercepto -3,13221250



BACTRAN 11%SELECTIVIDAD CONDICION TERMICA





Diámetro



99





S3 23,01 24,38 23,91 24,06 23,76 23,18 24,25 23,40 23,03 23,66ESTANDAR 23,14 22,92 23,40 23,10 22,83 22,24 22,33 22,27 22,36 22,73 23,97

Promedio

S3 23,95 25,30 24,18 23,83 24,93 24,18 24,18 23,44 23,55 24,17MUESTRA 24,10 24,48 24,40 24,41 24,80 24,44 23,83 23,43 23,50 24,15 24,88



Concentración (UI/ml) recuperada 0,853 1,117 Fecha de vencimiento N.A.Log (Concentración) -0,069 0,048 N1E200

17,4 292,5 293,11,0 4,77 Pendiente 0,127882 23 --- Intercepto -3,1322



BACTRAN 11%SELECTIVIDAD CONDICION ULTRAVIOLETA





Diámetro



100

ANEXO 9. PRECISIÓN DEL METODO BACITRACINA ZINC

• PRECISION DE METODO BACITRACINA ZINC

La precisión del método es evaluado con los siguientes datos:

DATOS DEL GRUPO 1 - PRECISION DIA 1 ANALISTA 1

Muestra Concentración (UI/ml) Diámetro (mm) % Recuperación

1 1,0 24.90 107.64

2 1,0 24.85 106.00

3 1,0 24.91 107.73

Media 24.886 107.123 Tendencia central

Desviación Estándar

0.032

0.976

Expresa la variabilidad del método

Coeficiente de variación

0.001 (0.127%)

0.009 (0.911%)

Debe ser inferior al 5%

Desviación estándar de la media

0.096

2.829


IC 95% para la media

(IC= X ± t * s/√n)

IC = 24.886±4.303* 0.032/√3

IC= 107.12± 4.303*0.976/√3

24.80-24.96

104.6-109.5

Limites de confianza de la media

Números de datos 3

Números de datos usados en el calculo

3

Nivel de confianza 95%

Varianza del grupo Diámetro (mm)

Varianza del grupo % Recuperación

0.001

0.95

101


Muestra Concentración (UI/ml) Diámetro (mm) %

Recuperación

1 1,0 24,82 105.12

2 1,0 24.94 108.83

3 1,0 24.90 107.18



0.060

1.857



0.002

(0.241%)

0.017

(1.735%)



0.096

2.829



(IC= X ± t * s/√n)

IC = 24.887±4.303* 0.060/√3

IC = 107.04 ± 4.303 *1.857/√3

24.73-25.03

102.4-111.6


Números de datos 3


3




0.004

3.45

102



1 1,0 24.71 101.79

2 1,0 24.65 99.84

3 1,0 24.77 103.43



0.060

1.797



0.002

(0.243%)

0.018

(1.767%)



0.096

2.829



(IC= X ± t * s/√n)

IC = 24.711±4.303* 0.06/√3

IC = 101.6±4.303 *1.797/√3

24.56-24.86

97.13-106.0


Números de datos 3


3




0.004

3.23

103



1 1,0 24.96 103.32

2 1,0 24.91 106.56

3 1,0 24.91 107.44



0.031

1.410



0.001

(0.124%)

0.013

(1.308%)



0.096

2.829



(IC= X ± t * s/√n)

IC = 24.925±4.303* 1.410/√3

IC = 107.7 ± 4.303 * 1.41/√3

21.42-28.42

104.2-111.2


Números de datos 3


3




0.001

1.99

104

DATOS DEL GRUPO 5 - PRECISIONES ANALISTAS


1 1,0 24.90 107.64

2 1,0 24.85 106.00

3 1,0 24.91 107.73

4 1,0 24,82 105.12

5 1,0 24.94 108.83

6 1,0 24.90 107.18

7 1,0 24.71 101.79

8 1,0 24.65 99.84

9 1,0 24.77 103.43

10 1,0 24.96 103.32

11 1,0 24.91 106.56

12 1,0 24.91 107.44



0.097

2.880



0.004

(0.389%)

0.027

(2.720%)



(IC= X ± t * s/√n)

IC = 24.85±2.201* 0.097/√12

IC= 105.9±2.201* 2.88/√11

24.78-24.91

103.9-107.8


105

# Diámetro % Recuperación Sesgo (b) 1 24,886 107,123 7,123 2 24,887 107,043 7,043 3 24,711 101,692 -1,692 4 24,925 107,772 7,772

Varianza 0,009 8,005 Media 24,852 Ř 105,908 5,062

Desviación estándar 0,096 2,829 4,514 Coeficiente de

variación 0,004 0,027 0,892 % Coeficiente de

variación 0,386 2,671 89,186

t de Student

texp = (100 – Ř) √n / CV%

texp = (100 – 105.908) √4 / 2.671 = 4.423

Para p= 0.05/2 y v= 4 tTablas tiene un valor de 3.182:

X= X ± t S/√n X= X ± t S/√n

X= 24.852± 0.1527 X= 105.908 ± 4.5009

X1= 24.699 X2= 25.004 X1= 101.407 X2= 110.408

Números de datos 12


11



Varianza del grupo

0.009

8.296

Numero de datos totales para el calculo 12

Nivel de confianza (1-α/2) 95.00

Grados de libertad 11

t (table) ( Test T Student) 3.182

106





S3 22,81 22,49 22,82 22,29 23,21 23,05 23,11 23,09 23,06 23,02M1 23,05 23,36 22,89 22,86 23,10 23,21 22,98 23,01 23,09 23,02 24,90

Promedio

S3 23,19 23,06 24,50 24,20 23,31 23,19 23,81 24,00 23,57 23,72M2 23,10 23,04 24,25 23,57 23,63 24,23 23,65 24,09 24,06 23,67 24,85

PromedioS3 23,82 24,58 23,82 23,14 23,74 23,84 23,19 24,46 23,78 23,82M3 23,51 24,17 23,95 23,80 23,60 24,17 23,46 24,27 23,50 23,83 24,91

M1 M2 M3 Peso (mg) 17,024,90 24,85 24,91 Potencia (P) UI/mg 75,1

Concentración (UI/ml) 1,122 1,106 1,124 Fecha de vencimiento N.A.Log (Concentración) 0,050 0,044 0,051 N1E200

0,2171 0,2171 0,21726.461 6366 6470 Pendiente 0,1278



Pr T (X S3)es mayor que Pr R= SumaPr T (X S3)es menor que Pr R= Resta

Factor de Dilución (D)Potencia Promedio 6432% 107,1

Lote Cantidad Muestra (g) DATOSg Bacitracina Zinc /100 g


Diámetro



BACTRAN 15%PRECISION DIA 1 ANALISTA 1


107





S3 23,03 24,01 23,27 23,49 23,31 24,76 23,19 23,59 23,83 23,61M1 23,26 23,20 23,09 23,52 23,80 24,45 23,87 23,08 23,52 23,53 24,82

Promedio

S3 24,36 24,40 23,50 24,77 23,64 24,26 24,05 23,81 23,81 24,21M2 24,50 24,15 24,22 24,71 24,41 24,70 24,15 24,23 23,65 24,25 24,94

PromedioS3 24,15 23,55 24,24 23,33 23,89 24,01 23,75 24,21 24,19 23,92M3 24,40 23,31 23,91 23,00 24,11 24,22 23,88 23,96 24,49 23,92 24,90

M1 M2 M3 Peso (mg) 1724,82 24,94 24,90 Potencia (P) UI/mg 75,1

Concentración (UI/ml) 1,097 1,135 1,121 Fecha de vencimiento N.A.Log (Concentración) 0,040 0,055 0,049 N1E200

0,2172 0,2173 0,21766314 6531 6437 Pendiente 0,1278




Factor de Dilución (D)Potencia Promedio 6.427% 107,0

Lote Cantidad Muestra (g) DATOSg Bacitracina Zinc/100 g


Diámetro





108





S3 25,34 23,98 24,57 25,58 24,65 25,20 24,95 25,30 25,41 24,93M1 24,65 23,83 24,51 24,86 23,63 24,13 25,68 25,24 25,00 24,74 24,71

Promedio

S3 25,53 25,32 25,37 25,63 25,20 25,60 25,89 25,68 24,77 25,39M2 25,52 25,32 25,01 25,25 25,07 24,96 25,24 24,87 24,73 25,14 24,65

PromedioS3 24,53 24,19 24,33 24,66 24,93 24,77 25,10 25,88 25,50 24,88M3 24,33 24,39 25,04 24,54 24,57 24,65 25,52 25,05 24,63 24,75 24,77


Concentración (UI/ml) 1,061 1,042 1,080 Fecha de vencimiento N.ALog (Concentración) 0,026 0,018 0,033 N1E200

0,2171 0,2173 0,21736.109,3 5.996,8 6.212,4 Pendiente 0,1278







Diámetro





109





S3 25,43 24,54 24,54 25,57 25,38 24,89 24,80 25,62 24,89 25,07M1 25,18 24,20 25,42 25,73 25,11 25,63 25,01 25,58 24,35 25,13 24,96

Promedio

S3 24,48 24,74 25,34 24,96 25,12 25,33 24,53 25,28 24,12 24,88M2 24,57 25,61 24,97 24,96 25,47 25,34 24,33 24,67 24,07 24,89 24,91

PromedioS3 25,21 26,11 25,24 25,01 24,56 26,18 25,31 25,57 24,80 25,52M3 24,46 25,66 25,80 25,90 26,13 25,83 25,47 25,28 25,79 25,52 24,91



0,2175 0,2198 0,21776.566 6.400 6.462 Pendiente 0,1278







Diámetro





110

ANEXO 10. PRECISIÓN DE METODO BACITRACINA METILEN DISALICILATO

• PRECISION DE METODO BACITRACINA METILEN DISALICILATO




1 1,0 24.88 106.28

2 1,0 24.87 105.93

3 1,0 24.84 104.90



0.024

0.720



0.001

(0.097%)

0.007

(0.681%)



0.078

2.368



(IC= X ± t * s/√n)

IC = 24.86±4.303* 0.024/√3

IC = 105.7 ± 4.303 * 0.720/√3

24.80-24.91

103.9-107.4


Números de datos 3


3




0.001

0.517

111



1 1,0 24,91 106.90

2 1,0 24,97 109.39

3 1,0 25,00 109.98



0.049

1.638



0.002

(0.194%)

0.015

(1.50%)



0.11

2.368



(IC= X ± t * s/√n)

IC = 24.96±4.303* 0.049/√3

IC = 108.75 ± 4.303*1.638/√3

24.83-25.08

104.6-112.8


Números de datos 3


3




0.002

2.682

112



1 1,0 24.92 107.64

2 1,0 24.93 108.0

3 1,0 24.95 108.20



0.014

0.282



0.001

(0.055%)

0.003

(0.261%)



0.078

2.368



(IC= X ± t * s/√n)

IC = 24.935±4.303* 0.014/√3

IC = 107.9 ± 4.303 * 0.282/√3

24.90-24.96

107.2-108.6


Números de datos 3


3




0.0002

0.080

113



1 1,0 24.73 101.86

2 1,0 24.71 101.10

3 1,0 24.92 107.58



0.115

3.542



0.005

(0.464%)

0.034

(3.421%)



0.078

2.368



(IC= X ± t * s/√n)

IC = 24.78±4.303* 0.115/√3

IC = 103.51 ± 4.303*3.542/√3

24.49-25.06

94.71-112.3


Números de datos 3


3




0.01

12.54

114

DATOS DEL GRUPO 5 - PRECISIONES ANALISTAS


1 1,0 24.88 106.28

2 1,0 24.87 105.93

3 1,0 24.84 104.90

4 1,0 24,91 106.90

5 1,0 24,97 109.39

6 1,0 25,00 109.98

7 1,0 24.92 107.64

8 1,0 24.93 108.0

9 1,0 24.95 108.20

10 1,0 24.73 101.86

11 1,0 24.71 101.10

12 1,0 24.92 107.58



0.089

2.728



0.004

(0.357%)

0.025

(2.561%)



(IC= X ± t * s/√n)

IC = 24.88±2.201* 0.089/√12

IC= 106.48±2.201*2.728/√12

24.82-24.94

104.7-108.2




12




0.008

7.441

115

# Diámetro %

Recuperación Sesgo (b) 1 24,86 105,704 5,704 2 24,96 108,775 8,775 3 24,94 107,947 7,947 4 24,786 103,512 3,512

Varianza 0,006 5,610 Media 24,886 Ř 106,485 6,485

Desviación estándar 0,078 2,369 2,369 Coeficiente de variación 0,003 0,022 0,365

% Coeficiente de variación 0,315 2,224 36,526

t de Student

texp = (100 – Ř) √n / CV%

texp = (100 – 106.485)√4 / 2.224 = 5.83

Para p= 0.05/2 y v= 3 tTablas tiene un valor de 3.182:

X= X ± t S/√n X= X ± t S/√n

X= 24.886 ± 0.1240 X= 106.485 ± 3.769

X1= 24..761 X2= 25.010 X1= 1102.715 X2= 110.254

Numero de datos totales para el calculo 12

Nivel de confianza (1-α/2) 95.00


t (table) ( Test T Student) 3.182

116





S3 24,13 24,99 24,78 24,63 24,69 25,09 25,20 24,53 24,59 24,81M1 24,66 24,80 24,84 25,50 24,92 24,52 25,62 24,37 24,74 24,79 24,88

Promedio

S3 25,13 24,12 24,84 24,94 24,47 24,48 25,36 24,56 25,17 24,87M2 24,30 24,83 24,85 24,80 24,68 24,80 25,12 25,34 25,50 24,84 24,87

PromedioS3 25,10 25,45 25,20 24,75 24,54 25,20 25,62 24,83 24,80 25,05M3 25,20 25,20 25,16 24,71 25,22 24,50 25,04 24,88 25,00 24,99 24,84



0,2923 0,2924 0,29224770 4755 4710 Pendiente 0,1278








% Factor de Dilución (D)105,7

Diámetro

Lote Cantidad Muestra (g) DATOS


4745,0g Bacitracina Metilen Disalicilato /10

Potencia Promedio

117





S3 25,72 25,75 25,33 25,19 25,03 25,11 25,10 25,51 25,51 25,36M1 25,82 25,60 25,27 25,04 25,46 24,54 25,41 25,69 25,49 25,37 24,91

Promedio

S3 24,52 25,23 24,82 25,08 24,99 24,66 24,59 24,49 24,81 24,80M2 24,57 25,55 24,71 24,76 24,90 25,20 24,56 24,45 25,16 24,87 24,97

PromedioS3 24,74 24,89 25,00 25,28 24,70 25,05 24,96 24,84 25,01 24,94M3 24,97 24,80 25,16 25,48 24,85 25,25 25,30 24,08 25,50 25,04 25,00



0,2929 0,2919 0,29274800 4911 4938 Pendiente 0,1278









Diámetro

Lote Cantidad Muestra (g) DATOSg BacitracinaMetilen Disalicilato /100

Potencia Promedio 4.883% 108,8 Factor de Dilución (D)

118





S3 22,14 21,99 21,76 23,05 22,09 22,41 21,54 22,49 23,05 22,28M1 22,67 22,17 21,84 21,93 22,07 23,20 22,76 22,20 21,89 22,30 24,92

PromedioS3 21,83 22,63 23,03 22,91 21,90 21,65 21,97 22,32 22,76 22,33M2 22,67 22,78 22,92 22,39 22,15 22,29 21,14 22,54 22,41 22,37 24,93

PromedioS3 21,58 22,53 21,61 21,37 21,84 23,01 23,08 21,99 21,78 22,26M3 22,96 22,10 21,80 21,33 22,78 23,23 22,56 22,72 22,22 22,31 24,95



0,2922 0,2920 0,29304.833 4.849 4.858 Pendiente 0,1278









Diámetro

Lote Cantidad Muestra (g) DATOSg Bacitracina Metilen Disalicilato/100

Potencia Promedio 4.847% 107,9 Factor de Dilución (D)

119





S3 21,25 23,45 23,20 23,51 23,70 23,30 23,21 23,60 22,48 23,08M1 21,85 22,70 22,17 23,76 23,12 22,20 23,83 23,03 23,52 22,91 24,73

Promedio

S3 23,18 23,26 23,09 22,23 23,89 22,65 22,92 23,67 23,18 23,05M2 22,95 23,52 23,32 22,35 22,20 22,07 22,78 23,12 23,41 22,86 24,71

PromedioS3 23,62 22,70 23,60 22,79 22,59 22,67 22,07 23,08 22,94 22,90M3 22,50 22,93 22,86 22,41 23,55 23,02 23,33 22,57 23,05 22,91 24,92



0,2918 0,2920 0,29194.574 4.539 4.830 Pendiente 0,1278









Diámetro

Lote Cantidad Muestra (g) DATOSg Bacitracina Metilen Disalicilato /10


120

ANEXO11. PRECISION DEL SISTEMA

• PRECISION DEL SISTEMA BACITRACINA


Muestra Concentración (UI/ml) Diámetro (mm) %

Recuperación 1 1.0 24.84 107.79 2 1.0 24.89 109.58 3 1.0 24.76 105.50 4 1.0 24.82 107.44 5 1.0 24.66 102.30 6 1.0 24.77 105.80 7 1.0 24.81 107.10 8 1.0 24.77 105.85 9 1.0 24.83 107.46 10 1.0 24.83 107.55



0.062

1.938



0.003

(0.251%)

0.018

(1.817%)



(IC= X ± t * s/√n)

IC = 24.798±2.262* 0.062/√10

IC = 106.64 ± 2.262 * 1.938/√10

24.75-24.84

105.25-108.02




10




0.004

3.755

121

ANEXO 12. EXACTITUD METODO BACITRACINA ZINC

• EXACTITUD DEL METODO BACITRACINA ZINC

La exactitud del método es evaluado con los siguientes datos:

Concentración Concentración Concentración

L. inferior 80% %

recuperación Teórico 100% %

recuperación L. superior120% %

recuperación

23,766 100,230 24,893 111,790 24,862 92,410

23,878 103,710 24,888 111,660 24,830 91,430 23,231 85,690 24,530 100,450 24,830 91,460

variancia 91.374 42.379 0.311

Homogeneidad de variancias (Test Cochran)

Gexp = S2max / S2

li +S2t +S2

is

Gexp = 91.374/ 91.374+42.379+0.311 = 0.682

Determinación del sesgo o error determinado

# %

recuperacion Sesgo (b) 1 100,230 -0,230 2 103,710 -3,710 3 85,690 14,310 4 111,790 -11,790 5 111,660 -11,660 6 100,450 -0,450 7 92,410 7,590 8 91,430 8,570 9 91,460 8,540

Promedio Ř 98,759 Б 1,241 Desvest 9,246 Media 98,759

CV 0,094 CV% 9,362

Variancia 85.485 e% 1,24

Valor de referencia 100,00

e [%]= (Б / valor de referencia ) * 100

e [%]= (1.241/100)*100= 1.24

122

t de Student

texp = (100 – Ř) √n / CV%

texp = (100 – 98,759) √9 / 9,362 = 0.39

para p= 0.05/2 y v= 8 tiene un valor de 2.306: no hay diferencia significativa entre la

recuperación de la media obtenida y el 100% por lo que la exactitud es conforme.

# halos 1 23,766

2 23,878 3 23,231 4 24,893 5 24,888 6 24,530 7 24,862 8 24,830 9 24,830

Varianza 0,390 Media 24,412

IC 0,408 Desvest 0,625

n 9 CV 0,026

CV% 2,559

Determinación

resultados Criterios de aceptación

Homogeneidad de variancias

P Valor Gexp = 0.682 P >0.005 (no significativo)

Sesgo

e%

1.24 Inferior al 3%

T de Student P Valor texp = 0.39 P > 0.05 ( no significativo)

123

Area

Confidence level (1-�/2) 95.00

Variance 0.390

Mean 24.41

Confidence interval 0.408

Coefficient of variation of repeatability 2.55%

Recovery

Variance 85.485



Degrees of freedom 8

Mean recovery 98.759

Interval confianza(+-) 6.040

124



ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 173.8 mg 25 HCl 0,01N 0,8 UI / mL1 50 BPH6 1 50 BPH6


S3 23,36 24,41 23,29 23,34 23,03 23,23 23,30 23,10 23,24 23,37M1 22,64 23,01 22,53 22,17 22,01 22,26 21,68 21,75 22,04 22,23 23,77

Promedio

S3 23,54 23,34 23,92 23,91 24,00 24,04 23,60 23,35 22,95 23,63M2 23,36 22,88 23,06 22,33 22,40 22,39 22,41 22,17 22,45 22,61 23,88

PromedioS3 23,36 24,64 23,59 24,30 24,08 24,49 24,42 23,66 24,03 24,06M3 21,28 22,97 22,45 22,27 22,86 23,59 21,99 22,69 21,45 22,39 23,23


Concentración (UI/ml) recup 0,804 0,831 0,687 Fecha de vencimiento N.ALog (Concentración) -0,095 -0,081 -0,163 N1E200

174,0 173,8 173,90,802 0,801 0,801 Pendiente 0,1278

100,23 103,71 85,69 Intercepto -3,1322



BACTRAN 15%EXACTITUD AL 80%





Diámetro

Lote Cantidad Muestra mg DATOSUI reales / mg Porcentaje Recuperado%Porcentaje % 96,5 Factor de Dilución (D)

125





S3 23,51 22,20 23,73 23,83 23,73 23,37 23,87 23,27 23,34 23,43M1 22,12 23,36 24,10 23,56 23,82 23,34 23,76 23,45 23,28 23,42 24,89

Promedio

S3 23,34 22,92 23,16 22,96 22,25 23,13 23,19 24,02 24,13 23,23M2 23,33 23,83 22,24 22,92 22,95 23,43 23,23 23,22 23,84 23,22 24,89

PromedioS3 24,31 24,11 23,94 23,57 29,07 23,68 24,43 23,36 23,88 24,48M3 24,50 23,21 24,21 23,62 23,84 24,34 24,39 24,60 24,31 24,11 24,53


Concentración (UI/ml) recup 1,120 1,118 1,006 Fecha de vencimiento N.ALog (Concentración) 0,049 0,048 0,003 N1E200

217,4 217,3 217,41,00 1,00 1,00 Pendiente 0,1278

111,79 111,66 100,45 Intercepto -3,1322








Diámetro


126





S3 23,44 23,60 23,67 23,46 23,53 23,01 23,96 23,88 23,95 23,61M1 23,57 23,63 23,52 23,20 23,23 23,95 23,78 23,67 23,61 23,57 24,86

Promedio

S3 24,26 23,50 24,38 23,27 23,64 23,47 23,38 23,63 23,65 23,69M2 24,13 24,46 24,06 23,61 23,63 23,76 23,70 23,48 23,61 23,83 24,83

PromedioS3 23,44 23,96 23,72 24,38 24,09 23,82 24,19 24,62 24,02 24,03M3 23,93 24,02 23,86 24,21 23,59 23,84 24,50 24,39 23,27 23,96 24,83



260,6 260,9 260,81,20 1,20 1,20 Pendiente 0,1278

92,41 91,43 91,46 Intercepto -3,1322








Diámetro


127

ANEXO 13. EXACTITUD DEL METODO BACITRACINA METILEN DISALICILATO

• EXACTITUD DEL METODO BACITRACINA METILEN DISALICILATO

La exactitud del método es evaluado con los siguientes datos:

Homogeneidad de variancias (Test Cochran)

Gexp = S2max / S2

li +S2t +S2

is

Gexp = 8.012/ 2.537+8.012+0.068 = 0.754

Determinacion del sesgo o error determinado

# % recuperacion Sesgo (b) 1 98,663 1,337 2 95,477 4,523 3 97,071 2,929 4 105,449 5,449 5 105,449 5,449 6 100,547 0,547 7 101,256 1,256 8 101,654 1,654 9 101,745 1,745

Promedio Ř 100,812 Б 2,766 Desvest 3,390 Media 100,812

CV 0,034 CV% 3,363

Variancia 11,492 e% 2,766

Valor de referencia 100,000

e [%]= (Б / valor de referencia ) * 100

e [%]= (2.766/100)*100= 2.76

Concentración Concentración Concentración

L. inferior 80% %

recuperación Teórico 100% %

recuperación L. superior120% %

recuperación

23.54 98.66 24.52 105.44 25.01 101.26 23.43 95.48 24.52 105.44 25.02 101.65 23.49 97.07 24.36 100.54 25.02 101.75

variancia 2.537 8.012 0.068

128

t de Student

texp = (100 – Ř) √n / CV%

texp = (100 – 100.812) √9 / 3.363 = 0.724

Para p= 0.05/2 y v= 8 tiene un valor de 2.306: no hay diferencia significativa entre la

recuperación de la media obtenida y el 100% por lo que la exactitud es conforme.

# halos 1 23,540 2 23,430 3 23,488 4 24,526 5 24,526 6 24,369 7 25,011 8 25,024 9 25,024

Variancia 0,456 Media 24,327

Desvest 0,675 n 9,000

CV 0,028 CV% 2,776

Determinación

resultados Criterios de aceptación

Homogenidad de variancias

P Valor Gexp = 0.754 P >0.005 (no significativo)

Sesgo e% 2.7 Inferior al 3%

T de Student O Valor texp = 0.724 P > 0.05 ( no significativo)

129

Area


Variance 0.479

Mean 24.32


Recovery

Variance 11.49



Degrees of freedom 8

Mean recovery 100.81

130





S3 22,91 23,21 23,62 22,90 23,47 23,11 23,09 23,63 22,80 23,09M1 21,04 22,17 20,92 21,86 21,56 20,29 21,98 21,76 20,63 21,73 23,54

Promedio

S3 23,58 23,97 23,64 24,44 24,15 23,30 23,97 23,43 23,48 23,69M2 21,42 21,33 22,18 23,00 22,50 21,73 22,38 21,74 22,01 22,22 23,43

PromedioS3 23,58 22,94 23,00 23,59 23,64 24,12 23,09 23,01 23,39 23,37M3 22,79 21,67 21,79 24,12 21,09 22,51 20,97 21,80 20,91 21,96 23,49



222,6 222,7 222,80,76 0,76 0,76 Pendiente 0,127898,7 95,5 97,1 Intercepto -3,1322








Diámetro

Lote Cantidad Muestra g DATOSUI reales / mg Porcentaje Recuperado%Porcentaje % 97,1 Factor de Dilución (D)

131





S3 22,62 22,84 23,30 22,84 23,04 23,00 23,75 23,30 23,99 23,40M1 23,06 23,10 23,42 23,19 23,11 22,90 23,39 22,80 23,00 23,02 24,53

Promedio

S3 23,25 22,77 23,60 23,41 22,69 23,78 23,77 23,41 22,61 23,54M2 23,28 23,44 23,52 23,56 22,08 23,69 23,70 22,87 23,39 23,16 24,53

PromedioS3 23,24 23,94 23,86 24,25 23,24 24,07 24,73 24,38 24,29 24,10M3 23,48 23,77 23,13 23,08 24,52 23,69 23,53 24,20 23,52 23,56 24,37


Concentración (UI/ml) recuperada 1,01 1,01 0,96 Fecha de vencimiento N.ALog (Concentración) 0,00 0,00 -0,02 M1E200

278,40 278,40 278,800,95 0,95 0,95 Pendiente 0,1278

105,449 105,449 100,547 Intercepto -3,1322








Diámetro


132





S3 23,63 24,53 23,51 22,65 23,53 23,63 24,04 24,64 24,04 23,80M1 24,05 24,55 23,75 23,88 23,87 24,56 23,62 23,19 23,73 23,91 25,01

Promedio

S3 24,14 23,77 24,40 23,43 23,94 23,38 24,00 24,01 23,85 23,88M2 24,65 23,20 23,44 23,81 23,47 23,07 24,48 23,85 23,71 23,74 25,02

PromedioS3 24,64 23,66 23,09 23,84 23,76 24,41 23,63 23,69 23,41 23,79M3 24,04 23,85 24,01 24,50 23,20 24,49 24,09 23,70 23,37 23,92 25,02



334,4 334,4 334,11,14 1,14 1,14 Pendiente 0,1278

101,26 101,65 101,75 Intercepto -3,1322---



Porcentaje Recuperado%Porcentaje % 101,6 Factor de Dilución (D)

Lote Cantidad Muestra mg DATOSUI reales / mg


Diámetro





133

ANEXO 14. LIMITE DE CUANTIFICACION

• LIMITE DE CUANTIFICACION DEL METODO BACITRACINA ESTANDAR

El método es evaluado con los siguientes datos:

# Concentración

(UI/ml) Diámetro (mm)% recuperación

1 0,02 17,82 669.00

2 0,02 17,55 616.90 3 0,02 17,57 620.60 4 0,02 17,55 617.30 5 0,02 17,15 548.20

6 0,02 17,40 591.30

Varianza 0.050 1572.275



0.223

39.65

Expresa la variabilidad del

método


0.013

(1.272%)

0.065

(6.49%)



0.100

----------

Expresa la variabilidad del

método


(IC= X ± t * s/√n)

IC = 17.51±2.571* 0.233/√6

IC= 610.55± 2.571*39.65/√6

17.26-17.75

568.93-652.16


Números de datos 6

Números de datos utilizados en el calculo

6



134

ACTIVO: BACITRACINA ZINC

LOTE N1E200

ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 17 mg 25 HCl 0,01N 0,02 UI/mL1 50 BPH6 1 100 BPH6

2 50 BPH6


S3 23,27 23,15 24,00 23,41 23,52 23,24 23,42 23,38 24,07 23,50M1 16,63 17,67 16,61 16,34 16,66 16,31 15,66 16,60 15,30 16,42 17,82

Promedio

S3 22,99 23,13 23,33 22,74 23,53 23,65 23,30 22,94 23,23 23,20M2 15,79 16,20 16,83 16,60 15,32 15,02 15,16 15,76 16,00 15,85 17,55

PromedioS3 23,17 24,56 23,36 23,35 23,65 23,83 22,89 23,67 23,70 23,58M3 16,07 16,36 16,71 14,68 15,47 16,65 16,20 17,44 16,62 16,24 17,57



17,400 17,400 17,4000,021 0,021 0,021 Pendiente 0,1278

669,044 616,934 620,576 Intercepto -3,1322---






Diámetro



BACITRACINALIMITE DE CUANTIFICACION


135

ACTIVO: BACITRACINA ZINC

LOTE N1E200

ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 17 mg 25 HCl 0,01N 0,02 UI/mL1 50 BPH6 1 100 BPH6

2 50 BPH6


S3 23,36 22,69 23,36 24,12 23,73 23,77 23,60 23,27 23,52 23,49M1 16,33 15,74 15,80 15,65 15,90 16,00 16,16 16,89 16,81 16,14 17,55

Promedio

S3 23,27 23,45 23,85 23,26 23,17 24,54 23,30 23,27 23,61 23,52M2 15,82 16,07 15,82 16,10 14,83 15,42 15,77 16,40 15,72 15,77 17,15

PromedioS3 23,73 23,70 23,90 23,44 23,69 23,47 24,03 23,65 23,57 23,69M3 15,63 16,36 15,92 16,55 16,16 16,68 16,76 16,01 15,65 16,19 17,40



17,400 17,400 17,4000,021 0,021 0,021 Pendiente 0,1278

617,338 548,248 591,260 Intercepto -3,1322---






Diámetro



BACITRACINALIMITE DE CUANTIFICACION


136

ANEXO 15. LIMITE DE DETECCIÓN ACTIVO Bacitracina Zinc BACITRACINA

Lote M1E200

ESTANDAR MUESTRA 1250 25 HCl 0,01N1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL 1 100 BPH6

1 50 BPH6

0,5 1 1,5 2,5

50 50 50 50 BPH60,005 0,01 0,015 0,025 UI/ml


S3 23,65 24,46 23,70 24,16 23,59 25,17 24,43 23,94 23,30 24,04

0,005 UI/ml --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---

Promedio Promedio corr

S3 23,73 23,67 23,39 24,23 24,53 23,77 22,84 23,39 23,73 23,63

0,01 UI / mL 11,54 11,04 11,74 10,00 11,45 11,05 11,21 11,01 11,70 11,19 12,46

Promedio

S3 23,62 23,62 23,25 23,48 23,70 23,11 23,22 23,66 23,94 23,51

0,015 UI / mL 15,66 15,21 15,14 14,14 14,72 14,44 14,47 13,47 14,18 14,60 15,99

Promedio

S3 23,51 23,41 24,76 23,67 24,05 23,26 23,38 23,64 23,72 23,71

0,025 UI / mL 16,77 17,18 16,69 16,23 16,86 16,56 15,59 15,64 16,30 16,42 17,61

0,005 0,01 0,015 0,025 Peso (mg) 170,0 12,46 15,99 17,61 Potencia (P) UI/mg 75,1

Concentración (UI/ml) recuperación 0,001 0,029 0,082 0,131 Fecha de vencimiento N.ALog (Concentración) -3,1322 -1,540 -1,088 -0,881 N1E200

16,90 16,90 16,90 16,900,005 0,010 0,015 0,025 Pendiente 0,1278

Intercepto -3,1322Promedio General Concentracion Central 24,90

CONCENTRACIÓN RESULTADO

M1 ST 0,005 UI/ml No se detecta halo de inhibición Pr T (X S3)es mayor que Pr R= SumaM2 ST 0.01 UI / Ml Se detecta halo de inhibición Pr T (X S3)es menor que Pr R= RestaM3 ST 0.015UI / mL Se detecta halo de inhibición

M4 ST 0.025UI / mL Se detecta halo de inhibición

UI reales / mg

Diámetro

Lote Cantidad Muestra mg DATOS






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