V JORNADAS DE DIVULGACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN EN … · v jornadas de divulgaciÓn de la...

V JORNADAS DE DIVULGACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN EN

BIOLOGÍA MOLECULAR, CELULAR, GENÉTICA Y BIOTECNOLOGÍA

Córdoba, 27-‐28 marzo 2012Organiza

Departamento de Bioquímica y Biología MolecularUniversidad de Córdoba

Editado por:Juan Jurado Carpio

Víctor Manuel Luque AlmagroÁngel Llamas Azúa

Rosario Blanco Portales

V JORNADAS DE DIVULGACIÓN DE LA

INVESTIGACIÓN EN BIOLOGÍA

MOLECULAR, CELULAR, GENÉTICA Y

BIOTECNOLOGÍA

Córdoba, 2012

Libro de resúmenes

Juan Jurado Carpio Víctor Manuel Luque Almagro

Ángel Llamas Azúa Rosario Blanco Portales

(Editores)

ISBN: 978-‐‑84-‐‑940063-‐‑0-‐‑2 Depósito legal: CO-‐‑287-‐‑2012 Imprime:

Ámbito Gráfico S.L.L. C/ El Nogal, nº 16 local 14006 -‐‑ Córdoba www.ambitografico.com

El papel utilizado para la impresión de este libro es cien por cien libre de cloro y está calificado como papel ecológico

Universidad de Córdoba

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular

Comité Organizador: Emilio Fernández Reyes

Juan Jurado Carpio

Víctor Manuel Luque Almagro

Ángel Llamas Azúa

Rosario Blanco Portales

Secretaría Técnica: Inés Molina Moreno

Susana Plazuelo Lozano

Apoyo informático: Alejandro Chamizo Ampudia

7

ÍNDICE

Programa ............................................................................................... 11

Presentación .......................................................................................... 17

NEUROPROTECCIÓN Y TERAPIA CELULAR EN LA ENFERMEDAD DEPARKINSON. Conferencia Inaugural. José López Barneo ....................................................... 21

METABOLISMO DE UREIDOS EN JUDÍA (PHASEOLUS VULGARIS). Grupo BIO115. Pedro Piedras Montilla. .................................................................................... 23

EL PROYECTO DE SECUENCIACIÓN (FASE DE MUESTREO CROMOSÓMICO) DEL CROMOSOMA 4A DEL TRIGO. Grupo AGR248. Pilar Hernández Molina .......... 29

NATALIZUMAB MODIFICA EL ESTRÉS OXIDATIVO GLOBAL PERIFÉRICO EN PACIENTES CON ESCLEROSIS MÚLTIPLE. Grupo CTS624. Francisco Javier Medina Fernández ............................................................................................ 35

VIVACELL: AVANZANDO EN EL DESARROLLO DE MEDICAMENTOS CANNABINODES. Vivacell Biotechnology España S.L. M. Luz Bellido Cabello de Alba ................................................................................................................... 39

LA REPARACIÓN DEL ADN POR ESCISIÓN DE BASES: PAPEL EN LA PROTECCIÓN DEL GENOMA Y LA REPROGRAMACIÓN DEL EPIGENOMA. Grupo BIO301. Mª Teresa Roldán Arjona ....................................................................................... 41

APROXIMACIONES MOLECULARES PARALA MEJORA BIOTECNOLÓGICA DE PLANTAS DE INTERÉS AGROALIMENTARIO. Grupo BIO278. José Luis Caballero Repullo .............................................................................................................. 47

DIGE: HERRAMIENTA CLAVE EN EL DESCUBRIMIENTO DE NUEVOS MECANISMOS DE CONTROL CELULAR. Investigador egresado. Antonio Romero Ruiz ................................................................................................................... 59

BIOCÁPSULAS DE LEVADURA PARA SU USO EN VINIFICACIÓN. Grupo AGR146. Teresa García Martínez y Nieves López de Lerma Extremera .......................... 65

GENÓMICA FUNCIONAL DE LA ASIMILACION DE NITROGENO Y PRODUCCION DE ENERGIA EN CHLAMYDOMONAS. Grupo BIO128. Aurora Galván Cejudo .. 71

8

CONTRIBUCIONES DEL GRUPO FQM-‐227 EN METABOLÓMICA Y EN EL APROVECHAMIENTO DE RESIDUOS DE LA VID/VINO Y DEL OLIVO/ACEITE. Grupo FQM227. Feliciano Priego Capote ......................................................... 75

IDOLIVE; EMPRESA DE BASE TECNOLÓGICA. Pomología. Diego Barranco Navero .............................................................................................................. 81

PROTEÓMICA PARA EVALUAR EL ESTRÉS AMBIENTAL EN DOÑANA Y SU ENTORNO. Grupo BIO151. José Alhama Carmona ........................................... 85

TRANSCRIPTÓMICA AMBIENTAL: EVALUACIÓN DE LOS EFECTOS BIOLÓGICOS DE LA CONTAMINACIÓN EN ORGANISMOS BIOINDICADORES DE ECOSISTEMAS TERRESTRES (MUS SPRETUS) Y ACUÁTICOS (PROCAMBARUS CLARKII). Grupo BIO187. Nieves Abril Díaz ................................................................................. 89

HOMEOSTASIS DE POTASIO Y SODIO EN LEVADURAS NO CONVENCIONALES. Grupo BIO202. José Ramos Ruiz ....................................................................... 95

LA CORTISTATINA NO ES UN MERO ANÁLOGO NATURAL DE LA SOMATOSTATINA: ESTUDIO ENDOCRINO-‐METABÓLICO DE RATONES DEFICIENTES EN CORTISTATINA. Investigador egresado. Raúl Luque Huertas ........................................................................................................................ 101

BIODEGRADACIÓN DE RESÍDUOS INDUSTRIALES CIANURADOS POR LA BACTERIA ALCALÓFILA Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344. Grupo BIO117. Francisco Castillo Rodríguez ............................................................. 105

METABOLISMO DE CARBONO Y NITRÓGENO EN PROCHLOROCOCCUS. Grupo BIO123. María Agustina Domínguez Martín ................................................... 111

APROXIMACIÓN MOLECULAR AL ESTUDIO E INVESTIGACIÓN TRANSLACIONAL DE ESPECIES FORESTALES: EL CASO DE LA ENCINA (Quercus ilex L.). Grupo AGR164. Jesús Jorrín Novo ............................................................................. 115

EVALUATION OF MICROBIAL BIOPOLYMER PRODUCTION FROM AGROFOOD RESIDUES. Grupo TEP169. Isabel López García .............................................. 123

BIOMEDAL: UNA DECADA DESARROLLANDO Y TRANSFIRIENDO BIOTECNOLOGIA MADE IN SPAIN. Biomedal S.L. Ángel Cebolla Ramírez ....... 129

BASES CELULARES Y MOLECULARES DE LA REGULACIÓN NEUROENDOCRINO-‐METABÓLICA Y SUS DISFUNCIONES EN TUMORES Y CÁNCER. Grupo BIO139 (L1): Raúl Luque Huertas. MARCADORES MOLECULARES DEL TEJIDO ADIPOSO

9

EN LA SALUD Y EN LA ENFERMEDAD. Grupo BIO139 (L-‐2): José Alberto Díaz-‐Ruíz y Rocío Guzmán Ruíz ............................................................................... 137

MODULACIÓN DEL PROTEOMA REDOX TIÓLICO POR REDOXINAS: MECANISMOS E IMPLICACIONES EN EL METABOLISMO DEL HIERRO Y LA FUNCIÓN MITOCONDRIAL. Grupo BIO216. Alicia Padilla Peña ...................... 143

LA GRASA DE LA DIETA MODULA LOS CAMBIOS EN MARCADORES APOPTÓTICOS PRODUCIDOS POR LA RESTRICCIÓN CALÓRICA EN MÚSCULO ESQUELÉTICO DE RATÓN. Grupo BIO276. José Manuel Villalba Montoro ..... 151

MODELOS Y HERRAMIENTAS PARA EL ESTUDIO DE LOS MECANISMOS DE CONTROL METABÓLICO DE LA PUBERTAD Y LA FUNCIÓN REPRODUCTORA. Grupo BIO310. Manuel Tena Sempere ........................................................... 155

EXPERIENCIA INVESTIGADORA PRE-‐ Y POSTDOCTORAL DE UN ANTIGUO ALUMNO DE LA UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA. Investigador egresado. David González Ballester .......................................................................................... 163

RNA-‐SEQ ANALYSIS OF THE TRANS-‐KINGDOM PATHOGEN FUSARIUM OXYSPORUM REVEALS EXTENSIVE TRANSCRIPTIONAL REPROGRAMMING DURING FUNGAL INFECTION OF PLANT AND MAMMALIAN HOSTS. Grupo BIO138. David Turrà ....................................................................................... 167

AUTISM SPECTRUM DISORDERS: BEHAVIORAL RESCUE OF CAENORHABDITIS ELEGANS NEUROLIGIN-‐DEFICIENT MUTANTS BY THE HUMAN NLGN1 GENE. Grupo BIO272. Manuel Ruíz Rubio ................................................................. 171

PROTEOMIC ANALYSIS OF PORCINE INTESTINAL RESPONSES TO SALMONELLA ENTERICA SEROVAR TYPHIMURIUM INFECTION. Grupo AGR231. Juan José Garrido Pavón ................................................................................................. 177

GESTIÓN DE RESIDUOS PELIGROSOS EN LOS LABORATORIOS UNIVERSITARIOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR, CELULAR, GENÉTICA Y BIOTECNOLOGÍA. Servicio de protección ambiental (SEPA). Antonio Gomera Martínez .............................. 185

Listado de pósteres ............................................................................. 191

Índice de autores ................................................................................. 197

11

PROGRAMA

V JORNADAS DE DIVULGACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN EN BIOLOGÍA MOLECULAR, CELULAR,

GENÉTICA Y BIOTECNOLOGÍA

Martes, 27 de marzo de 2012

Sesión Primera

15:30 Entrega de documentación y colocación de pósteres.

15:45 Inauguración y Presentación de las Jornadas. Excmo. y Mgfco. Sr. Rector D. José Manuel Roldán Nogueras.

16:00 Conferencia Inaugural: NEUROPROTECCIÓN Y TERAPIA CELULAR EN LA ENFERMEDAD DE PARKINSON. José López Barneo. Director del Instituto de Biomedicina de Sevilla -‐ IBiS.

17:00 Descanso/sesión de pósteres.

MODERADOR: Juan Muñoz Blanco

17:30 GRUPO BIO115: Biotecnología de plantas superiores y algas verdes. METABOLISMO DE UREIDOS EN JUDÍA (PHASEOLUS VULGARIS). Pedro Piedras Montilla.

17:45 GRUPO AGR248: Biotecnología agroalimentaria. EL PROYECTO DE SECUENCIACIÓN (FASE DE MUESTREO CROMOSÓMICO) DEL CROMOSOMA 4A DEL TRIGO. Pilar Hernández Molina.

18:00 GRUPO CTS624: Neuroplasticidad y estrés oxidativo. NATALIZUMAB MODIFICA EL ESTRÉS OXIDATIVO GLOBAL PERIFÉRICO EN PACIENTES CON ESCLEROSIS MÚLTIPLE. Francisco Javier Medina Fernández.

MODERADORA: Isabel González Roncero

18:15 VIVACELL BIOTECHNOLOGY ESPAÑA S.L. VIVACELL: AVANZANDO EN EL DESARROLLO DE MEDICAMENTOS

12

CANNABINODES. M. Luz Bellido Cabello de Alba. Directora General de Vivacell.

18:35 GRUPO BIO301: Mecanismos moleculares de mutagénesis y reparación de ADN. LA REPARACIÓN DEL ADN POR ESCISIÓN DE BASES: PAPEL EN LA PROTECCIÓN DEL GENOMA Y LA REPROGRAMACIÓN DEL EPIGENOMA. Mª Teresa Roldán Arjona.

18:50 GRUPO BIO278: Biotecnología y farmacognosia vegetal. APROXIMACIONES MOLECULARES PARA LA MEJORA BIOTECNOLÓGICA DE PLANTAS DE INTERES AGROALIMENTARIO. José Luis Caballero Repullo.

19:05 Fin de la sesión.

Miércoles, 28 de marzo de 2012

Sesión Segunda

MODERADOR: José Manuel García Fernández

9:00 Investigador egresado: Antonio Romero Ruiz (incorporado al grupo BIO310). DIGE: HERRAMIENTA CLAVE EN EL DESCUBRIMIENTO DE NUEVOS MECANISMOS DE CONTROL CELULAR.

9:20 GRUPO AGR146: Viticultura y enología. BIOCÁPSULAS DE LEVADURA PARA SU USO EN VINIFICACIÓN. Teresa García Martínez y Mª Nieves López de Lerma Extremera.

9:35 GRUPO BIO128: Biología molecular de la asimilación de nitrato en algas. GENÓMICA FUNCIONAL DE LA ASIMILACION DE NITROGENO Y PRODUCCION DE ENERGIA EN CHLAMYDOMONAS. Aurora Galván Cejudo.

9:50 GRUPO FQM227: Plataformas analíticas en metabolómica/ proteómica y aprovechamiento de residuos agroalimentarios. CONTRIBUCIONES DEL GRUPO FQM-‐227 EN METABOLÓMICA Y EN EL APROVECHAMIENTO DE RESIDUOS DE LA VID/VINO Y DEL OLIVO/ACEITE. Feliciano Priego Capote.

10:05 POMOLOGÍA S.L. IDOLIVE; EMPRESA DE BASE TECNOLÓGICA. Diego Barranco Navero.

13

10:25 Descanso/sesión de pósteres.

MODERADOR: Francisco Castillo Rodríguez

10:50 GRUPO BIO151: Biomarcadores moleculares de contaminación ambiental. PROTEÓMICA PARA EVALUAR EL ESTRÉS AMBIENTAL EN DOÑANA Y SU ENTORNO. José Alhama Carmona.

11:05 GRUPO BIO187: Biología Molecular de los mecanismos de respuesta a estrés. TRANSCRIPTÓMICA AMBIENTAL: EVALUACIÓN DE LOS EFECTOS BIOLÓGICOS DE LA CONTAMINACIÓN EN ORGANISMOS BIOINDICADORES DE ECOSISTEMAS TERRESTRES (MUS SPRETUS) Y ACUÁTICOS (PROCAMBARUS CLARKII). Nieves Abril Díaz

11:20 GRUPO BIO202: Homeostasis de cationes en levaduras. HOMEOSTASIS DE POTASIO Y SODIO EN LEVADURAS NO CONVENCIONALES. José Ramos Ruiz.

11:35 Investigador Egresado: Raúl Luque Huertas (incorporado al grupo BIO139). LA CORTISTATINA NO ES UN MERO ANÁLOGO NATURAL DE LA SOMATOSTATINA: ESTUDIO ENDOCRINO-‐METABÓLICO DE RATONES DEFICIENTES EN CORTISTATINA.

MODERADOR: Juan López Barea

11:55 GRUPO BIO117: Metabolismo del nitrógeno microbiano. BIODEGRADACIÓN DE RESIDUOS INDUSTRIALES CIANURADOS POR LA BACTERIA ALCALÓFILA Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344. Francisco Castillo Rodríguez.

12:10 GRUPO BIO123: Asimilación de nutrientes en Prochlorococcus, cianobacteria clave en ecosistemas marinos. METABOLISMO DE CARBONO Y NITRÓGENO EN PROCHLOROCOCCUS. María Agustina Domínguez Martín

12:25 GRUPO AGR164: Bioquímica y proteómica vegetal y agroforestal. APROXIMACIÓN MOLECULAR AL ESTUDIO E INVESTIGACIÓN TRANSLACIONAL DE ESPECIES FORESTALES: EL CASO DE LA ENCINA (Quercus ilex L.). Jesús Jorrín Novo.

14

12:40 GRUPO TEP169: Biocombustibles y sistemas de ahorro energéticos. EVALUATION OF MICROBIAL BIOPOLYMER PRODUCTION FROM AGROFOOD RESIDUES. Isabel López García.

12:55 BIOMEDAL S.L. BIOMEDAL: UNA DECADA DESARROLLANDO Y TRANSFIRIENDO BIOTECNOLOGIA MADE IN SPAIN. Ángel Cebolla Ramírez.

13:15 Sesión de pósteres. /Fin de la sesión.

Sesión Tercera

MODERADOR: José Antonio Bárcena Ruiz

15:30 GRUPO BIO139: Endocrinología celular y molecular. BASES CELULARES Y MOLECULARES DE LA REGULACIÓN NEUROENDOCRINO-‐METABÓLICA Y SUS DISFUNCIONES EN TUMORES Y CÁNCER. (L-‐1) Raúl Luque Huertas. MARCADORES MOLECULARES DEL TEJIDO ADIPOSO EN LA SALUD Y EN LA ENFERMEDAD. (L-‐2) José Alberto Díaz-‐Ruiz y Rocío Guzmán Ruiz.

15:45 GRUPO BIO216: Sistemas moleculares de defensa frente al estrés oxidativo y proteómica. MODULACIÓN DEL PROTEOMA REDOX TIÓLICO POR REDOXINAS: MECANISMOS E IMPLICACIONES EN EL METABOLISMO DEL HIERRO Y LA FUNCIÓN MITOCONDRIAL. Alicia Padilla Peña.

16:00 GRUPO BIO276: Biomembranas, antioxidantes y estrés oxidativo. LA GRASA DE LA DIETA MODULA LOS CAMBIOS EN MARCADORES APOPTÓTICOS PRODUCIDOS POR LA RESTRICCIÓN CALÓRICA EN MÚSCULO ESQUELÉTICO DE RATÓN. José Manuel Villalba Montoro.

16:15 GRUPO BIO310: Balance energético y función reproductora. MODELOS Y HERRAMIENTAS PARA EL ESTUDIO DE LOS MECANISMOS FISIOLÓGICOS DE CONTROL METABÓLICO DE LA PUBERTAD Y LA FUNCIÓN REPRODUCTORA. Manuel Tena Sempere.

16:30 Investigador Egresado: David González Ballester (incorporado al grupo BIO128). EXPERIENCIA INVESTIGADORA PRE-‐ Y POSTDOCTORAL DE UN ANTIGUO ALUMNO DE LA UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA.

15

17.50 Descanso/sesión de pósteres.

MODERADOR: José Antonio González Reyes

18:15 GRUPO BIO138: Genética molecular de la patogénesis fúngica. RNA-‐SEQ ANALYSIS OF THE TRANS-‐KINGDOM PATHOGEN FUSARIUM OXYSPORUM REVEALS EXTENSIVE TRANSCRIPTIONAL REPROGRAMMING DURING FUNGAL INFECTION OF PLANT AND MAMMALIAN HOSTS. David Turrá.

18:30 GRUPO BIO272: Genética y trastornos del comportamiento. AUTISM SPECTRUM DISORDERS: BEHAVIORAL RESCUE OF CAENORHABDITIS ELEGANS NEUROLIGIN-‐DEFICIENT MUTANTS BY THE HUMAN NLGN1 GEN. Manuel Ruiz Rubio.

18:45 GRUPO AGR231: Genómica y mejora animal. PROTEOMIC ANALYSIS OF PORCINE INTESTINAL RESPONSES TO SALMONELLA ENTERICA SEROVAR TYPHIMURIUM INFECTION. Juan José Garrido Pavón.

19:00 Servicio de protección ambiental (SEPA). Universidad de Córdoba. GESTIÓN DE RESIDUOS PELIGROSOS EN LOS LABORATORIOS UNIVERSITARIOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR, CELULAR, GENÉTICA Y BIOTECNOLOGÍA. Antonio Gomera Martínez.

19:15 Clausura de las Jornadas: D. Justo Pastor Castaño Fuentes. Sr. Vicerrector de Política Científica y Campus de Excelencia Agroalimentaria (ceiA3). Universidad de Córdoba.

17



Presentación de las Jornadas Esta es la quinta ocasión que el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Córdoba ha organizado las ya tradicionales Jornadas de Divulgación de la Investigación en Biología Molecular, Celular, Genética y Biotecnología.

Los investigadores de los grupos de investigación de los Departamentos participantes, Bioquímica y Biología Molecular, Biología Celular, Fisiología e Inmunología, Microbiología, Genética, Botánica, Ecología y Fisiología Vegetal, Química Analítica, y Química Física y Termodinámica Aplicada, se encuentran entre los más activos de la UCO. En el intenso día y medio que sigue, estos grupos presentarán sus líneas de trabajo, objetivos y resultados a estudiantes de Licenciatura y Grado, investigadores, empresas y sociedad. El firme propósito de estas Jornadas es animar y despertar vocaciones entre los jóvenes, fomentar y cristalizar colaboraciones entre los grupos, e iniciar contactos y plasmar ideas con el sector empresarial.

Profesores de los Departamentos mencionados imparten los másteres en Investigación

Biomédica Tran Mención de Calidad y Hacia la Excelencia y que han sido seguidos por un buen número de estudiantes como prolegómeno necesario a su

doctorandos. En esta edición participan tres doctores egresados que han desarrollado exitosamente su actividad postdoctoral en Centros de investigación extranjeros de primer nivel.

Siguiendo los aspectos positivos incorporados en anteriores Jornadas, contamos con tres empresas biotecnológicas, todo unos ejemplos de transferencia de conocimiento, de cómo los investigadores dan el salto del mundo de la investigación académica a la creación y desarrollo de empresas biotecnológicas. Con las explicaciones de su actividad y proyectos futuros se pretende animar a estudiantes de diverso nivel a explorar el mundo de las empresas biotécnológicas como una de las vías de búsqueda de valor añadido a la investigación.

18



El prestigioso Profesor José López Barneo, Director del Instituto de Biomedicina de Sevilla, IBiS, nos honrará con la conferencia inaugural sobre Neuroprotección y Terapia Celular en la Enfermedad de Parkinson, tema en el que es una autoridad mundial.

Agradecemos al profesor López Barneo su desinteresado esfuerzo por asistir a estas Jornadas; al Dr. Ángel Cebolla, Director de Biomedal S.L.. a la Dra. M. Luz Bellido, Directora General de Vivacell Biotechnology España S.L., al Dr. Diego Barranco, Consejero de Pomología S.L., y a D. Antonio Gomera del Servicio de Protección Ambiental de la UCO su generosa disponibilidad. A la Universidad de Córdoba, su Magnifico Sr. Rector y su Vicerrector de política científica, a la OTRI de la UCO, y a la Fundación Torres Gutiérrez su apoyo y Financiación. A cada uno de los investigadores de los grupos de investigación participantes por su respuesta tan positiva, y a los postdoctores egresados invitados por hacernos partícipes de sus trayectorias científicas.

El comité organizador

19



Sesión Primera

20



21



Conferencia Inaugural

NEUROPROTECCIÓN Y TERAPIA CELULAR EN LA ENFERMEDAD DE PARKINSON

José López Barneo

Instituto de Biomedicina de Sevilla, Hospital Universitario Virgen del Rocío/CSIC/Universidad de Sevilla, Sevilla.

La enfermedad de Parkinson (EP) es una patología neurodegenerativa que afecta a más de 2 millones de europeos y a unas 200 mil personas en España. Su origen y patogénesis se desconocen. Una de las zonas del cerebro más afectadas en la EP es la vía nigroestriatal, debido a la muerte de neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra (SN). Este hecho es responsable de los síntomas motores más característicos de la enfermedad (temblor, rigidez de las articulaciones, lentitud de los movimientos, etc). Las terapias farmacológicas que existen actualmente para tratar la EP, aunque beneficiosas en las fases iniciales del proceso, tienen acción solo sintomática y pierden eficacia con los años. Entre las terapias avanzadas que se están investigando en la actualidad una de las más prometedoras se basa en la administración de factores neurotróficos en el estriado (la zona de proyección de las neuronas dopaminérgicas de la SN) con el objeto de frenar o parar el curso de la enfermedad. No obstante, el uso clínico sistemático de estas terapias requiere el desarrollo de un conocimiento básico sólido sobre la localización y acción molecular y celular de los factores neurotróficos más eficaces, así como una investigación traslacional que permita diseñar un sistema eficaz y seguro para la administración intracerebral de los mismos. En nuestro grupo de investigación estudiamos el efecto neuroprotector del factor

22



GDNF (glial cell line-‐derived neurotrophic factor), su localización en el cerebro y la forma de aplicarlo mediante el uso de células que lo sinteticen. Hemos demostrado que la ablación de gen que codifica el GDNF produce en el ratón adulto la muerte de un grupo selectivo de neuronas, particularmente las que se encuentran en la SN. Estos datos indican que el GDNF es absolutamente necesario para el mantenimiento de la vía nigroestriatal. Además hemos identificado un tipo celular localizado en el cuerpo carotídeo del adulto capaz de sintetizar y segregar GDNF. El trasplante intracerebral de estas células produce una notable mejoría del parkinsonismo experimental. Sobre la base de estos resultados, trabajamos actualmente en la generación de un producto celular que pueda ser utilizado en la clínica humana.

23



GRUPO BIO115

BIOTECNOLOGÍA DE PLANTAS SUPERIORES Y ALGAS VERDES

COMPONENTES:

RESPONSABLE: Pineda Priego, Manuel .................. [email protected] Piedras Montilla, Pedro ......................................... [email protected] Muñoz Alamillo, Josefa........................................... [email protected] Gálvez-‐Valdivieso, Gregorio ................................... [email protected] Aguilar Urbano, Miguel [email protected] Quiles Luque, Francisco Antonio ............................. [email protected] Cabello Díaz, Juan Miguel ......................................... [email protected] Díaz Leal, Juan Luis .................................................... [email protected] Lambert Rodríguez, Rocío ........................................ [email protected] Coleto Reyes, Inmaculada ....................................... [email protected] Jurado Ruiz, Luis Pedro ............................................. [email protected]

DEPARTAMENTO E INSTITUCIÓN:

Departamento de Botánica, Ecología y Fisiología Vegetal. Universidad de Córdoba.

LÍNEAS DE INVESTIGACIÓN:

1. Implicaciones biotecnológicas de la síntesis y movilización de ureidos y amidas en leguminosas.

2. Antioxidantes naturales: bioproducción de tocoferoles mediante ingeniería metabólica.

3. Aceite de oliva, parámetros de calidad y control del fraude. 4. Optimización de procesos y desarrollo de nuevos productos en

industrias agroalimentarias.

PUBLICACIONES MÁS RELEVANTES:

Cabello-‐Diaz JM, Quiles FA, Lambert R, Pineda M, Piedras P (2012) Identification of a novel phosphatase with high affinity for nucleotides monophosphate from common bean (Phaseolus vulgaris). Plant Physiol Biochem. 53:54-‐61

24



Muñoz A, Bannenberg GL, Montero O, Cabello-‐Diaz JM, Piedras P, Pineda M (2011) An alternative pathway for ureide usage in legumes: enzymatic formation of a ureidoglycolate adduct in Cicer arietinum and Phaseolus vulgaris. J Exp Bot. 62:307-‐318

Galvez-‐Valdivieso G, Cardeñosa R, Vera JM, Pineda M, Aguilar M (2011) gamma-‐Tocopherol methyltransferase from the green alga Chlamydomonas reinhardtii: functional characterization and expression analysis. Physiol Plant. 143:316-‐328

Alamillo JM, Diaz-‐Leal JL, Sanchez-‐Moran MV, Pineda M (2010) Molecular analysis of ureide accumulation under drought stress in Phaseolus vulgaris L. Plant Cell Environ. 33:1828-‐1837

Quiles FA, Raso MJ, Pineda M, Piedras P (2009) Ureide metabolism during seedling development in French bean (Phaseolus vulgaris). Physiol Plant. 135: 19-‐28

Raso MJ, Muñoz A, Pineda M, Piedras P (2007) Biochemical characterisation of an allantoate degrading enzyme from French bean (Phaseolus vulgaris): the requirement of phenylhydrazine. Planta 226:1333-‐1342

Muñoz A, Raso MJ, Pineda M, Piedras P (2006) Degradation of ureidoglycolate in French bean (Phaseolus vulgaris) is catalysed by a ubiquitous ureidoglycolate urea-‐lyase. Planta 224:175 184

Muñoz A, Piedras P, Aguilar M, Pineda M (2001) Urea is a product of ureidoglycolate degradation in chickpea. Purification and characterization of the ureidoglycolate urea-‐lyase. Plant Physiol. 125:828 834

PONENCIA:

METABOLISMO DE UREIDOS EN JUDÍA (PHASEOLUS VULGARIS).

RESUMEN

El grupo de investigación BIO115 tiene una línea de trabajo establecida en metabolismo de ureidos en organismos fotosintéticos. En los últimos años se ha profundizado en el papel de la fenilhidrazina en las enzimas del metabolismo de ureidos y se ha comprobado que actúa como sustrato en la actividad que cataliza la degradación de ureidoglicolato tanto en judía como en garbanzo, abriendo la puerta la nuevos mecanismos de regulación. Por otro lado, se ha abordado el papel de la actividad nucleotidasa en la síntesis de ureidos en ejes en desarrollo, y se ha purificado y caracterizado esta actividad en ejes en

http://apps.webofknowledge.com/OneClickSearch.do?product=WOS&search_mode=OneClickSearch&colName=WOS&SID=V29mdfl5gpMCGiEHob2&field=AU&value=Galvez-Valdivieso,%20G

http://apps.webofknowledge.com/OneClickSearch.do?product=WOS&search_mode=OneClickSearch&colName=WOS&SID=V29mdfl5gpMCGiEHob2&field=AU&value=Galvez-Valdivieso,%20G

http://apps.webofknowledge.com/OneClickSearch.do?product=WOS&search_mode=OneClickSearch&colName=WOS&SID=V29mdfl5gpMCGiEHob2&field=AU&value=Vera,%20JM

25



desarrollo de judía. Además, en plantas adultas, se ha demostrado que la acumulación de ureidos observada en condiciones de estrés hídrico es independiente de la fijación de nitrógeno así como que la actividad alantoinasa podría ser la enzima clave en la regulación de síntesis de ureidos durante la ontogenía de judía. Estos hitos suponen un gran avance en el conocimiento del metabolismo de ureidos en plantas superiores.

INTRODUCCIÓN

La judía común, Phaseolus vulgaris, es una de las leguminosas más cultivadas del mundo. La judía es capaz de conseguir la mayor parte del nitrógeno que necesita para su crecimiento gracias a la simbiosis con bacterias fijadoras de nitrógeno. Este proceso tiene un gran interés agronómico y ecológico, puesto que el nitrógeno es, junto con el agua, el nutriente más limitante del crecimiento vegetal y, por tanto, de la producción de los cultivos.

El nitrógeno fijado y asimilado en los nódulos radicales se puede transportar hasta las partes aéreas como amidas (glutamina y fundamentalmente asparragina) o como ureidos (alantoína y alantoato), lo que permite distinguir entre plantas amídicas (guisante, trebol, ...) y ureídicas (soja, judía,...), respectivamente. Los ureidos son compuestos orgánicos ricos en nitrógeno con una relación N:C de 1:1, lo que los convierte en moléculas ideales de transporte, suministrando nitrógeno con un gasto mínimo de carbono reducido. En condiciones de fijación de nitrógeno, los ureidos pueden constituir hasta el 95% del nitrógeno transportado desde los nódulos hasta las partes aéreas en las leguminosas ureídicas. En los nódulos de las leguminosas ureídicas, el nitrógeno fijado por las bacterias se utiliza para la síntesis de purinas, que a través de una serie de reacciones enzimáticas se oxidan hasta alantoína y alantoato. Los ureidos sintetizados en los nódulos se transportan a las partes aéreas donde deben ser degradados para que su nitrógeno pueda ser reasimilado. La síntesis de novo de purinas es la ruta principal de síntesis de ureidos en nódulos. Sin embargo, las purinas implicadas en la síntesis de ureidos pueden proceder también del reciclaje de ácidos nucleicos (Zrenner et al., 2006). En la actualidad se conoce poco sobre las enzimas implicadas en este metabolismo.

El interés en el metabolismo de ureidos ha aumentado en los últimos años debido a las numerosas publicaciones en las que se ha indicado que la degradación de ureidos en las partes aéreas de la planta puede influir en la actividad fijadora de nitrógeno en condiciones de déficit hídrico y a las nuevas funciones de estos metabolitos en otros procesos. La fijación de nitrógeno es

26



un proceso extremadamente sensible al déficit hídrico. Se ha propuesto que los ureidos se acumulan en condiciones de sequía y que esa acumulación es una de las causas que producen dicha inhibición (King y Purcell, 2005).

OBJETIVOS

Los objetivos parciales llevados a cabo por el grupo en esta línea de investigación en los últimos años han sido:

-‐ Estudio del metabolismo de los ureidos durante la germinación de judía.

-‐ Identificación de la actividad fosfatasa implicada en la síntesis de ureidos en ejes en desarrollo.

-‐ Determinación del papel de la fenilhidrazina en la ruta de degradación de ureidos en judía.

-‐ Papel de los ureidos en la tolerancia a la sequía de plantas de judía.

RESULTADOS

-‐ Estudio del metabolismo de los ureidos durante la germinación de judía. Se ha observado que semillas secas de judía acumulaban ureidos. Estos ureidos se mantuvieron constantes durante la germinación, pero aumentaron en ejes y cotiledones tras la emergencia radicular. Las actividades que catalizan la degradación de alantoína y alantoato se detectaron en semillas secas e incrementaron en los ejes embrionarios de judía tras la germinación. Los ejes de judía tienen capacidad de sintetizar ureidos, puesto que estos compuestos se acumularon en ejes desprovistos de cotiledones.

-‐ Identificación de la actividad fosfatasa implicada en la síntesis de ureidos en ejes en desarrollo. El primer paso en la conversión de purinas a ureidos es la eliminación del grupo 5-‐fosfato catalizada por una fosfatasa. En ejes embrionarios de judía se detectaron dos fosfatasas mayoritarias que usaban inosina monofosfato como sustrato. Una de éstas fue insensible al inhibidor común de fosfatasas, molibdato, y además fue la primera en inducirse tras la emergencia radicular. Esta enzima se ha purificado hasta homogeneidad electroforética y entre los distintos sustratos fosforilados ensayados mostró mayor actividad frente a nucleótidos. Además, la enzima mostró inhibición por nucleósidos, los productos de la reacción enzimática con nucleótidos como sustratos. Las características de la enzima purificada sugieren que podría ser la fosfatasa implicada en la síntesis de ureidos en ejes embrionarios de judía.

27



-‐ Determinación del papel de la fenilhidrazina en la ruta de degradación de ureidos en judía. Las actividades ureidoglicolasas purificadas a partir de garbanzo y judía así como la enzima que cataliza la degradación de alantoato de judía dependían de la presencia de fenilhidrazina en el ensayo (Muñoz et al., 2001; Muñoz et al., 2006; Raso et al., 2007). Se ha demostrado que el producto de la reacción catalizada por las ureidoglicolasas purificadas a partir de garbanzo y judía no producen directamente glioxilato y que la fenilhidrazina es un sustrato para las mismas. El producto de la reacción sería ureidoglicolil-‐fenilhidrazida, el cual se degrada no enzimáticamente dando lugar a fenilhidrazona del glioxilato y urea. Este avance, junto con el requerimiento de fenilhidrazina por la actividad que cataliza la degradación de alantoato en judía (Raso et al., 2007), sugiere que la ruta de degradación de ureidos puede presentar diferencias entre Arabidopsis y leguminosas.

-‐ Metabolismo de ureidos en plantas de judía sometidas a déficit hídrico. Se ha realizado una aproximación molecular para caracterizar la acumulación de ureidos en plantas de judía sometidas a déficit hídrico. Hemos observado que las plantas de judía sometidas a déficit hídrico acumulaban ureidos, principalmente alantoato, en raíces, tallos y hojas, pero sólo transitoriamente en nódulos. Esta acumulación se regula a nivel transcripcional principalmente a través de la inducción de la expresión del gen que codifica la alantoinasa mientras que el gen que codifica la enzima implicada en la degradación de alantoato se reprimió ligeramente. También se ha observado que el incremento en los niveles de ureidos en judía sometidas a déficit hídrico fue similar en plantas no noduladas y noduladas. Estos resultados indican que la acumulación de ureidos en respuesta al déficit hídrico es independiente de la síntesis de novo de ureidos en nódulos y, por tanto, desacoplada del proceso de fijación de nitrógeno.

AGRADECIMIENTOS

Financiado por los proyectos AGL2009-‐11290 (Ministerio de Ciencia e Innovación), P06-‐CVI-‐01761 (Consejería de Innovación, Ciencia y Empresa de la Junta de Andalucía), P07-‐RNM-‐03307 (Consejería de Innovación, Ciencia y Empresa de la Junta de Andalucía) y Grupo BIO115 (Junta de Andalucía).

REFERENCIAS

King CA, Purcell LC (2005) Inhibition of N2 fixation in soybean is associated with elevated ureides and amino acids. Plant Physiol. 137:1389 1396

28



Muñoz A, Piedras P, Aguilar M, Pineda M (2001) Urea is a product of ureidoglycolate degradation in chickpea. Purification and characterization of the ureidoglycolate urea-‐lyase. Plant Physiol. 125:828 834

Muñoz A, Raso MJ, Pineda M, Piedras P (2006) Degradation of ureidoglycolate in French bean (Phaseolus vulgaris) is catalysed by a ubiquitous ureidoglycolate urea-‐lyase. Planta 224:175 184

Raso MJ, Muñoz A, Pineda M, Piedras P (2007) Biochemical characterisation of an allantoate degrading enzyme from French bean (Phaseolus vulgaris): the requirement of phenylhydrazine. Planta 226:1333-‐1342

Zrenner R, Stitt M, Sonnewald U, Boldt R (2006) Pyrimidine and purine biosynthesis and degradation in plants. Annu Rev Plant Biol 57: 805-‐836.

29



GRUPO AGR248

BIOTECNOLOGÍA AGROALIMENTARIA

COMPONENTES

RESPONSABLE: Dorado Pérez, Gabriel1 ................ [email protected] Hernández Molina, Pilar2 ............................... [email protected] Díaz González, David3 ...................................... [email protected] Pérez Jiménez, Margarita2 ...................................... [email protected] Esteban Risueño, Francisco José4 ............................ [email protected] Caballero Molina, Juan Antonio5 ........................... [email protected]

COLABORADORES EN LA PONENCIA PRESENTADA:

Sergio Gálvez3, Mihaela Martis6, Matthias Pfeifer6, Sebastian Schaaf6, Nicolás Jouve7, Hana Simkova8, Miroslav Valarik8, Jaroslav Dolezel8, Klaus FX Mayer6

DEPARTAMENTO E INSTITUCIÓN 1Dpto. de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Córdoba. 2Dpto. de Mejora Genética Vegetal, Instituto de Agricultura Sostenible (IAS), Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC). 3Dpto. Lenguajes y Ciencias de la Computación, Universidad de Málaga. 4Servicio de Informática. Universidad de Córdoba. 5Dpto. de Estadística. Universidad de Córdoba. 6Dpto. Institute for Bioinformatics and Systems Biology, Helmholtz Center Munich (Alemania) 7Dpto. de Biología Celular y Genética, Universidad de Alcalá. 8Dpto. Centre of the Haná Region for Biotechnological and Agricultural Research, Institute of Experimental Botany (República Checa).

LÍNEAS DE INVESTIGACIÓN 1. Genómica vegetal. 2. Biotecnología agroalimentaria.

30



3. Desarrollo de herramientas bioinformáticas. 4. Desarrollo de herramientas genómicas.


Díaz D, Esteban FJ, Hernández P, Caballero JA, Dorado G, Gálvez S (2011): Parallelizing and optimizing a bioinformatics pairwise sequence alignment algorithm for many-‐core architecture. Parallel Computing -‐ Systems & Applications 37: 244-‐259.

Díaz D, Gálvez S, Falgueras J, Caballero JA, Hernández P, Claros G, Dorado G (2009): Intuitive bioinformatics for genomics applications: Omega-‐Brigid workflow framework. Lecture Notes in Computer Science (IWANN 2009) 5518: 1084-‐1091.

Gálvez S, Díaz D, Hernández P, Esteban FJ, Caballero JA, Dorado G (2010): Next-‐generation bioinformatics: using many-‐core processor architecture to develop a web service for sequence alignment. Bioinformatics 26: 683-‐686.

Hernández P, Martis M, Dorado G, Pfeifer M, Gálvez S, Schaaf S, Jouve N, Simkova H, Valarik M, Dolezel J, Mayer KFX (2012): Next-‐generation sequencing and syntenic integration of flow-‐sorted arms of wheat chromosome 4A exposes the chromosome structure and gene content. The Plant Journal 69: 377-‐386.

PONENCIA:

EL PROYECTO DE SECUENCIACIÓN (FASE DE MUESTREO CROMOSÓMICO) DEL CROMOSOMA 4A DEL TRIGO

RESUMEN

Durante años, el avance en la genómica de trigo ha estado limitado por el gran tamaño y complejidad de su genoma. Afortunadamente, los recientes avances tecnológicos han permitido abordar la secuenciación de este genoma, que se está llevando a cabo por un consorcio internacional. En la fase actual del proyecto, la utilización de tecnologías de secuenciación masiva de nueva generación y la utilización de genomas modelo ya secuenciados (braquipodio, arroz y sorgo) está permitiendo revelar el espacio génico sinténico de este genoma.

INTRODUCCIÓN

31



La secuenciación del genoma del trigo se está llevando a cabo por el Consorcio Internacional para la Secuenciación del Trigo (IWGSC; 'International Wheat Genome Sequencing Consortium' <http://www.wheatgenome.org>), en el que participan 28 países. España participa en la secuenciación del cromosoma 4A, en colaboración con La República Checa y Alemania. Con sus 17.000 millones de bases, el genoma del trigo es uno de los más grandes y complejos de las plantas cultivadas. Se trata de un genoma hexaploide (generado de forma natural al cruzarse sucesivamente hasta tres especies distintas), con un tamaño casi seis veces mayor que el genoma humano. Por ejemplo, sólo el cromosoma 4A duplica en tamaño al genoma del arroz. La secuenciación de este genoma se ha podido abordar ya que es posible separar sus 21 cromosomas mediante citometría de flujo. Esta separación se realiza en un laboratorio de la República Checa, y desde allí se envían las muestras de los distintos cromosomas a los países participantes (en España participa nuestro grupo de investigación). La secuenciación del genoma del trigo se está llevando a cabo en varias fases: la realización de un mapa físico, la secuenciación para el muestreo cromosómico, y finalmente la secuenciación de referencia.

OBJETIVOS

El objetivo final del consorcio IWGSC es obtener la secuenciación de referencia del genoma de la variedad de trigo harinero 'Chinese Spring'. Dicho objetivo se ha estructurado en distintos proyectos y se realiza simultáneamente a la secuenciación de genomas diploides y a la resecuenciación (Figura 1). La fase actual (muestreo cromosómico) se apoya en la información disponible de otros genomas modelo de cereales, cuya secuencia es conocida.

RESULTADOS

Concretamente, para el muestreo ('survey sequencing') del cromosoma 4A en el que participa el grupo PAIDI AGR-‐258, se han empleado tecnologías de secuenciación de segunda generación, también lla

-‐genomas disponibles del arroz, sorgo y braquipodio, mediante la integración sinténica. Para ello se ha adaptado al trigo una herramienta bioinformática (GenomeZipper) previamente desarrollada para la cebada (Mayer et al. 2011; Hernández et al. 2012).

Esta integración multidisciplinar de herramientas, que implica la citometría de flujo para el aislamiento del cromosoma, la secuenciación masiva NGS y el análisis bioinformático GenomeZipper, han permitido mostrar la estructura del cromosoma 4A del trigo, con un catálogo que incluye más del 85% de los

32



genes de dicho cromosoma, correspondientes a su espacio génico sinténico (Hernández et al. 2012).

Figura 1. Estado actual de los proyectos del consorcio IWGSC, actualizado al 22 de febrero de 2012 <http://www.wheatgenome.org/Projects>.

Por otra parte, se ha colaborado con el equipo australiano del IWGSC, que ha realizado el muestreo cromosómico del grupo cromosómico 7 (7A, 7B y 7D), para analizar la traslocación cromosómica 4AL-‐7BS a resolución génica (Berkman et al. 2012).

El muestreo cromosómico del cromosoma 4A del trigo nos ha permitido la localización 'in silico' de más de 1.000 marcadores moleculares de p -‐

más relevantes para la selección asistida y mejora del trigo.

En definitiva, el avance en la secuenciación y análisis del cromosoma 4A del trigo ha permitido avanzar en el conocimiento de la estructura y contenido génico de este cromosoma, así como generar herramientas para facilitar y acelerar los programas de mejora convencional de este cultivo.

REFERENCIAS

Berkman P, Skarshewski A, Manoli S, Lorenc M, Stiller J, Smits L, Lai K, Campbell E, Kubalakova M, Simkova H, Batley J, Dolezel J, Hernández P, Edwards D (2012) Sequencing wheat chromosome arm 7BS delimits the 7BS/4AL translocation and reveals homoeologous gene conservation. Theoretical and Applied Genetics: 124: 423-‐432.

33



Hernández P, Martis M, Dorado G, Pfeifer M, Gálvez S, Schaaf S, Jouve N, Simkova H, Valarik M, Dolezel J, Mayer KFX (2012) Next-‐generation sequencing and syntenic integration of flow-‐sorted arms of wheat chromosome 4A exposes the chromosome structure and gene content. The Plant Journal 69: 377-‐386.

Paux E, Faure S, Choulet F, Roger D, Gauthier V, Martinant J-‐P, Sourdille P, Balfourier F, LePaslier M-‐C, Chauveau A, Cakir M, Gandon B, Feuillet C (2010) Insertion site-‐based polymorphism markers open new perspectives for genome saturation and marker-‐assisted selection in wheat. Plant Biotechnology Journal 8: 196-‐210.

AGRADECIMIENTOS:

La participación española en el proyecto genoma del trigo está financiada por los proyectos BIO2009-‐07443, AGL2010-‐17316 y BIO2011-‐15237.

34



35



GRUPO CTS624

NEUROPLASTICIDAD Y ESTRÉS OXIDATIVO

COMPONENTES:

RESPONSABLE: Túnez Fiñana, Isaac .......................... [email protected] Luque Carabot, Evelio............................................. [email protected] Gascón Luna, Félix ................ [email protected] Sánchez López, Fernando ........................ [email protected] Agüera Morales, Eduardo............................... [email protected] Medina Fernández, Francisco Javier ................. [email protected] Ruiz Villén, María Concepción .............. [email protected] Salcedo Espinosa, Manuel ......................... [email protected]


Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Medicina, Instituto Maimónides de Investigación Biomédica de Córdoba (IMIBIC)/Universidad de Córdoba.

Departamento de Ciencias Morfológicas, Sección de Histología, Facultad de Medicina, IMIBIC/Universidad de Córdoba.

Servicio de Neurología, IMIBIC/Hospital Universitario Reina Sofía de Córdoba.

Servicio de Análisis Clínicos, IMIBIC/Hospital Comarcal Valle de los Pedroches.

Servicio de Anestesiología, IMIBIC/Hospital Universitario Reina Sofía de Córdoba.


1. Modelos experimentales y clínicos de enfermedades neuro-‐ degenerativas y psiquiátricas.

2. Estimulación magnética transcraneal y neuromodulación. 3. Neuroplasticidad y estrés oxidativo.

36




Tasset I, Agüera E, Sánchez-‐López F, Feijóo M, Giraldo AI, Cruz AH, Gascón F, Túnez I (2012) Peripheral oxidative stress in relapsing-‐remitting multiple sclerosis. Clin Biochem. (en prensa).

Tasset I, Sánchez-‐López F, Agüera E, Fernández-‐Bolaños R, Sánchez FM, Cruz-‐Guerrero A, Gascón-‐Luna F, Túnez I (2012) NGF and nitrosative stress in patients with Huntington's disease. J Neurol Sci. (en prensa)

Tasset I, Agüera E, Olmo-‐Camacho R, Escribano B, Sánchez-‐López F, Delgado MJ, Cruz AH, Gascón F, Luque E, Peña J, Jimena IM, Túnez I (2011) Melatonin improves 3-‐nitropropionic acid induced behavioral alterations and neurotrophic factors levels. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 35:1944-‐1949.

Tasset I, Pontes AJ, Hinojosa AJ, de la Torre R, Túnez I (2011) Olive oil reduces oxidative damage in a 3-‐nitropropionic acid-‐induced Huntington's disease-‐like rat model. Nutr Neurosci. 14:106-‐111.

Túnez I, Sánchez-‐López F, Agüera E, Fernández-‐Bolaños R, Sánchez FM, Tasset-‐Cuevas I (2011) Important role of oxidative stress biomarkers in Huntington's disease. J Med Chem. 54:5602-‐5560.

Gonzalez-‐Aparicio R, Flores JA, Tasset I, Tunez I, Fernandez-‐Espejo E (2011) Mice lacking the peroxisome proliferator-‐activated receptor gene present reduced number of dopamine neurons in the substantia nigra without altering motor behavior or dopamine neuron decline over life. Neuroscience. 186:161-‐169.

Medina FJ, Túnez I (2010) Huntington's disease: the value of transcranial meganetic stimulation. Curr Med Chem. 17:2482-‐2491.

Tasset I, Drucker-‐Colín R, Peña J, Jimena I, Montilla P, Medina FJ, Túnez I (2010) Antioxidant-‐like effects and protective action of transcranial magnetic stimulation in depression caused by olfactory bulbectomy. Neurochem Res. 35:1182-‐1187.

Túnez I, Tasset I, Pérez-‐De La Cruz V, Santamaría A (2010) 3-‐Nitropropionic acid as a tool to study the mechanisms involved in Huntington's disease: past, present and future. Molecules. 15:878-‐916.

PONENCIA:

NATALIZUMAB MODIFICA EL ESTRÉS OXIDATIVO GLOBAL PERIFÉRICO EN PACIENTES CON ESCLEROSIS MÚLTIPLE

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22330938



























37



RESUMEN

INTRODUCCIÓN

La esclerosis múltiple (EM) es la enfermedad neurológica no traumática más frecuente en adultos jóvenes, con mayor incidencia en mujeres que en varones. Este proceso se caracteriza por daño al sistema nervioso central (SNC) caracterizado por inflamación, daño oxidativo y desmielinización.

Diferentes son las estrategias terapéuticas utilizadas, siendo la más efectiva actualmente la que involucra el tratamiento con natalizumab1.

Natalizmab (Tysabri, Biogen Idec, Inc. y Elan Pharmaceuticals, Inc.) es un anticuerpo monoclonal dirigido contra alfa-‐4-‐beta-‐1-‐integrinas, que juegan un papel destacado en la transmigración de las células inmunes a través de la barrera hemato-‐encefálica (BHE)2.

OBJETIVOS

En base a lo expuesto, fue diseñado el presente estudio para evaluar el efecto de este fármaco sobre el estrés oxidativo periférico en pacientes con EM recurrente-‐remitente (EMRR).

RESULTADOS

El tratamiento con natalizumab causó un descenso en los niveles de GOS, junto aún incremento en la ratio SOD/GPx.

Tabla.-‐ Efectos de natalizumab sobre los niveles de daño oxidativo en pacientes con EMRR en situación basal y tras 14 meses (EMRR-‐14) de tratamiento.

cP< 0.05 vs basal.

CONCLUSIONES

Basal

(n=13)

EMRR-14

(n=9)

GOS 0.77 (0.4) 0.57 (0.28)c

GSH/GSSG ratio 16.80 (9.5) 12.28 (5.6)

SOD/GPx 12.68 (1.7) 17.15 (2.1)c

38



Estos datos sugieren que natalizumab reduce los biomarcadores de daño oxidativo en plasma.

REFERENCIAS

1. Gold R, Wolinsky JS (2011) Pathophysiology of multiple sclerosis and the place of teriflunomide. Acta Neurol Scand. 124:75-‐84.

2. Giovannoni G, Southam E, Waubant E (2012) Systematic review of disease-‐modifying therapies to assess unmet needs in multiple sclerosis: tolerability and adherence. Mult Scler. (en prensa).

39



Ponencias empresas

VIVACELL BIOTECHNOLOGY ESPAÑA S.L.

EQUIPO EJECUTIVO:

CEO: Bellido Cabello de Alba, M. Luz .. [email protected] CSO: González Granja, Aitor ................ [email protected] CFO: Mellado Miranda, Joaquín ............. [email protected]


Vivacell Biotechnology España S.L. es una empresa de biotecnología orientada al desarrollo preclínico de fármacos de origen natural, principalmente de plantas. Nuestros programas de investigación están centrados en la búsqueda de principios activos para el tratamiento y/o prevención de procesos inflamatorios crónicos y degenerativos.


Taglialatela-‐Scafati O. et al. (2012). STAT-‐3 Inhibitory Bisabolanes from Carthamus glaucus. J. Nat. Prod.

Fiebich BL, et al. (2011). Pseudoephedrine inhibits T-‐cell activation by targeting NF-‐ -‐1 signaling pathways. Immunopharmacol Immunotoxicol. Jun 2.

Fiebich BL, et al. (2011). Molecular Targets of the Antiinflammatory

COX-‐2 Gene Expression by Preventing Activation of AP-‐1. Phytother Res. Nov 10.

M. Pérez A. et al. (2010). Bryostatin-‐1 synergizes with histone deacetylase inhibitors to reactivate HIV-‐1 from latency. Current HIV Research, Sep 1;8(6):418-‐29.

40



PONENCIA:

VIVACELL: AVANZANDO EN EL DESARROLLO DE MEDICAMENTOS CANNABINODES

RESUMEN

El uso de la planta Cannabis Sativa se remonta a miles de años de antigüedad y hoy día su potencial terapéutico es indudable. Sin embargo, muchas de sus actividades terapéuticas están asociadas al mismo principio activo que induce los efectos psicotrópicos del Cannabis, el 9 -‐tetrahidrocannabinol (9 -‐THC), por lo que su aplicación médica está limitada por el psicotropismo. Sin embargo está planta contiene más de 400 fitocannabinoides no psicotrópicos con muy alto potencial terapéutico y actualmente no existe ninguna duda de que muchas de las propiedades medicinales de la planta Cannabis se deben a la presencia de estos fitocannabinoides entre los que destacan el Cannabigerol (CBG) y el Cannabidiol (CBD) y sobre los que VivaCell ha desarrollado y patentado sus dos principales moléculas de interés terapéutico, el VCE-‐003 y el VCE-‐004. Además, VivaCell también ha patentado un fitoextracto, el CDE-‐001, obtenido a partir de una variedad de Cannabis sativa L. llamada CARMA propiedad de VivaCell. Estos compuestos están siendo actualmente desarrollados para el tratamiento de enfermedades neuroinflamatorias y dermatológicas.

41



GRUPO BIO301

MECANISMOS MOLECULARES DE MUTAGÉNESIS Y REPARACIÓN DE ADN

COMPONENTES:

RESPONSABLE: Rodríguez Ariza, Rafael ................... [email protected] Roldán Arjona, Mª Teresa ...................................... [email protected] Córdoba Cañero, Dolores ....................................... [email protected] García-‐Ortiz, Mª Victoria ....................................... [email protected] Martínez-‐Macías, Mª Isabel ............................... [email protected] Morales Ruiz, Teresa ............................................ [email protected] Parrilla Doblas, Jara Teresa .................................... [email protected] Ponferrada Marín, Mª Isabel ............................... [email protected] Ramiro Merina, Ángel ........................................... [email protected]


Departamento de Genética, Universidad de Córdoba. Instituto Maimónides de Investigación Biomédica de Córdoba (IMIBIC).


1. Identificar y caracterizar mecanismos de reparación de ADN y su papel en el proceso de mutagénesis.

2. Analizar el papel de la reparación por escisión de bases en fenómenos de control epigenético.

3. Aplicabilidad de las desmetilasas de ADN en reprogramación epigenética


Martinez-‐Macias, M.I., Qian, W., Miki, D., Pontes, O., Liu, Y., Tang, K., Liu, R., Morales-‐Ruiz, T., Ariza, R.R., Roldan-‐Arjona, T., et al. (2012). A DNA 3' phosphatase functions in active DNA demethylation in Arabidopsis. Mol Cell. 45:357-‐370.

42



Ponferrada-‐Marin, M.I., Parrilla-‐Doblas, J.T., Roldan-‐Arjona, T., and Ariza, R.R. (2011). A discontinuous DNA glycosylase domain in a family of enzymes that excise 5-‐methylcytosine. Nucleic Acids Res. 39: 1473-‐1484.

Cordoba-‐Cañero, D., Roldan-‐Arjona, T., and Ariza, R.R. (2011). Arabidopsis ARP endonuclease functions in a branched base excision DNA repair pathway completed by LIG1. Plant J. 68: 693-‐702.

Ponferrada-‐Marin, M.I., Martinez-‐Macias, M.I., Morales-‐Ruiz, T., Roldan-‐Arjona, T., and Ariza, R.R. (2010). Methylation-‐independent DNA binding modulates specificity of repressor of silencing 1 (ROS1) and facilitates demethylation in long substrates. J Biol Chem. 285: 23032-‐23039.

Córdoba-‐Cañero, D., Dubois, E., Ariza, R.R., Doutriaux, M.P., and Roldan-‐Arjona, T. (2010). Arabidopsis uracil DNA glycosylase (UNG) is required for base excision repair of uracil and increases plant sensitivity to 5-‐fluorouracil. J Biol Chem. 285: 7475-‐7483.

Córdoba-‐Cañero, D., Morales-‐Ruiz, T., Roldán-‐Arjona, T., and Ariza, R.R. (2009). Single-‐nucleotide and long-‐patch base excision repair of DNA damage in plants. Plant J. 60: 716-‐728.

Ponferrada-‐Marin, M.I., Roldan-‐Arjona, T., and Ariza, R.R. (2009). ROS1 5-‐methylcytosine DNA glycosylase is a slow-‐turnover catalyst that initiates DNA demethylation in a distributive fashion. Nucleic Acids Res. 37:4264-‐4274.

PONENCIA:

LA REPARACIÓN DEL ADN POR ESCISIÓN DE BASES: PAPEL EN LA PROTECCIÓN DEL GENOMA Y LA REPROGRAMACIÓN DEL EPIGENOMA

RESUMEN

INTRODUCCIÓN

Uno de los mecanismos de reparación de ADN más importantes es la ruta de Reparación por Escisión de bases (Base Excision Repair, BER), bien caracterizada en modelos animales y microbianos, pero muy poco conocida en plantas. La ruta BER consta de varias etapas y se inicia por la acción de enzimas denominadas ADN glicosilasas que eliminan bases dañadas. La reparación se completa con enzimas adicionales que restauran la estructural original del ADN. Durante nuestro estudio de la ruta BER en la planta modelo Arabidopsis thaliana, hemos identificado ADN glicosilasas que eliminan lesiones frecuentes en el ADN. Sin embargo, también hemos descubierto ADN glicosilasas que actúan sobre 5-‐meticitosina (5-‐meC), una marca epigenética

43



que suprime la expresión génica y desempeña un papel clave en el desarrollo y la diferenciación celular. Estas enzimas inician una ruta de escisión para borrar la metilación del ADN y no tienen equivalentes en células animales. Nuestros resultados demuestran que las plantas usan la ruta de escisión de bases para proteger su genoma y reprogramar su epigenoma.

OBJETIVOS

Diseccionar la ruta de reparación por escisión de bases en plantas. Caracterizar una familia de desmetilasas que eliminan del ADN una marca epigenética

Usar las desmetilasas de plantas para reprogramar el epigenoma de células humanas.

RESULTADOS

La ruta de reparación por escisión de bases en plantas

Hemos desarrollado un sistema de reparación in vitro para identificar las enzimas que participan en la reparación por escisión de bases en plantas (Córdoba-‐Cañero et al., 2009). Para nuestro análisis inicial hemos elegido como lesión modelo el uracilo, que surge en el ADN por desaminación espontánea de la citosina y genera mutaciones. En primer lugar hemos identificado la ADN glicosilasa (AtUNG) que elimina el uracilo del ADN en la planta (Córdoba-‐Cañero et al., 2010). Hemos purificado la proteína recombinante y hemos identificado una línea mutante de Arabidopsis portadora de una inserción de T-‐DNA en el gen AtUNG. Las plantas mutantes son morfológicamente normales, pero han perdido la capacidad de reparar uracilo y lo acumulan en su ADN (Córdoba-‐Cañero et al., 2010). Además de AtUNG, hemos identificado y caracterizado una segunda enzima (AtMBD4) con actividad reparadora de uracilo, y cuya relevancia estamos estudiando.

Por otra parte hemos demostrado que, tras la escisión del uracilo, el sitio abásico resultante es procesado por la endonucleasa ARP (Cordoba-‐Cañero et al., 2011). Las plantas mutantes en el gen ARP son incapaces de completar la reparación de uracilo, y son sensibles a su derivado 5-‐fluoruracilo (Cordoba-‐Cañero et al., 2011). Además, hemos descubierto que la ADN ligasa I es la enzima encargada de finalizar el proceso de reparación (Cordoba-‐Cañero et al., 2011).

ADN glicosilasas que borran una marca epigenética

Una de las modificaciones más frecuentes en los genomas de animales y plantas es la metilación del carbono 5 de la citosina para generar 5-‐

44



metilcitosina (5-‐meC). La 5-‐meC es una marca epigenética reversible que promueve el silenciamiento génico y desempeña un papel importante en el control de la diferenciación y la proliferación celular. El trabajo llevado a cabo por nuestro grupo y por otros laboratorios en Arabidopsis ha llevado a la identificación de 5-‐meC DNA glicosilasas de la familia ROS1/DME, y ha establecido que las células vegetales usan la ruta de reparación por escisión de bases para borrar la metilación del ADN (Gong et al., 2002; Morales-‐Ruiz et al., 2006; Ortega-‐Galisteo et al., 2008).

Para profundizar en el estudio de la desmetilación activa del DNA, nuestro grupo ha elegido a ROS1 como prototipo de 5-‐meC DNA glicosilasa. Mediante el análisis bioquímico de su actividad enzimática hemos demostrado es una enzima muy poco procesiva (Ponferrada-‐Marin et al., 2009) y que se une de forma no específica al ADN mediante su extremo amino-‐terminal, lo que facilita la escisión de 5-‐meC en moléculas largas (Ponferrada-‐Marin et al., 2010). El alineamiento con proteínas de estructura conocida nos ha permitido generar un modelo tridimensional de ROS1 y sus homólogos, y descubrir que poseen un dominio catalítico discontinuo sin precedentes en otras DNA glicosilasas. Hemos usado este modelo para identificar aminoácidos implicados en el reconocimiento específico de la 5-‐meC y su escisión (Ponferrada-‐Marin et al., 2011).

Tras la escisión, las proteínas de la familia ROS1/DME rompen el sitio abásico resultante, generando en la cadena de ADN un hueco flanqueado por extremos 3´-‐P y 5´-‐P (Figura 3). Recientemente hemos demostrado que la ADN fosfatasa ZDP actúa a continuación de ROS1, eliminando el grupo 3´-‐P y permitiendo que una ADN polimerasa inserte una citosina no metilada (Martinez-‐Macias et al., 2012). Los mutantes en el gen ZDP son incapaces de completar la desmetilación in vitro, y sufren una hipermetilación en cientos de loci distribuidos por su genoma (Martinez-‐Macias et al., 2012).

Un sistema para la desmetilación del ADN en células humanas

La información disponible sobre los mecanismos de desmetilación en células animales es muy limitada. Nuestro conocimiento cada vez más detallado sobre las 5-‐meC DNA glicosilasas de plantas plantea la posibilidad de utilizarlas como desmetilasas para revertir el estado de metilación de secuencias diana en células animales. Esta reversión puede tener utilidad en al menos dos aplicaciones concretas: (A) contrarrestar la hipermetilación aberrante de genes supresores de tumor característica de células cancerosas), y (B) superar el obstáculo de una desmetilación insuficiente durante la reprogramación nuclear para generar células pluripotentes. En la actualidad, nuestro grupo está expresando en células normales y tumorales distintas versiones de

45



desmetilasas de Arabidopsis, y nos disponemos a analizar su efecto sobre el metiloma humano.

REFERENCIAS

Córdoba-‐Cañero, D., Dubois, E., Ariza, R.R., Doutriaux, M.P., and Roldan-‐Arjona, T. (2010). Arabidopsis uracil DNA glycosylase (UNG) is required for base excision repair of uracil and increases plant sensitivity to 5-‐fluorouracil. J Biol Chem. 285: 7475-‐7483.

Córdoba-‐Cañero, D., Morales-‐Ruiz, T., Roldán-‐Arjona, T., and Ariza, R.R. (2009). Single-‐nucleotide and long-‐patch base excision repair of DNA damage in plants. Plant J. 60: 716-‐728.

Cordoba-‐Cañero, D., Roldan-‐Arjona, T., and Ariza, R.R. (2011). Arabidopsis ARP endonuclease functions in a branched base excision DNA repair pathway completed by LIG1. Plant J. 68: 693-‐702.

Gong, Z., Morales-‐Ruiz, T., Ariza, R.R., Roldan-‐Arjona, T., David, L., and Zhu, J.K. (2002). ROS1, a repressor of transcriptional gene silencing in Arabidopsis, encodes a DNA glycosylase/lyase. Cell 111: 803-‐814.

Martinez-‐Macias, M.I., Qian, W., Miki, D., Pontes, O., Liu, Y., Tang, K., Liu, R., Morales-‐Ruiz, T., Ariza, R.R., Roldan-‐Arjona, T., et al. (2012). A DNA 3' phosphatase functions in active DNA demethylation in Arabidopsis. Mol Cell. 45:357-‐370.

Morales-‐Ruiz, T., Ortega-‐Galisteo, A.P., Ponferrada-‐Marin, M.I., Martinez-‐Macias, M.I., Ariza, R.R., and Roldan-‐Arjona, T. (2006). DEMETER and REPRESSOR OF SILENCING 1 encode 5-‐methylcytosine DNA glycosylases. Proc Natl Acad Sci USA. 103: 6853-‐6858.

Ortega-‐Galisteo, A.P., Morales-‐Ruiz, T., Ariza, R.R., and Roldan-‐Arjona, T. (2008). Arabidopsis DEMETER-‐LIKE proteins DML2 and DML3 are required for appropriate distribution of DNA methylation marks. Plant Mol Biol. 67: 671-‐681.

Ponferrada-‐Marin, M.I., Martinez-‐Macias, M.I., Morales-‐Ruiz, T., Roldan-‐Arjona, T., and Ariza, R.R. (2010). Methylation-‐independent DNA binding modulates specificity of repressor of silencing 1 (ROS1) and facilitates demethylation in long substrates. J Biol Chem. 285: 23032-‐23039.

Ponferrada-‐Marin, M.I., Parrilla-‐Doblas, J.T., Roldan-‐Arjona, T., and Ariza, R.R. (2011). A discontinuous DNA glycosylase domain in a family of enzymes that excise 5-‐methylcytosine. Nucleic Acids Res. 39: 1473-‐1484.

46



Ponferrada-‐Marin, M.I., Roldan-‐Arjona, T., and Ariza, R.R. (2009). ROS1 5-‐methylcytosine DNA glycosylase is a slow-‐turnover catalyst that initiates DNA demethylation in a distributive fashion. Nucleic Acids Res. 37:4264-‐4274.

47



GRUPO BIO278

BIOTECNOLOGIA Y FARMACOGNOSIA VEGETAL

COMPONENTES:

RESPONSABLE: Muñoz Blanco, Juan, .......................... [email protected]

Caballero Repullo, José Luis, .................................... [email protected] Rodriguez Franco, Antonio, ..................................... [email protected] Moyano Cañete, Enriqueta, .................................. [email protected] Blanco Portales, Rosario, ......................................... [email protected] Amil Ruiz, Francisco, ........................................... [email protected] Medina Puche, Laura, ............................................ [email protected] Molina Hidalgo, Francisco Javier, ........................... [email protected] Garrido, José, ........................................................... [email protected] García Caparrós, Nicolás,[email protected] Mérida Cerro, Juan Antonio, .................................. [email protected] Cañete Gómez , Carlos, .............................. [email protected]


Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Campus de Excelencia Internacional Agroalimentario (CEIA3). Universidad de Córdoba.


1. Biotecnología molecular de la calidad y saludabilidad de frutos de fresa (Fragaria x ananassa),

2. Biotecnología de la resistencia de plantas de fresa (Fragaria x ananassa) a patógenos fúngicos y bacterianos.

3. Bioproducción y validación de compuestos biológicos eco-‐compatibles inductores de los mecanismos de defensa de las plantas

4. Aproximaciones biotecnológicas a la resistencia del olivo (Olea europea) a la verticilosis (Verticillium dahliae).


48



Cumplido-‐Laso G, Medina-‐Puche L, Moyano E, Hoffmann T, Sinz Q, Ring L, Studart-‐Wittowsky C, Caballero JL, Muñoz Blanco J, Blanco-‐Portales R. (2012) The fruit ripening related gene FaAAT2 encodes an acyl transferase involved in strawberry aroma biogenesis. Journal of Experimental Botany (accepted for publication).

Amil-‐Ruiz F, Blanco-‐Portales R, Muñoz-‐Blanco J, Caballero JL (2011) The Strawberry Plant Defence Mechanism: A Molecular Review. Plant & Cell Physiology. 52: 1873-‐1903.

Bombarely A, Merchante C, Csukasi C, Cruz-‐Rus E, Caballero JL, Medina-‐Escobar N, Blanco-‐Portales R, Botella MA, Muñoz-‐Blanco J, Sánchez-‐Sevilla JF, Valpuesta V (2010) Generation and analysis of ESTs from strawberry (Fragaria x ananassa) fruits and evaluation of their utility in genetic and molecular studies. BMC Genomics. 11,503

Miguel A. Quesada, Rosario Blanco-‐Portales, Sara Posé, Juan A.García-‐Gago, Silvia Jiménez-‐Bermúdez, Andrés Muñoz-‐Serrano, Jose L. Caballero, Fernando Pliego, José A. Mercado, Juan Muñoz-‐Blanco (2009) Antisense downregulation of FaPG1 gene reveals an unexpected crucial role for polygalacturonase in strawberry fruit softening. Plant Physiology. 150, 1002-‐1003.

Encinas-‐Villarejo, S., Maldonado, A.M., Amíl-‐Ruíz, F., de los Santos, B., Romero, F., Pliego-‐Alfaro, F., Muñoz-‐Blanco, J., Caballero, J.L. (2009) Evidence for a positive regulatory role of strawberry (Fragaria x ananassa) FaWRKY1 and Arabidopsis AtWRKY75 proteins in resistance. Journal of Experimental Botany. 60: 3043-‐3065.

Markus Griesser, Thomas Hoffmann, Mari Luz Bellido, Carlo Rosati, Barbara Fink, Robert Kurtzer, Asaph Aharoni, Juan Muñoz-‐Blanco and Wilfried Schwab. (2008) Redirection of flavonoid biosynthesis through the downregulation of an anthocyanidin glucosyltransferase in ripening strawberry (Fragaria x ananassa) fruit. Plant Physiology. 146: 1528-‐1539.

Thomas Raab, Juan Antonio López-‐Ráez , Dorothee Klein, José Luis Caballero, Enriqueta Moyano, Wilfried Schwab, Juan Muñoz-‐Blanco (2006) FaQR, a gene required for the biosynthesis of the strawberry flavor compound 4-‐hydroxy-‐2,5-‐dimethyl-‐3(2H)-‐furanone, encodes an enone oxidoreductase. The Plant Cell.18: 1023-‐1037.

Casado-‐Díaz A, Encinas Villarejo S, de los Santos , Schiliro E, Yubero-‐Serrano E.M, Amil-‐Ruiz F, Pocovi MI, Pliego-‐Alfaro F, Dorado G, Rey M, Romero F, Muñoz-‐Blanco J, Caballero J.L. (2006) Analisis of strawberry genes differentially expressed in response to Colletotrichum infection. Physiologia Plantarum.128: 633-‐651.

49



Benítez Y. Botella MA. Trapero A, Aslalimiya M, Caballero JL. Dorado G, Muñoz-‐Blanco .(2005). Molecular analysis of the interaction between Olea europaea and he biotrophic fungus Spilocaea oleagina Molecular Plant Pathology. 6: 425-‐438.

PONENCIA:

APROXIMACIONES MOLECULARES PARA LA MEJORA BIOTECNOLÓGICA DE PLANTAS DE INTERÉS AGROALIMENTARIO.

RESUMEN

INTRODUCCIÓN

La fresa, dada su importancia agronómica, se ha propuesto recientemente como sistema de planta modelo para el desarrollo de tecnología molecular y estudios de genómica básica aplicada entre las Rosaceas (Mezzetti 2009). De hecho, la fresa es única entre las Rosaceas, ya que posee un tamaño pequeño de genoma (~240 Mb, x=7) y, actualmente, se dispone de un sistema robusto y fácil de transformación y regeneración in vitro. Además, desde febrero del año 2011 se dispone de la secuencia completa del genoma de la fresa silvestre (F. vesca, la especie diploide), gracias a la labor investigadora de un consorcio internacional liderado por el Dr. Kevin M. Folta (Shulaev et al., 2011. First published online 26 December 2010; doi:10.1038/ng.740).

Desde el punto de vista molecular y aplicado, además de nuestro grupo (BIO-‐278), actualmente existen numerosos programas y proyectos internacionales que están generando una gran variedad de publicaciones científicas de calidad y están encaminados a la caracterización de genes de fresa relacionados con el color (Griesser et al., 2008b) (Griesser et al., 2008a) (Muñoz et al., 2010), sabor y aroma (Aharoni et al., 2004) (Aharoni et al., 2000) (Beekwilder et al., 2004) (Raab et al., 2006), procesos de maduración y reblandecimiento del fruto (Jiménez-‐Bermúdez et al., 2002) (Benitez-‐Burraco et al., 2003) (Santiago-‐Domenech et al., 2008) (Quesada et al., 2009) (Osorio et al., 2008) o el contenido de compuestos saludables (Agius, 2003). La finalidad es la de obtener información molecular adecuada para el diseño de estrategias biotecnológicas útiles en el mejoramiento de dichos procesos en la planta. En este sentido, es claro que se está realizando un gran esfuerzo internacional

roteómicos y metabolómicos, que pueden servir de base para la selección de genes candidatos, potencialmente relacionados con las mencionadas características de calidad de frutos, para su posterior caracterización funcional y evaluación

50



de su potencial biotecnológico (Aharoni and O'Connell, 2002) (Bianco et al., 2009) (Fait et al., 2008).

Sin embargo, aunque las bases moleculares de estos procesos del fruto de fresa están siendo objeto de estudios de genómica funcional con cierta amplitud internacional, sorprendente las bases moleculares de la resistencia de la planta de fresa a sus patógenos y los mecanismos y rutas de señalización molecular implicados en los procesos de defensa de esta planta a estrés biótico y abiótico apenas se han abordado a este nivel. A pesar del aislamiento de algunos genes de fresa relacionados con la defensa a patógenos (Khan et al., 1999) (Wu et al., 2001) (Khan et al., 2003) (Wu and Bradford, 2003) (Khan and Shih, 2004) (Mehli et al., 2004), existen muy pocos estudios moleculares sobre la funcionalidad de los mismos, ecepto los de nuestro grupo (Amil-‐Ruiz et al. 2011). Más aún, considerando que en la fresa cultivada (Fragaria x ananassa), hasta ahora, no se han descrito cultivares totalmente resistentes a determinados patógenos (como por ejemplo Colletotrichum spp., que causan importantes pérdidas de producción e incluso son consideradas en Europa como organismos de cuarentena (Directiva EC 77/93, Real Decreto 2071/1993) (Bosshard, 1997) (Denoyes and Baudry, 1995) (Denoyes-‐Rothan et al., 2003) (Freeman and Rodriguez, 1995), es lamentable que este área de gran interés científico y de enorme importancia agronómica permanezca aún pobremente explorada (Amil-‐Ruiz et al. 2011) .

En este sentido, en la actualidad, la única información molecular y la más relevante en relación con el mecanismo de defensa de la fresa, es la publicada por nuestro grupo y relacionada con el proceso de interacción fresa (Fragaria x ananassa. Duch)/patógeno fúngico (Colletotrichum acutatum) (Casado-‐Diaz et al., 2006) (Mercado et al., 2007) (Encinas-‐Villarejo et al., 2009) (Amil-‐Ruiz et al., 2011) (Amil-‐Ruiz et al., 2012). Nuestro grupo, lleva varios años estudiando a nivel molecular este sistema fresa/Colletotrichum, como sistema modelo, con la intención de dilucidar y caracterizar los genes y mecanismos moleculares relacionados con la defensa de la planta de fresa a éste y otros importantes patógenos de fresa.

OBJETIVOS

Identificar, en fresa, cuáles son los componentes moleculares asociados a las rutas de señalización de defensa conocidas en otras plantas, SA y JA, y cuales de éstos son clave en la defensa frente a C. acutatum. Conocer la función biológica de los genes de fresa previamente identificados, FaWRKY1 y FaNPR3.1, asociados a la via de SA, y comenzar la caracterización de otros genes parálogos FaNPRs de fresa, por su potencial biotecnológico aplicado.

51



RESULTADOS

Hemos obtenido perfiles de expresión globales (transcriptómica) mediante el

laboratorio, correspondientes a 12.000 ESTs unigenes seleccionados en respuesta a C. acutatum, a partir de 2 cultivares de interés para Andalucía con diferente grado de susceptibilidad al patógeno. Así, hemos generado datos moleculares que nos han permitido identificar numerosos genes de fresa con homología a genes asociados a rutas conocidas de señalización de defensa (SAR y JA) en plantas modelo, como A. thaliana, y que se ven alterados en su expresión tras la infección de la planta con C. acutatum.

Nuestros estudios transcriptómicos y los análisis computacionales posteriores de agrupamientos mediante programas como el Gene Ontology (GO) o el FATIGO-‐Singular Enrichment Analysis (SEA), (Al-‐Shahrour et al. 2004) nos han permitido identificar procesos biológicos qué están significativamente sobrerepresentados en la póblación (Figura 1). Así, los estudios preliminares muestran un enriquecimiento de los genes inducidos asociados a rutas de SA, sugiriendo que es esta ruta y no la de JA, la que se activa en fresa en primera respuesta a la interacción con el patógeno (C. acutatum) (Francisco Amil-‐Ruiz, Tesis; Francisco Amil-‐Ruiz et al. en prensa).

Pese a todo, un análisis más profundo revela que ambas rutas SA y JA son activadas por el patógeno, si bien esta respuesta de defensa no impide el crecimiento del mismo, de naturaleza hemibiotrófica, capaz de desarrollarse, finalmente, en los cultivares de fresa analizados. Esto parece indicar que la activación de la ruta de SA no es evento suficiente para generar resistencia a C. acutatum en fresa, al menos en estos cultivares, bien porque todos los genes que se conocen asociados a esta ruta de SA en otras plantas no son activados en los mismos, o porque es necesario la activación de genes de otras

52



rutas de defensa, como la de JA.

Figura 1. FATIGO-‐Singular Enrichment Analysis (SEA)

En este sentido, es muy interesante el hecho de que C. acutatum utiliza una doble estrategia de infección, que incluye una fase subcellular hemibiotrófica y una fase subcuticular necrotrófica (Wharton and Diéguez-‐Uribeondo, 2004). Se considera que las rutas de señalización de defensa que involucran compuestos como jasmonato (JA) y etileno (ET) son, principalmente, efectivas frente a patógenos necrotróficos, insectos e infecciones por heridas, mientras aquellas que involucran ácido salicílico (SA) son más efectivas frente a patógenos biotróficos (Kunkel and Brooks, 2002). Para tratar de desentrañar estos mecanismos de defensa en fresa, hemos seleccionado un pequeño grupo de los genes que hemos identificado, por su marcado carácter aplicado, y hemos comenzado la caracterización previa molecular, espacial y funcional de algunos de ellos, como los genes FAWRKY1 y el FANPR31, FaNPR32, FaNPR33, FaNPR5, FaEDR1 and FaEDS1, que son componentes importantes en la ruta de señalización de SA en otras plantas, como Arabidopsis, así como otros como los genes FaWRKY33, FaGLN1, FaCHI4-‐2 and FaPR10-‐4, (Figura 2).

Actualmente tenemos información molecular más detallada sobre el gen FaWRKY1, uno de los genes candidatos previamente seleccionado por su

semejanza con factores de transcripción tipo WRKY (descritos en la literatura como reguladores de importancia de genes de defensa), si bien aún desconocemos su función real en fresa. FaWRKY1 codifica un factor de transcripción del tipo IIc de la familia WRKY de factores de transcription en plantas (Eulgem et al., 2000; Zhang and Wang, 2005) y su

expresión aumenta en fresa tras la infección con C. acutatum, el tratamiento con elicitores de defensa, como SA, MeJA y ABA, y las heridas. En un intento

53



para caracterizar con precisión su función biológica, hemos utilizado la expresión ectópica de este gen de fresa en A. thaliana y la complementación de mutantes de A. thaliana en el gen ortólogo AtWRKY75. Esto nos ha llevado a contactar con el grupo dirigido por el Dr. Imre E. Somssich, del Instituto Max-‐Planck (Alemania), experto en los mecanismos defensa de plantas y factores de transcripción tipo WRKY, con el que mantenemos colaboración.

Los primeros resultados (Figuras 3) nos han mostrado evidencias de que tanto AtWRKY75 como FaWRKY1 actúan como reguladores positivos de defensa en Arabidopsis, durante las interacciones con P. syringae (tanto compatibles como incompatible) y sugieren que, muy probablemente, FaWRKY1 puede jugar en fresa un papel en la regulación de la respuesta de defensa a C. acutatum (Encinas-‐Villarejo et al., 2009). Además, estos resultados han demostrado la posibilidad de utilizar Arabidopsis como organismo heterólogo modelo para estudios funcionales de otros genes de fresa.

Figura 3. La expresión del FaWRKY1 en en Arabidopsis wild-‐type y mutante wrky75At22 genera plantas con un aumento de la resistencia a Pseudomonas. (A) Desarrollo de síntomas en hojas de plantas wild-‐type y transgénicas wrky75At22/Fa WRKY1 y wild-‐type/Fa WRKY1, a los 3 dias tras la inoculación con la cepa virulenta Pst DC3000 y avirulenta Pst DC3000 portando avrRpm1, avrRpt2, or avrRps4 (106 CFU ml-‐1). (B) El crecimiento bacteriano en la planta muestra un aumento de la resistencia de las plantas wrky75At22/Fa WRKY1 y (C) wild-‐type/Fa WRKY1 a Pseudomonas syringae. El crecimiento bacteriano se evaluó a los 3 dias tras la infección con Pst DC3000, tanto con aislados virulentos como avirulentos avrRpm1, avrRpt2, y avrRps4 (106 CFU ml-‐1).

A partir de una genoteca genómica de fresa realizada por nuestro grupo, tenemos aislado el fragmento de ADN genómico completo correspondiente al gen FaWRKY1, incluyendo parte de su región reguladora, y hemos caracterizado sus niveles basales de expresión en diferentes tejidos y variedades de fresa con diferente grado de susceptibilidad a C. acutatum y bajo diferentes condiciones de infección por el patógeno.

54



Estos y otros resultados de nuestro grupo BIO278 han sido los primeros publicados en la literatura y hasta el presente los únicos, que aportan conocimientos moleculares de grupos de genes que responden al patógeno en el sistema de interacción planta de fresa-‐Colletotrichum, como modelo para entender su defensa a patógenos. Sin duda, se necesita un mayor progreso en el conocimiento de la genética y biología molecular de la fresa para poder desentrañar la lógica de su complicado mecanismo de defensa. Esto debe proporcionar un marco adecuado de conocimiento y trabajo para la manipulación racional de la fresa en futuros programas de mejora de la Resistencia, como alternativa al uso de químicos y demás pesticidas agresivos con el medio ambiente.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo está financiado por la Junta de Andalucía [Proyecto de Excelencia P07-‐AGR-‐02482, FEDER-‐UE y ayudas PAIDI al Grupo-‐BIO278]. El Grupo BIO278 está también financiado por proyectos MICINN y UE.

REFERENCIAS

Agius, F., González-‐Lamothe, R., Caballero, J.L., Muñoz-‐Blanco, J., Botella, M.A. Valpuesta, V. (2003). Engineering increased vitamin C levels in plants by overexpression of a D-‐galacturonic acid reductase. Nat. Biotech. 21, 177 -‐ 181.

Aharoni, A., and O'Connell, A.P. (2002). Gene expression analysis of strawberry achene and receptacle maturation using DNA microarrays. J. Exp. Bot. 53, 2073-‐2087.

Aharoni, A., Giri, A.P., Verstappen, F.W.A., Bertea, C.M., Sevenier, R., Sun, Z., Jongsma, M.A., Schwab, W., and Bouwmeester, H.J. (2004). Gain and Loss of Fruit Flavor Compounds Produced by Wild and Cultivated Strawberry Species. Plant Cell 16, 3110-‐3131.

Aharoni, A., Keizer, L.C.P., Bouwmeester, H.J., Sun, Z., Alvarez-‐Huerta, M., Verhoeven, H.A., Blaas, J., van Houwelingen, A.M.M.L., De Vos, R.C.H., van der Voet, H., Jansen, R.C., Guis, M., Mol, J., Davis, R.W., Schena, M., van Tunen, A.J., and O'Connell, A.P. (2000). Identification of the SAAT Gene Involved in Strawberry Flavor Biogenesis by Use of DNA Microarrays. Plant Cell 12, 647-‐662.

Amil-‐Ruiz, F., Blanco-‐Portales, R., Muñoz-‐Blanco, J. and Caballero, J.L. (2011) The Strawberry Plant Defence Mechanism: A Molecular Review. Plant and Cell Physiology 52: 1873-‐1903.

Benitez-‐Burraco, A., Blanco-‐Portales, R., Redondo-‐Nevado, J., Bellido, M.L., Moyano, E., Caballero, J.-‐L., and Munoz-‐Blanco, J. (2003). Cloning and characterization of two ripening-‐related strawberry (Fragaria x ananassa cv. Chandler) pectate lyase genes. J. Exp. Bot. 54, 633-‐645.

Bianco, L., Lopez, L., Scalone, A.G., Di Carli, M., Desiderio, A., Benvenuto, E., and Perrotta, G. (2009). Strawberry proteome characterization and its regulation during fruit ripening and in different genotypes. J. Proteomics 72, 586-‐607.

55



Bosshard, E. (1997). Why is Colletotrichum acutatum a quarantine organism, and C. gloeosporoides and C. fragariae are not? In Acta Hort. (ISHS), pp. 799-‐802.

Casado-‐Diaz, A., Encinas-‐Villarejo, S., Santos, B.d.l., Schiliro, E., Yubero-‐Serrano, E.M., Amil-‐Ruiz, F., Pocovi, M.I., Pliego-‐Alfaro, F., Dorado, G., Rey, M., Romero, F., Muñoz-‐Blanco, J., and Caballero, J.L. (2006). Analysis of strawberry genes differentially expressed in response to Colletotrichum infection. Physiol. Plant. 128, 633-‐650.

Denoyes-‐Rothan, B., Guerin, G., Delye, C., Smith, B., Minz, D., Maymon, M., and Freeman, S. (2003). Genetic diversity and pathogenic variability among isolates of Colletotrichum species from strawberry. Phytopathol. 93, 219-‐228.

Dong, X. (2004). NPR1, all things considered. Curr. Opin. Plant Biol. 7, 547-‐552.

Encinas-‐Villarejo, S., Maldonado, A.M., Amil-‐Ruiz, F., de los Santos, B., Romero, F., Pliego-‐Alfaro, F., Muñoz-‐Blanco, J., and Caballero, J.L. (2009). Evidence for a positive regulatory role of strawberry (Fragaria x ananassa) Fa WRKY1 and Arabidopsis At WRKY75 proteins in resistance. Journal of Experimental Botany.

Eulgem, T., Rushton, P.J., Robatzek, S., and Somssich, I.E. (2000). The WRKY superfamily of plant transcription factors. Trends Plant Sci. 5, 199-‐206.

Fait, A., Hanhineva, K., Beleggia, R., Dai, N., Rogachev, I., Nikiforova, V.J., Fernie, A.R., and Aharoni, A. (2008). Reconfiguration of the Achene and Receptacle Metabolic Networks during Strawberry Fruit Development. Plant Physiol. 148, 730-‐750.

Feys, B.J., and Parker, J.E. (2000). Interplay of signaling pathways in plant disease resistance. Trends in Genet. 16, 449-‐455.

Freeman, S., and Rodriguez, R.J. (1995). Differentiation of Colletotrichum Species Responsible for Anthracnose of Strawberry by Arbitrarily Primed Pcr. Mycological Research 99, 501-‐504.

Griesser, M., Vitzthum, F., Fink, B., Bellido, M.L., Raasch, C., Munoz-‐Blanco, J., and Schwab, W. (2008a). Multi-‐substrate flavonol O-‐glucosyltransferases from strawberry (Fragariaxananassa) achene and receptacle. J. Exp. Bot. 59, 2611-‐2625.

Khan, A.A., and Shih, D.S. (2004). Molecular cloning, characterization, and expression of two class II chitinase genes from the strawberry plant. Plant Sci. 166, 753-‐762.

Khan, A.A., Wu, J., and Shih, D.S. (1999). Cloning and sequence analysis of a class III chitinase gene (accession no. AF134347) from Fragaria ananassa Dutch (PGR99-‐069). Plant Physiol. 120, 340.

-‐1,3-‐glucanase gene from strawberry. DNA seq. 14, 406-‐412.

Kunkel, B.N., and Brooks, D.M. (2002). Cross talk between signaling pathways in pathogen defense. Curr. Opin. Plant Biol. 5, 325-‐331.

Mehli, L., Schaart, J.K., Kjellsen, T.D., Tran, D.H., Salentijn, E., Schouten, H.J., and Iversen, T.-‐H. (2004). A gene encoding a polygalacturonase-‐inhibiting protein (PGIP) shows developmental regulation and pathogen-‐induced expression in strawberry. New Phytol. 163, 99-‐110.

Mercado, J.A., Martín-‐Pizarro, C., Pascual, L., Quesada, M.A., Pliego-‐Alfaro, F., de los Santos, B., Romero, F., Galvez, J., Rey, M., de la Viña, G., Llobell, A., Yubero-‐Serrano,

56



E.M., Muñoz-‐Blanco, J., and Caballero, J.L. (2007). Evaluation of tolerance of Colletotrichum acutatum in strawberry plants transformed with Trichoderma-‐derived genes. In Acta Horticulturae, R.S. R.E. Litz, ed (Daytona Beach, Florida, USA: ISHS), pp. 383-‐388.

Mukhtar, M.S., Nishimura, M.T., and Dangl, J. (2009). NPR1 in Plant Defense: It's Not over 'til It's Turned over. Cell 137, 804-‐806.

Muñoz, C., Hoffmann, T., Escobar, N.M., Ludemann, F., Botella, M.A., Valpuesta, V., and Schwab, W. (2010). The Strawberry Fruit Fra a Allergen Functions in Flavonoid Biosynthesis. Mol. Plant 3, 113-‐124.

Osorio, S., Castillejo, C., Quesada, M.A., Medina-‐Escobar, N., Brownsey, G.J., Suau, R., Heredia, A., Botella, M.A., and Valpuesta, V. (2008). Partial demethylation of oligogalacturonides by pectin methyl esterase 1 is required for eliciting defence responses in wild strawberry (Fragaria vesca). Plant J. 54, 43-‐55.

Parkhi, V., Kumar, V., Campbell, L., Bell, A., Shah, J., and Rathore, K. (2010). Resistance against various fungal pathogens and reniform nematode in transgenic cotton plants expressing Arabidopsis NPR1. Transgenic Res..

Pieterse, C.M.J., and Van Loon, L.C. (2004). NPR1: the spider in the web of induced resistance signaling pathways. Curr. Opin. Plant Biol. 7, 456-‐464.

Quesada, M.A., Blanco-‐Portales, R., Pose, S., Garcia-‐Gago, J.A., Jimenez-‐Bermudez, S., Munoz-‐Serrano, A., Caballero, J.L., Pliego-‐Alfaro, F., Mercado, J.A., and Munoz-‐Blanco, J. (2009). Antisense Down-‐Regulation of the FaPG1 Gene Reveals an Unexpected Central Role for Polygalacturonase in Strawberry Fruit Softening. Plant Physiol. 150, 1022-‐1032.

Santiago-‐Domenech, N., Jimenez-‐Bemudez, S., Matas, A.J., Rose, J.K.C., Munoz-‐Blanco, J., Mercado, J.A., and Quesada, M.A. (2008). Antisense inhibition of a pectate lyase gene supports a role for pectin depolymerization in strawberry fruit softening. J. Exp. Bot. 59, 2769-‐2779.

Shulaev, V., Sargent, D.J., Crowhurst, R.N., Mockler, T.C., Folkerts, O., Delcher, A.L., et al. (2011) The genome of woodland strawberry (Fragaria vesca). Nature Genetics 43: 109-‐116.

Wally, O., Jayaraj, J., and Punja, Z. (2009). Broad-‐spectrum disease resistance to necrotrophic and biotrophic pathogens in transgenic carrots (Daucus carota L.) expressing an Arabidopsis NPR1 gene. Planta 231, 131-‐141.

Wharton, P.S., and Diéguez-‐Uribeondo, J. (2004). The Biology of Colletotrichum acutatum. Anales del Jardín Botanico de Madrid 61, 3-‐22.

Wu, C.-‐T., and Bradford, K.J. (2003). Class I Chitinase and beta-‐1,3-‐Glucanase Are Differentially Regulated by Wounding, Methyl Jasmonate, Ethylene, and Gibberellin in Tomato Seeds and Leaves. Plant Physiol. 133, 263-‐273.

Wu, C.T., Leubner-‐Metzger, G., Meins, F., and Bradford, K.J. (2001). Class I beta-‐1,3-‐glucanase and chitinase are expressed in the micropylar endosperm of tomato seeds prior to radicle emergence. Plant Physiol. 126, 1299-‐1313.

57



Sesión Segunda

58



59



Ponencias investigadores egresados

DIGE: HERRAMIENTA CLAVE EN EL DESCUBRIMIENTO DE NUEVOS MECANISMOS DE CONTROL CELULAR

Antonio Romero Ruiz

A.R.R. es doctor en Bioquímica por la Universidad de Córdoba. Realizó estancias postdoctorales en el Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS) y en el Department of Physiology, Development and Neuroscience de la Universidad de Cambridge (UK). En la actualidad es Investigador contratado en el grupo BIO310.

RESUMEN

Los estudios proteómicos de expresión diferencial, permiten conocer las proteínas que cambian en un proteoma enfrentado a dos o varias situaciones diferentes. En muchos procesos patológicos, la posibilidad de conocer las proteínas implicadas permite un avance rápido y fiable en el conocimiento de las bases moleculares de dichos procesos. El uso del análisis de expresión diferencial mediante DIGE seguido de estudios mecanicísticos, permite identificar proteínas clave, así como describir su función en diferentes situaciones de respuesta a estrés. Como ejemplo se presentan los avances conseguidos en los mecanismos de respuesta neuronal a dos situaciones críticas, la hipoxia y el ayuno.

INTRODUCCIÓN

Aunque la fisiología de los diferentes órganos y tejidos está muy avanzada, no ocurre lo mismo con los mecanismos moleculares que regulan dichos procesos, especialmente en el Sistema Nervioso Central. Como es sabido, todas las células de un organismo son genéticamente idénticas, sin embargo tienen funciones especializadas dependiendo de su localización. Esta especialización ocurre a nivel molecular y es tremendamente compleja, ya que depende de mecanismos de regulación a nivel transcripcional, postranscripcional y postraduccional. Uno de los retos más importantes de la investigación biomédica en general y de la neurofisiología en particular, es conocer las bases moleculares de los mecanismos de control celular, ya que muchas enfermedades están basadas en el malfuncionamiento de estos procesos. Las herramientas proteómicas de expresión diferencial, como son la

60



plataforma cuantitativa DIGE (differential y gel electroforesis), junto con la espectrometría de masas y herramientas bioinformáticas, permiten identificar de forma rápida y precisa las proteínas implicadas en las repuestas celulares a estrés, paso indispensable para entender las bases moleculares de la neurofisiología1.

OBJETIVOS

En este trabajo se utilizan aproximaciones proteómicas para la identificación de proteínas de interés así como su función en diferentes procesos celulares.

Se presentan dos ejemplos, donde la utilización de esta metodología está contribuyendo al conocimiento de nuevos mecanismos de regulación neuronal en situaciones de estrés. Se mostrarán avances realizados en los mecanismos de respuesta celular a hipoxia aguda y en los mecanismos de regulación hipotalámica a situaciones de ayuno.

RESULTADOS

A.-‐ Modulación aguda del proteoma celular por hipoxia

El cerebro de mamíferos es muy sensible a alteraciones en la homeostasis celular. En particular una reducción de los niveles de oxígeno (hipoxia) y/o de glucosa, pueden causar severas alteraciones en su función, incluso provocar la muerte neuronal en minutos. Desafortunadamente, con la edad el aporte de oxígeno a las células disminuye, aumentando la susceptibilidad a sufrir daños neuronales. Los órganos quimiosensores, como por ejemplo el cuerpo carotídeo, provocan reflejos sistémicos respiratorios y cardiovasculares en situaciones de hipoxia aguda, para garantizar la entrega rápida de O2 en el cerebro y corazón2. Sin embargo, una exposición prolongada a la hipoxia, genera respuestas homeostáticas para reducir al mínimo el efecto nocivo de la deficiencia de O2. Esta adaptación de la célula a la hipoxia puede ser dependiente o independiente de transcripción génica2-‐4. La respuesta celular a una tensión baja de O2 mediada por mecanismos dependientes de transcripción génica, está bien establecida y depende principalmente de HIF (factor de transcripción inducible por hipoxia), que regula un elevado número de genes cuya expresión optimiza el consumo y el suministro de O2 a los tejidos4,5. En contraste, los mecanismos de respuesta rápida e independientes de transcripción génica no se conocen. En este trabajo se presenta un estudio mediante aproximaciones proteómicas de los procesos que median en esta respuesta. Para ello células cromafines fueron expuestas a hipoxia y a DMOG (mimetizador farmacológico de la respuesta a hipoxia). Una misma proteína se alteró en ambos casos, el factor de elongación 2 de la síntesis de proteínas

61



(eEF2) (fig. 1) . Posteriores experimentos demostraron que la regulación de la síntesis de proteínas es el primer y más importante punto de modulación, ya que consume el 75 % del ATP intracelular. Se mostrarán datos que explican este mecanismo y que confirman que esta regulación ocurre a nivel de la

ATP a la espera de los mecanismos de respuesta dependientes de HIF5. Este descubrimiento abre nuevas perspectivas en el tratamiento de la isquemia y el cáncer.

Fig. 1.-‐ Análisis de expresión diferencial mediante DIGE. A Gel representativo. Electroforesis bidimensional con marcaje de fluorescencia de células PC12 en situación control (21% O2, verde) o expuestas a hipoxia (1% O2, 15 min; rojo). Los spots numerados fueron identificados por espectrometría de masas. B gel bidimensional con marcaje de fluorescencia representativo donde se muestra extractos control (rojo) o tratados con DMOG. Los spots enmarcados se expresaron diferencialmente tras el tratamiento a DMOG y son los mismos que el spot 1 en figura 1 A. El estándar interno no se muestra en la imágenes.

B.-‐ Mecanismos moleculares de respuesta al ayuno agudo

Está bien establecido que una bajada en los aportes de energía u oxígeno, no sólo afecta a la homeostasis neuronal, sino que un desbalance en el estado metabólico/energético del organismo afecta al desarrollo y a la llegada a pubertad 6,7. Esta influencia se manifiesta en condiciones de balance energético negativo (retraso puberal) y en alteraciones metabólicas tales como la obesidad o la anorexia, lo que desencadena alteraciones del crecimiento somático (baja talla final) y de comportamiento, además de un mayor riesgo de hipertensión, obesidad y diabetes en etapas posteriores de la vida 8-‐11.

125

15

B A

a

a

a

a

62



El objetivo del presente proyecto es conocer qué rutas intracelulares en neuronas hipotalámicas responden a situaciones de ayuno agudo en ratones hembra y su papel fisiológico en el control del balance energético y desarrollo puberal.

Para ello se ha realizado un estudio de expresión diferencial, mediante la plataforma proteómica DIGE, en el área medio basal del hipotálamo de ratones hembra peri-‐puberales expuestos a 24 horas de ayuno. Los análisis DIGE mostraron cambios en 4 proteínas (fig. 2). Aumentó la sinapsina 1 y la creatina kinasa (CK) mitocondrial y disminuyó el factor sensible a n-‐etilmaleimida (SNF) y la protein kinasa activada por mitógenos (MapK). Según está descrito, la fosforilación en serina 9 de la sinapsina 1, controla la liberación de neurotransmisor mediante mecanismos de exocitosis de vesículas (mediados por proteínas tipo SNARE como es la SNF), consumiendo ATP (que podría estar almacenado por las CK)12. Se mostrarán experimentos que demuestran por primera vez que este tipo de regulación presináptica está implicada en la respuesta a estrés metabólico y desarrollo puberal.

Fig. 2.-‐ Análisis de expresión diferencial mediante DIGE. Gel representativo. Electroforesis bidimensional con marcaje de fluorescencia de extractos celulares de hipotálamo medio basal de ratas hembra peri-‐puberales en situación control (verde) o expuestas a ayuno agudo (24 horas, rojo). Los spots numerados fueron identificados por espectrometría de masas y se muestran en la tabla adjunta a la figura. El estándar interno no se muestra en la imágenes.

REFERENCIAS

1. Zhang, C. Proteomic studies on the development of the central nervous system and beyond. Neurochem. Res. 35, 1487 1500 (2010).

2. Lopez-‐Barneo, J., Pardal, R. & Ortega-‐Sáenz, P. Cellular mechanism of oxygen sensing. Annu. Rev. Physiol. 63, 259 287 (2001).

3. Kaelin, W. G. & Ratcliffe, P. J. Oxygen sensing by metazoans: the central role of the HIF hydroxylase pathway. Mol. Cell 30, 393 402 (2008).

4. Semenza, G. L. Regulation of oxygen homeostasis by hypoxia-‐inducible factor 1. Physiology (Bethesda) 24, 97 106 (2009).

5. Romero Ruiz, A. et al. Prolyl hydroxylase-‐dependent modulation of eukaryotic elongation factor 2 activity and protein translation in acute hypoxia. J Biol Chem (2012).doi:10.1074/jbc.M111.299180

6. Fernández-‐Fernández, R., Martini, A. C., Tena-‐Sempere, M.8 Novel signals for the

63



integration of energy balance and reproduction. Molecular and Cellular Endocrinology 254-‐255, 127 132 (2006).

7. Castellano, J. M. J., Roa, J. J., Tena-‐Sempere, M. M.7 KiSS-‐1/kisspeptins and the metabolic control of reproduction: physiologic roles and putative physiopathological implications. Peptides 30, 139 145 (2008).

8. Ibáñez, L., Díaz, R., López-‐Bermejo, A. & Marcos, M. V. Clinical spectrum of premature pubarche: links to metabolic syndrome and ovarian hyperandrogenism. Rev Endocr Metab Disord 10, 63 76 (2009).

9. Carter, R., Jaccard, J., Silverman, W. K. & Pina, A. A. Pubertal timing and its link to -‐

girls. J Adolesc 32, 467 481 (2009). 10.Taeymans, J. et al. Tracking of adult adiposity in early, average and late maturing children: a thirty year longitudinal growth study. J Sports Med Phys Fitness 48, 326334 (2008).

11.Lakshman, R. et al. Association between age at menarche and risk of diabetes in adults: results from the EPIC-‐Norfolk cohort study. Diabetologia 51, 781 786 (2008).

12.Cesca, F., Baldelli, P., Valtorta, F. & Benfenati, F. The synapsins: key actors of synapse function and plasticity. Prog. Neurobiol. 91, 313 348 (2010).

LÍNEAS DE INVESTIGACIÓN ACTUALES:

1. Fisiología del sistema Kiss1/GPR54: papel en el control neuroendocrino de la reproducción.

2. Fisiología de la pubertad: Control neuropeptidérgico, epigenético y por microRNAs. Mecanismos de control e integración del balance energético y la función reproductora.

3. Búsqueda mediante estudios de expresión diferencial en genes (qPCR, inmunohistoquímica, microchips de ARN, bioinformática, etc.) y proteínas (2D-‐DIGE, espectrometría de masas, búsqueda de modificaciones postraduccionales, nanoHPLC, producción de proteínas recombinantes, técnicas bioinformáticas, etc.) de nuevas rutas de señalización celular relacionadas con el neuropétido y su receptor Kiss1/GPR54.


García-‐Galiano D, Pineda R, Ilhan T, Castellano JM, Ruiz-‐Pino F, Sánchez-‐Garrido MA, Vazquez MJ, Sangiao-‐Alvarellos S, Romero-‐Ruiz A, Pinilla L, Diéguez C, Gaytán F, Tena-‐Sempere M (2012) Cellular Distribution, Regulated Expression, and Functional Role of the Anorexigenic Peptide, NUCB2/Nesfatin-‐1, in the Testis. Endocrinology [Epub ahead of print]





64



Romero-‐Ruiz A, Bautista L, Navarro V, Heras-‐Garvin A, March-‐Diaz R, Castellano A, Gomez-‐Diaz R, Castro MJ, Berra E, Lopez-‐Barneo J, Pascual A (2012) Prolyl hydroxylase-‐dependent modulation of eukaryotic elongation factor 2 activity and protein translation in acute hypoxia. J Biol Chem [Epub ahead of print]

García-‐Galiano D, van Ingen Schenau D, Leon S, Krajnc-‐Franken MA, Manfredi-‐Lozano M, Romero-‐Ruiz A, Navarro VM, Gaytan F, van Noort PI, Pinilla L, Blomenröhr M, Tena-‐Sempere M (2012) Kisspeptin signaling is indispensable for neurokinin B, but not glutamate, stimulation of gonadotropin secretion in mice. Endocrinology 153(1):316-‐28

Romero-‐Ruiz A, Mejías R, Díaz-‐Martín J, López-‐Barneo J, Gao L (2010) Mesencephalic and striatal protein profiles in mice over-‐expressing glucose-‐6-‐phosphate dehydrogenase in dopaminergic neurons. J Proteomics 73(9):1747-‐57

Pascual A, Romero-‐Ruiz A, Lopez-‐Barneo J (2009) Differential proteomic analysis of adrenal gland during postnatal development. Proteomics 9(11):2946-‐54













65



GRUPO AGR146

VITICULTURA Y ENOLOGÍA

COMPONENTES:

RESPONSABLE: Moreno Vigara, Juan ...................... [email protected] García Martínez, Teresa ...................... [email protected] Lopez de Lerma Extremera, Mª Nieves .................. [email protected] García Mauricio, Juan Carlos .................................. [email protected] Peinado Amores, Rafael Andrés ............................ [email protected] Moreno García, Jaime ..................................... [email protected] Porras Tamayo, Elena .............................................. [email protected]


Departamento de Química Agrícola y Edafología. Departamento de Microbiología. Universidad de Córdoba.


1. Coinmovilización de levaduras para su uso en vinificación. 2. Actividad antioxidante de uvas tradicionalmente pasificadas.


García-‐Martínez T, Puig-‐Pujol A, Peinado R, Moreno J, Mauricio JC (2012) Potential use of wine yeasts immobilized on Penicillium chrysogenum for ethanol production. J Chem Technol Biotechnol. 87:351-‐359

García-‐Martínez T, Bellincontro A, López de Lerma MN, Peinado RA, Mauricio JC, Mencarelli F, Moreno J (2011) Discrimination of sweet wines partially fermented by two osmo-‐ethanol-‐tolerant yeasts by gas chromatographic analysis and electronic nose. Food Chem. 127:1391-‐1396

García-‐Martínez T, Peinado R, Moreno J, García-‐García I, Mauricio, JC (2011) Co-‐culture of Penicillium chrysogenum and Saccharomyces

66



cerevisiae leading to the immobilisation of yeast. J Chem Technol Biotechnol. 86:812-‐817

López de Lerma N, Peinado RA (2011) Use of two osmoethanol tolerant yeast strain to ferment must from Tempranillo dried grapes: effect on wine composition. Int J Food Microbiol. 145:342-‐348

López de Lerma N, Bellicontro A, Mencarelli F, Moreno J, Peinado RA (2012) Use of electronic nose, validated by GC-‐MS, to establish the optimum off-‐vine dehydration time of wine grapes. Food Chem. 130:447-‐452

López de Lerma N, García-‐Martínez T, Moreno J, Mauricio JC, Peinado RA (2012) Sweet wines with great aromatic complexity obtained by partial fermentation of must from Tempranillo dried grapes. Eur Food Res Technol. DOI:10.1007/s00217-‐012-‐1680-‐4

67



PONENCIA:

BIOCÁPSULAS DE LEVADURA PARA SU USO EN VINIFICACIÓN

RESUMEN

Los problemas asociados a la fermentación de mostos de uva con gran contenido en azúcar se han minimizado mediante el empleo de un nuevo sistema de inmovilización celular. Los vinos así obtenidos presentan una mayor complejidad aromática que los elaborados de forma tradicional.

INTRODUCCIÓN

Los vinos dulces son elaborados a partir de mostos con elevada concentración de azúcar. La fermentación de estos presenta una serie de inconvenientes como son las paradas prematuras de fermentación o fermentaciones lentas, debido a la elevada presión osmótica que tienen que soportar las levaduras. Por esta razón, los vinos dulces en Andalucía se han elaborado, tradicionalmente, alcoholizando los mostos de uvas pasificadas impidiéndose de este modo la fermentación alcohólica.

El desarrollo de los procesos fermentativos con levadura inmovilizada presenta una serie de ventajas técnicas y económicas frente a los realizados con levadura en forma libre: (i) permiten la retirada de las células en el momento deseado, (ii) posibilitan la reutilización de las células, (iii) agilizan el proceso (iv) facilitan el desarrollo de procesos continuos, y por tanto, (v) se minimizan los costes asociados al desarrollo de la fermentación. El grupo de investigación AGR 146 ha desarrollado un nuevo sistema de inmovilización natural de levaduras (Peinado et al. 2006). La originalidad de este sistema de inmovilización consiste en inducir una coinmovilización espontánea entre un hongo filamentoso GRAS, Penicillium chrysogenum, y Saccharomyces cerevisiae, en ausencia de compuestos químicos de unión y de soportes externos, creando artificialmente las condiciones adecuadas para favorecer una simbiosis. Este nuevo sistema de coinmovilización ha sido patentado por nuestro grupo . La versatilidad de este sistema permitiría aplicarlo no sólo para la fermentación de mostos, sino que usando las levaduras apropiadas podría utilizarse en la desacidificación biológica de mostos, en la segunda fermentación conducente a la obtención de vinos espumosos y en otros procesos industriales como es la obtención de bioetanol.

68



OBJETIVOS

El objetivo general del presente trabajo es elaborar vinos dulces a partir de biocápsulas de levadura. Los objetivos específicos son los siguientes:

1º) Estudiar la estructura de las biocápsulas de levadura por microscopía.

2º) Comparar el perfil proteómico de las células inmovilizadas con las células de levadura libres en medio de formación de biocápsulas.

3º) Aplicar biocápsulas de levaduras seleccionadas osmotolerantes para la producción de vinos dulces naturales.

RESULTADOS

Se ha comprobado al microscopio óptico que las paredes de las biocápsulas están compuestas por hifas de hongo y células de levaduras atrapadas y unidas

a estas hifas. Por estudio de diálisis se ha comprobado que tras cinco días en un medio de fermentación el hongo filamentoso muere por

contacto directo célula de levadura-‐hifa (García-‐Martínez et al. 2011).

Los primeros estudios del perfil proteómico de las células de levadura coinmovilizadas con respecto a las células libres en el medio de formación de biocápsulas indican que las proteínas identificadas, con un nivel de significación p<0,05 y de expresión de , tienen funciones relacionadas con la reparación y maduración del ADN, con el control del ciclo celular; además de la síntesis y traducción de proteínas, funciones implicadas en el control tanto a nivel de ciclo celular como de transcripción.

la levadura S. cerevisiae G1 obtenido por 2-‐ED.

69



La fracción aromática de los mostos de uva parcialmente fermentada es de gran complejidad tanto desde un punto de vista cuantitativo como cualitativo. El establecimiento de series aromáticas puede ayudar a estimar la contribución de los compuestos volátiles al aroma del vino. Para esto primero debemos calcular el valor de actividad odorante (VAO) de cada compuesto y posteriormente agruparlos en función de sus descriptores aromáticos. El valor de cada serie aromática se obtiene sumando los VAOs de los compuestos que la integran. Dado que el perfil aromático de todos los vinos se obtiene del mismo modo es más fácil obtener conclusiones sobre el impacto que tiene en el aroma la realización de una determinada práctica (López de Lerma y Peinado 2011).

Figura 2. Valores de las series aromáticas en vinos elaborados de forma tradicional (control) y en los fermentados con levadura X4 y X5 en forma libre (X4F, X4F) y en forma inmovilizada (X4In, X5In). Letras diferentes indican diferencias significativas al 95%.

Como se muestra en la figura 2 todas las series aumentan de forma significativa por efecto de la fermentación parcial de los mostos. Destacan los valores de las series química, fruta madura y láctea. Para las dos últimas series es la levadura X5 en forma libre la que presenta un mayor valor. En la serie química los valores más elevados corresponden a los vinos obtenidos tras la fermentación parcial de mostos con levadura X5 y de la levadura X4 en forma inmovilizada. Las siguientes series en importancia son la tostada y la floral. En el caso de la serie tostada no existen diferencias significativas entre los mostos parcialmente fermentados. La serie floral presenta sus mayores valores en los vinos

A

B

C CC

A

B B

C

D

A

B

C

D

C

A

B C DC

A B C D DA

B B B B

A B C D D AB C D C

A B B B B

0

5

10

15

20

25

Val

ores

de

las

seri

es a

rom

átic

as

Quimica F rutamadura

Lactea F loral H ierbafresca

Tostada F rutaverde

G rasa Hierbaseca

Control X4FX4In X5FX5In

A

B

C CC

A

B B

C

D

A

B

C

D

C

A

B C DC

A B C D DA

B B B B

A B C D D AB C D C

A B B B B

0

5

10

15

20

25

Val

ores

de

las

seri

es a

rom

átic

as

Quimica F rutamadura

Lactea F loral H ierbafresca

Tostada F rutaverde

G rasa Hierbaseca

Control X4FX4In X5FX5In

70



obtenidos con levadura X4 y X5 empleada en forma libre, aunque son significativamente mayores en el primer caso. El resto de las series presentan en todos los casos valores inferiores a la unidad. No obstante, se debe destacar que en el caso de las series hierba fresca y fruta verde los vinos obtenidos tras fermentación parcial de los mostos con levadura X5 son los que presentan menores valores, mientras que no existen diferencias significativas para la serie hierba seca entre los mostos parcialmente fermentados.

CONCLUSIONES

Los resultados del estudio proteómico sugieren que podría existir una defensa de las células inmovilizadas de levadura frente al hongo bajo las condiciones ensayadas, marcada a través de una serie de controles a nivel de ADN, de ARN y de proteínas. La fermentación parcial de mostos de uva pasificada da lugar a vinos que presentan una mayor concentración de compuestos volátiles lo que se traduce en una mayor complejidad aromática de estos vinos frente a los elaborados de forma tradicional. La utilización del sistema de inmovilización se plantea con una buena opción para la fermentación parcial de mostos de uva pasificada.

REFERENCIAS

García-‐Martínez T, Peinado R, Moreno J, García-‐García I, Mauricio, JC (2011) Co-‐culture of Penicillium chrysogenum and Saccharomyces cerevisiae leading to the immobilisation of yeast. J Chem Technol Biotechnol. 86:812-‐817

López de Lerma N, Peinado RA (2011) Use of two osmoethanol tolerant yeast strain to ferment must from Tempranillo dried grapes: effect on wine composition. Int J Food Microbiol. 145:342-‐348

Peinado RA, Moreno JJ, Villalba JM, González-‐Reyes JA, Ortega JM, Mauricio JC (2006) Yeast biocapsules: A new immobilization method and their applications. Enzyme Microb Tech. 40:79-‐84

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos al Ministerio de Ciencia e Innovación (MICINN-‐INIA) y FEDER, Ref. RTA2011-‐00020-‐C02-‐02. Al Ministerio de educación por la concesión de una beca FPU (convocatoria 2008).

71



GRUPO BIO128

BIOLOGÍA MOLECULAR DE LA ASIMILACIÓN DE NITRATO EN ALGAS

COMPONENTES:

RESPONSABLE: Fernández Reyes, Emilio ................ [email protected] Galván Cejudo, Aurora ........................................... [email protected] Llamas Azúa, Ángel .................................................... [email protected] González Ballester, David [email protected] Higuera Sobrino, José Javier ..................................... [email protected] Sanz Luque, Emanuel............................................... [email protected] Chamizo Ampudia, Alejandro ................................. [email protected] González Sánchez, Zahira ........................................ [email protected] Ocaña Calahorro, Francisco J .................................. [email protected] Macías Gómez, María Isabel ............................... [email protected] Onieva Jiménez, Rocío .............................................. [email protected] Jurado Oller, José Luis ............................................... [email protected]


Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus de Excelencia (ceiA3), Universidad de Córdoba.


1. Transporte y reducción de nitrato/nitrito. 2. Metabolismo del molibdeno y ensamblado de la apo-‐enzima. 3. Señalización por nitrato y amonio de la regulación de la ruta. 4. Fotoproducción de almidón e hidrógeno.


Chamizo-‐Ampudia A, Galvan A, Fernandez E, Llamas A. (2011) The Chlamydomonas reinhardtii molybdenum cofactor enzyme CrARC has a Zn-‐dependent activity and protein partners similar to those of its human homologue. Eukaryot Cell. 10(10):1270-‐1282

72



Llamas A, Tejada-‐Jiménez M, Fernández E, Galván A. (2011) Molybdenum metabolism in the alga Chlamydomonas stands at the crossroad of those in Arabidopsis and humans. Metallomics 3(6):578-‐590

Gonzalez-‐Ballester D, Pootakham W, Mus F, Yang W, Catalanotti C, Magneschi L, Higuera JJ, de Montaigu A, Prior M, Galván A, Fernandez E, Grossman AR (2011) Reverse Genetics in Chlamydomonas: A Moderate Throughput Platform for Isolating Insertional Mutants. Plant Methods. 7:24.

Tejada-‐Jiménez M, Galván A, Fernández E. (2011) Algae and humans share a molybdate transporter. Proc Natl Acad Sci U S A. 108(16):6420-‐6425

de Montaigu A, Sanz-‐Luque E, Galván A, Fernández E 8 (2010) A soluble guanylate cyclase mediates negative signaling by ammonium on expresión of nitrate reductase in Chlamydomonas. Plant Cell. 22(5):1532-‐1548

de Montaigu A, Sanz-‐Luque E, Macias MI, Galvan A, Fernandez E. (2010) Transcriptional regulation of CDP1 and CYG56 is required for proper NH4+ sensing in Chlamydomonas. J Exp Bot. 62(4):1425-‐1437

Tejada-‐Jiménez M, Galván A, Fernández E, Llamas A (2009) Homeostasis of the micronutrients Ni, Mo and Cl with specific biochemical functions Curr Opin Plant Biol 12(3):358-‐863

Castaings L, Camargo A, Pocholle D, Gaudon V, Texier Y, Boutet-‐Mercey S, Taconnat L, Renou JP, Daniel-‐Vedele F, Fernandez E, Meyer C, Krapp A. (2009). The nodule inception-‐like protein 7 modulates nitrate sensing and metabolism in Arabidopsis. Plant J. 57(3):426-‐435

Tejada-‐Jiménez M, Llamas A, Sanz-‐Luque E, Galván A, Fernández E. (2007) A high-‐affinity molybdate transporter in eukaryotes. Proc Natl Acad Sci U S A. 104(50):20126-‐20130

Camargo A, Llamas A, Schnell RA, Higuera JJ, González-‐Ballester D, Lefebvre PA, Fernández E, Galván A. (2007) Nitrate signaling by the regulatory gene NIT2 in Chlamydomonas. Plant Cell. 19(11):3491-‐3503.

73



PONENCIA:

GENÓMICA FUNCIONAL DE LA ASIMILACION DE NITROGENO Y PRODUCCION DE ENERGIA EN CHLAMYDOMONAS

RESUMEN

Nuestro grupo utiliza el alga fotosintética eucariota y haploide Chlamydomonas reinhardtii como sistema modelo para el estudio de cuestiones fundamentales del conocimiento no bien conocidas en organismos superiores más complejos como plantas o animales. Para ello utiliza estrategias de genómica funcional y el aislamiento y caracterización de mutantes afectados en el (los) gen(es) de interés.

Actualmente enfocamos la atención sobre los siguientes aspectos:

1.Transporte y reducción de nitrato/nitrito. Hemos identificado las proteínas NRT2 como las responsables del transporte de alta afinidad de nitrato/nitrito a nivel de membrana plasmática. Pueden actuar como sistemas de un componente o de dos, en combinación con NAR2. Las proteínas NAR1 median el transporte de alta afinidad de nitrito al cloroplasto según la disponibilidad de carbono, y pueden mediar además el transporte de bicarbonato y otros metabolitos. En plantas además de NRT2/NAR2 los transportadores NRT1 juegan un papel importante en la entrada de nitrato. Estamos caracterizando el único sistema NRT1 de Chlamydomonas.

2. Metabolismo del molibdeno y ensamblado de la apo-‐enzima. El molibdeno es esencial para la construcción del sitio activo de reducción de nitrato en la enzima nitrato reductas a donde participa en la forma activa de cofactor de molibdopterina (MoCo). Esta enzima es fundamental para el crecimiento de organismos fotosintéticos. Asimismo, la sulfito oxidasa es una molibdoenzima cuya deficiencia causa serios problemas de viabilidad en animales. La ruta de biosíntesis de MoCo es universal. Hemos identificado MOT1 como un transportador de molibdato de alta afinidad que está presente en los diversos organismos a excepción de animales. También hemos identificado el transportador de molibdato MOT2 presente en organismos eucarióticos (como el hombre) pero ausente en procariotas. MCP1 es una proteína portadora de Moco que participa en su protección frente a la degradación por oxígeno, y su transferencia a

74



la apo-‐molibdoenzima. Recientemente, hemos identificado el sistema ARC de reducción de hidroxiderivados de bases nitrogenadas, que resultan tóxicos en diversos organismos procariotas y eucariotas. Se trata de una molibdoenzima que permite la destoxificación de estos compuestos. El sistema ARC del alga Chlamydomonas es similar al de humanos e implica citocromo b5 y citocromo b5 reductasa.

3. Señalización por nitrato y amonio de la regulación de la ruta. El nitrato no solamente es una fuente de nitrógeno esencial sino que también es una señal positiva de la expresión de los genes de la ruta y de otros procesos celulares. Por el contrario, el amonio y sus derivados suministran una señal negativa. Hemos construido una biblioteca ordenada de mutantes insercionales para identificar genes

nitrato reductasa depende exclusivamente de las concentraciones de nitrato intracelular determinadas por la actividad de los transportadores. Hemos caracterizado NIT2 como un factor transcripcional del tipo de cremallera de leucinas que media la señal de nitrato. La señalización negativa es compleja y depende de la activad de diversos genes y entre ellos una guanilato ciclasa dependiente de óxido nítrico. El efecto negativo del amonio a su vez depende de su balance con la señal positiva de nitrato.

4. Fotoproducción de almidón e hidrógeno. Bajo condiciones de estrés, tales como el colapso de transferencia fotosintética de electrones o anaerobiosis, las células de Chlamydomonas son capaces de realizar un metabolismo fermentativo complejo relacionado con la fermentación ácido mixta bacteriana, produciendo una serie de metabolitos como formiato, etanol, acetato, glicerol, lactato, dióxido de carbono e hidrógeno molecular. La enzima más importante para la producción de hidrógeno por una [Fe]-‐hidrogenasa activa. Asimismo por eliminación de la fuente S, las células inducen la capacidad de producción de hidrógeno a la luz debido a un desbalance entre la fotosíntesis y la respiración, que induce la expresión de la hidrogenada, en una anaerobiosis así generada. Hemos identificado estirpes mutantes de Chlamydomonas que poseen una capacidad aumentada de almacenar almidón. Estos mutantes se han analizado para una fotoproducción eficiente de hidrógeno habiéndose obtenido resultados prometedores.

75



GRUPO FQM227

PLATAFORMAS ANALÍTICAS EN METABOLÓMICA/PROTEÓMICA Y APROVECHAMIENTO DE RESIDUOS AGROALIMENTARIOS

COMPONENTES:

RESPONSABLE: Luque de Castro, María Dolores ........ [email protected] Priego Capote, Feliciano ............................................... [email protected] Ruiz Jiménez, José .......................................................... [email protected] Ferreiro Vera, Carlos ................................................ [email protected] Alcaide Molina, Miguel ................................. [email protected] Orozco Solano, Mara Isabel ........................................ [email protected] Sánchez de Medina Baena, Verónica ............... [email protected] Delgado de la Torre, M. Pilar ............... [email protected] Fernández Peralbo, M. Auxiliadora ........................... [email protected] Peralbo Molina, Ángela .................................. [email protected]


Departamento de Química Analítica, Facultad de Ciencias, Universidad de Córdoba e Instituto Maimónides de Investigación Biomédica de Córdoba (IMIBIC).


1. Plataformas analíticas en metabolómica/proteómica. 2. Aprovechamiento de residuos de la industria agroalimentaria.


Álvarez-‐Sánchez B, Priego-‐Capote F, Luque de Castro MD (2010) Metabolomics analysis, Parts I and II. Trends Anal chem. 29(2): 111-‐127

Ibid (2010) Automated determination of folate catabolites in human biofluids (urine, breast milk and serum) by on-‐line SPE HILIC MS/MS. J Chromatogr A. 1217:4688-‐4695

76



Ferreiro-‐Vera C, Priego-‐Capote F, Luque de Castro MD (2011) Automated method for targeting analysis of prostanoids in human serum by on-‐line solid-‐phase extraction and liquid chromatographymass-‐spectrometry in selected reaction monitoring. J Chromatogr A. 1218:2848-‐2855

León-‐González L, Ferreiro-‐Vera C, Priego-‐Capote F, Luque de Castro MD (2011) Bioaccumulation assessment of the sunscreen agent 2.ethylhexyl 4-‐(N,N-‐dimethylamino)benzoate in human semen by automated online SPE LC MS/MS. Anal Bioanal Chem. 401:1003-‐1011

Orozco-‐Solano, MI, Priego-‐Capote F, Luque de Castro DM (2011) Influence of simultaed deep frying on the antioxidant fraction of vegetable oils after enrichment with extracts from olive oil pomace. J Agric Food Chem.

Rojano-‐Delgado A, Priego-‐Capote F, Luque de Castro MD, de Prado R (2010) Screening and confimatory analysis of glyoxilate: a biomarker of plants resistance against herbicides. Talanta. 82:1757-‐1762.

PONENCIA:

CONTRIBUCIONES DEL GRUPO FQM-‐227 EN METABOLÓMICA Y EN EL APROVECHAMIENTO DE RESIDUOS DE LA VID/VINO Y DEL OLIVO/ACEITE

RESUMEN

La investigación actual del grupo FQM-‐227 se centra en dos líneas de investigación: (1) Desarrollo de plataformas analíticas en metaboló-‐mica/proteómica, con aplicación en tres vertientes, (1.i) metabolómica nutricional, fundamentalmente dirigida a la evaluación del efecto metabólico de la ingesta de diferentes dietas o tipos de alimentación, así como a la búsqueda de nutraceúticos y complementos dietéticos extraídos del olivo o de la vid; (1.ii) metabolómica clínica, orientada a la búsqueda de herramientas analíticas que auxilien en la prognosis y diagnosis de diferentes patologías como enfermedades cardio-‐vasculares, diabetes y ciertos tipos de cáncer (pulmón, mama y colon); (1.iii) metabolómica vegetal, en la que se desarrollan herramientas para la selección avanzada en el programa de mejora genética del olivo

77



y para la identificación de las rutas metabólicas que diferencian variedades de plantas resistentes y sensibles a herbicidas para la interpretación de este comportamiento. (2) La explotación de los residuos agroalimentarios, que abarca, (2.i) los procedentes del olivo y de la industria del aceite de oliva (hoja y alperujo, respectivamente); (2.ii) los derivados de la vid (hojas y sarmientos) y de la industria vinícola (orujo de vino hollejos, pepitas, raspón y restos de industrias alcoholeras y lías de vinificación).

INTRODUCCIÓN

El grupo FQM-‐227 tiene una antigüedad de más de 20 años, buena parte de los cuales se ha dedicado a la automatización de sistemas dinámicos, especialmente a la aceleración y mejora de la preparación de la muestra. Paralelamente a esta investigación desarrolló estudios metabólicos aun antes de que la disciplina metabolómica se designara como tal. Con las plataformas instrumentales con las que cuenta actualmente el Grupo (cromatógrafos de gases y de líquidos acoplados a espectrómetros de masas de trampa de iones, de triple cuadrupolo y de tiempo de vuelo), la investigación que desarrolla abarca 2 líneas principales de las que se expondrán ejemplos de estudios ya completados o que actualmente se están desarrollando:

(1) Plataformas analíticas en metabolómica/proteómica.

(1.i) Área nutricional: En el área de la nutrimetabolómica se han desarrollado plataformas para el análisis orientado (targeted analysis) de las diferentes familias de lípidos derivadas de los ácidos grasos poli-‐insaturados omega-‐6 y omega-‐3 a través de sus rutas biosintéticas la de la ciclooxigenasa (COX), la de la lipoxigenasa (LOX) y la del citocromo P-‐450 , con especial énfasis en el metabolismo del ácido araquidónico. Para ello se ha utilizado como técnica analítica la cromatografía de líquidos espectrometría de masas en tándem (LC MS/MS) con analizador de triple cuadrupolo y como muestra analítica suero humano. Las plataformas se han aplicado conjuntamente al estudio de la modificación de estas rutas (estrechamente implicadas en los mecanismos que provocan la inflamación) causada por la ingesta de alimentos cocinados con aceites de fritura que contenían antioxidantes naturales o artificiales. (Forma parte de la tesis doctoral de C. Ferreiro Vera fecha de lectura: 20/12/2011).

En análisis global se han obtenido las huellas dactilares (fingerprints) mediante LC MS con detector de tiempo de vuelo (LC TOF/MS) de muestras de suero tomadas a diferentes tiempos de pacientes sometidos a dietas ricas/pobres en ácidos grasos saturados o monoinsaturados, o ricas/pobres en

78



hidratos de carbono, durante un periodo de 3 meses. Los perfiles globales obtenidos son un reflejo del metabolismo de los individuos y ponen de manifiesto el efecto de la dieta en la salud de los individuos. (Forma parte de la tesis doctoral de M.I. Orozco Solano. En colaboración con Dr. López Miranda y Dr. Pérez Jiménez del IMIBIC).

(1.ii) Área clínica: En el estudio de enfermedades la investigación se ha centrado hasta el momento en las enfermedades cardiovasculares, para lo que se cuenta con 300 muestras de suero y 115 muestras de orina de enfermos cardiacos, además de un número representativo de muestras de individuos sanos (controles). Los estudios, tanto de huella dactilar como de análisis orientado, han puesto de manifiesto la capacidad de la metabolómica para discernir no sólo entre diferentes enfermedades cardiacas, sino también diferentes grados de desarrollo de la enfermedad en cuestión; lo que supone una ayuda de gran valor para en diagnóstico clínico. (Forma parte de las tesis doctorales de M. Calderón Santiago y de M. A. Fernández Peralbo. En colaboración con el Dr. Galache Osuna del Hospital Miguel Servet de Zaragoza).

Actualmente se realiza la recogida de muestras de aire exhalado y de sudor de enfermos de cáncer de pulmón y de individuos con riesgo de padecerlo para la búsqueda de compuestos que permitan realizar un diagnóstico precoz de la enfermedad. (Formará parte de las tesis doctorales de M. Calderón Santiago y de M. A. Fernández Peralbo. En colaboración con el Dr. Jurado Gámez de la Unidad de Neumología de la UCO).

En proteómica el grupo trabaja en colaboración con el Grupo de Investigación en Proteómica Biomédica de la Universidad de Ginebra liderado por el Dr. Jean-‐Charles Sanchez. La colaboración se centra en el desarrollo de metodologías de análisis de proteínas glicadas en individuos afectados por patologías en las que está implicada la glucotoxicidad.

(1.iii) Área vegetal: En esta área se trabaja principalmente en dos proyectos. El primero de ellos está orientado a la utilización de grupos de compuestos de interés como los fenoles hidrofílicos, los ácidos grasos y los compuestos volátiles como biomarcadores de calidad en los programas de mejora del olivo. Así, estos parámetros de respuesta se pueden utilizar para la selección de genitores o cruzamientos entre variedades que proporcionen perfiles de los compuestos indicados que se ajusten a los niveles de calidad deseados. (Constituye la tesis doctoral de M. El Riachy fecha de lectura: 13/1/2012. En colaboración con el Prof. Rallo Romero del Departamento de Agronomía de la UCO).

79



El segundo proyecto se centra en el estudio del metabolismo de especies resistentes y sensibles a la acción de herbicidas. Esta investigación está permitiendo elucidar por qué ciertas plantas pueden presentar resistencia a la acción de herbicidas de determinados tipos y cómo combatir esta situación. (Constituye las tesis doctorales de A.M. Delgado Rojano próxima lectura y de M. Alcaide Molina. En colaboración con el Prof. de Prado Amián del Departamento de Química Agrícola y Edafología de la UCO).

2. Aprovechamiento de residuos de la industria agroalimentaria.

Esta línea está especialmente orientada a los residuos más abundantes en la agricultura y las industrias derivadas en Andalucía: El olivo/aceite y la vid/vino.

(2.i) Tanto en las hojas del olivo como en el desecho de la industria del aceite obtenido en el proceso en dos fases (el alperujo) existe una concentración muy alta de compuestos antioxidantes (fenoles hidrofílicos, mayoritariamen-‐te) muy beneficiosos para la salud. Se trabaja en el aprovechamiento de estos compuestos mediante extracción con disolventes no tóxicos (agua y etanol) para su uso: en el área alimentaria para el enriquecimiento de otros aceites y otros alimentos (leche, alimentos semisólidos o sólidos); en la industria cosmética para la preparación de cremas de belleza, champús, etc.; en el área ambiental como antiespumantes, etc. (Constituye la tesis doctoral de V. Sánchez de Medina).

(2.ii) Las mezclas etanol agua sobrecalentadas (temperatura por encima de su punto de ebullición y presión suficiente para mantenerlas en estado líquido) permiten extraer de los desechos de la vid y de la industria del vino una serie de compuestos con gran eficiencia, rapidez y bajo coste. Ejemplos de la riqueza no explotada de estos desechos son los siguientes: (a) La obtención de colorantes de las hojas senescentes de la vid (diferentes colorantes en función de la variedad de la vid); (b) extractos de sarmientos, de características muy semejantes a las de las maderas de roble que se utilizan para el envejecimiento de vinos y licores; (c) fracciones lipídicas y polares de las pepitas de uva que forman parte del orujo de vinos, de gran interés en la industria cosmética, alta cocina e industria nutracéutica; (d) hollejos de uva, especialmente tinta, con un gran contenido de colorantes naturales, muy apreciados en la actualidad debido a la prohibición de colorantes artificiales; (e) lías de vinificación, materia prima no explotada para la obtención de colorantes naturales, aminoácidos y antioxidantes.

El estudio discriminante de los extractos obtenidos de cada una de las variedades de la materia prima en cuestión mediante LC TOF/MS permite seleccionar las condiciones de extracción y las variedades más adecuadas para la aplicación en cuestión. La posterior identificación (bases de datos de

80



metabolómica) y la cuantificación mediante LC MS/MS, triple cuadrupolo o GC MS/MS trampa de iones proporciona una base sólida en la que soportar los criterios de aprovechamiento de estos extractos y, en definitiva, de las materias primas poco o nada explotadas. (Constituyen las tesis doctorales de M.P. Delgado de la Torre y A. Peralbo Molina).

81



Ponencias empresas

POMOLOGÍA S.L. (GRUPO AGR157)

RESPONSABLE: Barranco Navero, Diego ............... [email protected] Rallo Romero, Luis .................................................... [email protected] Trujillo Navas, Mª Isabel ........................................... [email protected] Muñoz Díez, Mª Concepción ................................ [email protected] Rodríguez Castillo, Estrella .......................................... [email protected]


Departamento de Agronomía. Universidad de Córdoba.


1. Evaluación y mejora de recursos genéticos del olivo. 2. Manejo de plantaciones de olivar en seto.


Barranco D., Rallo L (1984) Las Variedades de Olivo cultivadas en Andalucía. Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación. Junta de Andalucía

Barranco D¸ Cimato A., Fiorino P., Rallo L., Touzani A., Castañeda C., Serafini F., Trujillo I. (2000) World Catalogue of Olive Varieties. Consejo Oleícola Internacional

Rallo L, Barranco D, Del Río C, Martín A, Tous J, Trujillo I (2005) Variedades de olivo en España. Junta de Andalucía, MAPA y Ediciones Mundi-‐Prensa. Madrid

Barranco D., Fernández-‐Escobar R., Rallo L (2008) El cultivo del olivo. Junta de Andalucía, MAPA y Ediciones Mundi-‐Prensa. Madrid

PONENCIA:

IDOLIVE; EMPRESA DE BASE TECNOLÓGICA

RESUMEN

IDolive es una empresa de base tecnológica (EBT) surgida como resultado de años de investigación del Grupo de Pomología del

mailto:[email protected]

82



Departamento de Agronomía de la Universidad de Córdoba. Esta empresa se constituye como un sólido mecanismo para la aplicación y transferencia al sector de nuevas tecnologías.

La identificación de las distintas variedades de olivo mediante marcadores moleculares y el diagnóstico sanitario para la detección molecular de los patógenos incluidos en el Real Decreto 1678/1999 para la producción de plantas de olivo certificadas enmarca la actividad de IDolive.

Esta empresa se diferencia por su marcado carácter innovador. La exclusividad de sus servicios se debe a la amplia experiencia que IDolive posee en identificación de variedades de olivo, al disponer de una base de datos que incluye los perfiles moleculares y la descripción morfológica de más de 500 variedades pertenecientes a 22 países.

Los análisis ofrecidos por IDolive no sólo acreditarían la identidad varietal, demandado actualmente por la industria viverística, sino también la ausencia de agentes patógenos, uniéndose así a los esfuerzos realizados con el fin de cumplir con la legislación para la producción de plantas de olivo certificadas.

INTRODUCCIÓN

IDolive es una EBT que surge como una spin-‐off dentro del Grupo de Pomología del Departamento de Agronomía de la Universidad de Córdoba. Formada por un equipo multidisciplinar con un marcado carácter científico, se sustenta en los estudios sobre recursos genéticos y mejora genética de olivo del referido grupo durante los últimos 35 años, ámbitos en los que es referente nacional e internacional.

OBJETIVOS

IDolive se basa principalmente en dos servicios:

Identificación de variedades de olivo: Comprobación de la autenticidad varietal e identificación de una muestra desconocida mediante marcadores moleculares Microsatélites o SSRs. Como material de referencia se utilizan variedades correctamente identificadas incluidas en la Base de datos del Departamento de Agronomía de la Universidad de Córdoba.

Diagnóstico sanitario de plantas de olivo: Detección molecular de los patógenos incluidos en el Real Decreto 1678/1999 que regula la producción de plantas de olivo certificadas en España.

83



Los patógenos a detectar son: Hongos: Verticillium dahliae Kleb. (Verticilosis) Bacterias: Pseudomonas savastanoi (Tuberculosis)

Virosis: Arabis mosaic virus (Mosaico del Arabis), Cherry leaf roll virus (Enrollado del ciruelo), Cucumber mosaic virus (Mosaico del pepino) y Strawberry latent ringspot virus (Virus latente de las manchas anulares de la fresa).

La identificación de variedades de olivo por marcadores moleculares, junto con la identificación morfológica, no es ofrecida por ningún otro grupo investigador o empresa privada y supone un gran apoyo e impulso para el desarrollo de la industria viverística de olivo. La capacidad de identificar variedades de olivo requiere una contrastada experiencia en técnicas de identificación de variedades y la disponibilidad de una amplia base de datos que incluya descripciones morfológicas y moleculares de un elevado número de cultivares. El Grupo de Pomología del Departamento de Agronomía dispone de esta experiencia y base de datos como resultado de su labor de identificación del Banco Mundial de Germoplasma de Olivo de Córdoba, con más de 500 variedades pertenecientes a 22 países.

De los diversos trabajos de investigación desarrollados en el Departamento de Agronomía de la Universidad de Córdoba, se concluye que actualmente existe una gran diversidad de variedades de olivo, cuyo número se estima en más de 2000 genotipos. A pesar de su importancia, este gran patrimonio genético en olivo no ha sido suficientemente estudiado ni explotado. En este sentido, la presencia de un número elevado de denominaciones varietales erróneas dificulta el conocimiento del patrimonio genético del olivo. La conservación y el estudio de los recursos genéticos del olivo implica, al igual que para el resto de especies frutales, el establecimiento de colecciones en campo (bancos de germoplasma). El principal problema de las colecciones es la correcta identificación del material existente, así como de las nuevas entradas. La principal actividad de IDolive, la identificación varietal en olivo, sería determinante para proteger el patrimonio genético de la especie, así como para cumplir los objetivos en programas de mejora genética por cruzamiento y para la autentificación varietal de plantas de vivero. A esta identificación varietal, IDolive incorpora análisis sanitarios de evaluación de los patógenos incluidos en el Real Decreto 1678/1999 para la producción de plantas de olivo certificadas. La incorporación de los análisis sanitarios se debe a que por una parte el Consejo Oleícola Internacional y diferentes países están impulsando programas de certificación, debido principalmente a la reciente expansión de la Verticilosis, causada por el hongo Verticillium dahliae Kleb. Esta situación ha

84



suscitado la urgencia de establecer programas de certificación para limitar la difusión de esta grave enfermedad.

Por otro lado, la Consejería de Agricultura y Pesca de la Junta de Andalucía desarrolla una serie de medidas para fomentar la producción de plantones de olivo de categoría certificada, una de estas medidas es el convenio de colaboración que dicha Consejería mantiene actualmente con el Grupo de Pomología de la Universidad de Córdoba para la creación y mantenimiento en Rabanales de una colección de las variedades comerciales de olivo en España. Además se ha iniciado la constitución de un Centro Internacional de Recursos Genéticos de Olivo (CIRGO) donde se pretende conservar y evaluar la mayor parte de las variedades cultivadas de esta especie. La gestión y difusión de esta experiencia y conocimiento mediante la EIBT IDolive es, por tanto, el objetivo de este proyecto.

RESULTADOS

IDolive se constituye como Empresa de Base Tecnológica fomentada por la UCO, en virtud del artículo 17 de la Normativa para la creación de Empresas de Base Tecnológica de la Universidad de Córdoba, aprobada en Consejo de Gobierno el 23 de julio de 2008 y modificada por acuerdo de Consejo de Gobierno del 17 de marzo de 2010. La normativa mencionada permite a la UCO, con la finalidad de fomentar las iniciativas emprendedoras, suscribir convenios de colaboración con empresas de base tecnológica constituidas con participación de su personal docente e investigador, como es el caso de IDolive S.L.

El pasado año 2011 IDolive estuvo presentando sus servicios mediante un stand expositor y una charla informativa al sector en Expoliva 2011, la feria internacional de aceite de oliva e industrias afines. Esta feria, celebrada desde 1983, está consolidada como la más importante del sector a nivel mundial. IDolive estuvo presente en esta nueva edición, uniéndose así a las más de 300 empresas que exponen sus productos y servicios en dicha feria.

La actividad de IDolive no se centra en la mera explotación de resultados de investigación ya consolidados, sino que lo que pretende es la puesta a punto de nuevos productos innovadores, que den respuesta a las necesidades del sector y estén en consonancia con el avance de las tecnologías.

La proyección que IDolive presenta es muy amplia, pudiendo ser un nexo de unión entre la investigación y el mundo empresarial, al poner a disposición de otras empresas sus servicios, siendo a la vez una fuente de empleo y de innovación en la industria agroalimentaria, así como de transferencia de resultados al sector.

85



GRUPO BIO151

BIOMARCADORES MOLECULARES DE CONTAMINACIÓN AMBIENTAL

COMPONENTES:

RESPONSABLE: López Barea, Juan [email protected] Alhama Carmona, José ............................................. [email protected] Chicano Gálvez, Eduardo ......................................... [email protected] Fernández Cisnal, Ricardo ......................................... [email protected] Gómez Chaparro, José Luis .................................... [email protected]


Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Universidad de Córdoba


1. Estudiamos el estrés medioambiental en Doñana con dos proyectos, uno del PN Ciencias y Tecnologías del Medio Ambiente y otro de Excelencia (CICYE, J. Andalucía) con 3 grupos PAI. Los estudios se realizan en organismos de ecosistemas terrestres y acuáticos, mediante la aplicación integradora de distintas tecnologías ómicas: proteómica, transcriptómica y metalómica.

2. Estamos desarrollando dos proyectos de Investigación -‐glucosidasa de

plasma de cordón umbilical como biomarcador de enterocolitis necronizante, fulminante en neonatos. El otro (CSAL, J. Andalucía) es un estudio piloto en el que se lleva a cabo un análisis proteómico de la leche materna madura humana y de leches de fórmula comerciales de inicio.




86



González-‐Fernández M, García-‐Barrera T, Jurado J, Prieto Álamo MJ, Pueyo C, López-‐Barea J, Gómez-‐Ariza JL (2008) Integrated application of Transcriptomics, Proteomics and Metallomics in environmental studies. Pure Appl Chem. 80: 2609-‐2626.

Salas-‐Leiton E, Cánovas-‐Conesa B, Zerolo R, López-‐Barea J, Cañavate JP, Alhama J (2009) Proteomics of juveniles Senegalese sole (Solea senegalensis) affected by gas bubble disease in hyperoxigenated ponds. Mar Biotechnol. 11: 473-‐487

Vioque-‐Fernández A, Alves-‐de-‐Almeida E, López-‐Barea J (2009) Biomarker responses and protein expression profile changes in Procambarus clarkii after chlorpyrifos or carbaryl exposure. Biomarkers 14: 299-‐310.

Gonzalez-‐Fernandez M, García-‐Barrera T, Jurado J, Pueyo C, López-‐Barea J, Gómez-‐Ariza JL (2009) Metallomics integrated with proteomics in deciphering metal-‐related environmental issues. Biochimie 91: 1311-‐1317.

Montes-‐Nieto R, García-‐Barrera T, Gómez-‐Ariza JL, López-‐Barea J (2010). Environmental monitoring of Domingo Rubio stream (Huelva Estuary, SW Spain) by combining conventional biomarkers and Proteomic analysis in Carcinus maenas. Environ Pollut. 158: 401-‐408.

González-‐Fernández M, García-‐Sevillano MA, Jara-‐Biedma R, García-‐Barrera T, Vioque A, López-‐Barea J, Pueyo C, Gómez-‐Ariza JL (2011) Size characterization of metal species in liver and brain from free-‐living (Mus spretus) and laboratory (Mus musculus) mice by SEC-‐ICP-‐MS. Application to environmental contamination assessment. J Anal Atom Spectrom. 26: 141-‐149.

Jurado-‐Gámez B, Fernández Marín MC, Gómez-‐Chaparro Moreno JL, Muñoz Cabrera L, López Barea J, Pérez Jiménez F, López Miranda J (2011) Relationship of oxidative stress and endotelial dysfunction in sleep apnoea. Eur Respir J. 37 (4): 873-‐879.

Abril N, Ruiz-‐Laguna J, Osuna-‐Jiménez I, Vioque-‐Fernández A, Fernández-‐Cisnal R, Chicano-‐Galvez E, Alhama J, López-‐Barea J, Pueyo C (2011) Omic approaches in environmental issues. J Toxicol Environ Health A. 74: 1-‐19.

87



PONENCIA:

PROTEÓMICA PARA EVALUAR EL ESTRÉS AMBIENTAL EN DOÑANA Y SU ENTORNO

RESUMEN

A pesar de su relevancia medioambiental, el Parque Nacional de Doñana (PND) está amenazado por diversos factores concurrentes como la actividad agrícola desarrollada en su entorno, la influencia de los Polos Industriales de Huelva, y los riesgos derivados de la actividad minera, como mostró el vertido de Aznalcóllar de 1998(1). En este estudio se integran perfiles de expresión detectados a nivel proteómico, con métodos de alto rendimiento, para evaluar la calidad ambiental del PND.

INTRODUCCIÓN

El desarrollo de herramientas analíticas para diagnosticar situaciones de estrés es clave en la evaluación del deterioro ambiental. El estudio de la presencia de los contaminantes debe ir unido al de las respuestas biológicas, donde las nuevas tecnologías proteómicas juegan un papel esencial(2,3).

OBJETIVOS

Empleando tecnologías proteómicas de segunda generación se pretende analizar los efectos de la contaminación en el entorno de Doñana. Como bioindicadores se han usado ratones morunos (Mus spretus) y cangrejos rojos americanos (Procambarus clarkii), procedentes de 5 sitios (casa de Bernabé -‐BER-‐, arroyos del Partido -‐PAR-‐, Rocina -‐ROC-‐ y Ajolí -‐AJO-‐, y arrozales del Matochal -‐MAT-‐) con distintos niveles de agroquímicos, metales y plaguicidas, sirviendo de referencia los del Lucio del Palacio -‐LP-‐, en el corazón del PND.

RESULTADOS

Mediante iTRAQ (etiquetado isobárico) se han estudiado 97.384 péptidos y 12.600 posibles identificaciones. Tras la aplicación de varios filtros (XCorr, FDR, mínimo 2 péptidos por proteína identificada, niveles de expresión -‐sobre/subexpresión-‐) obtuvimos una lista de 225 proteínas con diferencias en los 5 sitios estudiados. Con 2D-‐DIGE (electroforesis bidimensional diferencial cuantitativa con marcaje fluorescente) hemos detectado en cangrejos un total de 57 proteínas con patrones de expresión modificados en animales de sitios

88



problema. Algunas de las proteínas identificadas presentan niveles de expresión similares a los obtenidos empleando técnicas transcriptómicas.

Un gran número de proteínas contienen grupos tioles críticos cuya oxidación altera su actividad o propiedades de unión. La oxidación ocurre durante el metabolismo normal o tras ser expuestas a estrés oxidativo, como el provocado por la contaminación ambiental. en animales de Doñana y su entorno se obtuvieron mayores diferencias en cangrejos que en ratones, siendo el orden relativo: MAT>ROC>PAR~LP. Los cangrejos de los arrozales del Matochal han sufrido un fuerte estrés oxidativo, como sugieren los niveles incrementados de proteínas con tioles oxidados. En ratones se han observado distintas formas modificadas (oxidadas) de varias de las proteínas identificadas; dichas modificaciones post-‐traduccionales tienen una importancia clave al dar lugar a diversos productos proteicos a partir de un único gen, los cuales pueden tener funciones distintas.

El análisis funcional de las proteínas identificadas con las distintas aproximaciones muestra cambios en el metabolismo, en la respuesta inmune y frente al estrés, en vías de señalización, en el control del ciclo celular y la proliferación (cáncer), y en la apoptosis.

REFERENCIAS (1)Vioque-‐Fernández A, Alves de Almeida E, López-‐Barea J (2009) Assessment of Doñana National Park contamination in Procambarus clarkii: integration of conventional biomarkers and proteomic approaches. Sci Tot Environ. 407: 1784-‐1797. (2)González-‐Fernández M, García-‐Barrera T, Jurado J, Prieto Álamo MJ, Pueyo C, López-‐Barea J, Gómez-‐Ariza JL (2008) Integrated application of Transcriptiomics, Proteomics and Metallomics in environmental studies. Pure Appl Chem. 80: 2609-‐2626. (3)Abril N, Ruiz-‐Laguna J, Osuna-‐Jiménez I, Vioque-‐Fernández A, Fernández-‐Cisnal R, Chicano-‐Galvez E, Alhama J, López-‐Barea J, Pueyo C (2011) Omic approaches in environmental issues. J Toxicol Environ Health A. 74: 1-‐19.

89



GRUPO BIO187

BIOLOGÍA MOLECULAR DE LOS MECANISMOS DE RESPUESTA A ESTRÉS

COMPONENTES:

RESPONSABLE: Pueyo de la Cuesta, Carmen ......... [email protected] Abril Díaz, Nieves ................................................... [email protected] Prieto Álamo, M. José ............................................. [email protected] Michán Doña, Carmen M. [email protected] Jurado Carpio, Juan ................................................. [email protected] Osuna Jiménez, Inmaculada ..................................... [email protected] Ruiz-‐Laguna, Julia .................................................... [email protected]


Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Universidad de Córdoba.


1. Biotecnología Ambiental:

a. Aplicación integradora de tecnologías ómicas (genómica, proteómica y metalómica) en la evaluación de estrés ambiental en animales de ecosistemas terrestres y acuáticos (P08-‐CVI-‐03829 y CTM2009-‐12858.C02-‐02).

b. Evaluación de Respuestas Biológicas a Contaminantes Convencionales y Emergentes Integrando Métodos Analíticos en Exposiciones Controladas. Validación en Ecosistemas Estuáricos.

2. Acuicultura: Efecto del probiótico Shewanella putrefaciens Pdp11 sobre los patrones de expresión transcripcional y proteica en peces de interés en acuicultura (Solea senegalensis y Sparus aurata) (AGL2011-‐30381-‐C03-‐03. 2012-‐2014).

90




Prieto-‐Álamo M-‐J, Abril N, Osuna-‐Jiménez I, Pueyo C. (2009) Solea senegalensis genes responding to lipopolysaccharide and copper sulphate challenges: Large-‐scale identification by suppression subtractive hybridization and absolute quantification of transcriptional profiles by real-‐time RT-‐PCR. Aquatic Toxicol 91:312-‐319.

Osuna-‐Jiménez I, Williams TD, Prieto-‐Álamo MJ, Abril N, Chipman JK, Pueyo C. (2009) Immune-‐ and stress-‐related transcriptomic responses of Solea senegalensis with lipopolysaccharides and copper sulphate using heterologous cDNA microarrays. Fish & Shellfish Immunol 26:699-‐706.

Gonzalez-‐Fernandez M, García-‐Barrera T, Jurado J, Pueyo C, López-‐Barea J, Gómez-‐Ariza JL (2009) Metallomics integrated with proteomics in deciphering metal-‐related environmental issues. Biochimie 91: 1311-‐1317.

Michán C, Pueyo C. (2009) Growth phase-‐dependent variations in transcript profiles for thioredoxin-‐ and glutathione-‐dependent redox systems followed by budding and hyphal C. albicans cultures. FEMS Yeast Res 9:1078 1090.

González-‐Fernández M, Garcia-‐Sevillano MA, Jara-‐Biedma R, García-‐Barrera T, Vioque A, López Barea J, Pueyo C, Gómez Ariza JL. (2011) Size characterization of metal species in liver and brain from laboratory (Mus musculus) and free-‐living (Mus spretus) mice by SEC-‐ICP-‐MS. Application to environmental contamination assessment. J Anal Atom Spectr 26:141-‐149.

Abril N, Ruiz-‐Laguna J, Osuna-‐Jiménez I, Vioque-‐Fernández A, Fernández-‐Cisnal R, Chicano-‐Gálvez E, Alhama J, López-‐Barea J, Pueyo C. (2011) Omic approaches in environmental issues. J Toxicol Environ Health Part A 74:1001-‐1019.

Pueyo C, Gómez Ariza JL, Bello-‐López MA, Fernández-‐Torres R, Abril N, Alhama J, García-‐Barrera T, López-‐Barea J. (2011) New methodologies for assessing the presence and ecological effects of pesticides in Doñana National Park (SW Spain). Pesticides in the Modern World

91



Trends in Pesticides Analysis (M. Stoytcheva, ed) INTECH Open Access Publisher, chapter 8:165-‐196.

Prieto-‐Álamo MJ, Osuna-‐Jiménez I, Abril N, Alhama J, Pueyo C, López-‐Barea J. (2012) Omics methodologies: new tools in aquaculture studies. En Aquaculture (Z. Muchlisin, ed.) INTECH Open Access Publisher, pp: 361-‐390.

Abril N, Ruiz-‐Laguna J, Pueyo C (2012) Differential expression of the Gstp2 gene between the aboriginal species Mus spretus and the model mouse Mus musculus. Mut Res-‐Gen Toxicol Environ Mut (en prensa).

PONENCIA:

TRANSCRIPTÓMICA AMBIENTAL: EVALUACIÓN DE LOS EFECTOS BIOLÓGICOS DE LA CONTAMINACIÓN EN ORGANISMOS BIOINDICADORES DE ECOSISTEMAS TERRESTRES (MUS SPRETUS) Y ACUÁTICOS (PROCAMBARUS CLARKII).

RESUMEN

Las nuevas metodologías transcriptómicas son muy adecuadas para la evaluación de la calidad medioambiental, ya que proporcionan una visión global de las respuestas provocadas por los contaminantes en los organismos. El trabajo aquí presentado recoge los estudios realizados mediante microarrays heterólogos diseñados para Mus musculus, utilizando el ratón moruno Mus spretus como organismo bioindicador de ecosistemas terrestres y mediante la construcción de genotecas sustractivas por supresión, para utilizar el cangrejo rojo Procambarus clarkii como organismo bioindicador de ecosistemas acuáticos. Los resultados muestran que ambas metodologías ómicas pueden ser usadas en los estudios de contaminación ambiental, pese a la complejidad de los ecosistemas y a la necesidad de usar organismos bioindicador ecológicamente interesantes, pero escasamente estudiados a nivel genético. Los animales que viven en zonas contaminadas, terrestres o acuáticas, presentaron inducción de las respuestas inmune, antinflamatoria y antioxidante, así como alteraciones en diversos procesos metabólicos. En ratones capturados en zonas contaminadas donde abunda la planta Salicornia, se encontró una fuerte represión de los genes implicados en las rutas de biosíntesis

92



de colesterol, por lo que puede ser de gran interés estudiar el mecanismo de la Salicornia en la regulación de los niveles del colesterol.

INTRODUCCIÓN

Las tecnologías ómicas se han propuesto como una alternativa a los biomarcadores convencionales en los estudios de toxicología ambiental, ya que monitorizan cuantitativamente muchas moléculas simultáneamente, dando una visión global de las respuestas biológicas que se alteran en un organismo por exposición a contaminación(1, 2). La aplicación de metodologías basadas en la cuantificación de transcritos a estudios medioambientales se enfrenta al problema de que los organismos elegidos como centinela no son por lo común, organismos modelo y en consecuencia, están escasamente representados en las bases de datos genómicas. El grupo BIO187 tiene amplia experiencia en la cuantificación de los cambios de expresión génica a nivel de transcritos en organismos no modelo de interés comercial(3-‐5) utilizando microarrays heterólogos diseñados para algún organismo modelo, que se hibridan con mRNA del organismo en estudio, al que se le exige proximidad filogenética con el organismo modelo.

OBJETIVOS

El objetivo de este trabajo es la aplicación de técnicas transcriptómicas para la evaluación de los efectos biológicos de la contaminación en organismos bioindicadores no modelo de ecosistemas terrestres (M. spretus) y acuáticos (P. clarkii) y la identificación de posibles biomarcadores moleculares para el seguimiento rutinario de los ecosistemas.

RESULTADOS

Mediante la tecnología de microarrays se han comparado ratones M. spretus capturados en la Reserva Biológica de Doñana (SOL), una zona limpia, con otros capturados en zonas altamente contaminadas en las proximidades de Huelva (el Estero Domingo Rubio -‐DR-‐, afectado por plaguicidas, metales y residuos mineros y el Polo Industrial PS-‐ con fábricas de ácido fosfórico y derivados, plantas metalúrgicas, refinerías, etc.). En hígado de ratones capturados en DR se identificaron 39 genes con diferencias de expresión (inducción o represión) mayores de 10 veces respecto a los controles. La categorización funcional de estos genes indicó una fuerte alteración de las respuestas inmune/antinflamatoria y antioxidante. La respuesta obtenida con los ratones capturados en PS, con 133 genes diferencialmente expresados, fue similar, excepto en lo referente al metabolismo lipídico, ya que los ratones de

93



PS tenían reprimida la expresión de genes implicados en varios pasos de la ruta de biosíntesis de colesterol. Sin descartar otros factores, es posible que esta respuesta esté asociada a una dieta rica en Salicornia, planta halófita que abunda en la zona, que es usada en medicina tradicional por sus propiedades antioxidantes, antinflamatorias y antihiperlipidémicas(6).

Procambarus clarkii es un buen organismo centinela de ecosistemas acuáticos(7), pero sin relación filogenética con organismos modelo para los cuales existan microarrays comerciales. En este caso, el estudio transcriptómico se abordó mediante hibridación sustractiva por supresión. Los animales problema se capturaron en los alrededores de Doñana, donde se practica una agricultura intensiva, y de nuevo SOL fue la zona control. También en este caso los transcritos diferencialmente expresados entre animales control y problema correspondieron a genes relacionados con respuesta inmune y respuesta a estrés.

Los resultados aquí descritos demuestran que las metodologías ómicas pueden ser usadas en los estudios de contaminación ambiental, pese a la complejidad de los ecosistemas y a la necesidad de usar organismos bioindicadores pobremente representados en las bases de datos de secuencias de genes y/o proteínas. También queda de manifiesto que la exposición a los contaminantes induce respuesta inmune crónica y alteraciones en multitud de procesos metabólicos. Por último, cabe reseñar el interés que puede tener el estudiar las bases moleculares del efecto de la salicornia sobre el metabolismo del colesterol.

REFERENCIAS

(1) Abril N, Ruiz-‐Laguna J, Osuna-‐Jimenez I, et al. (2011) Omic approaches in environmental issues. J Tox Environ Health A. 74: 1001-‐1019.

(2) Pueyo C, Gómez-‐Ariza J-‐L, Bello-‐López M-‐A, et al. (2011). New methodologies for assessing the presence and ecological effects of pesticides in Doñana National Park (SW Spain). In: Stoytcheva M, ed. Pesticides in the Modern World. InTech, pp: 167-‐196.

(3) Osuna-‐Jimenez I, Williams TD, Prieto-‐Alamo MJ, Abril N, Chipman JK, Pueyo C. (2009) Immune-‐ and stress-‐related transcriptomic responses of Solea senegalensis stimulated with lipopolysaccharide and copper sulphate using heterologous cDNA microarrays. Fish Shellfish Immunol. 26: 699-‐706.

(4) Prieto-‐Alamo MJ, Abril N, Osuna-‐Jimenez I, Pueyo C. (2009) Solea senegalensis genes responding to lipopolysaccharide and copper sulphate challenges: large-‐scale identification by suppression subtractive hybridization and absolute quantification of transcriptional profiles by real-‐time RT-‐PCR. Aquat Toxicol. 91: 312-‐319.

94



(5) Prieto-‐Álamo MJ, Osuna-‐Jiménez I, Abril N, Alhama J, Pueyo C, López-‐Barea J. (2012). Omics Methodologies: New Tools in Aquaculture Studies. In: Muchlisin Z, ed. Aquaculture. InTech, pp: 361-‐390.

(6) Kim JY, Cho J-‐Y, Ma Y-‐K, et al. (2011) Dicaffeoylquinic acid derivatives and flavonoid glucosides from glasswort (Salicornia herbacea L.) and their antioxidative activity. Food Chemistry. 125: 55-‐62.

(7) Vioque-‐Fernandez A, Alves de Almeida E, Lopez-‐Barea J. (2009) Assessment of Donana National Park contamination in Procambarus clarkii: integration of conventional biomarkers and proteomic approaches. Sci Total Environ. 407: 1784-‐1797.

95



GRUPO BIO202

HOMEOSTASIS DE CATIONES EN LEVADURAS

COMPONENTES:

RESPONSABLE DE LA LÍNEA DE INVESTIGACIÓN: Ramos Ruiz, José ...................................................... [email protected] Gelis, Samuel ......................................................... [email protected] Alvarez Morales, María C. ...................................... [email protected] Herrera Vega, Rito ................................................. [email protected] Calero Dueñas, Fernando ....................................... [email protected] Medina Navarro, Teresa ...................................... [email protected] Morales Prieto, Noelia .......................................... [email protected] García Barbado, Casimiro ...................................... [email protected] Santana Martín , Ulises ........................ [email protected] García García, Transito ............................. [email protected]


Departamento de Microbiología. Universidad de Córdoba.


A pesar de ser un catión relativamente poco abundante, las células de todos los organismos vivos, acumulan grandes cantidades de potasio para cumplimentar diversas funciones. Por el contrario, otro catión alcalino, el sodio, es muy común en los ecosistemas naturales pero se comporta como tóxico si se acumula por encima de determinadas concentraciones. Utilizando levaduras como organismos modelo, nuestro grupo está interesado en el estudio de los procesos de homeostasis de estos cationes.


Greiner T, Ramos J, Alvarez M, Gurnon J, Kang M, Van Etten J, Moroni A, Thiel, G (2011) A Functional HAK/KUP/KT-‐like Potassium Transporter Encoded by Chlorella Viruses. Plant Journal 68: 977-‐86

96



Barreto L, Canadell D, Petrezsélyová S, Navarrete -‐Valle J, Herrera R, Giraldo J, Olier I, Sychrová H, Yenush L, Ramos J, Ariño J (2011) A genome-‐wide screen for tolerance to cationic drugs reveals genes important for potassium homeostasis in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryotic Cell. 10: 1241-‐50

Ramos J, Ariño J, Sychrova H (2011) Alkali-‐metal-‐cation influx and efflux systems in nonconventional yeast species. FEMS Microbiol Lett. 317: 1-‐8

Martínez JL, Sychrova H, Ramos J (2011) Monovalent cations regulate expression and activity of the Hak1 potassium transporterin Debaryomyces hansenii. Fungal Genet Biol 48: 177-‐184

Rodríguez C, Tejera P, Medina B, Guillén R, Domínguez A, Ramos J, Siverio J M. (2010) Ure2 is involved in nitrogen catabolite repression and salt tolerance via. J Biol Chem 285: 37551-‐37560

Curto M, Valledor L, Navarrete C, Gutierrez D, Ramos J, Jorrín J. (2010) 2-‐DE based proteomic analysis of Saccharomyces cerevisiae wild and K+ transport-‐affected mutant (trk1,2) strains at the growth exponential and stationary phases. J. Proteomics 73: 2316-‐2335

Casado C, Yenush L, Melero C, Ruiz M, Serrano R, Pérez-‐Valle J, Arino J, Ramos J (2010) Regulation of Trk-‐dependent potassium transport by the calcineurin pathway involves the Hal5 Kinase FEBS Letters 584: 2415-‐2420

Findon H, Calcagno-‐Pizarelli AM, Martínez JL, Spielvogel A, Markina-‐Iñarrairaegui A, Indrakumar T, Ramos J, Peñalva MA, Espeso E, Herb A (2010) Analysis of a novel calcium auxotrophy in Aspergillus nidulans. Fungal Genetics and Biology 47: 647-‐655

Navarrete C, Petrezsélyová S, Barreto L, Martínez JL, Zahrádka J, Ariño J, Sychrová H, Ramos J (2010) Lack of main K+ uptake systems in Saccharomyces cerevisiae cells affects yeast performance both in potassium sufficient and limiting conditions FEMS Yeast Research 10: 508-‐517

Ariño J, Ramos J, Sychrova H (2010) Alkali-‐metal cation transport and homeostasis in yeasts Microbiol. Mol. Biol. Rev. (2010) 74:95-‐120

Ferrer-‐Dalmau J, González A, Platara M, Navarrete C, Martínez JL, Barreto L, Ramos J, Ariño J, Casamayor A (2010) Ref2, a regulatory subunit of the yeast protein phosphatase 1, is a novel component of cation homeostasis Biochemical Journal 426: 355-‐364

97



PONENCIA:

HOMEOSTASIS DE POTASIO Y SODIO EN LEVADURAS NO CONVENCIONALES

RESUMEN

La regulación de los contenidos y flujos de potasio y sodio es un proceso fundamental para la vida. En la levadura Saccharomyces cerevisiae se dispone de abundante información sobre el tema, conocemos las proteínas transportadoras implicadas y algunas de las vías que las regulan. Sin embargo este organismo ha resultado ser un modelo de trabajo insuficiente puesto que no cubre las diferentes posibilidades y la diversidad evolutiva en el tema de la homeostasis de cationes.

Nuestro trabajo está planteado en torno a tres grandes bloques:

1.-‐ Flujos de potasio en levaduras no convencionales.

Tres especies de levaduras no convencionales, con interés tanto desde el punto de vista biotecnológico como clínico, han sido seleccionadas: Debaryomyces hansenii, Hansenula polymorpha y Candida albicans. Aunque el estado del conocimiento es muy desigual en las tres, podemos afirmar que consiguen el objetivo común de la homeostasis de cationes a través de mecanismos diferentes a los presentes en S. cerevisiae.

2.-‐ Distribución intracelular de cationes en levaduras.

Aunque conocemos el contenido total de potasio y sodio en levaduras crecidas o incubadas en muy diversas condiciones, es sorprendente el hecho de que no disponemos de un método efectivo para determinar la distribución intracelular de estos cationes. Este factor juega un papel básico en la fisiología celular y en la respuesta a estrés salino. Trabajamos para establecer una metodología que permita abordar esta problemática tanto en la levadura S. cerevisiae como en las levaduras no convencionales citadas anteriormente.

3.-‐ Relación entre el estrés salino y el estrés oxidativo en levaduras no convencionales. Aislamiento y caracterización de levaduras procedentes de alimentos ricos en sal.

98



En las levaduras S. cerevisiae y Sch. pombe se ha descrito una respuesta global a distintos tipos de estrés medioambiental. Nosotros investigamos la relación entre el estrés salino y el estrés oxidativo en levaduras no convencionales.

INTRODUCCIÓN

Potasio y sodio son los dos cationes alcalinos más importantes para la fisiología celular aunque por dos razones muy diferentes. Mientras que el primero es necesario y se acumula en contra de gradientes de concentración muy elevados, el segundo se comporta habitualmente como un tóxico que puede llegar a envenenar a la célula si alcanza ciertos niveles intracelulares. Aunque todas las células y, por supuesto las levaduras, comparten el objetivo común de la homeostasis de potasio y sodio, hoy en día estamos empezando a comprender que las estrategias para conseguirlo son muy diferentes y que, de hecho, Saccharomyces no parece ser un modelo suficiente (Ariño et al 2010). Estudios recientes demuestran que hay grandes diferencias entre las rutas y las sensibilidades frente a distintos tipos de estrés en especies como S. cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe ó Candida albicans, lo cual reflejaría las diferencias en los nichos ambientales que ocupan las distintas especies. Existen levaduras que habitan otros ecosistemas, que poseen un metabolismo diferente o que pueden comportarse como patógenas y el estudio de estas levaduras no convencionales aborda un aspecto novedoso al que no se ha prestado suficiente atención. S. cerevisiae y Sch. pombe son de las pocas levaduras que sólo poseen transportadores de potasio tipo Trk, en otras levaduras con interés biotecnológico y clínico sabemos hoy que los transportadores del catión son más diversos y ahora vislumbramos que las vías de señalización y de regulación también lo son. De hecho, estudios moleculares indican la existencia de genes que son específicos (los genes HAK no se encuentran ni en S. cerevisiae ni en Sch. pombe ) o que poseen peculiaridades que les hacen poseer funciones diferentes a las que desempeñan en las levaduras modelo (KHA1 codifica para un transportador intracelular de potasio que en la levadura de ambientes salinos D. hansenii ha evolucionado para transportar sodio en lugar de potasio (Ramos et al 2011).

Hemos decidido utilizar tres levaduras no convencionales de interés básico y también biotecnológico, industrial y clínico: la levadura halotolerante D. hansenii, de ambientes salinos; la levadura metilotrófica Hansenula polymorpha que, además, es capaz de asimilar nitrato, y la levadura C. albicans que se comporta como patógena.

Por otra parte, incluso en S. cerevisiae, no conocemos como se distribuyen intracelularmente los cationes potasio y sodio. Se ha asumido que, tanto en

99



levaduras como en plantas, la distribucion debe ser un factor importante de halotolerancia, pero la única información significativa sobre el tema es la proporcionada por el grupo de Okorokov en los años 80 siguiendo una metodología que ha resultado ser simplista e incompleta (Okorokov et al 1980). Finalmente, hay que indicar que en las levaduras modelo S. cerevisiae y Sch. pombe se ha descrito una respuesta global a distintos tipos de estrés medioambiental (salino, térmico, oxidativo, etc.) que se denomina ESR (Environmental Stress Response). Sin embargo, este puede no ser un mecanismo general y está en entredicho en otras levaduras. Nosotros estudiamos esta posible respuesta en relación al estrés oxidativo.

OBJETIVOS

A continuación aparecen los Objetivos específicos que persigue nuestro trabajo actual:

1.-‐ Transporte de potasio en levaduras no convencionales 1.1 Transporte de potasio en D. hansenii

1.1.a Adaptación de herramientas bioquímicas (medida de pH intracellular, potencial de membrane relativo) y moleculares 1.1.b Obtención de mutantes carentes de los transportadores Hak1 y/o Trk1 1.1.c Caracterización de un grupo de cepas de Debaryomyces que ya poseemos en nuestro laboratorio en relación con el carácter halotolerancia 1.1.d Alteraciones del proteoma inducidas por presencia de sal

1.2 Transporte de potasio en H. polymorpha 1.2a Estudio de mutantes hak1, trk1 y de dobles mutantes hak1,trk1 1.2.b Búsqueda de un posible tercer transportador de potasio

1.3 Transporte de potasio en C. albicans. 1.3.a Aislamiento y caracterización de mutantes de transporte 1.3.b Relaciones con los procesos de morfogénesis

2.-‐ Distribución intracelular de potasio y sodio en levaduras 2.1 Puesta a punto de un procedimiento que permita analizar la distribución intracelular de potasio y sodio en cepas control de S. cerevisiae crecidas en diversas condiciones (ayuno de potasio, presencia de sodio, etc). 2.2 Análisis de las repercusiones que una estructura defectiva acarrea en la distribución de cationes y en la actividad celular. Utilizacion de mutantes carentes de estructuras funcionales (por ejemplo sin vacuolas) o de determinados transportadores de membranas.

100



2.3 Estudio de la distribución intracelular de cationes en levaduras no convencionales. Este punto es de especial importancia en el caso de la levadura halotolerante D. hansenii, cuya distribución intracelular de Na+ podría ser un importante determinante de halotolerancia.

3.-‐ Estrés salino y estrés oxidativo en levaduras no convencionales. 3.1. Levaduras no convencionales de laboratorio (Dh, Ca y Hp).

3.1a Determinación de protección cruzada entre el estrés oxidativo y el estrés salino. 3.1b Determinación de marcadores de estrés oxidativo tras exposición a estrés salino.

3.2. Aislamiento y caracterización de levaduras silvestres provenientes de alimentos ricos en sal.

3.2a Aislamiento de estirpes silvestres de alimentos ricos en sal: quesos y embutidos. 3.2b Caracterización de las estirpes aisladas con especial atención a su tolerancia salina y oxidativa.

RESULTADOS

Actualmente trabajamos en los tres grandes Objetivos planteados. Resultados específicos serán mostrados durante la presentación oral. De manera muy resumida podemos afirmar que (i) hemos puesto a punto técnicas de análisis de pH intracelular y potencial de membrana relativo en levaduras no convencionales (ii) estamos caracterizando los flujos de potasio en D. hansenii y H. polymorpha (iii) avanzamos en el diseño de una metodología que permita analizar la distribución intracelular de cationes en levaduras y (iv) hemos decrito por primera vez la existencia de un efecto protector del sodio sobre los procesos de estrés oxidativo en la levadura halotolerante D. hansenii.

REFERENCIAS

Ariño J, Ramos J, Sychrova H (2010) Alkali-‐metal cation transport and homeostasis in yeasts. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74: 95-‐120.

Ramos J, Ariño J, Sychrová H. (2011) Alkali-‐metal-‐cation influx and efflux systems in nonconventional yeast species. FEMS Microbiol Lett. 317:1-‐8.

Okorokov LA, Lichko LP, Kulaev IS (1980) Vacuoles: main compartments of potassium, magnesium, and phosphate ions in Saccharomyces carlsbergenis cells. J Bacteriol. 144:661-‐5.





101




LA CORTISTATINA NO ES UN MERO ANÁLOGO NATURAL DE LA SOMATOSTATINA: ESTUDIO ENDOCRINO-‐METABÓLICO DE RATONES DEFICIENTES EN CORTISTATINA.

Raúl Luque Huertas

R.L.H. es doctor en Biología por la Universidad de Córdoba. Realizó una estancia postdoctoral en la Universidad de Illinois, Chicago (USA). En la actualidad es Investigador Contratado del Programa Ramón y Cajal en el grupo BIO139 (L2).

RESUMEN

INTRODUCCIÓN

Cortistatina (CORT) y somatostatina (SST) son dos neuropéptidos estrechamente relacionados estructural, farmacológica y funcionalmente. De hecho, CORT actúa a través de los mismos receptores que SST (sst1-‐5) y se la ha considerado un análogo natural de SST. Sin embargo, existen datos que indican que CORT podría ejerce funciones específicas propias a través de receptores selectivos (ej. receptor de ghrelina GHS-‐R1a).

OBJETIVOS

El presente trabajo de investigación se ha dirigido a realizar, por primera vez, una profunda caracterización endocrino-‐metabólica de los ratones deficientes en CORT con respecto a sus controles normales y con respecto a los ratones deficientes en SST in vivo. Además, se determinó el efecto directo de la CORT sobre cultivos primarios de hipófisis de ratón y de primate.

RESULTADOS

La CORT ejerce funciones únicas, diferentes a la SST, sobre distintos ejes hipofisarios-‐metabólicos. Así, observamos que CORT estimula (mientras que SST inhibe) la secreción de prolactina (PRL) en ratones y primates, un efecto estimulador que CORT ejerce a través del GHS-‐R1a, pues se bloqueó en presencia de un antagonista del GHS-‐R1a. En apoyo de estos resultados, los ratones CORT-‐KO sufren una disminución de PRL circulante y la proporción de hembras CORT-‐KO que sacan adelante su primera camada de crías es mucho

102



menor que el de las hembras control, todo lo cual sugiere que la CORT ejerce un papel fisiológico relevante en el eje lactotrópico. Asimismo, la CORT ejerce importantes acciones inhibidoras, sexo-‐dependientes, sobre los ejes somatotropo-‐(GH) y corticotropo-‐(ACTH), los cuales están elevados en ratones CORT-‐KO in vivo y son inhibidos por CORT in vitro. Además, la deficiencia en CORT reveló un papel esencial, sexo-‐dependiente de este péptido en la regulación de la homeostasis glucídica/insulínica, pues sólo los machos CORT-‐KO y no las hembras CORT-‐KO o machos/hembras SST-‐KO, son resistentes a la insulina. Nuestros resultados demuestran que muchas acciones ejercidas por la CORT no son compartidas por la SST, lo que sugiere una relevancia singular para este péptido y ofrece nuevas vías para investigar su verdadero papel fisiológico en la regulación de procesos endocrinos y metabólicos.


Nuestro grupo investiga las bases celulares y moleculares de la regulación neuroendocrino-‐metabólica y sus disfunciones en tumores y cáncer. En especial, estudiamos el papel de los sistemas de los neuropéptidos somatostatina, cortistatina, ghrelina, kisspeptinas y sus receptores (sst1-‐5, GHS-‐R, Kiss1r) y rutas de señal asociadas. Partiendo de su estudio en la regulación de la secreción hormonal hipofisaria, analizamos el papel de estas moléculas en la homeostasis metabólica y el desarrollo de patologías relevantes: cáncer de mama, obesidad, diabetes y tumores hipofisarios y neuroendocrinos. Como fin último pretendemos descubrir y transferir nuevas dianas moleculares aplicables al diseño de estrategias terapéuticas innovadoras.

PUBLICACIONES MÁS RELEVANTES (últimos 2 años):

Córdoba-‐Chacón J, Gahete MD, Culler MD, Castaño JP, Kineman RD, Luque RM (2012) Somatostatin dramatically stimulates growth hormone release from primate somatotropes acting at low doses via sst5 and cAMP. J Neuroendocrinol. doi: 10.1111/j.1365-‐2826.2011.02261.x. [Epub ahead of print]

Córdoba-‐Chacón J, Gahete MD, Castaño JP, Kineman RD, Luque RM (2012) Homologous and heterologous in vitro regulation of pituitary receptors for somatostatin, growth hormone (GH)-‐releasing hormone, and ghrelin in a nonhuman primate (Papio anubis). Endocrinology 153(1):264-‐72.

103



Córdoba-‐Chacón J, Gahete MD, Pozo-‐Salas AI, Martínez-‐Fuentes AJ, de Lecea L, Gracia-‐Navarro F, Kineman RD, Castaño JP, Luque RM (2011) Cortistatin is not a somatostatin analogue but stimulates prolactin release and inhibits GH and ACTH in a gender-‐dependent fashion: potential role of ghrelin. Endocrinology 152(12):4800-‐12.

Durán-‐Prado M, Gahete MD, Hergueta-‐Redondo M, Martínez-‐Fuentes AJ, Córdoba-‐Chacón J, Palacios J, Gracia-‐Navarro F, Moreno-‐Bueno G, Malagón MM, Luque RM, Castaño JP (2011) The new truncated somatostatin receptor variant sst5TMD4 is associated to poor prognosis in breast cancer and increases malignancy in MCF-‐7 cells. Oncogene. 2011 Sep 19. doi: 10.1038/onc.2011.389. [Epub ahead of print]

Gahete MD, Córdoba-‐Chacón J, Hergueta-‐Redondo M, Martínez-‐Fuentes AJ, Kineman RD, Moreno-‐Bueno G, Luque RM, Castaño JP (2011) A novel human ghrelin variant (In1-‐ghrelin) and ghrelin-‐O-‐acyltransferase are overexpressed in breast cancer: potential pathophysiological relevance. PLoS One 6(8):e23302.

Luque RM, Córdoba-‐Chacón J, Gahete MD, Navarro VM, Tena-‐Sempere M, Kineman RD, Castaño JP (2011) Kisspeptin regulates gonadotroph and somatotroph function in nonhuman primate pituitary via common and distinct signaling mechanisms. Endocrinology 152(3):957-‐66. Epub 2011 Jan 5.

Martínez-‐Fuentes AJ, Molina M, Vázquez-‐Martínez R, Gahete MD, Jiménez-‐Reina L, Moreno-‐Fernández J, Benito-‐López P, Quintero A, de la Riva A, Diéguez C, Soto A, Leal-‐Cerro A, Resmini E, Webb SM, Zatelli MC, degli Uberti EC, Malagón MM, Luque RM, Castaño JP (2011) Expression of functional KISS1 and KISS1R system is altered in human pituitary adenomas: evidence for apoptotic action of kisspeptin-‐10. Eur J Endocrinol 164(3):355-‐62.

Córdoba-‐Chacón J, Gahete MD, Castaño JP, Kineman RD, Luque RM (2011) Somatostatin and its receptors contribute in a tissue-‐specific manner to the sex-‐dependent metabolic (fed/fasting) control of growth hormone axis in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab 300(1):E46-‐54.

Gahete MD, Rubio A, Córdoba-‐Chacón J, Gracia-‐Navarro F, Kineman RD, Avila J, Luque RM, Castaño JP (2010) Expression of the ghrelin and

104



neurotensin systems is altered in the temporal lobe of Alzheimer's disease patients. J Alzheimers Dis 22(3):819-‐28.

Durán-‐Prado M, Saveanu A, Luque RM, Gahete MD, Gracia-‐Navarro F, Jaquet P, Dufour H, Malagón MM, Culler MD, Barlier A, Castaño JP (2010) A potential inhibitory role for the new truncated variant of somatostatin receptor 5, sst5TMD4, in pituitary adenomas poorly responsive to somatostatin analogs. J Clin Endocrinol Metab 95(5):2497-‐502.

Gahete MD, Rubio A, Durán-‐Prado M, Avila J, Luque RM, Castaño JP (2010) Expression of Somatostatin, cortistatin, and their receptors, as well as dopamine receptors, but not of neprilysin, are reduced in the temporal lobe of Alzheimer's disease patients. J Alzheimers Dis 20(2):465-‐75.

Córdoba-‐Chacón J, Gahete MD, Duran-‐Prado M, Pozo-‐Salas AI, Malagón MM, Gracia-‐Navarro F, Kineman RD, Luque RM, Castaño JP (2010) Identification and characterization of new functional truncated variants of somatostatin receptor subtype 5 in rodents. Cell Mol Life Sci 67(7):1147-‐63.

Durán-‐Prado M, Gahete MD, Martínez-‐Fuentes AJ, Luque RM, Quintero A, Webb SM, Benito-‐López P, Leal A, Schulz S, Gracia-‐Navarro F, Malagón MM, Castaño JP (2009) Identification and characterization of two novel truncated but functional isoforms of the somatostatin receptor subtype 5 differentially present in pituitary tumors. J Clin Endocrinol Metab 94(7):2634-‐43.

105



GRUPO BIO117

METABOLISMO DEL NITRÓGENO MICROBIANO

COMPONENTES:

RESPONSABLE: Castillo Rodríguez, Francisco ......... [email protected] Roldán Ruiz, María Dolores ................................... [email protected] Luque Almagro, Víctor Manuel ................................ [email protected] Sáez Melero, Lara Paloma ...................................... [email protected] Ibáñez García, María Isabel .................................... [email protected] Caballero Domínguez, Francisco Javier .................. [email protected] Escribano Fernández, María de la Paz ..... [email protected] Blanco Moreno, Rafael ..................................... [email protected] Manso Cobos, Isabel María .................................... [email protected] Moreno Vivián, Conrado ........................................ [email protected]




Biodegradación bacteriana de residuos cianurados y otros contaminantes nitrogenados.


Luque-‐Almagro VM, Merchán F, Blasco R, Igeño MI, Martínez-‐Luque M, Moreno-‐Vivián C, Castillo F, Roldán MD (2011) Cyanide degradation by Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344 involves a malate:quinone oxidoreductase and an associated cyanide-‐electron transfer chain. Microbiology-‐UK. 157:739-‐746.

Luque-‐Almagro VM, Blasco R, Martínez-‐Luque M, Moreno-‐Vivián C, Castillo F, Roldán MD (2011) Bacterial cyanide degradation is under review: Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344, a case of an alkaliphilic cyanotroph. Biochem. Soc. Trans. 39:269-‐274.








106



Huertas MJ, Sáez LP, Roldán MD, Luque-‐Almagro VM, Martínez-‐Luque M, Blasco R, Castillo F, Moreno-‐Vivián C, García-‐García I (2010). Alkaline cyanide degradation by Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344 in a batch reactor. Influence of pH. J. Hazard. Mater. 179:72-‐78.

Pérez-‐Reinado E, Roldán MD, Castillo F, Moreno-‐Vivián C (2008) The NprA nitroreductase required for 2,4-‐dinitrophenol reduction in Rhodobacter capsulatus is a dihydropterine reductase. Environ. Microbiol. 10:3174-‐3183.

Luque-‐Almagro V, Huertas MJ, Sáez LP, Luque-‐Romero M, Moreno-‐Vivián C, Castillo F, Roldán MD, Blasco R (2008) Characterization of the Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344 cyanase, an enzyme that is not esential for cyanide assimilation. Appl. Environ. Microbiol. 74:6280-‐6288.

PONENCIA:

BIODEGRADACIÓN DE RESIDUOS INDUSTRIALES CIANURADOS POR LA BACTERIA ALCALÓFILA Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344

RESUMEN

Se han descrito diversos microorganismos capaces de asimilar cianuro, aunque ninguno de ellos presenta las características requeridas para realizar el proceso de biorremediación de cianuro en condiciones óptimas. En nuestro grupo de investigación se ha aislado a partir de lodos del río Guadalquivir (Córdoba) una bacteria extremófila cianotrofa, identificada y depositada en la Colección Española de Cultivos tipo como Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344, que asimila altas concentraciones de cianuro en condiciones extremas de alcalinidad (pH 9-‐10), lo que evita la volatilización del cianuro en forma de ácido cianhídrico. En biorreactores, esta bacteria es capaz de eliminar el cianuro presente en los residuos procedentes de la industria joyera. Se ha secuenciado el genoma completo de P. pseudoalcaligenes CECT5344 y en la actualidad se está finalizando la anotación del mismo. Se ha caracterizado la ruta de degradación de cianuro por P. pseudoalcaligenes, en la que participa una malato:quinona oxidorreductasa asociada a una cadena de trasporte electrónico insensible a cianuro. La malato:quinona oxidorreductasa, a su vez, está relacionada con una nitrilasa inducible por cianuro que transforma 2-‐hidroxinitrilos en amonio y sus respectivos ácidos orgánicos (R-‐COOH).

107



INTRODUCCIÓN

La mayoría de los residuos tóxicos generados por las industrias son difíciles y costosos de tratar por lo que para su eliminación se contempla la posibilidad de usar microorganismos capaces de utilizarlos como fuente de carbono y/o nitrógeno para su crecimiento. Se han descrito varias rutas de degradación de cianuro llevadas a cabo por diferentes microorganismos, pero la mayoría destacan por realizarse a pH neutro. Entre éstas hay que destacar las rutas de hidrólisis, oxidación y sustitución/adición (Gupta, 2010). La hidrólisis del cianuro da lugar a la formación de ácido fórmico y amonio (Kunz et al., 2001). El cianuro se puede oxidar para formar dióxido de carbono y amonio, a veces con cianato como intermediario (Harris y Knowles, 1983). Existen dos tipos de reacciones de sustitución/adición, aquéllas que producen tiocianato a partir de cianuro y tiosulfito (Dubey y Holmes, 1995; Gupta, 2010), y las que producen 3-‐cianoalanina a partir de cianuro y serina o cisteina (Blumenthal et al., 1968; Castric y Strobel, 1969). Teniendo en cuenta que el pKa del par HCN/CN-‐ es de 9,2, existe una alta posibilidad de que a pH neutro una gran cantidad de cianuro se evapore en forma de ácido cianhídrico. El cianuro presenta una elevada afinidad por los metales y en muchos casos, los contaminantes cianurados que se generan están constituidos por el cianuro formando complejos metálicos más que por cianuro libre, el cual se encuentra en una menor proporción. Otra propiedad que caracteriza a los efluentes contaminados por cianuro es el elevado pH al que se encuentran para evitar las pérdidas de cianuro por evaporación. Por todo ello, es interesante contemplar la posibilidad del uso de microorganismos, fácilmente manipulables en el laboratorio, en la descontaminación de residuos cianurados. Se ha aislado una bacteria autóctona a partir de lodos del río Guadalquivir (Córdoba), que ha sido identificada como Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344 y depositada en la Colección Española de Cultivos tipo (Luque-‐Almagro et al., 2005a). Esta estirpe utiliza cianuro, cianato y complejos cianuro-‐metálicos como única fuente de nitrógeno a una concentración de hasta 10 mM (Luque-‐Almagro et al., 2005a; 2005b). P. pseudoalcaligenes CECT5344 es una bacteria alcalófila que presenta un pH óptimo de crecimiento de 9,5, lo que la convierte en una candidata idónea para realizar la degradación de medios líquidos contaminados con cianuro en condiciones alcalinas.

OBJETIVOS

El objetivo principal de nuestro grupo de investigación se centra en el conocimiento de los procesos biodegradativos de contaminantes nitrogenados por bacterias que podrían paliar los problemas de contaminación asociados a ciertas industrias que generan residuos que suponen un riesgo para la salud y

108



el medioambiente. Se cuenta con la colaboración de diversas empresas como GEMASUR S.L., AVENIR S.L. y SAVECO S.L. que gestionan los residuos de la industria joyera de Córdoba. Además, esta línea de investigación se encuentra actualmente financiada con los Proyectos del Ministerio de Ciencia e Innovación/Ministerio de Economía y Competitividad BIO2011-‐30026-‐C02-‐02 y PET2008_0048, y por el Proyecto de Excelencia de la Junta de Andalucía CVI-‐7560.

RESULTADOS

Mediante electroforesis bidimensional se han identificado algunas proteínas de P. pseudoalcaligenes inducidas por cianuro, encontrándose que este compuesto tóxico produce una respuesta a estrés oxidativo, a limitación de nitrógeno, y producción de sideróforos (Huertas et al., 2006; Luque-‐Almagro et al., 2007). También mediante electroforesis 2D se han encontrado otras proteínas que se inducen por cianuro, como la proteína de función desconocida codificada por el gen nitB, que pertenece a la misma agrupación génica (nit1C) que el gen nitC que codifica una posible nitrilasa (Fig. 1), dos proteínas relacionadas con la respiración insensible a cianuro u oxidasa alternativa (CIO), la cianasa (CynS) que cataliza la conversión de cianato en amonio y CynA, el componente periplásmico de un transportador de cianato, aunque se ha comprobado que las rutas de asimilación de cianato y cianuro son diferentes en esta bacteria (Luque-‐Almagro et al., 2008). Por otro lado, la estirpe CECT5344 utiliza como fuente de nitrógeno cianuros orgánicos como la 3-‐cianoalanina, un 3-‐hidroxinitrilo, y varias cianhidrinas (2-‐hidroxinitrilos). Además, se ha encontrado una actividad malato:quinona oxidorreductasa (MQO), que es inducible por cianuro y que produce oxalacetato, el cual podría reaccionar con el cianuro en el citosol para formar su respectiva cianhidrina (Luque-‐Almagro et al., 2011a; 200b). El análisis transcripcional de la agrupación génica nit1C de P. pseudoalcaligenes CECT5344 revela la presencia de dos unidades transcripcionales, una formada por el gen regulador (nitA) y otra con siete genes estructurales (nitB-‐H). Los productos de la agrupación génica nit1C son las siguientes: un activador transcripcional de tipo Fis dependiente de 54 (NitA), una nitrilasa (NitC), una proteína de la familia S-‐adenosilmetionina (NitD), una N-‐aciltransferasa (NitE), un polipéptido con tres funciones perteneciente a la familia AIRS/GARS (NitF), una flavina dependiente de NADH (NitH), y dos proteínas de función desconocida (NitB and NitG). Mediante inserción de casetes de resistencia a antibióticos en los genes nitA, nitB y nitC se han generado las estirpes mutantes respectivas. Así, los mutantes NitA, NitB y NitC de P. pseudoalcaligenes fueron incapaces de crecer con cianuro o 2-‐hidroxinitrilos, demostrándose que la agrupación

109



génica nit1C está involucrada en la asimilación de cianuro y nitrilos (también denominados cianuros orgánicos).

Para la descontaminación de efluentes contaminados por cianuro, como el residuo de la industria joyera, se ha utilizado un reactor de 5 L de capacidad (Huertas et al., 2010) y se ha obtenido un mutante espontáneo resistente a altas concentraciones de cianuro (tolera hasta 100 mM) denominado RC5. En la estirpe CECT5344, que acumula gránulos intracelulares de polihidroxialcanoatos (PHAs) cuando se cultiva en presencia de cianuro, se han identificado los genes implicados en la biosíntesis y el metabolismo de PHAs de cadena corta (scl-‐PHAs), como el polihidroxibutirato (PHB), y PHAs de cadena media (mcl-‐PHAs). Según los datos obtenidos mediante el análisis del genoma, P. pseudoalcaligenes posee tres tipos de polimerasas de PHA con diferente especificidad de sustrato, una sintasa de PHB (PhaC) y dos sintasas de msl-‐PHAs (PhaC1 y PhaC2). Mediante inserción de casetes de resistencia a antibióticos se han obtenido las estirpes mutantes PhaC1ZC2 y PhaC de P. pseudoalcaligenes. La estirpe silvestre acumula gránulos de ambos tipos, PHB y mcl-‐PHAs. La estirpe deficiente en ambas sintasas de cadena media PhaC1 y PhaC2 y en la despolimerasa PhaZ, exclusivamente sintetiza gránulos del tipo PHB, mientras que la estirpe mutante PhaC, sólo acumula gránulos del tipo mcl-‐PHAs.

La anotación del genoma de la estirpe CECT5344 también ha permitido identificar regiones génicas que podrían estar implicadas en la degradación de otros contaminantes (compuestos nitroaromáticos, furfurales, atracina, nitrato/nitrito, arsénico, mercurio).

REFERENCIAS

Gupta N, Balomajumder C, Agarwal VK (2010) Enzymatic mechanism and biochemistry for cyanide degradation: a review. J. Hazard. Mater. 176:1-‐13.

Kunz DA, Fernandez RF, Parab P (2001) Evidence that bacterial cyanide oxygenase is a pterin-‐dependent hydroxylase. Biochem. Biophys. Res. Comun. 287:514-‐518.

Harris R, Knowles CJ (1983) Isolation and growth of a Pseudomonas species that utilizes cyanide as a source of nitrogen. J. Gen. Microbiol. 129:1005-‐1011.

Dubey SK, Holmes DS (1995) Biological cyanide destruction mediated by microorganisms. World J. Microbiol. Biotech. 11:257-‐265.

Blumenthal SG, Hendrickson HR, Abrol YP, Conn EE (1968) Cyanide metabolism in higher plants. J. Biol. Chem. 243:5302-‐5307.

Castric PA, Strobel GA (1969) Cyanide metabolism by Bacillus megaterium. J. Biol. Chem. 244:4089-‐4094.

110



Luque-‐Almagro VM, Blasco R, Huertas MJ, Martínez-‐Luque M, Moreno-‐Vivián C, Castillo F, Roldán MD (2005a) Alkaline cyanide biodegradation by Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344. Biochem. Soc. Trans. 33:168-‐169.

Luque-‐Almagro VM, Huertas MJ, Martínez-‐Luque M, Moreno-‐Vivián C, Roldán MD, García-‐Gil LJ, Castillo F, Blasco R (2005b) Bacterial cyanide degradation and its metal complexes under alkaline conditions. Appl. Environ. Microbiol. 71:940-‐947.

Huertas MJ, Luque-‐Almagro VM, Martínez-‐Luque M, Blasco R, Moreno-‐Vivián C, Castillo F, Roldán MD (2006) Cyanide metabolism of Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344: Role of siderophores. Biochem. Soc. Trans. 34:152-‐155.

Huertas MJ, Luque-‐Almagro VM, Martínez-‐Luque M, Blasco R, Moreno-‐Vivián C, Castillo F, Roldán MD (2006) Cyanide metabolism of Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344: Role of siderophores. Biochem. Soc. Trans. 34:152-‐155.

Luque-‐Almagro VM, Huertas MJ, Roldán MD, Moreno-‐Vivián C, Martínez-‐Luque M, Blasco R, Castillo F (2007) The cyanotrophic bacterium Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344 responds to cyanide by defence mechanism against iron deprivation, oxidative damage and nitrogen stress. Environ. Microbiol. 9:1541-‐1549.

Luque-‐Almagro V, Huertas MJ, Sáez LP, Luque-‐Romero M, Moreno-‐Vivián C, Castillo F, Roldán MD, Blasco R (2008) Characterization of the Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344 cyanase, an enzyme that is not esential for cyanide assimilation. Appl. Environ. Microbiol. 74:6280-‐6288.

Luque-‐Almagro VM, Blasco R, Martínez-‐Luque M, Moreno-‐Vivián C, Castillo F, Roldán MD (2011a) Bacterial cyanide degradation is under review: Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344, a case of an alkaliphilic cyanotroph. Biochem. Soc. Trans. 39:269-‐274.

Luque-‐Almagro VM, Merchán F, Blasco R, Igeño MI, Martínez-‐Luque M, Moreno-‐Vivián C, Castillo F, Roldán MD (2011b) Cyanide degradation by Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344 involves a malate:quinone oxidoreductase and an associated cyanide-‐insensitive electron transfer chain. Microbiology SGM. 157:739-‐746.

Huertas MJ, Sáez LP, Roldán MD, Luque-‐Almagro VM, Martínez-‐Luque M, Blasco R, Castillo F, Moreno-‐Vivián C, García-‐García I (2010) Alkaline cyanide degradation by Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344 in a batch reactor. Influence of pH. J. Hazard. Mater. 179:72-‐78.

111



GRUPO BIO123

ASIMILACIÓN DE NUTRIENTES EN PROCHLOROCOCCUS, CIANOBACTERIA CLAVE EN ECOSISTEMAS MARINOS

COMPONENTES:

RESPONSABLE: Díez Dapena, Jesús ......................... [email protected] García Fernández, José Manuel ............................... [email protected] Toribio Menéndez-‐Valdés, Fermín ......................... [email protected] Gómez Baena, [email protected] Domínguez Martín, María Agustina.................... [email protected] Muñoz Marín, María del [email protected]




1. Mecanismos de regulación del balance nitrógeno/carbono. 2. Mixotrofía en Prochlorococcus, transporte de glucosa.


McDonagh M, Domínguez-‐Martin MA, Gomez-‐Baena G, Lopez-‐Lozano A, Diez J, Barcena JA & Garcia-‐Fernandez JM (2012) Nitrogen starvation induces extensive changes in the redox proteome of Prochlorococcus sp. strain SS120. Environ Microbiol Rep. Accepted

Rangel OA, Gomez-‐Baena G, Lopez-‐Lozano A, Diez J, Garcia-‐Fernandez JM (2009) Physiological role and regulation of glutamate dehydrogenase in Prochlorococcus sp. strain MIT9313. Environ Microbiol Rep. 1:56-‐64

Gomez-‐Baena G, Lopez-‐Lozano A, Gil-‐Martinez J, Lucena JM, Diez J, Candau P, Garcia-‐Fernandez JM (2008) Glucose uptake and its effect on gene expression in Prochlorococcus. PLoS ONE 3(10) e3416. DOI:10.1371/journal. pone.0003416

Gomez-‐Baena G, Garcia-‐Fernandez JM, Lopez-‐Lozano A, Toribio F, Diez J

http://www3.interscience.wiley.com/journal/121641582/abstract

http://www.plosone.org/article/fetchObjectAttachment.action?uri=info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0003416&representation=PDF

112



(2006): Glutamine synthetase degradation is controlled by oxidative proteolysis in the marine cyanobacterium Prochlorococcus marinus strain PCC 9511. Biochim Biophys Acta 1760:930-‐940.

Garcia-‐Fernandez JM, Tandeau de Marsac N, Diez J (2004) Streamlined regulation and gene loss as adaptive mechanisms in Prochlorococcus for optimized nitrogen utilization in oligotrophic environments. Microbiol Mol Biol Rev 68:630-‐638.

PONENCIA:

METABOLISMO DE CARBONO Y NITRÓGENO EN PROCHLOROCOCCUS

INTRODUCCIÓN

Los océanos juegan un papel clave en el ciclo global de nutrientes y la regulación del clima. La cianobacteria unicelular Prochlorococcus es un importante contribuyente a estos procesos, ya que es responsable de una fracción muy importante de la productividad en amplias zonas de los océanos. En el contexto actual de preocupación global por el cambio climático, la importancia de los estudios sobre uno de los principales fijadores de CO2, como Prochlorococcus, resulta evidente.

La importancia de Prochlorococcus ha provocado su utilización como organismo modelo en muy diversos estudios y durante la última década, diversas iniciativas han dado lugar a la secuenciación del genoma de trece estirpes de Prochlorococcus. Sin embargo, en otros campos el conocimiento sobre Prochlorococcus es muy escaso, y en particular en lo referente a los metabolismos del nitrógeno y del carbono.

Resultados previos de nuestro grupo, sobre la absorción de glucosa por Prochlorococcus, permiten sugerir que esta cianobacteria no es un organismo estrictamente autotrófico, sino mixotrófico, lo que le conferiría una importante ventaja en su adaptación al medio en que vive.

En relación con el sistema regulador del metabolismo del nitrógeno y el carbono en cianobacterias, PII es una proteína transductora de señales que se fosforila cuando la célula experimenta un incremento en la relación C/N, y presenta sitios de unión para ATP y 2-‐oxoglutarato, siendo esta molécula clave en el control del balance carbono nitrógeno en estos organismos. El factor transcripcional NtcA es el principal elemento responsable del control del nitrógeno en cianobacterias. Sin embargo, no es mucho lo que se conoce sobre los dos componentes del sistema regulador del nitrógeno en

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=MImg&_imagekey=B6T1W-4J9MWRM-1-H&_cdi=4901&_user=723077&_orig=search&_coverDate=06%2F30%2F2006&_sk=982399993&view=c&wchp=dGLzVtb-zSkWA&md5=d3e3992e764e5c1ed68251960faa6d3e&ie=/sdarticle.pdf

http://mmbr.asm.org/cgi/reprint/68/4/630.pdf



113



Prochlorococcus, y parece claro, resultados previos de nuestro grupo, que ninguno de ellos muestra el comportamiento descrito en otras cianobacterias.

OBJETIVOS

Caracterizar el sistema de transporte de glucosa y confirmar su funcionamiento en el medio natural. Estudio de los mecanismos de control del balance carbono/nitrogeno en el metabolismo de Prochlorococcus. Estudio del proteoma redox de Prochlorococcus en respuestas a cambios nutricionales.

RESULTADOS

La utilización de un azúcar como la glucosa por Prochlorococcus representa un salto conceptual, puesto que la absorción de la misma sólo se justifica por el aporte de esqueletos carbonados, que pueden ser utilizados a continuación, tal y como hemos descrito recientemente. Además, estudios en colaboración con el Dr. Ignacio Luque (IBVF, Sevilla), han mostrado que el gen melB codifica un transportador de glucosa con una constante de afinidad por la misma extraordinariamente baja. Para ello se ha clonado el gen melB que codifica un posible transportador de glucosa en Synechococcus 7942, una estirpe incapaz de transportar glucosa, bajo el control de diferentes promotores. Por otra parte, nuestra participación en la campaña oceanográfica Atlantic Meridional Transect 21 (AMT21) nos han permitido poner de manifiesto el transporte de glucosa por parte de poblaciones naturales de Prochlorococcus, con el objetivo de comprender si existe variabilidad en la tasa de absorción de glucosa, así como si ésta presenta correlación con alguna característica importante de las poblaciones naturales de esta cianobacteria. La mencionada absorción le permitiría obtener moléculas orgánicas utilizables directamente en su metabolismo, lo que representaría un ahorro energético significativo.

En cuanto a la regulación de los metabolismos de carbono y nitrógeno, se han realizado distintos tipos de tratamientos: ausencia de diferentes oligoelementos, luz/oscuridad o distintos tipos de inhibidores entre los que se puede destacar la azaserina, inhibidor de la enzima glutamato sintasa, en las estirpes SS120 y PCC9511. Este tratamiento conduce a una subida en la concentración de 2-‐oxoglutarato que podría afectar a la actividad glutamina sintetasa y a la expresión de genes que participan en el metabolismo del nitrógeno, tales como ntcA, glnB, glnA, icd, o gogat. El mismo tipo de estudio se realizará en una tercera estirpe: MIT9313, con objeto de establecer posibles diferencias que arrojaran luz sobre un modelo de regulación en este tipo de microorganismos.

114



Asímismo, se han iniciado estudios de interacción DNA-‐proteína con el objetivo de investigar el papel que juega el factor de transcripción NtcA en el control del balance N/C. Para ello, por un lado se han clonado y sobrexpresado de forma heteróloga tanto el factor de transcripción NtcA, como dos proteínas reguladoras relacionadas, PII y PipX, de dos estirpes de Prochlorococcus, MIT9313 y SS120 (mismo ecotipo pero diferente aparición a lo largo de la evolución). Por otro, se están clonando los promotores de varios genes involucrados en el metabolismo del N/C (como glnA). Una vez se disponga de todo el material se realizarán estudios de interacción usando la técnica de SPR (Surface Plasmon Resonance) gracias a una colaboración con el Dr. Burkovski en la Universidad Friedrich-‐Alexander Universität Erlangen-‐Nürnberg.

Finalmente, en colaboración con el grupo del Dr. Bárcena, y mediante el uso de técnicas proteómicas de "shotgun" se ha estudiado el efecto de la ausencia de nitrógeno sobre la homeostasis redox de la célula. Esto nos ha permitido identificar una serie de proteínas, tanto relacionadas con el metabolismo del nitrógeno como con otras rutas metabólicas importantes, que muestran cisteínas modificadas de forma diferente respecto a los cultivos control. Estos resultados sugieren que además de los cambios transcripcionales previamente propuestos, Prochlorococcus responde con cambios redox post-‐traduccionales a la carencia de nitrógeno.

REFERENCIAS

Kelly L, Huang KH, Ding H, Chisholm SW (2012) ProPortal: a resource for integrated systems biology of Prochlorococcus and its phage. Nucleic Acids Res. 40: 632-‐640.

Garcia-‐Fernandez JM, Tandeau de Marsac N, Diez J (2004) Streamlined regulation and gene loss as adaptive mechanisms in Prochlorococcus for optimized nitrogen utilization in oligotrophic environments. Microbiol Mol Biol Rev. 68:630-‐638.

Gomez-‐Baena G, Lopez-‐Lozano A, Gil-‐Martinez J, Lucena JM, Diez J, Candau P, Garcia-‐Fernandez JM (2008) Glucose uptake and its effect on gene expression in Prochlorococcus. PLoS ONE 3(10) e3416. DOI:10.1371/journal.pone. 0003416

McDonagh M, Domínguez-‐Martin MA, Gómez-‐Baena G, López-‐Lozano A, Diez J, Bárcena JA, García-‐Fernández JM (2012) Nitrogen starvation induces extensive changes in the redox proteome of Prochlorococcus sp. strain SS120. Environ Microbiol Rep. doi:10.1111/j.1758-‐2229.2012.00329.x.




http://www.plosone.org/article/fetchObjectAttachment.action?uri=info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0003416&representation=PDF

115



GRUPO AGR164

BIOQUÍMICA Y PROTEÓMICA VEGETAL Y AGROFORESTAL

COMPONENTES:

RESPONSABLE: Jorrín Novo, Jesus V ........................ [email protected] Tena Aldave, Manuel .............................................. [email protected] Maldonado Alconada, Ana M. ................................ [email protected] González Fernández, Raquel ................................... [email protected] Echevarría-‐Zomeño, Sira ......................................... [email protected] Simova, Lyudmila ............................................ [email protected] Valero Galván, José ................................................. [email protected] Sghaier-‐Hammami, Besma ........................... [email protected] Molina Gómez, Mari Carmen .............................. [email protected] Redondo López, Inmaculada .................................... [email protected] Romero Rodríguez, Cristina ............................ [email protected] Sánchez Lucas, Rosa ................................................. [email protected] Archidona Yuste, Antonio........................................ [email protected]


Bioquímica y Biología Molecular. Universidad de Córdoba-‐Campus de Excelencia Internacional Agroalimentaria, (ceiA3).


1. Bioquímica y Biología Molecular Vegetal y Agroforestal. 2. Proteómica (plantas, hongos fitopatógenos, levaduras).

Modificaciones postraduccionales, proteoma redox. 3. Transcriptómica, marcadores moleculares de DNA. 4. Aspectos moleculares relacionados con la variabilidad,

embriogénesis y respuesta a estreses bióticos y abióticos en plantas.

5. Metabolismo secundario, compuestos fenólicos.


116



Se incluyen aquellas publicaciones más representativas publicadas en el periodo 2010-‐2012. Más información en la página web: http://www.uco.es/investiga/grupos/probiveag/

ALEDO JC, JIMÉNEZ-‐RIVERES S, TENA M. 2010. The effect of temperature on the enzyme-‐catalyzed reactions: Insights from termodinamics. Journal of Chemical Education 87: 296-‐298. PALOMARES-‐RIUS JE, CASTILLO P, NAVAS-‐CORTÉS JA, JIMÉNEZ-‐DÍAZ RM, TENA M. 2011. A proteomic study of in-‐root interactions between chickpea pathogens: The root-‐knot nematode Meloidogyne artiellia and the soil-‐borne fungus Fusarium oxysporum f. sp. ciceris race 5. Journal of Proteomics 74: 234-‐251.

SGHAIER-‐HAMMAMI B, VALERO-‐GAVAN J, ROMERO-‐RODRÍGUEZ C, NAVARRO-‐CERRILLO RM, JORRÍN-‐NOVO JV. 2011. 2-‐DE based proteomics approach in the study of the Holm oak response to Phytophthora cinnamomi. Phytochemistry (en prensa).

SIRA ECHEVARRÍA-‐ZOMEÑO, NIEVES ABRIL, JULIA RUIZ-‐LAGUNA, JESÚS JORRÍN-‐NOVO, ANA M. MALDONADO-‐ALCONADA. 2012. Simple, rapid and reliable methods to obtain high quality RNA and genomic DNA from Quercus ilex L. leaves suitable for molecular biology Studies. Acta Physiologia Plantarum; . On line first (http://www.springerlink.com/content/r7370105gw011358/fulltext.pdf). DOI: 10.1007/s11738-‐011-‐0880-‐z

RAQUEL GONZALEZ-‐FERNANDEZ, AND JESUS V. JORRIN-‐NOVO. 2012. Contribution of Proteomics to the Study of Plant Pathogenic Fungi. Journal of Proteome Research 11: 3-‐16

JOSÉ VALERO GALVÁN, LUIS VALLEDOR, RAFAEL Mª NAVARRO CERRILLO, JESUS V. JORRÍN-‐NOVO. 2011. Studies of variability in Holm oak (Quercus ilex subsp. ballota (Desf.) Samp.) through proteomic analysis of acorns. Journal of Proteomics 74: 1244-‐1255. doi:10.1016/j.jprot.2011.05.003 .

NIEVES ABRIL, JEAN-‐MARC GION, RENÉ KERNER, GERHARD MÜLLER-‐STARCK, RAFAEL M. NAVARRO CERRILLO, CHRISTOPHE PLOMION, JENNY RENAUT, LUIS VALLEDOR, JESÚS V. JORRIN-‐NOVO. 2011. Proteomics research on forest trees, the most recalcitrant and orphan plant species. Phytochemistry 72: 1219-‐1242.

PONENCIA:

APROXIMACIÓN MOLECULAR AL ESTUDIO E INVESTIGACIÓN TRANSLACIONAL DE ESPECIES FORESTALES: EL CASO DE LA ENCINA (Quercus ilex L.)

http://www.springerlink.com/content/r7370105gw011358/fulltext.pdf

http://dx.doi.org/10.1016/j.jprot.2011.05.003

117



RESUMEN

La encina (Quercus ilex L.) es la especie más importantes y representativa del ecosistema forestal andaluz (la dehesa) y del sur europeo: Nuestro grupo lleva a cabo un proyecto de investigación con esta especie mediante el cual, y utilizando herramientas bioquímicas y las nuevas técnicas ómicas, pretendemos contribuir al avance en el conocimiento de las bases genéticas, moleculares y fisiológicas de la variabilidad natural, desarrollo y respuesta a estreses (sequía y Phytophtora cinnamomi, los dos agentes de mayor incidencia en el síndrome de la seca) en esta especie. Esperamos, con nuestros trabajos, ayudar a la caracterización y conservación de la variabilidad natural en encina, al mantenimiento y gestión sostenible de la dehesa y el bosque mediterráneo, y al desarrollo de programas de reforestación, todos ello considerando los problemas y retos actuales y en un escenario futuro de cambio climático. En el proyecto participan, no sólo los miembros de nuestro grupo, sino también de otros, con mención especial para la Profesora Nieves Abril Díaz, el Profesor Rafael Navarro Cerrillo, la Dra. M. A. Bueno (INIA-‐CIFOR, Córdoba), el Dr. W. Weckwerth (Universidad de Austria), el Dr. Reiner Finkeldey (Universidad de Gottingen, Alemania) y el Dr. C. Plomion (INRA, Francia) Falta Alejandro pérez de Luque. En el proyecto también están implicadas instituciones públicas (Consejería de Medio Ambiente de la Junta de Andalucía) y privadas (COVAP, entre otras).

INTRODUCCIÓN

A pesar de su interés, tanto desde el punto de vista medioambiental como económico, loa encina es una especie poco estudiada a nivel molecular. Dicho interés se pone de manifiesto y queda reflejado en: i) la importancia de las especies forestales en el secuestro del carbono, ciclo del agua, protección del suelo y reserva de biodiversidad); ii) el incremento en los programas de reforestación; ii) la elaboración de una normativa específica sobre la dehesa1 iii) en el incremento del número de publicaciones científicas sobre la género Quercus, en general, y la encina, en particular2. La conservación de la dehesa

1

2 En la base de datos SCI/Web of Knowledge, utilizando como palabras de búsqueda oak o Quercus, aparecen 90 publicaciones en el año 1990 (12 para Q. ilex), número que se ha incrementado a 887 en el año 2011 (144 para Q. ilex), cifra no muy por

118



es, en este momento, un objetivo prioritario, entendido como forma de preservar, desarrollar y revalorizar su riqueza económica, biológica, ambiental, social y cultural, por lo que se hace necesario promover su gestión de una manera integral y sostenible; todo ello a través de su estudio y el desarrollo de nuevas estrategias y técnicas.

Los principales problemas que presenta la dehesa como espacio natural y ente socioeconómico productivo son la continua pérdida de arbolado, la baja productividad que presenta el sistema, y la compleja gestión que requiere, lo que conduce a la necesidad de realizar un doble esfuerzo, tanto en la vertiente científico-‐técnica como en la socioeconómica. En los últimos 30 años ha habido una importante pérdida de masa forestal, asociada a una mala política forestal, con una falta acusada de diversidad de edades en el arbolado, incendios y al decaimiento y síndrome de la seca. Esta situación puede ser incluso pero en un futuro escenario de cambio climático.

El manejo y mantenimiento sostenible del sistema agroforestal requerirá la identificación de rodales selectos y genotipos productivos y adaptados a condiciones ambientales adversas, para lo que habrá que explotar la variabilidad natural existente en encina (típica de especies alógamas poco intervenidas por el hombre). Es necesario establecer y consolidar una línea de investigación sobre el estudio de la variabilidad en encina y la selección de

cular con estudios de relaciones filogenéticas y de dinámica poblacional.

Existe un largo camino antes de que los problemas y retos planteados en relación a la encina, en particular, y a la dehesa, en general, puedan empezar a superarse. Su logro, desde una base científica más que empírica, requiere un estudio multidisciplinar de procesos claves en su ciclo biológico, desde la germinación a la implantación y desarrollo en campo, a la respuesta a factores ambientales adversos (sequía y P. cinnamomi). Los estudios llevados a cabo por nuestros grupos se establecen de acuerdo a la propuesta anterior, intentando cubrir todo el camino que va desde el campo al laboratorio y viceversa, lo que hoy se ha dado en denominar investigación transnacional. Se incluyen técnicas de silvicultura, cultivo in vitro de tejidos y células vegetales, criopreservación, fisiología, bioquímica clásica, y las más modernas ómicas (genómica, transcriptómica, proteómica y metabolómica). El estudio a nivel molecular, con la incorporación de las nuevas técnicas ómicas, nos llevará a la catalogación y caracterización de procedencias, a la selección genotipos

debajo de la de otras especies forestales consideradas modelo: Populus (687 en 2011) o eucalipto (1048 en 2011), aunque muy por debajo del número de especies herbáceas modelo o de cultivo (6789 para Arabidopsis y 5984 para arroz, en el año 2011).

119



deseados y al establecimiento de métodos de propagación clonal sobre la base de marcadores moleculares más que fenotípicos. Todo ello se traducirá en un mayor éxito en los programas de reforestación y en el mantenimiento de ecosistemas agroforestales como es la dehesa. La importancia de los programas de análisis genómico en el género Quercus y su relación con el estudio de la variabilidad y adaptabilidad, se ha reconocido a nivel internacional, con la financiación Europea de proyectos y el establecimiento de consorcios con el fin de secuenciar el genoma de algunas Fagaceas, entre ellas Q. robur y Q. petrea3.

OBJETIVOS

1. Estudio de la variabilidad mediante marcadores moleculares: Proteotipado y genotipado de poblaciones.

2. Análisis proteómico y transcriptómico de la respuesta a sequía y Phytophtora cinnamomi

RESULTADOS

Se han llevado a cabo estudios de variabilidad en poblaciones de encinas mediante análisis morfométrico, NIRS (contenido en proteínas, almidón, lípidos y ácidos grasos), y proteómico de bellotas y polen. Los resultados permitieron agrupar poblaciones de acuerdo a su localización latitudinal y actitudinal. Dicho trabajo forma parte de la Tesis Doctoral de José Valero Galván, y aparecen recogidos en las siguientes publicaciones: Valero et al. (2011, 2012a, b). La variabilidad en el perfil proteico de semillas y polen fue inferior al encontrado en hojas (Jorge et al., 2005, 2006, Echevarría-‐Zomeño et al., 2009), cuyo análisis no permitió discriminar claramente entre poblaciones. Esto es debido al carácter dinámico del proteoma, como fenotipo molecular, y, por lo tanto, a la influencia del ambiente. Presenta la ventaja de dar información adicional que puede ser utilizada en la selección de árboles plus, atendiendo, por ejemplo, a la composición química de bellotas. Teniendo en cuenta las limitaciones de la aproximación de proteómica, se planteó, en paralelo, el análisis de la variabilidad utilizando técnicas de marcadores moleculares de DNA. En relación a este punto, se optimizó, para Quercus métodos de extracción y análisis de DNA y RNA (Echevarría Zomeño, 2011; Echevarría Zomeño et al., 2012). El tipo de marcador molecular más utilizado

3 EVOLTREE (http://www.evoltree.eu/);; GENOAK : Sequencing of the oak genome and identification of genes that matter for forest tree adaptation (https://w3.pierroton.inra.fr/QuercusPortal/index.php?p=OAK%20GENOME%20SEQUENCING)

http://www.evoltree.eu/

120



o SSR (short sequence repeat). Dicha estrategia ha sido utilizada por nuestro grupo, aunque para un número reducido de poblaciones (Abril et al., 2012a). El desarrollo de las técnicas de marcadores moleculares en las últimas décadas ha supuesto un gran avance en el conocimiento de las especies forestales, permitiendo el estudio de su diversidad genética neutral (no influida por la selección e independiente del ambiente), así como su introducción en programas de recursos genéticos. La combinación de los datos obtenidos de diversas regiones polimórficas en el genoma haploide del cloroplasto carente de recombinación y con herencia uniparental paterna, se convierte en un sistema de estudio que nos proporcionará mucha información para el análisis de la diversidad genética de las poblaciones naturales.

Se han llevado a cabo estudios de respuesta a sequía y P.cinnamomi mediante ensayos en cámara de crecimiento de plantas y con un número limitado de poblaciones. Mediante parámetros morfométricos (crecimiento, bioamasa) y fisiológicos (contenido hídrico, apertura estomática e intercambio gaseoso, actividad fotosintética) se ha visto que existe una respuesta diferencial entre poblaciones, con distintas tolerancias a sequía y susceptibilidad al patógeno. Dichos estudios se han completado con el análisis proteómico de muestras de hoja. Los resultados obtenidos se han publicado (Jorge et al., 2006; Echevarría Zomeño et al., 2009), se han enviado para su publicación (Sghaier-‐Hammami et al., 2012). El análisis proteómico (2-‐DE/MS) de hojas reveló la existencia de una respuesta similar en ambas situaciones de estrés, típica de condiciones de déficit hídrico, con cambios observados en enzimas de la fotosíntesis y metabolismo energético y de síntesis de azúcares, así como de proteínas de respuesta a estrés, las cuales pueden ser utilizadas como marcadores de tolerancia y/o resistencia. No obstante, la técnica 2-‐DE presenta un número de limitaciones (no se detectan proteínas minoritarias o de Mr y pI extremo), por lo que, en una segunda etapa, se utilizarán técnicas de proteómica de segunda

-‐fr -‐Dichos estudios permitirán, por una parte, profundizar en el conocimiento de la respuesta a estrés, y, por otro, identificar proteínas marcadoras de resistencia y/o tolerancia. Los estudios proteómicos están siendo validados mediante análisis transcriptómico. El uso de la transcriptómica con especies no modelo, como Quercus, no es fácil y está en sus inicios. Dado que en nuestro caso la información genómica de la especie en estudio es prácticamente nula, la aplicación de la transcriptómica exige aproximaciones

-‐aproximación para el estudio de perfiles transcripcionales de un grupo de genes candidato de respuesta a estrés. Esta aproximación ha implicado el diseño y utilización de cebadores heterólogos para la amplificación de

121



secuencias diana de genes de interés de Q. ilex, la secuenciación de los amplicones y el diseño de nuevos cebadores específicos para las secuencias de Q-‐ ilex obtenidas. Este trabajo supone la primera vez que se estudia la respuesta de genes de Q. ilex a condiciones de estrés hídrico mediante cuantificación absoluta de transcritos (Abril et al., 2012b). La generación de

Suppression Substractive Hybridization) es una aproximación metodológica muy valiosa para la identificación masiva de genes expresados diferencialmente a nivel de mRNA, y su uso se plantea como próximo objetivo. Como resultado de estas estrategias se genera una lista de genes candidatos que deben posteriormente validarse mediante la aplicación de técnicas más precisas, como son las cuantificaciones mediante PCR a tiempo real. Además, el uso en paralelo de tecnologías novedosas que permiten la secuenciación masiva de organismos, nos va a permitir obtener un listado de secuencias que cubrirán gran parte del genoma de Q. ilex.

REFERENCIAS

Abril N, Ruiz Laguna J, Maldonado Alconada A, Jorrín Novo JV. 2012b. Absolute transcript expression signatures of drought responsive genes in Quercus ilex leaves. Manuscrito en preparación

Abril N, Gion JM, Kerner R, Müller-‐Starck G, Navarro Cerrillo RM, Plomion C, Renaut J, Valledor L, Jorrin-‐Novo JV. 2011. Proteomics research on forest trees, the most recalcitrant and orphan plant species. Phytochemistry 72: 1219-‐1242.

Echevarría-‐Zomeño S, Ariza D, Jorge I, Lenz C, Del Campo A, Jorrin JV, et al. 2009. Changes in the protein profile of Quercus ilex leaves in response to drought stress and recovery. J Plant Physiol 66:233 45.

Echevarría-‐Zomeño S, Abril N, Ruiz-‐Laguna J, Jorrín-‐Novo J, Maldonado-‐Alconada A. 2012. Simple, rapid and reliable methods to obtain high quality RNA and genomic DNA from Quercus ilex L. leaves suitable for molecular biology Studies. Acta Physiologia Plantarum;. On line first (http://www.springerlink.com/content/r7370105gw011358/fulltext.pdf). DOI: 10.1007/s11738-‐011-‐0880-‐z

Jorge I, Navarro Cerrillo RM, Lenz C, Ariza D, Porras C, Jorrin J. 2005. The Holm oak leaf proteome: analytical and biological variability in the protein expression level assessed by 2-‐DE and protein identification tandem mass spectrometry de novo sequencing and sequence similarity searching. Proteomics 2005;5:222 34.

http://www.springerlink.com/content/r7370105gw011358/fulltext.pdf

122



Jorge I, Navarro Cerrillo RM, Lenz C, Ariza D, Jorrin J. 2006. Variation in the Holm oak leaf proteome at different plant developmental stages, between provenances and in response to drought stress. Proteomics 6, :S207 14.

Jorrín Novo JV et al. 2009. Plant proteomics update (2007-‐2008). Second generation proteomic techniques, an appropiate experimental design and data analysis to fulfill MIAPE standards, increase plant proteome coverage and biological knowledge. Journal of Proteomics 72: 285-‐314.

Jorrín Novo JV et al. 2012. From 2003 to 2011: Proteomics investigation at the agroforestry and plant biochemistry and proteomics research group (University of Cordoba, Spain) En: Frontiers in Agriculture Proteome Research: Contribution of proteomics technology in agricultural sciences (HP Mock, ZY Wang, S Komatsu, eds.). En prensa. ISBN 978-‐4-‐904633-‐99-‐1

Sghaier-‐Hammami, B., Valero-‐galván, J, Romero Rodriguez, C., Navarro cerrillo, R.M., Jorrín Novo, J. 2012. 2-‐DE based proteomics approach in the study of holm oak response to Phytophtora cinnamomi. Phytochemistry (en prensa).

Valero Galván J, Valledor L, Navarro Cerrillo R, Jorrín-‐Novo JV. 2011. Studies of variability in Holm oak (Quercus ilex subsp. ballota (Desf.) Samp.) through proteomic analysis of acorns. Journal of Proteomics 74: 1244-‐1255. doi:10.1016/j.jprot.2011.05.003 .

Valero et al. 2012a. Population variability based on the morphometry and Chemicals composición of the acorne in holm oak (Quercus ilex subsp. Ballota [Desf.] Samp.) Eur J Forest Res. On line first (http://www.springerlink.com/content/l5735vm06671r607/fulltext.pdf). DOI 10.1007/s10342-‐011-‐0563-‐8.

Valero Galván J, Valledor L, Navarro Cerrillo R, Jorrín-‐Novo JV. 2012b. 2-‐DE based proteomic analysis of Holm oak (Quercus ilex subsp. ballota [Desf.] Samp.) pollen reveals differences among provenances. Journal of Proteomics (en prensa).

http://dx.doi.org/10.1016/j.jprot.2011.05.003

123



GRUPO TEP169

BIOCOMBUSTIBLES Y SISTEMAS DE AHORRO ENERGÉTICOS

COMPONENTES:

RESPONSABLE: Dorado Pérez, María del Pilar ... [email protected] López García, Isabel .................................................... [email protected] Koutinas, Apostolis ................................................. [email protected] Pinzi, Sara ................................................................. [email protected] Leiva Candia, David Eduardo [email protected] Ruz Ruiz, María Francisca ................................... [email protected] Gregorio Arenas, Marta Inés .................. [email protected]


Química Física y Termodinámica Aplicada, Universidad de Córdoba

Agricultural University of Athens, Grecia


1. Biocombustibles para motores de combustión interna alternativos. Desarrollo, caracterización, control de calidad, ensayos.

2. Biorrefinerías que integran el reciclado de residuos agroalimentarios para producir bioplásticos.

3. Biomasa como fuente energética. Caracterización, control calidad.


Pinzi S, Alonso F, García-‐Olmo J, Dorado MP (2012) Near infrared reflectance spectroscopy and multivariate analysis to monitor reaction products during biodiesel production. Fuel 92:354-‐359.

Pinzi S, Mata-‐Granados JM, Lopez-‐Gimenez FJ, Luque de Castro MD, Dorado MP (2011) Influence of vegetable oils fatty acid composition on biodiesel optimization. Bioresource Technol. 102:1059-‐1065.

Pinzi S, Leiva D, Arzamendi G, Gandia LM, Dorado MP (2011) Multiple response optimization of vegetable oils fatty acid composition to improve biodiesel physical properties. Bioresource Technol. 102:7280-‐7288.

124



Pinzi S, Lopez-‐Gimenez FJ, Ruiz JJ, Dorado MP (2010) Response surface modeling to predict biodiesel yield in a multi-‐feedstock biodiesel production plant. Bioresource Technol. 101:9587-‐9593.

Dorado MP, Lin SKC, Koutinas A, Du Ch, Wang R, Webb C (2009) Cereal-‐based biorefinery development: Utilisation of wheat milling by-‐products for the production of succinic acid. Journal of Biotechnol. 143:51-‐59.

Pinzi S, Garcia IL, Lopez-‐Gimenez FJ, Luque de Castro MD, Dorado G, Dorado MP (2009) The ideal vegetable oil-‐based biodiesel composition. A review of social, economical and technical issues. Energy & Fuels 23:2325-‐2341

Pinzi S, Priego Capote F, Ruiz Jiménez J, Dorado MP, Luque de Castro MD (2009) Flow injection analysis-‐based methodology for automatic on-‐line monitoring and quality control for biodiesel production. Bioresource Technol. 100:421-‐427.

Du Ch, Lin SKC, Koutinas A, Wang R, Doardo MP, Webb C (2008) A wheat biorefining strategy based on solid-‐state fermentation for fermentative production of succinic acid. Bioresource Technol. 99:8310-‐8315.

PONENCIA:

EVALUATION OF MICROBIAL BIOPOLYMER PRODUCTION FROM AGROFOOD RESIDUES

RESUMEN

The replacement of petroleum-‐derived plastics will be achieved through the cost-‐competitive production of durable and biodegradable plastics from renewable resources. The development of viable bioprocesses for the production of biodegradable plastics could be based on the utilization of food industry wastes and in some cases agricultural crops. Process design and preliminary costing studies could be employed in order to screen various process flowsheets. This study aims at the design of process flowsheets and subsequent costing of three bioprocesses used for the production of polyhydroxyalkanoates (PHA) based on published data. Whey, cereal milling by-‐products, corn starch and wheat have been used as raw materials in fermentation processes carried out by recombinant Escherichia coli, Haloferax mediterrenei and Cupriavidus necator. Downstream separation strategies (i.e. surfactant-‐hypochlorite digestion, natural lysis of Haloarchaea, enzymatic treatment) were selected based on published

125



data for the selected microorganisms. The processing options proposed for the production of PHA have been evaluated based on the same annual production capacity (2000 t/yr) and operation time (7920 h/yr). The obtained results demonstrate that the use of food wastes such as whey and other renewable resources such as cereal milling by-‐products and wheat could be a viable option for PHA production.

INTRODUCTION

Nowadays, petroleum is the main raw material that is used for the production of plastics. The annual capacity of approximately 150 million t of petroleum-‐derived plastics produced worldwide is currently disposed mainly in landfills or it is incinerated. In addition, approximately 135,000 t of plastics are disposed to the sea on an annual basis. Therefore, petroleum-‐derived plastic production will be eventually hindered by the depletion of petroleum and the inevitable environmental pollution that is caused by their disposal. The production of biodegradable plastics is the only solution to the replacement of petroleum-‐derived plastics.

Polyhydroxyalkanoates (PHA) is a family of biodegradable plastics that can be produced intracellularly by many microorganisms through fermentation of renewable resources. Three of the most important members of PHA are poly-‐(3-‐hydroxybutyrate) (PHB), poly-‐(3-‐hydroxybutyrate-‐co-‐3-‐hydroxyvalerate) PHBV and poly-‐(3-‐hydroxybutyrate-‐co-‐3-‐hydroxyhexanoate) P(3HB-‐co-‐3HHx). However, the commercial production of these bioplastics is hindered by the high production cost that is mainly attributed to the fermentation feedstock used and the downstream separation methodology employed. The only way to reduce the cost of PHA production is to advance research on the valorization of crude feedstocks such as food processing wastes and agricultural crops. This should be coupled with techno-‐economic evaluation in order to assess the potential of each process alternative. The utilization of waste and by-‐product streams in existing food plants will improve both PHA production economics and environmental problems caused by the current disposal methods of food processing wastes.

OBJECTIVES

The main objective of this study was to evaluate specific processes for the microbial production of PHA. Design and techno-‐economic evaluation has been employed to compare three process flowsheets based on different initial raw materials, microorganisms and downstream separation strategies.

126



RESULTS

The first process focuses on the utilization of whey for the production of PHB and the required information for the fermentation stage was taken from Ahn et al. (2000). The fermentation is carried out by a recombinant strain of Escherichia coli CGSC 4401. The downstream purification of PHB from E. coli cells was based on a surfactant-‐hypochlorite digestion method. The second process focuses on the utilization of rice bran and corn starch for the production of PHBV via fed-‐batch fermentation with the haloarchaeon Haloferax mediterranei ATCC 33500 as was published by Huang et al. (2006). The downstream separation stage was based on natural cell lysis due to the difference in NaCl concentration. The third process (Figure 1) focuses on the utilization of wheat for the production of PHB as the major product and gluten as a valuable by-‐product. This process has been described in previous publications (Xu et al, 2010). Figure 1 does not present the stages required in upstream processing. Wheat-‐based hydrolysate and fungal cell autolysate streams are used as fermentation media for the production of PHB via fermentation using Cupriavidus necator NCIMB 11599 based on the results published by Xu et al. (2010). The downstream separation strategy for the purification of PHB from C. necator cells was based on enzymatic cell lysis using commercial enzymes (i.e. bromelain).

Figure 1. Process flowsheet based on wheat utilization

After conducting the three simulations, the PHA production cost from process flowsheets 1, 2 and 3 were $3.42 per kg PHB, $6.29 per kg PHBV and $2.58 per kg PHB respectively. Therefore, for the production of 2000 t of PHA the lowest

127



cost could be achieved by process flowsheet 3 where wheat is used as raw material, C. necator NCIMB 11599 is used as the microorganism in the fermentation stage and enzymatic cell lysis for PHB separation.

The calculated cost per kg PHA produced from each process showed that preliminary costing studies should be carried out to evaluate the potential of experimentally developed processes. This is the only way to ensure that the most cost-‐competitive process will be commercialized.

REFERENCES

Ahn WS, Park SJ, Lee SY (2000) Production of poly(3-‐hydroxybutyrate) by fed-‐batch culture of recombinant Escherichia coli with a highly concentrate whey solution. App and Environm Microbiol. 66:3624-‐3627

Huang T-‐Y, Duan K-‐J, Huang S-‐Y, Chen CW (2006) Production of polyhydroxyalkanoates from inexpensive extruded rice bran and starch by Haloferax mediterranei. J Industrial Microbiol and Biotechnol. 33:701-‐706

Xu Y, Wang R-‐H, Koutinas AA, Webb C (2010) Microbial biodegradable plastic production from a what-‐based biorefining strategy. Process Biochem. 45:153-‐163

128



129



Ponencias empresas

BIOMEDAL S.L. (GRUPO BIO332)

COMPONENTES:

RESPONSABLE: Cebolla Ramírez, Angel ...... [email protected] Arevalo Rodríguez, Miguel ...................................... [email protected] Torgler, Catherine .......................... [email protected] Velasco Umpiérrez, Isabel ................... [email protected]


Tecnologías de producción de proteínas; tecnologías de separación e inmovilización de proteínas; análisis de macromoléculas y células; métodos analíticos de alérgenos, de contaminantes es muestras biológicas, microorganismos y biomarcadores.


Comino I, Real, A, Vivas S, Síglez MA, Caminero A, Nistal E, Casqueiro J, Rodríguez-‐Herrera A, Cebolla A, and Sousa C.(2012) Monitoring of gluten-‐free diet compliance in celiac patients by assessment of gliadin 33-‐mer equivalent epitopes in feces. Am J ClinNutr. 95:670 677.

Comino I, Real A, de Lorenzo L, Cornell H, López-‐Casado MA, Barro F, Lorite P, Torres MI, Cebolla A, Sousa C. (2011) Diversity in oat potential immunogenicity: basis for the selection of oat varieties with no toxicity in coeliac disease. Gut. 60:915-‐922.

Maestro B, Velasco I, Castillejo I, Arévalo-‐Rodríguez M, Cebolla A, Sanz JM. (2008) Affinity partitioning of proteins tagged with choline-‐binding modules in aqueous two-‐phase systems. J Chromatogr A. 1208:189-‐196.

Morón B, Bethune MT, Comino I, Manyani H, Ferragud M, López MC, Cebolla A, Khosla C, Sousa C. (2008) Toward the assessment of food toxicity for celiac patients: characterization of monoclonal antibodies to a main immunogenic gluten peptide. PLoS ONE 3:e2294.

130



Royo JL, Becker PD, Camacho EM, Cebolla A, Link C, Santero E, Guzmán CA. (2007) In vivo gene regulation in Salmonella spp. by a salicylate-‐dependent control circuit.NatureMethods 4:937-‐942.

PONENCIA:

BIOMEDAL: UNA DECADA DESARROLLANDO Y TRANSFIRIENDO BIOTECNOLOGIA MADE IN SPAIN

RESUMEN

Biomedal S.L. es una compañía Biotecnológica con más de diez años de experiencia en la investigación, desarrollo, producción y comercialización de productos innovadores para poder ser usados como herramientas en una gran diversidad de industrias, como la farmacéutica, el diagnóstico de enfermedades humanas, la seguridad alimentaria o la investigación en multitud de sectores relacionados con la biotecnología y biomedicina. Ha demostrado ser una compañía altamente eficiente en la búsqueda de aplicaciones comerciales a la investigación básica, y consiguiendo transformar el conocimiento en producto y la innovación en valor, colaborando con grupos de I+D públicos con los que ha conseguido desarrollar productos en menos de un año desde la idea. Sus tecnologías o productos han sido usados en más de un centenar de artículos científicos, teniendo vocación de liderazgo tecnológico, como ha logrado al haber lanzado kits de diagnóstico que reflejan la potencial toxicidad para celíacos de alimentos, para la monitorización de dietas sin gluten o la detección de nuevas enfermedades relacionadas con el trasplante órganos.

INTRODUCCIÓN

BIOMEDAL es una compañía biotecnológica que nació en Sevilla en el año 2000. Su actividad se centra en el desarrollo de nuevos productos, servicios y tecnologías destinados a la investigación, bioindustria, y el diagnóstico. Biomedal ha vendido sus productos y licencias de tecnología a más de 40 países gracias a sus más de quinientos clientes repartidos en cinco continentes.

La empresa busca su entorno científico y social fuentes de inspiración para desarrollar tecnologías innovadoras y lanzar productos novedosos a la sociedad en un mundo global. Los proyectos son elegidos, después de un exhaustivo análisis de viabilidad, en función de su mercado potencial, tiempo

131



de desarrollo y relación coste/beneficio con el objetivo de ser la mejor respuesta tecnológica del mercado.

Biomedal se ha reorganizado empresarialmente en torno a dos divisiones que se describen a continuación:

Biomedal LifeSciences: División dedicada a la búsqueda de nuevos procedimientos y herramientas moleculares/celulares para la investigación, diagnosis, producción y purificación de material biológico a partir de microorganismos, lo que implica el desarrollo de productos (proteínas, reactivos, cepas microbianas y anticuerpos) adecuados para la ingeniería genética y reactivos para la creación de plataformas de producción de los mismos. Biomedal tiene actualmente en el mercado sistemas muy competitivos para el control de la producción y purificación de proteínas, con una cartera de productos que está confeccionada con el objetivo de ser la mejor respuesta tecnológica del mercado.

Actualmente la tecnología que posee Biomedal se vende en forma de productos y se usa en los propios servicios de producción de la empresa a escala de laboratorio para favorecer su difusión. Asimismo, se negocian sublicencias con empresas del sector de la producción de proteínas recombinantes. Los servicios que se están realizando para las demostraciones tecnológicas de los sistemas de expresión y purificación de proteínas están generando nuevos productos que a su vez generan en nuevas oportunidades de negocio. Por ejemplo, la producción y purificación de algunas proteínas por sus sistemas han servido como base para el desarrollo de diagnósticos alimentarios o de enfermedades inmunológicas mediante la obtención de proteínas que se usan como reactivos analíticos.

Biomedal Diagnostics: Esta división está orientada al desarrollo de equipos (kits) diagnósticos relacionados con la salud humana, y el mayor grado de especialización está en torno a la enfermedad celíaca.

Productos para la seguridad alimentaria. Productos de diagnóstico humano.

OBJETIVOS

Al igual que todas las empresas, el objetivo fundamental de Biomedal es crecer. Este crecimiento depende al igual que en otras empresas, de conseguir más clientes a los que satisfacer con sus servicios o productos, y en hacer la producción y comercialización de esto productos rentables.

El crecimiento de la empresa utiliza tres estrategias en función de cada una de sus divisiones.

132



1.-‐ La penetración de sus productos, haciendo énfasis en la comercialización, validación multicéntrica, y el desarrollo de nuevos productos para el sector de la seguridad alimentaria, y ampliar las aplicaciones de los productos ya desarrollados a otros al campo agronómico o clínico.

2.-‐ La internacionalización pretende, sobre la base de sus mismos productos,ampliar los usuarios, mediante acuerdos de distribución cesión de licencias, e, incluso, el establecimiento de sedes propias que acerquen a nuevos segmentos de clientes.

3.-‐ Estrategias de diversificación, Biomedal LifeScience hace ciencia, ajustada a las necesidades que detecta en el mercado, está integrada con relevantes grupos de investigación con los que colabora, yque permite acumular conocimientos diferenciales con los que poder competir a nivel global. La visión de los colaboradores como usuarios de las tecnologías y como futuros clientes, van a validar o no el resultado de la innovación.

Los resultados aquí mostrados ilustran algunas tecnologías que se han transferido, desarrollado y comercializado por Biomedal como fruto de la estrategia de diversificación.

RESULTADOS

En Biomedal LifeSciences, el desarrollo principal de Biomedal han sido sistemas de expresión muy controlados, la tecnología CASCADE, originadas como una invención del CSIC, que permiten alto grado de productividad y reproducibilidad de las fermentaciones al estar altamente reguladas con independencia del medio de cultivo y usando inductores económicos. Se ha conseguido producir varias proteínas comerciales incluso en fermentadores de 100 litros, dando unos rendimientos excepcionales como son el 50% de las proteínas solubles totales (fig. 1). Se ha licenciado a empresas productoras de proteínas y de ingeniería metabólica nacionales e internacionales.

Fig.1. Superproducción de una proteína de unión a IgGs en E. coli con CASCADETM en un cultivo de alta densidad fermentador de 100L

133



Por otro lado, Biomedal ha diseñado un kit de purificación LYTAG, una secuencia para etiquetar proteínas que permite purificar y solubilizar mejor la proteína producida, además se tiene la ventaja de utilizar para ello soportes económicos. Además tiene como parte más innovadora que permite la purificación basada en un método de reparto y purificación de proteínas por afinidad mediante un sistema de dos fases acuosas, que permite de forma sencilla, rápida y escalable la purificación de proteínas recombinantes de fusión hasta más de un 90% (Fig. 2).

Fig. 2. Sistema de partición por afinidad en dos fases acuosas mediada por el tag, LYTAG (LYTAG-‐2-‐PHASE). La proteína fluorescente GFP es separada por afinidad solo cuando se fusiona a los dominios de unión a colina de la secuencia de LYTAG hasta 782 veces más concentrada en la fase superior rica en polímero (Maestro et al. 2008).

Fruto de los proyectos de demostración de producción de proteínas útiles se ha desarrollado productos de diagnóstico humano para determinación del nivel de alguna proteína marcadora relacionada con la salud humana. Se desarrolló el kit ELISA Anti-‐GSTT1, que consiste en un ensayo diseñado para detectar anticuerpos contra la proteína GSTT1 en suero humano, lo que refleja el riesgo y evolución de una una enfermedad recientemente descrita, la hepatitis de novo autoinmune, que se produce en algunos trasplantados hepáticos.

En otro de los proyectos demostrativos, Biomedal desarrolló en colaboración con grupos del CSIC y la Universidad de Sevilla, una línea de productos, denominada GLUTENTOX,basada en unos anticuerpos que detectan el péptido más inmunotóxicodel gluten en los alimentos: unos productos en formato ELISA que cuantifican gluten en alimentos y están orientados a laboratorios de análisis de alimentos (ELISA Sandwich y ELISA Competitivo), y otro semicuantitativo en formato tiras inmunocromatográficas GLUTENTOX STICKS y GLUTENTOX PRO (indicados para el control de calidad en la industria alimentaria), y GLUTENTOX HOME (para que el celíaco o sus familiares puedan controlar si existe gluten en sus alimentos). Estosproductos demostraron además ser un sistema de detección de la toxicidad potencial de cereales cuya toxicidad para celíacos ha sido puesta siempre en entredicho, como es la avena. La reactividad de los anticuerpos

134



de la línea GLUTENTOXdemostraban ser proporcional a la respuesta de células T aisladas de individuos celíacos (Fig. 3).

Figura 3. Reactividad del gluten de distintas variedades de avena con el anticuerpo anti gliadina G12 usado en los productos GLUTENTOX. Se pueden identificar tres variedades sin reactividad al anticuerpo G12 que mostraron una reactividad frente a células de celíacos equivalente a cereales seguros para celíacos como el de arroz (oryzein).

REFERENCIAS

Maestro B, Velasco I, Castillejo I, Arévalo-‐Rodríguez M, Cebolla A, Sanz JM. (2008) Affinity partitioning of proteins tagged with choline-‐binding modules in aqueous two-‐phase systems. J Chromatogr A. 1208:189-‐196.

Morón B, Bethune MT, Comino I, Manyani H, Ferragud M, López MC, Cebolla A, Khosla C, Sousa C. (2008) Toward the assessment of food toxicity for celiac patients: characterization of monoclonal antibodies to a main immunogenic gluten peptide. PLoS ONE 3:e2294.

Morón B, Cebolla A, Manyani H, Alvarez-‐Maqueda M, Megías M, Thomas M del C, López MC, Sousa C. (2008)Sensitive detection of cereal fractions that are toxic to celiac disease patients by using monoclonal antibodies to a main immunogenic wheat peptide. Am J ClinNutr. 87:405-‐414.

135



Sesión Tercera

136



137



GRUPO BIO139

COMPONENTES:

RESPONSABLES: Gracia Navarro, Francisco ................ [email protected] LÍNEA 1: Castaño Fuentes, Justo P ............................ [email protected] LÍNEA 2: Malagón Poyato, Mª del Mar. [email protected]

LÍNEA 1: Luque Huertas, Raúl Miguel .................................. [email protected] Martínez Fuentes, Antonio Jesús ........................... [email protected] Gahete Ortíz, Manuel David .................................. [email protected] Córdoba Chacón, José ............................................ [email protected] Pozo Salas, Anabel .................................................. [email protected] López Sánchez, Laura ............................. [email protected] Moreno Herrera, Antonio ............................ [email protected] Chanclón García, Belén........................................... [email protected] Villa Osaba, Alicia .................................................... [email protected] Ibañez Costa, Alejandro .............................. [email protected] Rivero Cortés, Esther ....................... [email protected] Rincón Fernández-‐Pacheco, David ..................... [email protected] LÍNEA 2: Almabouada Farid ..................................................... [email protected] Díaz-‐Ruiz, Ruiz, Jose Alberto ................................... [email protected] García Navarro, Socorro .......................................... [email protected] Guzmán Ruiz, Rocío ................................................. [email protected] Molero Murillo, Laura .......................................... [email protected] Moreno Castellanos, Natalia Rocío ....................... [email protected] Palomo Buitrago, Mª Encarnación ....................... [email protected] Rabanal Ruiz, Yoana ................................................ [email protected] Trávez García, Andrés Ricardo ................................. [email protected] Vazquez Martinez, Rafael ....................................... [email protected]


Departamento de Biología Celular, Fisiología e Inmunología. Facultad de Ciencias. Universidad de Córdoba.

mailto:[email protected]@uco.es












138



Grupo de Hormonas y Cáncer. Instituto Maimónides de Investigación Biomédica de Córdoba (IMIBIC) / Hospital Universitario Reina Sofía.

CIBER Fisiopatología de la Obesidad y la Nutrición (CIBERObn).


1.-‐ Somatostatina, cortistatina y sus receptores. 2.-‐ Fisiopatología del tejido adiposo. Identificación de moléculas marcadoras de tejido adiposo mediante técnicas proteómicas. Caracterización molecular de marcadores reguladores de la (dis)función del tejido adiposo. Adipobiología. Control del tráfico intracelular


Línea 1. Durán-‐Prado M, Gahete MD, Hergueta-‐Redondo M, Martínez-‐Fuentes AJ, Córdoba-‐Chacón J, Palacios J, Gracia-‐Navarro F, Moreno-‐Bueno G, Malagón MM, Luque RM, Castaño JP (2011) The new truncated somatostatin receptor variant sst5TMD4 is associated to poor prognosis in breast cancer and increases malignancy in MCF-‐7 cells. Oncogene. 2011 Sep 19. doi: 10.1038/onc.2011.389. [Epub ahead of print]

Gahete MD, Córdoba-‐Chacón J, Hergueta-‐Redondo M, Martínez-‐Fuentes AJ, Kineman RD, Moreno-‐Bueno G, Luque RM, Castaño JP (2011) A novel human ghrelin variant (In1-‐ghrelin) and ghrelin-‐O-‐acyltransferase are overexpressed in breast cancer: potential pathophysiological relevance. PLoS One 6(8):e23302.

Gahete MD, Córdoba-‐Chacón J, Kineman RD, Luque RM, Castaño JP (2011) Role of ghrelin system in neuroprotection and cognitive functions: implications in Alzheimer's disease. Peptides 32(11):2225-‐8.

Córdoba-‐Chacón J, Gahete MD, Durán-‐Prado M, Luque RM, Castaño JP (2011) Truncated somatostatin receptors as new players in somatostatin-‐cortistatin pathophysiology. Ann N Y Acad Sci 1220:6-‐15.

Luque RM, Córdoba-‐Chacón J, Gahete MD, Navarro VM, Tena-‐Sempere M, Kineman RD, Castaño JP (2011) Kisspeptin regulates gonadotroph and somatotroph function in nonhuman primate pituitary via common and distinct signaling mechanisms. Endocrinology 152(3):957-‐66. Epub 2011 Jan 5.

139



Martínez-‐Fuentes AJ, Molina M, Vázquez-‐Martínez R, Gahete MD, Jiménez-‐Reina L, Moreno-‐Fernández J, Benito-‐López P, Quintero A, de la Riva A, Diéguez C, Soto A, Leal-‐Cerro A, Resmini E, Webb SM, Zatelli MC, degli Uberti EC, Malagón MM, Luque RM, Castaño JP (2011) Expression of functional KISS1 and KISS1R system is altered in human pituitary adenomas: evidence for apoptotic action of kisspeptin-‐10. Eur J Endocrinol 164(3):355-‐62.

Marazuela M, Paniagua AE, Gahete MD, Lucas T, Alvarez-‐Escolá C, Manzanares R, Cameselle-‐Teijeiro J, Luque-‐Ramirez M, Luque RM, Fernandez-‐Rodriguez E, Castaño JP, Bernabeu I (2011) Somatotroph tumor progression during pegvisomant therapy: a clinical and molecular study. J Clin Endocrinol Metab 96(2):E251-‐9.

Gahete MD, Rubio A, Córdoba-‐Chacón J, Gracia-‐Navarro F, Kineman RD, Avila J, Luque RM, Castaño JP (2010) Expression of the ghrelin and neurotensin systems is altered in the temporal lobe of Alzheimer's disease patients. J Alzheimers Dis 22(3):819-‐28.

Durán-‐Prado M, Saveanu A, Luque RM, Gahete MD, Gracia-‐Navarro F, Jaquet P, Dufour H, Malagón MM, Culler MD, Barlier A, Castaño JP (2010) A potential inhibitory role for the new truncated variant of somatostatin receptor 5, sst5TMD4, in pituitary adenomas poorly responsive to somatostatin analogs. J Clin Endocrinol Metab 95(5):2497-‐502.

Gahete MD, Rubio A, Durán-‐Prado M, Avila J, Luque RM, Castaño JP (2010) Expression of Somatostatin, cortistatin, and their receptors, as well as dopamine receptors, but not of neprilysin, are reduced in the temporal lobe of Alzheimer's disease patients. J Alzheimers Dis 20(2):465-‐75.

Córdoba-‐Chacón J, Gahete MD, Duran-‐Prado M, Pozo-‐Salas AI, Malagón MM, Gracia-‐Navarro F, Kineman RD, Luque RM, Castaño JP (2010) Identification and characterization of new functional truncated variants of somatostatin receptor subtype 5 in rodents. Cell Mol Life Sci 67(7):1147-‐63.

Durán-‐Prado M, Gahete MD, Martínez-‐Fuentes AJ, Luque RM, Quintero A, Webb SM, Benito-‐López P, Leal A, Schulz S, Gracia-‐Navarro F, Malagón MM, Castaño JP (2009) Identification and characterization of two novel truncated but functional isoforms of the somatostatin receptor subtype 5 differentially present in pituitary tumors. J Clin Endocrinol Metab 94(7):2634-‐43.

Línea 2. Vazquez-‐Martinez R, Cruz-‐Garcia D, Duran-‐Prado M, Peinado JR, Castaño JP, Malagon MM (2007) Rab18 inhibits secretory activity in neuroendocrine cells by interacting with secretory granules. Traffic 8(7):867-‐82




140



Vazquez-‐Martinez R, Martinez-‐Fuentes AJ, Pulido MR, Jimenez-‐Reina L, Quintero A, Leal-‐Cerro A, Soto A, Webb SM, Sucunza N, Bartumeus F, Benito-‐Lopez P, Galvez-‐Moreno MA, Castaño JP, Malagon MM (2008) Rab18 is reduced in pituitary tumors causing acromegaly and its overexpression reverts growth hormone hypersecretion. J Clin Endocrinol Metab. 93(6):2269-‐76.

Peinado JR, Jimenez-‐Gomez Y, Pulido MR, Ortega-‐Bellido M, Diaz-‐Lopez C, Padillo FJ, Lopez-‐Miranda J, Vazquez-‐Martínez R, Malagón MM (2010). The stromal-‐vascular fraction of adipose tissue contributes to major differences between subcutaneous and visceral fat depots. Proteomics 10(18):3356-‐66.

Peinado JR, Quirós PM, Pulido MR, Marin G, Martínez-‐Chantar MR, Vázquez-‐Martínez R, Freije JMP, López-‐Otín C, Malagón MM (2011) Proteomic Profiling of Adipose Tissue from Zmpste24-‐/-‐ Mice, a Model of Lipodystrophy and Premature Aging, Reveals Major Changes in Mitochondrial Function and Vimentin Processing. Molecular & Cellular Proteomics 10: 1 16.

Pulido MR, Diaz-‐Ruiz A, Jiménez-‐Gómez Y, Garcia-‐Navarro S, Gracia-‐Navarro F, Tinahones F, López-‐Miranda J, Frühbeck G, Vázquez-‐Martínez R, Malagón MM(2011) Rab18 Dynamics in Adipocytes in Relation to Lipogenesis, Lipolysis and Obesity. Plos ONE 6(7): e22931

Vázquez-‐Martínez R, Malagón MM (2011) Rab proteins and the secretory pathway: the case of Rab18 in neuroendocrine cells. Frontiers in Endocrinology 2:1-‐9

Vázquez-‐Martínez R, Díaz-‐Ruiz A, Almabouada F, Rabanal-‐Ruiz Y, Gracia-‐

Navarro F, Malagón MM (2012) Revisiting the regulated secretory pathway: From frogs to human. General and Comparative Endocrinology 175: 1 9

Cruz-‐Garcia D, Diaz-‐Ruiz A, Rabanal-‐Ruiz Y, Peinado JR, Gracia-‐Navarro F, Castaño JP, Montero-‐Hadjadje M, Tonon MC, Vaudry H, Anouar Y, Vazquez-‐Martinez R, Malagon MM (2012). The Golgi-‐Associated Long Coiled-‐Coil Protein NECC1 Participates in the Control of the Regulated Secretory Pathway in PC12 Cells. Biochem J. Jan 18.

PONENCIA:

(L-‐1) BASES CELULARES Y MOLECULARES DE LA REGULACIÓN NEUROENDOCRINO-‐METABÓLICA Y SUS DISFUNCIONES EN TUMORES Y CÁNCER. (L-‐2) MARCADORES MOLECULARES DEL TEJIDO ADIPOSO EN LA SALUD Y EN LA ENFERMEDAD

RESUMEN









141



L-‐1

Nuestro grupo investiga las bases celulares y moleculares de la regulación neuroendocrino-‐metabólica y sus disfunciones en tumores y cáncer. En especial, estudiamos el papel de los sistemas de los neuropéptidos somatostatina, cortistatina, ghrelina, kisspeptinas y sus receptores (sst1-‐5, GHS-‐R, Kiss1r) y rutas de señal asociadas. Partiendo de su estudio en la regulación de la secreción hormonal hipofisaria, analizamos el papel de estas moléculas en la homeostasis metabólica y el desarrollo de patologías relevantes: cáncer de mama y de próstata, obesidad, diabetes y tumores hipofisarios y neuroendocrinos. Como fin último pretendemos descubrir y transferir nuevas dianas moleculares aplicables al diseño de estrategias terapéuticas innovadoras.

Objetivos generales:

1. Determinar la relación que existe entre la composición molecular de un tumor (hipofisario, neuroendocrino, etc), las características clínicas de la patología correspondiente y la respuesta del paciente al tratamiento con fármacos conocidos o de nueva generación.

2. Investigar el papel de la somatostatina, la cortistatina, la ghrelina, las kisspeptinas y su familia de receptores, especialmente los receptores truncados de somatostatina tipo 5 (sst5) y de una nueva variante de ghrelina (In1-‐ghrelina) identificadas por nuestro grupo, en el cáncer de mama, de próstata y en los tumores hipofisarios y neuroendocrinos, determinando las características moleculares y funcionales de los diferentes componentes de estos sistemas reguladores que puedan explicar las propiedades fisio-‐patológicas de estas enfermedades tumorales.

3. Estudiar la relación entre obesidad y cáncer de mama y definir el posible papel de los sistemas somatostatina-‐cortistatina-‐ghrelina-‐receptores en dicha interacción.

L-‐2.

El grupo de adipobiología esta interesado en la identificación de nuevos marcadores del tejido adiposo en estado normal y patológico, incluyendo tanto condiciones de ganancia de tejido adiposo (obesidad) como pérdida del mismo (lipodistrofia) mediante estudios proteómicos. Recientemente nuestro grupo ha podido finalizar la

142



caracterización proteómica del tejido adiposo en un modelo de ratón deficiente de la enzima (FACE1 o Zmpste24), que está implicada en el procesamiento y maduración de la proteína nuclear LAMINA. Este déficit esta asociado a un acelerado envejecimiento o progeria y a un fenotipo lipodistrófico que se caracteriza por la pérdida total de TASC y por una reducción considerable del TAV así como un descenso en el tamaño de sus adipocitos. Los resultados obtenidos muestran como un defecto en la maduración de la lamina puede estar relacionado directamente con una sobrecarga mitocondrial y un elevado daño oxidativo que se relacionan con la lipoatrofia y el envejecimiento. Y que, en conjunto podrían conducir a la pérdida de tejido adiposo, que se observa en los ratones mutantes (Peinado et al. 2011). Además, estamos iniciando distintos estudios proteómicos encaminados a identificar marcadores diferenciales tanto en el tejido adiposo como en precuersores de adipocitos, que pueden determinar por qué algunos obesos son metabolitamente sanos y otros no. Finalmente, hemos iniciado un estudio para caracterizar la ruta de señalizaron de la insulina en adipocitos de los dos grupos de pacientes mediante fosfoproteómica en este caso.

Además de los estudios proteómicos presentados, nuestro grupo está interesado en los aspectos celulares y moleculares que subyacen en la regulación del metabolismo lipídico en adipocitos y, en particular, de las gotas lipídicas. Estos estudios los realizamos mediante el análisis de una proteína relacionada con el trafico intracelular, Rab18 que se asocia a las gotas lipídicas en respuesta a la estimulación de la lipólisis y la lipogénesis en adipocitos, probablemente mediando la interacción entre las gotas lipídicas y el retículo endoplásmico, que es el orgánulo encargado de recibir y transferir los AG de las gotas lipídicas (Vazquez-‐Martinez et al., 2007; Pulido et al., 2011). En estos momentos estamos buscando posibles aliados de Rab18 que pudieran participar en estos procesos.

143



GRUPO BIO216

SISTEMAS MOLECULARES DE DEFENSA FRENTE AL ESTRÉS OXIDATIVO Y PROTEÓMICA

COMPONENTES:

RESPONSABLE: Bárcena Ruiz, José Antonio .......... [email protected] Martínez Galisteo, Emilia .................................... [email protected] Peinado Peinado, José ............................................ [email protected] Padilla Peña, Alicia .................................................. [email protected] Rodríguez Ortega, Manuel José ............................ [email protected] McDonagh, Brian .................................................. [email protected] González Ojeda, Raúl ............................................... [email protected] Olaya Abril, Alfonso ................................................. [email protected] Jiménez Munguía, Irene ........................................... [email protected]

@hotmail.com Carmona Cabello, Miguel ...................................... [email protected]


Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Córdoba; Instituto Maimónides de Investigación Biomédica de Córdoba (IMIBIC); Campus de Excelencia Internacional Agroalimentario (ceiA3).


1. homeostasis redox celular.

2. Desarrollo y aplicación de métodos proteómicos para el estudio del proteoma redox tiólico.

3. Mecanismos de acción del óxido nítrico (NO) sobre la proliferación de células de hepatoblastoma.

4. Aplicación de métodos proteómicos para el desarrollo de vacunas y herramientas de diagnóstico frente a microorganismos patógenos.

5. Estudio de las propiedades antioxidantes de productos derivados de la industria vitinícola.

144



PUBLICACIONES MÁS RELEVANTES (2010-‐2012):

Buffoni, L., R. Zafra, A. Perez-‐Ecija, F.J. Martinez-‐Moreno, E. Martinez-‐Galisteo, T. Moreno, J. Perez, and A. Martinez-‐Moreno. 2010. Immune response of goats immunised with glutathione S-‐transferase and experimentally challenged with Fasciola hepatica. Parasitol Int. 59:147-‐153.

Garibaldi, M., M.J. Rodríguez-‐Ortega, F. Mandanici, A. Cardaci, A. Midiri, S. Papasergi, O. Gambadoro, V. Cavallari, G. Teti, and C. Beninati. 2010. Immunoprotective activities of a Streptococcus suis pilus subunit in murine models of infection. Vaccine. 28:3609-‐3616.

González, R., A. Cruz, G. Ferrín, P. López-‐Cillero, J. Briceño, M.A. Gómez, S. Rufián, J. Padillo, M. de la Mata, J.J.G. Marin, and J. Muntané. 2011a. Cytoprotective properties of rifampicin are related to the regulation of detoxification system and bile acid transporter expression during hepatocellular injury induced by hydrophobic bile acids. Journal of hepato-‐biliary-‐pancreatic sciences. 18:740-‐750.

González, R., A. Cruz, G. Ferrín, P. López-‐Cillero, R. Fernández-‐Rodríguez, J. Briceño, M.A. Gómez, S. Rufián, M.D.l. Mata, A. Martínez-‐Ruiz, J.J.G. Marin, and J. Muntané. 2011b. Nitric oxide mimics transcriptional and post-‐translational regulation during -‐tocopherol cytoprotection against glycochenodeoxycholate-‐induced cell death in hepatocytes. Journal of hepatology. 55:133-‐144.

Hu, W., S. Tedesco, B. McDonagh, J.A. Bárcena, C. Keane, and D. Sheehan. 2010. Selection of thiol-‐ and disulfide-‐containing proteins of Escherichia coli on activated thiol-‐Sepharose. Analytical Biochemistry. 398:245-‐253.

López de Lerma, N., J. Peinado, J. Moreno, and R.A. Peinado. 2010. Antioxidant activity, browning and volatile Maillard compounds in Pedro Ximénez sweet wines under accelerated oxidative aging. LWT -‐ Food Science and Technology. 43:1557-‐1563.

Mandanici, F., L. Gómez-‐Gascón, M. Garibaldi, A. Olaya-‐Abril, I. Luque, C. Tarradas, G. Mancuso, S. Papasergi, J.A. Bárcena, G. Teti, C. Beninati, and M.J. Rodríguez-‐Ortega. 2010. A surface protein of Streptococcus suis serotype 2 identified by proteomics protects mice against infection. Journal of Proteomics. 73:2365-‐2369.

McDonagh, B., M.A. Domínguez-‐Martín, G. Gómez-‐Baena, A. López-‐Lozano, J. Díez, J.A. Bárcena, and J.M. García-‐Fernández. 2012. Nitrogen starvation induces extensive changes in the redox proteome of Prochlorococcus sp. strain SS120. Environmental Microbiology Reports. In Press.

145



McDonagh, B., C.A. Padilla, J.R. Pedrajas, and J.A. Bárcena. 2011a. Biosynthetic and Iron Metabolism Is Regulated by Thiol Proteome Changes Dependent on Glutaredoxin-‐2 and Mitochondrial Peroxiredoxin-‐1 in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 286:15565-‐15576.

Mcdonagh, B., R. Requejo, C.A. Fuentes-‐Almagro, S. Ogueta, J.A. Bárcena, and C.A. Padilla. 2011b. Thiol redox proteomics identifies differential targets of cytosolic and mitochondrial glutaredoxin-‐2 isoforms in Saccharomyces cerevisiae. Reversible S-‐glutathionylation of DHBP synthase (RIB3). J Proteomics. 74:2487-‐2497.

Pedrajas, J.R., C.A. Padilla, B. McDonagh, and J.A. Bárcena. 2010. Glutaredoxin participates in the reduction of peroxides by the mitochondrial 1-‐CYS peroxiredoxin in Saccharomyces cerevisiae. Antioxidants & Redox Signaling. 13:249-‐258.

Peinado, J., N. López de Lerma, and R. peinado. 2010. Synergistic antioxidant interaction between sugars and phenolics from a sweet wine. Eur Food Res Technol. 231:363-‐370.

Porras, P., B. McDonagh, J.R. Pedrajas, J.A. Bárcena, and C.A. Padilla. 2010. Structure and function of yeast glutaredoxin 2 depend on postranslational processing and are related to subcellular distribution. Biochim Biophys Acta. 1804:839-‐845.

Sheehan, D., B. McDonagh, and J.A. Bárcena. 2010. Redox proteomics. Expert review of proteomics. 7:1-‐4.

Tyther, R., A. Ahmeda, E. Johns, B. McDonagh, and D. Sheehan. 2010. Proteomic profiling of perturbed protein sulfenation in renal medulla of the spontaneously hypertensive rat. J Proteome Res. 9:2678-‐2687.

Tyther, R., B. McDonagh, and D. Sheehan. 2011. Proteomics in investigation of protein nitration in kidney disease: technical challenges and perspectives from the spontaneously hypertensive rat. Mass Spectrom Rev. 30:121-‐141.

PONENCIA:

MODULACIÓN DEL PROTEOMA REDOX TIÓLICO POR REDOXINAS: MECANISMOS E IMPLICACIONES EN EL METABOLISMO DEL HIERRO Y LA FUNCIÓN MITOCONDRIAL

RESUMEN

Se ha analizado el proteoma redox y el transcriptoma de mutantes de S. cerevisiae carentes de peroxirredoxina mitocondrial (Prx1), glutarredoxina 2

146



(Grx2) o ambas, para estudiar las funciones específicas de estas redoxinas. Se han descubierto importantes mecanismos reguladores de los flujos metabólicos y de la expresión génica desencadenados por modificaciones postraduccionales redox en proteínas específicas. Estos cambios muestran que las células han sufrido cambios para adaptarse a un defecto genético, aunque no haya cambios fenotípicos aparentes en condiciones óptimas. El mutante que carece de Prx1 constituye un modelo de disfunción fisiológica en que la comunicación entre mitocondria y citosol está afectada. En estas condiciones se induce el regulón de hierro dependiente de Aft1 a pesar de que la biogénesis de agrupaciones sulfoférricas (Fe-‐S) en la mitocondria funciona con normalidad. Sorprendentemente, la Grx2 parece ser necesaria para que este fenómeno tenga lugar, lo que por primera vez sitúa a una glutarredoxina ditiólica en el contexto del metabolismo del hierro. Estos resultados han abierto las puertas al estudio de los mecanismos por los que el óxido nítrico (NO) disminuye la proliferación de células tumorales.

INTRODUCCIÓN

Las mitocondrias no sólo suministran energía a las células mediante la fosforilación oxidativa, sino que tienen también un papel crucial en el metabolismo del hierro, tanto de agrupaciones sulfoférricas (Fe-‐S) como del grupo hemo, en la biosíntesis de aminoácidos, nucleótidos y esteroides; en la apoptosis y en la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS). La disfunción mitocondrial ocasionada por el estrés oxidativo y en general, la alteración de la homeostasis redox celular, están contribuyendo a la comprensión de los mecanismos moleculares de un buen número de enfermedades.

La naturaleza esencialmente reversible de las oxidaciones del aminoácido cisteína (Cys) le permite desempeñar un papel en la modulación de la función de las proteínas actuando como un interruptor (Klomsiri et al., 2011). En los últimos años se han descrito un gran número de proteínas cuyas funciones están reguladas mediante modificación de Cys específicas por H2O2, por peroxinitrito (ONOO-‐) o por simple intercambio tiol-‐disulfuro. Entre las proteínas así reguladas se encuentran factores de transcripción, actividades enzimáticas y componentes de vías de señalización (Buchanan and Balmer, 2005). Por razones de lógica regulatoria y por su reactividad química, las modificaciones redox de las Cys no se revierten espontáneamente con la simple recuperación de la homeostasis redox celular, sino que se regeneran

su estructura conservada y por su ubicuidad, las Trx y las Grx proporcionan una visión unificada de la "Biología Redox" (Meyer et al., 2009). Sin embargo,

147



el descubrimiento de miembros de las Grx con funciones en el ensamblaje de agrupaciones sulfoférricas (Fe-‐S) y biosíntesis del grupo hemo, ha establecido una separación funcional importante entre Trx y Grx (Herrero and de la Torre-‐Ruiz, 2007; Rouhier et al., 2010). También en el terreno de las Trx, se han encontrado funciones diferenciadoras. Por ejemplo, se ha demostrado una actividad desnitrosilante de proteínas (SNO-‐protein denitrosylase) que implica a las Trx en la regulación de la señalización dependiente de NO (Benhar et al., 2008; Foster et al., 2009).

La glutarredoxina 2 (Grx2) de levadura tiene una localización doble en el citosol y en la mitocondria y las dos isoformas tienen propiedades distintas (Porras et al., 2010). La peroxirredoxina 1 (Prx1) es una enzima mitocondrial que pertenece al grupo de las Prx de 1-‐Cys. Recientemente hemos demostrado que ambas proteínas están conectadas funcionalmente (Pedrajas et al., 2010).

El proteoma redox tiólico es el conjunto de proteínas que sufre modificaciones reversibles por óxido-‐reducción de cisteínas (Cys) como respuesta de la célula a diversos estímulos o situaciones. Su definición en una célula dada y en situaciones concretas constituye una contribución relevante en la investigación de la regulación redox de los procesos celulares.

OBJETIVOS

El objetivo central y genérico es la adscripción de funciones concretas a la redoxina mitocondrial Prx1 y a las isoformas mitocondrial y citosólica de la Grx2. Para ello:

1. afectadas en una o varias de estas redoxinas.

2. Se seleccionarán las dianas más relevantes y se prepararán sus formas recombinantes para validar su interconversión redox in vitro.

3. Se estudiarán también los cambios de expresión génica en los mismos mutantes para comparar los niveles de regulación del proteoma y del transcriptoma.

RESULTADOS

Los mutantes de la levadura Saccharomyces cerevisiae carentes de Prx1, de Grx2 o de ambas crecen normalmente y no presentan daños oxidativos significativos, pero presentan diferencias en los niveles de proteínas glutationiladas. El análisis del proteoma redox mediante la aplicación de un protocolo desarrollado por nosotros (McDonagh et al., 2009; McDonagh et al., 2011a) (ver figura) confirma que en los mutantes se encuentra afectado el

148



estado redox de cisteínas específicas en proteínas clave. Se detectaron más de 6000 péptidos con Cys oxidadas reversiblemente, que pertenecen a más de 200 proteínas. Cuando una proteína se detecta modificada en un mutante y no en el control, concluimos que esa proteína se ha modificado como consecuencia de la mutación. En donde más diferencias se encontraron fue en proteínas implicadas en la biosíntesis de aminoácidos y nucleótidos.

Si la modificación postraduccional redox de estas proteínas afectara a su función, el flujo metabólico por las vías metabólicas en las que esas proteínas participan se vería alterado. Para validar el modelo de regulación redox de la función de estas proteínas, se han obtenido formas recombinantes de algunas de ellas y se han iniciado experimentos de interconversión redox in vitro con análisis cuantitativos de la modificación redox por LC-‐MS/MS. En el caso de la proteína Rib3 hemos comprobado que de las 6 Cys que posee, sólo una, Cys56, es sensible a la glutationilación. Ésta Cys56 es precisamente la Cys que se identificó en el proteoma redox y además la Grx2 es capaz de revertir el proceso reduciéndola a tiol. Actualmente estamos haciendo estos análisis para otras 6 proteínas diana, incluyendo medidas de actividad en algunos casos.

149



La modificación de los flujos metabólicos y señalizadores por cambios redox en Cys específicas de proteínas concretas sería el efecto primario de la falta de una redoxina. Se comprobó que estos cambios tenían consecuencias sobre la transcripción génica como efecto adaptativo. Efectivamente, el análisis de la expresión génica en los mutantes mediante arrays conteniendo todos los ORFs de S. cerevisiae mostró que la ausencia de Prx1p, da lugar a una disfunción de la comunicación entre mitocondria y citosol, de tal forma que se activa el regulón del hierro AFT1, aún cuando la biogénesis mitocondrial de [Fe-‐S] está operativa. Todavía más sorprendente ha sido el hallazgo de que la Grx2 parece ser necesaria para que esta anómala activación del regulón del hierro tenga lugar. Estos resultados encajan bien con el dato de que la comunicación entre mitocondria y citosol necesita glutatión reducido (GSH), el sustrato específico de las glutarredoxinas.

detectadas también como dianas tiólicas en otros organismos (Balmer et al., 2003; Lindahl et al., 2011; McDonagh et al., 2012; McDonagh et al., 2011b). Actualmente estamos investigando estas cuestiones extrapolando a un modelo de célula de hepatoblastoma en condiciones de estrés nitrosativo en que se induce la muerte por apoptosis. Los resultados que se obtengan pueden proporcionar marcadores y dar claves sobre los mecanismos de disminución de la proliferación tumoral y así contribuir a la mejora de las estrategias terapéuticas frente al cáncer.

REFERENCIAS

Balmer, Y., A. Koller, G. del Val, W. Manieri, P. Schurmann, and B.B. Buchanan. 2003. Proteomics gives insight into the regulatory function of chloroplast thioredoxins. Proc Natl Acad Sci U S A. 100:370-‐375.

Benhar, M., M.T. Forrester, D.T. Hess, and J.S. Stamler. 2008. Regulated protein denitrosylation by cytosolic and mitochondrial thioredoxins. Science (New York, NY). 320:1050-‐1054.

Buchanan, B.B., and Y. Balmer. 2005. Redox regulation: a broadening horizon. Annual review of plant biology. 56:187-‐220.

Foster, M.W., D.T. Hess, and J.S. Stamler. 2009. Protein S-‐nitrosylation in health and disease: a current perspective. Trends in molecular medicine. 15:391-‐404.

Herrero, E., and M.A. de la Torre-‐Ruiz. 2007. Monothiol glutaredoxins: a common domain for multiple functions. Cell Mol Life Sci. 64:1518-‐1530.

Klomsiri, C., P.A. Karplus, and L.B. Poole. 2011. Cysteine-‐based redox switches in enzymes. ANTIOXIDANTS & REDOX SIGNALING. 14:1065-‐1077.

150



Lindahl, M., A. Mata-‐Cabana, and T. Kieselbach. 2011. The Disulfide Proteome and Other Reactive Cysteine Proteomes: Analysis and Functional Significance. ANTIOXIDANTS & REDOX SIGNALING.

McDonagh, B., S. Ogueta, G. Lasarte, C.A. Padilla, and J.A. Barcena. 2009. Shotgun redox proteomics identifies specifically modified cysteines in key metabolic enzymes under oxidative stress in Saccharomyces cerevisiae. J Proteomics. 72:677-‐689.

Meyer, Y., B. Buchanan, F. Vignols, and J. Reichheld. 2009. Thioredoxins and Glutaredoxins: Unifying Elements in Redox Biology. Annu Rev Genet. 43:335-‐367.

Rouhier, N., J. Couturier, M.K. Johnson, and J.-‐P. Jacquot. 2010. Glutaredoxins: roles in iron homeostasis. Trends in Biochemical Sciences. 35:43-‐52

.

151



GRUPO BIO276

BIOMEMBRANAS, ANTIOXIDANTES Y ESTRÉS OXIDATIVO

COMPONENTES:

RESPONSABLE: Villalba Montoro, José Manuel ..... [email protected] Ariza Gómez, Julia ......................................... [email protected] Burón Romero, María Isabel ................................. [email protected] Fernández del Río, Lucía ...................... [email protected] González Reyes, José Antonio .................................. [email protected] Gutiérrez Casado, Elena ............................... [email protected] Khraiwesh, Husam ................................. [email protected] López Domínguez, José Alberto ................. [email protected]


Departamento de Biología Celular, Fisiología e Inmunología, Facultad de Ciencias, Universidad de Córdoba, Campus de Excelencia Internacional Agroalimentario, (ceiA3).


1. Papel de la mitocondria y de la membrana plasmática en la adaptación metabólica relacionada con la extensión de la longevidad por restricción calórica y su modulación por el contenido graso de la dieta. La restricción calórica es la principal alteración no genética que incrementa la longevidad máxima en multitud de organismos, desde los unicelulares hasta los mamíferos. Investigamos las alteraciones que tienen en diversas funciones mitocondriales, como el transporte de electrones, la dinámica de fusión/fisión mitocondrial, y la biosíntesis de coenzima Q en animales alimentados con dietas en restricción calórica con diferente contenido graso. Asimismo, estamos estudiando las alteraciones estructurales y ultraestructurales, y los cambios en los mecanismos de señalización apoptótica de la mitocondria y la membrana plasmática que tienen lugar en tejidos mitóticos (hígado, riñón) y postmitóticos (músculo esquelético).


152



Finalmente, estamos interesados en el desarrollo de sistemas celulares in vitro.

2. Papel del factor de transcripción antioxidante Nrf2 y de la reductasa NQO1 en el control del crecimiento de las células animales. El factor de transcripción Nrf2 es uno de los principales responsables de la respuesta celular al estrés oxidativo. Entre las proteínas cuya expresión depende de Nrf2 destaca la NAD(P)H:quinona oxidoreductasa 1 (NQO1). La expresión de Nrf2 y de NQO1 están relacionadas con la susceptibilidad a la transformación celular. Estamos estudiando el impacto de la deleción genética de Nrf2 o de NQO1 sobre el crecimiento celular en fibroblastos embrionarios procedentes de ratones KO. Nuestros resultados indican que la falta de Nrf2 acelera la inmortalización pero acorta la longevidad celular. Por el contrario, la falta de NQO1 produce incrementa tanto el crecimiento como la longevidad de las células.


Parrado-‐Fernández C, López-‐Lluch G, Rodríguez-‐Bies E, Santa-‐Cruz S, Navas P, Ramsey JJ, Villalba JM (2011) Calorie restriction modifies ubiquinone and COQ transcript levels in mouse tissues. Free Radic Biol Med. 50:1728-‐1736

Santos-‐González M, López-‐Miranda J, Pérez-‐Jiménez F, Navas P, Villalba JM (2011) Dietary oil modifies the plasma proteome during aging in the rat. AGE. PMID: 21472381

Martín-‐Montalvo A, Villalba JM, Navas P, de Cabo R (2011) NRF2, cancer and calorie restriction. Oncogene. 30:505-‐520

Jódar L, Mercken EE, Ariza J, Younts C, González-‐Reyes JA, Alcaín FJ, Burón I, de Cabo R, Villalba JM (2010) Genetic deletion of NRF2 promotes immortalization and decreases lifespan of murine embryonic fibroblasts. J Gerontol Biol Sci. 66:247-‐256

Hagopian K, Weber KL, Hwee D.T., Van Eenennaam AL, López-‐Lluch G, Villalba JM, Burón I, Navas P, German JB, Watkins SM, Chen Y, Wei A, McDonald RB, Ramsey JJ (2010) Complex I-‐Associated Hydrogen Peroxide Production is Decreased and Electron Transport Chain Enzyme Activities are Altered in n-‐3 Enriched fat-‐1 Mice. PLoS One 5:e12696

153



PONENCIA:

LA GRASA DE LA DIETA MODULA LOS CAMBIOS EN MARCADORES APOPTÓTICOS PRODUCIDOS POR LA RESTRICCIÓN CALÓRICA EN MÚSCULO ESQUELÉTICO DE RATÓN

RESUMEN

INTRODUCCIÓN

El envejecimiento es un proceso progresivo e irreversible que lleva a una pérdida general de función. La restricción calórica sin malnutrición (RC) previene o retrasa un gran número de alteraciones pato-‐fisiológicas asociadas con la edad en los roedores. Aunque aún tienen que ser definidos completamente los mecanismos subyacentes a este efecto protector, tanto la disminución en el daño oxidativo como las alteraciones en la composición lipídica de las membranas parecen estar implicadas.

OBJETIVOS

En nuestro trabajo hemos estudiado los posibles efectos sinérgicos o antagónicos de una RC del 40% durante 6 meses y las variaciones en la composición grasa de las dietas. Hemos establecido tres grupos de ratones C57BL/6 que se han sometido a RC con dietas que contenían manteca de cerdo, aceite de soja o aceite de pescado como su fuente grasa principal. Para determinar si alguna de las dietas produce un papel protector sobre la apoptosis en el músculo esquelético, hemos estudiado algunos marcadores de la muerte celular apoptótica como caspasas 3, 8 y 9,niveles de Bax, y actividad esfingomielinasa neutra de la membrana plasmática. Además, hemos determinado los niveles de coenzima Q9 y Q10 y los hidroperóxidos lipídicos, como marcadores del estado redox celular, así como el área transversal de las fibras musculares y su grado de circularidad, marcadores establecidos del grado de atrofia muscular.

RESULTADOS

Hemos observado que la RC produce una disminución de la actividad esfingomielinasa (Figura 1), los niveles de hidroperóxidos y de la proteína pro-‐apoptótica Bax. Además, una dieta en RC basada en el aceite de pescado produjo alteraciones adicionales, como descensos en las actividades caspasa 8 y 9, o aumentos en el contenido de coenzima Q9 y Q10 en la membrana plasmática del músculo. Además, esta dieta influyó de manera positiva en la mayoría de los parámetros regulados por la RC, a excepción de la actividad caspasa 3, para la cual no observamos cambios significativos.

154



Figura 1.-‐ Efecto de la RC y del contenido graso de la dieta sobre la actividad esfingomielinasa neutra de la membrana plasmática. Los asteriscos denotan diferencias significativas entre la dieta ad libitum y RC-‐soja. A: diferencias con RC-‐manteca (p<0.001)

Por su parte, la RC produjo un incremento significativo del área transversal de las fibras musculares del gastrocnemio y una disminución de su circularidad, parámetros ambos indicativos de un menor grado de atrofia muscular. Estos efectos se perdieron cuando la grasa de la dieta fue manteca de cerdo (Figura 2). Estudios posteriores sobre RC a largo plazo y variaciones de la dieta en animales viejos se encuentran actualmente en fase de desarrollo. Estos estudios nos ayudaran a entender hasta qué punto los procesos apoptóticos en el músculo esquelético a lo largo del envejecimiento están regulados por la composición lipídica de las membranas y la actividad metabólica de éstas.

REFERENCIAS Wohlgemuth SE, Seo AY, Marzetti E, Lees HA, Leeuwenburgh C (2010) Skeletal muscle autophagy and apoptosis during aging: effects of calorie restriction and life-‐long exercise. Exp Gerontol. 45:138-‐148.

Marzetti E, Lawler JM, Hiona A, Manini T, Seo AY, Leeuwenburgh C (2008) Modulation of age-‐induced apoptotic signaling and cellular remodeling by exercise and calorie restriction in skeletal muscle. Free Radic Biol Med. 44:160-‐168.

Figura 2.-‐ Efecto de la RC y del contenido graso de la dieta sobre el área de sección transversal y la circularidad. Los asteriscos denotan diferencias significativas entre la dieta ad libitum y RC-‐soja. A/a: diferencias con RC-‐manteca (p<0.001 o p<0.01, respectivamente)

155



GRUPO BIO310

BALANCE ENERGÉTICO Y FUNCIÓN REPRODUCTORA

COMPONENTES:

RESPONSABLE: Tena Sempere Manuel [email protected] Pinilla Jurado Leonor ................................................. [email protected] Aguilar Benítez de Lugo Enrique .............................. [email protected] Navarro Loro Víctor ............................... [email protected] Roa Rivas Juan .................................................... [email protected] Romero Ruiz Antonio .............................................. [email protected] María Jesús Vázquez Villar ...................... [email protected] García Galiano David .............................................. [email protected] Sánchez-‐Garrido Miguel Angel ....................... [email protected] Ruiz Pino Francisco ................................................... [email protected] León Téllez Silvia ...................................................... [email protected] Manfredi Lozano María ................................. [email protected]


Departamento de Biología Celular, Fisiología e Inmunología. Área de Fisiología. Universidad de Córdoba.


1. Neurobiología de la Pubertad. 2. Papel del sistema Kiss1/GPR54 (Kiss1R), y sistemas neuropeptidérgicos relacionados, en el control neuroendocrino de la pubertad y la reproducción, y su regulación por señales metabólicas.

3. Mecanismos de señalización del estado energético sobre los centros de control de la reproducción.

4. Obesidad y función reproductora Influencia de las alteraciones del peso corporal (sobrepeso; sub-‐nutrición) sobre la pubertad y posibles mecanismos implicados.

5. Neuroproteómica Identificación de mecanismos hipotalámicos de control de la pubertad por señales neuropeptidérgicas y metabólicas.


156



6. Generación de modelos animales genéticamente modificados para el análisis de sistemas neuro-‐endocrinos de control integrado de la reproducción y el balance energético.

Otras líneas de investigación: Acciones sobre el eje neuroendocrino de la reproducción de neuropéptidos y hormonas de interés metabólico.

Fisiología gonadal Control de la función gonadal por señales de relevancia metabólica.

Disrupción endocrina del eje reproductor.


Desde el año 2006, los miembros del grupo han publicado un total de 100 artículos en revistas internacionales con censores. A modo de ejemplo, se reseñan abajo algunas de las aportaciones más relevantes en este periodo:

Castellano JM, Navarro VM, Fernandez-‐Fernandez R, Roa J, Vigo E, Pineda R, Dieguez C, Aguilar E, Pinilla L, Tena-‐Sempere M (2006) Expression of hypothalamic KiSS-‐1 system and rescue of defective gonadotropic responses by kisspeptin in streptozotocin-‐induced diabetic male rats. Diabetes 55:2602-‐10. (IF-‐5yr: 8.65).

Roa J, Aguilar E, Dieguez C, Pinilla L, Tena-‐Sempere M (2008) New frontiers in kisspeptin/GPR54 physiology as fundamental gatekeepers of reproductive function. Frontiers in Neuro-‐endocrinology 29:48-‐69 (IF-‐5yr: 12.1); related contribution: Tena-‐Sempere M 2008 Timeline: The role of kisspeptins in reproductive biology. Nature Medicine 14:1196. (IF-‐5yr: 27.9).

Castellano JM, Navarro VM, Roa J, Pineda R, Sanchez-‐Garrido MA, Garcia-‐Galiano D, Vigo E, Dieguez C, Aguilar E, Pinilla L, Tena-‐Sempere M (2009) Alterations in hypothalamic KiSS-‐1 system in experimental diabetes: early changes and functional consequences. Endocrinology 150:784-‐794 (IF-‐5yr: 5.26).

García-‐Galiano D, Navarro VM, Roa J, Ruiz-‐Pino F, Sánchez-‐Garrido MA, Pineda R, Castellano JM, Romero M, Aguilar E, Gaytán F, Diéguez C, Pinilla L, Tena-‐Sempere M (2010) The anorexigenic neuropeptide, Nesfatin-‐1, is indispensable for normal puberty onset in the female rat. Journal of Neuroscience 30:7783-‐92. (IF-‐5yr: 8.1).

Roa J, Tena-‐Sempere M (2010) Energy balance and puberty onset: emerging role of central mTOR signaling. Trends in Endocrinology & Metabolism 21:519-‐528 (IF-‐5yr: 7.53).

157



PONENCIA:

MODELOS Y HERRAMIENTAS PARA EL ESTUDIO DE LOS MECANISMOS FISIOLÓGICOS DE CONTROL METABÓLICO DE LA PUBERTAD Y LA FUNCIÓN REPRODUCTORA.

RESUMEN

La ingesta de alimentos, la homeostasis energética y la reproducción son funciones esenciales para la supervivencia de los individuos o de las especies, y están por ello bajo el control de sistemas de regulación muy sofisticados, cuyos elementos integrantes y mecanismos de acción son aun en gran medida desconocidos. Prueba adicional de su importancia funcional, el control de estos sistemas neuroendocrinos está estrechamente relacionado entre sí, lo que contribuye a un perfecto acoplamiento de funciones corporales relevantes tales como el control de los depósitos energéticos del organismo, el crecimiento y la fertilidad.

El Objetivo General de nuestro grupo de investigación es el de contribuir a una mejor caracterización de las señales y mecanismos moleculares implicados en el control fisiológico de la pubertad y la función reproductora, así como de la interacción de éstos con los sistemas responsables de la regulación del balance energético y el peso corporal. Aunque nuestra actividad investigadora es de carácter básico, ésta posee un claro potencial traslacional, habida cuenta nuestros resultados podrían tener interés aplicado en el medio y largo plazo, en el contexto del manejo de alteraciones de la función reproductora (infertilidad, trastornos de la pubertad) y el peso corporal (obesidad, anorexia), que presentan una prevalencia elevada y creciente en sociedades desarrolladas como la nuestra.

Líneas de Investigación: Bajo el objetivo general antes descrito, nuestro grupo de investigación desarrolla diversas actividades, estrechamente relacionadas, que pueden agruparse en las siguientes líneas temáticas:

1.-‐Neurobiología de la Pubertad. La pubertad es un evento madurativo clave en el desarrollo del individuo que es sensible a numerosas señales tanto internas como ambientales. Entre éstas, la maduración puberal es influenciada por factores nutricionales y por el estado metabólico del organismo. En el marco de nuestros estudios acerca de los mecanismos neuroendocrinos de control de la pubertad, el grupo ha acometido la caracterización de nuevos mecanismos de regulación puberal, incluyendo la participación de microRNAs y sistemas de control epigenético.

158



2.-‐ Papel del sistema Kiss1/GPR54 (Kiss1R), y sistemas neuropeptidérgicos relacionados, en el control neuroendocrino de la pubertad y la reproducción, y su regulación por señales metabólicas. Nuestro grupo ha sido pionero en la caracterización del papel fisiológico de las kisspeptinas en el control neuroendocrino de diversos aspectos de la función reproductora. Entre otros, nuestros datos han demostrado la implicación del sistema Kiss1 en la mediación de los efectos del estado energético del organismo sobre desarrollo (pubertad) y función del eje reproductor. Estudios recientes del grupo han contribuido igualmente a la definición del papel de neuro-‐péptido, neurokinina B (NKB), en la regulación del sistema Kiss1 y en el control estimulador de la pubertad y el eje reproductor.

3.-‐ Mecanismos de señalización del estado energético sobre los centros de control de la reproducción. Hemos avanzado en la caracterización de los mecanismos de acción de la leptina y otros reguladores metabólicos sobre los sistemas neuronales de control de la función reproductora. Igualmente, hemos estudiado la contribución a este fenómeno de los sistemas de señalización del estado energético celular, tales como mTOR y AMPK, y hemos iniciado análisis acerca del papel en este proceso de otros posibles mediadores centrales, tales como el factor de transcripción Crtc-‐1, y de los sistemas de modulación (epigenética) FTO y Sirt1.

4.-‐ Obesidad y función reproductora Influencia de las alteraciones del peso corporal (sobrepeso; sub-‐nutrición) sobre la pubertad y posibles mecanismos implicados. Hemos evaluado las consecuencias funcionales (efectos y mecanismos de acción) de alteraciones severas del peso corporal sobre la pubertad y la función reproductora en la edad adulta, empleando para ello modelos animales (rata) de obesidad y sub-‐nutrición. En este mismo contexto, hemos implementado análisis a gran escala (micro-‐arrays, proteómica, multiplex) metabólicos y reproductores en modelos animales de alteración multifactorial y combinatoria de la ingesta (sobrealimentación postnatal, dieta alta en grasa) y estado gonadal (androgenización neonatal, gonadectomía como modelo de menopausia).

5.-‐ Neuroproteómica Identificación de mecanismos hipotalámicos de control de la pubertad por señales neuropeptidérgicas y metabólicas. Hemos puesto en marcha recientemente el empleo de técnicas ómicas (especialmente proteómicas, mediante DIGE) con objeto de identificar mediadores moleculares de los cambios hipotalámicos durante la maduración puberal, tras manipulación de los procesos de diferenciación sexual del cerebro, en situaciones de estrés metabólico asociadas a alteración puberal y en modelos de alteración de la pubertad por ausencia de señalización de kisspeptinas.

159



6.-‐ Generación de modelos animales genéticamente modificados para el análisis de sistemas neuro-‐endocrinos de control integrado de la reproducción y el balance energético. A través de diversas colaboraciones con otros equipos de investigación, nuestro grupo ha puesto en marcha proyectos de generación y análisis de modelos murinos de sobre-‐expresión o eliminación de señales neuroendocrinas relevantes (modelo de sobre-‐expresión de Kiss1; modelo Gpr54 KO; modelo de eliminación del receptor de GnIH), así como modelos doble-‐transgénico y de eliminación selectiva de factores de interés en poblaciones neuronales de interés neuro-‐endocrino (estudios en progreso).

Otras líneas de investigación:

7.-‐ Acciones sobre el eje neuroendocrino de la reproducción de neuropéptidos y hormonas de interés metabólico. Hemos caracterizado en los últimos años los efectos y mecanismos de acción sobre el eje gonadotrópico de hormonas (leptina, ghrelina, PYY3-‐36, adipokinas) y neuro-‐péptidos (GALP, 26RFa, NMU, NMS, prokineticina-‐2, nesfatina, VGF) primariamente implicados en el control de la ingesta y el peso corporal.

8.-‐ Fisiología gonadal Control de la función gonadal por señales de relevancia metabólica. Nuestro grupo ha desarrollado estudios dirigidos a caracterizar los patrones de expresión y las acciones biológicas en las gónadas (especialmente, el testículo) de diversas señales de interés metabólico, tales como leptina, ghrelina, orexina, resistina, adiponectina, kisspeptina, nesfatina y prokinitecina.

9.-‐ Disrupción endocrina del eje reproductor. Nuestro grupo está igualmente interesado en el análisis de las acciones fisiológicas y fisiopatológicas de compuestos estrogénicos sobre el sistema reproductor y otros ejes hormonales relacionados, especialmente tras exposición durante periodos críticos del desarrollo en la rata. Estos análisis, centrados inicialmente en las alteraciones reproductoras, se han hecho extensivos a las modificaciones del peso corporal y sus sistemas neuroendocrinos de control inducidas por la exposición temprana (perinatal) a estrógenos y andrógenos sintéticos.).

Proyectos de Investigación y Tesis Doctorales: Las líneas de trabajo indicadas han sido desarrolladas en el marco de diversos proyectos de investigación, financiados por agencias públicas nacionales (MINECO, MICINN, MEC, ISCiii-‐FIS, CIBERobn, PAIDI-‐Junta de Andalucía) e internacionales (EU-‐FP5, EU-‐FP7), así como por contratos de investigación con entidades privadas. Los proyectos vivos del grupo incluyen: 1 proyecto del Plan Nacional (MINECO), 1 proyecto de excelencia de la Junta de Andalucía, 1 proyecto EU del programa Cooperación del 7FP y 3 proyectos EU del programa People del FP7, además de fondos del centro de investiga-‐ción biomédica en red del ISCiii (CIBERobn),

160



ayudas anuales del PAIDI y el plan propio de la UCO, así como proyectos financiados por empresas farmacéuticas.

Por otra parte, el desarrollo de las líneas de investigación descritas ha permitido completar en los últimos años un total de 6 Tesis Doctorales; doctores que han obtenido becas y contratos de investigación post-‐doctoral programas Marie Curie (4 en los últimos años; tres de ellos en las convocatorias 2007, 2008 y 2010), Parga-‐Pondal (Xunta de Galicia), Juan de la Cierva y Fulbright-‐. Adicionalmente, en la actualidad están en desarrollo un total de 5 proyectos de Tesis Doctoral en nuestro grupo de investigación. Igualmente, nuestro grupo viene desarrollando proyectos de colaboración con numerosos grupos de investigación nacionales e internacionales, y ha recibido (para estancias formativas de distinta duración) la visita de numerosos investigadores procedentes de universidades de diversos países europeos (Dinamarca, Francia, Italia, Polonia, Eslovaquia, Turquía, España) y americanos (México, Argentina)

Metodologías: Nuestro grupo aplica de rutina diversas técnicas y metodologías analíticas en el ámbito de la Endocrinología Experimental, que incluyen fundamentalmente aproximaciones in vivo y que emplean la rata y el ratón como especies modelo. Entre ellas se incluyen la administración intracerebral y sistémica de hormonas y neuropéptidos; la obtención de muestras biológicas -‐incluyendo diversos tejidos y muestras seriadas de sangre-‐; la monitorización in vivo de parámetros reproductores, de peso corporal e ingesta; el testado farmacológico en incubaciones de tejidos (hipotálamo, hipófisis, gónadas); el análisis de niveles hormonales mediante radioinmunoensayo (RIA); la determinación de niveles de expresión de RNA mediante RT-‐PCR en tiempo y real; y la evaluación de perfiles de expresión de proteínas mediante inmunohistoquímica. Igualmente, son operativos de rutina en nuestro grupo análisis de localización de RNA mediante hibridación in situ y estudios de niveles de proteínas por Western blot en tejidos de interés (cerebro, gónadas, tracto GI). Por otra parte, hemos potenciado en los últimos años el desarrollo de estudios en modelos murinos transgénicos y genéticamente modificados (actualmente el grupo cuenta con hasta 10 líneas diversas de ratones TG/GM), y hemos optimizado técnicas para el análisis de expresión y manipulación funcional de microRNAs en tejidos de interés (stem-‐loop qPCR, LNA-‐ISH, sistemas químicos y lentivirales de interferencia de microRNAs).

Otras Actividades: En los últimos años, los miembros del grupo de investigación han sido invitados a impartir >50 conferencias en congresos y >20 seminarios en foros científicos nacionales e internacionales. Igualmente, miembros de nuestro grupo forman parte de los comités editoriales de

161



revistas de alto prestigio en nuestra disciplina, tales como Endocrinology, Molecular & Cellular Endocrinology, Neuroendocrinology, Journal of Neuroendocrinology y PLoS ONE, así como en la dirección científica del CIBERobn. Finalmente, nuestro grupo mantiene colaboraciones científicas con más de 20 grupos de investigación nacionales y extranjeros; colaboraciones que en su mayoría han resultado ya en publicaciones conjuntas en revistas internacionales.

162



163




EXPERIENCIA INVESTIGADORA PRE-‐ Y POSTDOCTORAL DE UN ANTIGUO ALUMNO DE LA UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA

David González Ballester

D.G.B. es doctor en Bioquímica por la Universidad de Córdoba. Realizó una estancia postdoctoral en la Carnegie Institution of Science, Universidad de Stanford, California (USA). En la actualidad es Investigador Contratado del Programa Ramón y Cajal en el grupo BIO128.

RESUMEN

David González Ballester se graduó en Bioquímica por la Universidad de Córdoba (1993-‐1998). Ingresó en el Dpt. de Bioquímica y Biología Molecular con una beca de Alumno Colaborador (1997-‐1998) donde realizó primero su tesina (Identificación y Caracterización Molecular de una H+-‐ATPasa de membrana plasmática en Chlamydomonas; 1998-‐2000) y posteriormente su tesis doctoral (Genómica Funcional de la Señalización por Amonio y Nitrato, y Caracterización de Genes para el Transporte de Amonio en Chlamydomonas; 2000-‐2005). Ambas bajo la supervisión del Prof. Emilio Fernández Reyes. Para la realización de su tesis doctoral recibió una beca predoctoral de la Junta de Andalucía (F.P.D.I programa, 2001-‐2005). En enero de 2006 David se traslada a la Carnegie Institution of Science (Universidad de Stanford, California, EEUU) para realizar una estancia postdoctoral baja la dirección del Prof. Arthur Grossman. Allí continuará su trabajo con Chlamydomonas, estudiando en este caso las bases moleculares que median las respuestas de aclimatación de esta alga a un medio deficitario en azufre. Su estancia postdoctoral (2006-‐2010) fue financiada en primera instancia con una beca postdoctoral del MEC (2006-‐2007) y posteriormente con un contrato Marie Curie OIF (2006-‐2011). En julio de 2011 David se reincorpora al grupo de investigación dirigido por Emilio Fernández Reyes en la Universidad de Córdoba donde comienza una línea de investigación nueva basada en la Fotoproduccion de Hidrógeno en Chlamydomonas. En enero de 2012 se hace valedor de

164



un contrato Ramón y Cajal. En la actualidad David compagina sus tareas investigadoras con la docencia de la asignatura de Biotecnología (5º curso de la licenciatura Bioquímica) y es además codirector de una tesis doctoral.


1. Estudio de la fotoproducción de hidrógeno en algas verdes. 2. Estudio de las respuestas celulares frente a déficit de azufre en el alga vede Chlamydomonas reinhardtii.

3. Estudio de la asimilación de amonio y nitrato en el alga verde Chlamydomonas reinhardtii.


Leon-‐Bañares R, Gonzalez-‐Ballester D, Galvan A, Fernandez E (2004) Transgenic microalgae as green cell-‐factories. Trends in Biotechnology 22: 45-‐52

Gonzalez-‐Ballester D, Camargo A, Fernandez E (2004) Ammonium transporter genes in Chlamydomonas: the nitrate-‐specific regulatory gene Nit2 is involved in Amt1;1 expression. Plant Molecular Biology 56: 863-‐878

Gonzalez-‐Ballester D, de Montaigu A, Galvan A, Fernandez E (2005) Restriction enzyme site-‐directed amplification PCR: A tool to identify regions flanking a marker DNA. Analytical Biochemistry 340: 330-‐335

Gonzalez-‐Ballester D, de Montaigu A, Higuera JJ, Galvan A, Fernandez E (2005) Functional genomics of the regulation of the nitrate assimilation pathway in Chlamydomonas. Plant Physiology 137: 522-‐533

Camargo A, Llamas A, Schnell RA, Higuera JJ, Gonzalez-‐Ballester D, Lefebvre PA, Fernandez E, Galvan A (2007) Nitrate signaling by the regulatory gene NIT2 in Chlamydomonas. Plant Cell 19: 3491-‐3503

Llamas A, Tejada-‐Jimenez M, Gonzalez-‐Ballester D, Higuera JJ, Schwarz G, Galvan A, Fernandez E (2007) Chlamydomonas reinhardtii CNX1E reconstitutes molybdenum cofactor biosynthesis in Escherichia coli mutants. Eukaryotic Cell 6: 1063-‐1067

165



Merchant SS, Prochnik SE, Vallon O, Harris EH, Karpowicz SJ, Witman GB, Terry A, Salamov A, Fritz-‐Laylin LK, Marechal-‐Drouard L, Marshall WF, Qu L-‐H, Nelson DR, Sanderfoot AA, Spalding MH, Kapitonov VV, Ren Q, Ferris P, Lindquist E, Shapiro H, Lucas SM, Grimwood J, Schmutz J, Cardol P, Cerutti H, Chanfreau G, Chen C-‐L, Cognat V, Croft MT, Dent R, Dutcher S, Fernandez E, Fukuzawa H, Gonzalez-‐Ballester D, et al. (2007) The Chlamydomonas genome reveals the evolution of key animal and plant functions. Science 318: 245-‐251

Galvan A, Gonzalez-‐Ballester D, Fernandez E (2007) Insertional mutagenesis as a tool to study genes/functions in Chlamydomonas. Transgenic Microalgae as Green Cell Factories 616: 77-‐89

Gonzalez-‐Ballester D, Pollock SV, Pootakham W, Grossman AR (2008) The central role of a SNRK2 kinase in sulfur deprivation responses. Plant Physiology 147: 216-‐227

Moseley JL, Gonzalez-‐Ballester D, Pootakham W, Bailey S, Grossman AR (2009) Genetic Interactions Between Regulators of Chlamydomonas Phosphorus and Sulfur Deprivation Responses. Genetics 181: 889-‐905

Gonzalez-‐Ballester D, Casero D, Cokus S, Pellegrini M, Merchant SS, Grossman AR (2010) RNA-‐Seq Analysis of Sulfur-‐Deprived Chlamydomonas Cells Reveals Aspects of Acclimation Critical for Cell Survival. Plant Cell 22: 2058-‐2084

Pootakham W, Gonzalez-‐Ballester D, Grossman AR (2010) Identification and Regulation of Plasma Membrane Sulfate Transporters in Chlamydomonas.Plant Physiology 153: 1653-‐1668

Gonzalez-‐Ballester D, Pootakham W, Mus F, Yang W, Catalanotti C, Magneschi L, de Montaigu A, Higuera JJ, Prior M, Galvan A, Fernandez E, Grossman AR (2011) Reverse genetics in Chlamydomonas: a platform for isolating insertional mutants. Plant Methods 7, 2410.1186/1746-‐4811-‐7-‐24

166



167



GRUPO BIO138

INGENIERÍA GENÉTICA EN HONGOS

COMPONENTES:

RESPONSABLE: González Roncero, Mª Isabel ....... [email protected] de la Hera, Concepción............................................ [email protected] Di Pietro, Antonio ..................................................... [email protected] Ruiz Roldán, Carmen ............................................. [email protected] Elena Pérez Nadales .............................................. [email protected] Turrà, David ............................................................ [email protected] Roca, Mª Gabriela ............................................. [email protected] de Miguel Rojas, Cristina ....................................... [email protected] López Fernández, Loida ............................................ [email protected] Navarro Velasco, Gesabel....................................... [email protected] Bravo Ruiz, Gustavo ................................................ [email protected] Segorbe Luque, David ............................................. [email protected] Schäfer, Katja ...................................................k_scha11@hotmail.de El Ghalid, Mennat .......................................... [email protected] Corral Ramos, Cristina ............................... [email protected] Martínez Aguilera, Esther ..................................... [email protected]


Departamento de Genética. Universidad de Córdoba.


Los hongos patógenos: estudio de Fusarium oxysporum: Los hongos patógenos tienen un impacto devastador sobre la alimentación y la salud humana. Nuestro grupo investiga las bases moleculares y genéticas de la patogénesis fúngica, utilizando como modelo de estudio F. oxysporum, un hongo capaz de causar fusariosis vascular en más de cien especies distintas de cultivo. Además, F. oxysporum es un patógeno oportunista de humanos que puede provocar infecciones sistémicas en pacientes inmunodeprimidos. Con el fin de comparar los mecanismos de infección en plantas y mamíferos hemos puesto a

168



punto un modelo de infección multihospedador, basado en un aislado de F. oxysporum f. sp. lycopersici. De esta forma, los mutantes obtenidos en el laboratorio por inactivación génica pueden ensayarse simultáneamente en tomate y en ratón. La disponibilidad de la secuencia completa del genoma de F. oxysporum permite utilizar abordajes genómicos y proteómicos, además de la genética directa e inversa. Siguiendo una serie de estrategias experimentales, hemos identificado nuevos mecanismos implicados en la patogénesis fúngica: componentes de señalización, factores de transcripción, enzimas de biogénesis de la pared o proteínas secretada. El objetivo a largo plazo es identificar el conjunto de genes que permiten a F. oxysporum causar enfermedad en un amplio rango de especies pertenecientes a diversos reinos eucariotas.


Navarro-‐Velasco GY, Prados-‐Rosales RC, Ortíz-‐Urquiza A, Quesada-‐Moraga E, Di Pietro A (2011) Galleria mellonella as model host for the trans-‐kingdom pathogen Fusarium oxysporum. Fungal Genetics & Biology 48:doi:10.1016/j.fgb.2011.08.004

Pérez-‐Nadales E, Di Pietro A (2011) The membrane mucin Msb2 regulates invasive growth and plant infection in Fusarium oxysporum. Plant Cell 23:1171-‐1185

López-‐Berges MS, Rispail N, Prados-‐Rosales RC, Di Pietro A (2010) A nitrogen response pathway regulates virulence functions in Fusarium oxysporum via the protein kinase TOR and the bZIP protein MeaB. Plant Cell 22: 2459-‐75

Ma LJ, van der Does C, Borkovich KA, Coleman JJ, Daboussi MJ, Di Pietro A, Dufresne M, Freitag M, Grabherr M, Henrissat B, Houterman PM, Kang S, Shim WB, Woloshuk C, Xie X, Xu JR, Antonxiw J, Baker SE, Bluhm BH, Breakspear A, Brown DW, Butchko RAE, Chapman S, Coulson R, Coutinho PM, Danchin EGJ, Diener A, Gale LR, Gardiner DM, Goff S, , Hilburn K, Houterman PM, Hua-‐Van A, Jonkers W, Kazan K, Kodira CD, Koehrsen M, Kumar L, Lee YH, Li L, Manners JM, Miranda-‐Saavedra D, ParkG, Park J, Park SY, Proctor RH, Regev A, Ruiz-‐Roldan MC, Sain D, Sakthikumar S, SykesS, Schwartz DC, Turgeon BG, Wapinski I, Yoder O, Young S, Zeng Q, Zhou S, Galagan J, Cuomo CA, Kistler HC, Rep M (2010) Comparative genomics reveals mobile pathogenicity chromosomes in Fusarium oxysporum. Nature 464: 367-‐73

Ruiz-‐Roldán MC, Köhli M, Roncero MIG, Philippsen P, Di Pietro A, Espeso E (2010) Nuclear dynamics during germination, conidiation and hyphal fusion of Fusarium oxysporum. Eukaryotic Cell 9: 1216 -‐1224

169



Pareja-‐Jaime Y, Martín-‐Urdíroz M, Roncero MIG, González-‐Reyes JA, Ruiz-‐Roldán MC (2010) Chitin synthase deficient mutant of Fusarium oxysporum elicits tomato plant defence response and protects against wild type infection. Molecular Plant Pathology 11: 479 493

Rispail N, Di Pietro A (2010) The two-‐component histidine kinase Fhk1 controls stress adaptation and virulence of Fusarium oxysporum. Molecular Plant Pathology 11: 395-‐407

Martín-‐Urdiroz M, Martínez-‐Rocha AL, Di Pietro A, Martínez del Pozo A, Roncero MIG (2009) Differential toxicity of antifungal protein AFP against mutants of Fusarium oxysporum. International Microbiology 12: 115-‐121

Prados-‐Rosales R, Luque-‐Garcia JL, Martínez-‐López R, Gil C, Di Pietro A (2009) The Fusarium oxysporum cell wall proteome under adhesion-‐inducing conditions. Proteomics 9: 4755-‐69

Rispail N, Di Pietro A (2009) Fusarium oxysporum Ste12 controls invasive growth and virulence downstream of the Fmk1 MAPK cascade. Molecular Plant-‐Microbe Interactions 22: 830-‐9

López-‐Berges MS, Di Pietro A, Daboussi MJ, Wahab HA, Vasnier C, Roncero MI, Dufresne M, Hera C (2009) Identification of virulence genes in Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici by large-‐scale transposon tagging. Molecular Plant Pathology 10: 95-‐107

Rispail N, Soanes DM, Ant C, Czajkowski R, Grünler A, Huguet R, Perez-‐Nadales E, Poli A, Sartorel E, Valiante V, Yang M, Beffa R, Brakhage AA, Gow NA, Kahmann R, Lebrun MH, Lenasi H, Perez-‐Martin J, Talbot NJ, Wendland J, Di Pietro A (2009) Comparative genomics of MAP kinase and calcium-‐calcineurin signalling components in plant and human pathogenic fungi. Fungal Genetics & Biology 46: 287-‐98

Di Pietro, Roncero MIG, Ruiz Roldán C (2009) From tools of survival to weapons of destruction: role of cell wall-‐degrading enzymes in plant infection. The Mycota Vol V, 181-‐200, Springer Verlag, Heidelberg.

PONENCIA:

RNA-‐SEQ ANALYSIS OF THE TRANS-‐KINGDOM PATHOGEN FUSARIUM OXYSPORUM REVEALS EXTENSIVE TRANSCRIPTIONAL REPROGRAMMING DURING FUNGAL INFECTION OF PLANT AND MAMMALIAN HOSTS

RESUMEN

The soilborne fungus Fusarium oxysporum causes wilt disease on more than a hundred different crops and lethal systemic infections in

170



immunocompromized patients. During plant infection, F. oxysporum invades the host via the roots and the vascular system, whereas in humans, fungal dissemination occurs efficiently through the bloodstream. In this study, we have used massively parallel sequencing of cDNA (RNA-‐seq) to generate a high-‐resolution map of the F. oxysporum transcriptome during fungal growth on tomato roots and in whole human blood. Gene expression profiles during initial stages of plant infection and bloodstream dissemination (0, 30, 90 minutes) were compared with those on minimal medium (MM) at 28ºC or 37ºC, respectively. The analysis identified 588 and 1235 genes whose expression is upregulated on tomato roots and blood, respectively. Moreover, 2648 genes are differentially expressed during growth on tomato roots vs. human blood. Out of these, 535 also show differential expression in MM (28ºC vs. 37ºC), suggesting temperature-‐dependent regulation. We conclude that differential expression of the remaining 2113 genes is caused by the host-‐specific response of F. oxysporum to the plant or the blood environment. These genes encode proteins involved in general stress response, antioxidative response, as well as ATP-‐binding cassette transporters and putative PTH11-‐type G-‐protein-‐coupled receptors, among others. We are currently extending the study by performing RNA-‐seq of fungal gene knockout mutants lacking key transcription factors, including the homeodomain transcription factor Ste12 required for virulence on tomato plants, the pH response transcription factor PacC essential for virulence on mice, and LaeA, a global regulator of secondary metabolism that contributes to virulence on both classes of hosts. The goal is to identify genes whose differential expression during infection depends on these transcriptional regulators, and which may represent potential virulence determinants. The results of this comprehensive transcriptome analysis will provide new insights into the genetic programs that determine pathogenicity of F. oxysporum both on plant and human hosts, facilitating to the identification of novel antifungal targets.

171



GRUPO BIO272

GENÉTICA Y TRASTORNOS DEL COMPORTAMIENTO

COMPONENTES:

RESPONSABLE: Ruiz Rubio, Manuel ...................... [email protected] Calahorro Núñez, Fernando ................................... [email protected] González Izquierdo, Patricia ................................... [email protected] Alejandre Durán, Encarna ...................................... [email protected] Contreras Luque, Israel ......................................... [email protected] Romero Porras, Raquel ............................. [email protected] Martín Borreguero, Pilar ................... [email protected] Guijarro Granados, Teresa ... [email protected] Burgos Marín, Rafael .......................................... [email protected] Romero Balsera, Mª Auxiliadora .......................... [email protected] Tienda Carril, Pilar ........... [email protected] Sánchez Raya, Mª Araceli ...................................... [email protected]

[email protected]

DEPARTAMENTO E INSTITUCIONES:

Departamento de Genética Facultad de Ciencias, Universidad de Córdoba. Unidad de Salud Mental Infanto-‐Juvenil, Hospital Reina Sofía. Departamento de Psicología, Facultad de Ciencias de la Educación, Universidad de Córdoba. Instituto Maimonides de Investigación Biomédica de Córdoba (IMIBIC).


1. Genética del autismo: estudio de endo-‐fenotipos en pacientes y familiares y relación con genes específicos.

2. Caenorhabditis elegans como modelo en el estudio de la función sináptica neuronal implicada en autismo.

PUBLICACIONES MÁS RELEVANTES: Calahorro F, Ruiz-‐Rubio M (2012) Functional phenotypic rescue of Caenorhabditis elegans neuroligin-‐deficient mutants by the human and rat NLGN1 genes. PLoS ONE (under review).

172



Calahorro F, Ruiz-‐Rubio M (2011) Caenorhabditis elegans as an experimental

Invertebrate Neuroscience 11:73-‐83.

Suárez-‐Gómez M, Alejandre E, Ruiz-‐Rubio M (2011) microRNAs in bipolar disorder: diagnostic and therapeutic applications. Rev Neurol 53: 91-‐98.

Ruiz-‐Rubio M, Calahorro F, Alejandre E, Anaya N, Guijarro T, Sanz Y, Romero A, Tienda P, Burgos R, Gay E, Sánchez V (2010) Piezas relevantes en el puzzle de la etiología genética del autismo. En: Investigaciones sobre autismo en español: Problemas y perspectivas (Mercedes Belinchon, Ed), Universidad Autónoma de Madrid. pp: 249-‐262.

Calahorro F, Alejandre E, Ruiz-‐Rubio M (2009) Osmotic avoidance in Caenorabditis elegans: synaptic funtion of two genes orthologues of human NRXN1 and NLGN1, as candidate for autism. Journal of Visualized Experiments 34, doi: 10.3791/1616.

Calahorro F, Alejandre E, Anaya N, Guijarro T, Sanz Y, Romero A, Tienda P, Burgos R, Gay E, Sánchez V, Ruiz-‐Rubio M (2009) A preliminary study of gene polymorphisms involved in the neurotransmitters metabolism of a homogeneous Spanish autistic group. Research in Autism Spectrum Disorders 3: 438-‐443.

Ruiz-‐Rubio M, McInnes (2008) Serotonin (5-‐hydroxytriptamine) and the etiology of autism. In: Bioactve Natural Products (Atta-‐Ur-‐Rhaman, Ed), Elsevier Science Publishers, Amsterdan, Vol 30, pp. 367-‐392.

PONENCIA:

AUTISM SPECTRUM DISORDERS: BEHAVIORAL RESCUE OF CAENORHABDITIS ELEGANS NEUROLIGIN-‐DEFICIENT MUTANTS BY THE HUMAN NLGN1 GENE

RESUMEN

Abormalities in the neuronal synapse are involved in the etiology of autism. Neuroligins are postsynaptic cell adhesion proteins that interact with neurexin at the presynaptic membrane. Single missense and frameshift mutations in neuroligin coding genes lead to autism and/or mental retardation. In C. elegans, nlg-‐1 is orthologous to mammalian neuroligin genes. We have found that nlg-‐1 defective mutants are altered in several behavioural traits, including osmotic

173



strength response, touch response, basal slowing response mediated by dopamine-‐containing neural circuit, experience-‐dependent response mediated by serotonergic neurotransmission, defecation cycle, and distortional sensitivity to drugs such as aldicarb, levamisol and pentylenetetrazol which modify acetylcholine and GABA neurotransmitters activities. The expression of cDNAs from rat Nlgn1 or human NLGN1 genes in nlg-‐1 deficient mutants of C. elegans rescued the phenotypes tested. These results demonstrate that mammalian and C. elegans neuroligins seem to be functionally comparable and would allow the study of how mutations in human neuroligin genes modulate phenotypes in different genetic backgrounds and different environmental conditions. In this sense, the nematode could be used as an effective model to explore basic mechanisms underpinning autism spectrum disorders.

INTRODUCCIÓN

Studies on patients afflicted with autism spectrum disorders are contributing significantly to our understanding of the pathogenesis of autism spectrum disorders, but the molecular bases involved in these diseases remain unknown. The experimental results obtained in other mammals to identify these mechanisms have advantages in order to translate them to humans, but there are some limitations due to ethical and methodological difficulties. Invertebrates, especially the well-‐established model organism C. elegans, offer several advantages as an animal model [1,2]. Significantly, it is estimated that over 83% of the nematode proteome has human orthologous proteins [3]. In particular, the worm presents several useful characteristics as an animal model for studying neurological diseases, since the wiring diagram of the nematode nervous system consists of a defined set of 302 neurons, which are well mapped and characterized and the main interactions between them are known [4]. In addition, the basic cell biology and biochemistry of the nematode nervous system overlaps generally with mammals; it includes similar ion channels, neurotransmitters (e.g. dopamine, serotonin, acetylcholine, glutamate, GABA, etc.), vesicular transporters, receptors and several synaptic components [5,6]. Although the worm presents limitations as an animal model compared with more complex organisms, it is contributing to understanding many fundamental conserved mechanisms in humans including programmed cell death [7], mechanisms mediated by RNA interference [8] and fundamental discoveries in neuroscience, development, signal transduction and aging [9].

174



OBJETIVOS

To study the mechanisms of how neuroligin and other human proteins, modulate the synaptic function in different genetics backgrounds and different environmental conditions in C. elegans. The main goal is to extrapolate these results to humans for understanding molecular mechanisms involved in the etiology of autism spectrum disorder.

RESULTADOS

Mammalian and C. elegans neuroligins seem to be functionally comparable since their structures are similar, containing an extracellular cholinesterase-‐like domain, a type-‐1 transmembrane domain and an intracellular domain with a PDZ-‐binding motif at the C-‐terminal end [10]. C. elegans nlg-‐1 gene is expressed in neurons, and localizes mainly in the postsynaptic regions, although it has also been found associated to the presynaptic region of some neurons. The C. elegans mutants deficient in nlg-‐1 are defective in several phenotypes [11].

e of behaviours is simple it is possible to study integrated response to different sensory stimuli [12]. Rat Nlgn1 and human NLGN1 isoforms, when expressed in nlg-‐1 deficient mutants, were able to rescue the phenotype, suggesting that mammalian neuroligins are functional in C. elegans. Figure 1, provides an experimental example of a phenotype rescue of C. elegans nlg-‐1 deficient mutants by mammals neuroligins (Figure 1A). Mutation in neuroligins involved in autism such as Asp396Stop and Arg453Cys, failed to rescue the wild type phenotype (Figure 1B). These results indicate that mammalian and C. elegans neuroligins seem to be functionally comparable. The results anticipate that the nematode could be useful as an in vivo model for studying specific synapse mechanisms involved in autism.

175



. Figure 1. Phenotype rescues of nlg-‐1 deficient mutants by rat Nlgn1 and human NLGN1 genes. Osmotic strength response was measured as follow: L4 animals of each strain were placed within an annular ring (1 cm diameter) of 4M fructose solution, on NGM plates; animals avoiding the ring six times in a row were considered normal, if not, they were counted as defective. A. Phenotype rescues in nlg-‐1 (ok259) deficient mutants by expressing cDNAs from C. elegans nlg-‐1, rat Nlgn1 and human NLGN1 genes under C. elegans nlg-‐1 promoter. B. Rescue analysis of nlg-‐1 (ok259) deficient mutants in transgenic strains expressing C. elegans NLG-‐1 protein with Arg437Cys, and human NLGN1 protein with Arg453Cys or Asp396Stop mutations. N2 is the wild type strain in A and B. The * indicates significant difference by Student t-‐test (p 0.001),

Error bars indicate the standard deviation of at least three independent experiments with ten worms of each strain.

REFERENCIAS

1. Brenner S (1974) The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics 77: 71-‐94.

2. Sulston JE, Brenner S (1974) The DNA of Caenorhabditis elegans. Genetics 77: 95-‐104.

3. Lai CH, Chou CY, Ch'ang LY, Liu CS, Lin W (2000) Identification of novel human genes evolutionarily conserved in Caenorhabditis elegans by comparative proteomics. Genome Res 10: 703-‐713.

4. White JG, Southgate E, Thomson JN, S. B (1986) The structure of the nervous system of the nematode C. elegans Philosophical Transactions of the Royal Society of London 314: 1-‐340.

5. Bargmann CI (1998) Neurobiology of the Caenorhabditis elegans genome. Science 282: 2028-‐2033.

176



6. Chalfie M, White J (1986) The nervous system. In: The Nematode Caenorhabditis elegans (W.B. Wood, Editor), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor: 337 391.

7. Hedgecock EM, Sulston JE, Thomson JN (1983) Mutations affecting programmed cell deaths in the nematode Caenorhabditis elegans. Science 220: 1277-‐1279.

8. Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, et al. (1998) Potent and specific genetic interference by double-‐stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391: 806-‐811.

9. Antoshechkin I, Sternberg PW (2007) The versatile worm: genetic and genomic resources for Caenorhabditis elegans research. Nat Rev Genet 8: 518-‐532.

10. Hunter JW, Mullen GP, McManus JR, Heatherly JM, Duke A, et al. (2010) Neuroligin-‐deficient mutants of C. elegans have sensory processing deficits and are hypersensitive to oxidative stress and mercury toxicity. Dis Model Mech 3: 366-‐376.

11. Calahorro F, Alejandre E, Ruiz-‐Rubio M (2009) Osmotic avoidance in Caenorhabditis elegans: synaptic function of two genes, orthologues of human NRXN1 and NLGN1, as candidates for autism. J Vis Exp 34.

12. Calahorro F, Ruiz-‐Rubio M (2011) Caenorhabditis elegans as an experimental tool for the study of complex neurological diseases: Parkinson's disease, Alzheimer's disease and autism spectrum disorder. Invert Neurosci 11: 73-‐83.

177



GRUPO AGR231

GENÓMICA Y MEJORA ANIMAL

COMPONENTES:

RESPONSABLE: Garrido Pavón, Juan José ............... [email protected] Moreno López, Angela ........................................... [email protected] Llanes Ruiz, Diego .................................................... [email protected] Barbancho Medina, Manuel ................................ [email protected] Morera Sanz, Luiz .................................................. [email protected] Lucena Martínez, Concepción ................................ [email protected] Jiménez Marín, Angeles .......................................... [email protected] Sanz Santos, Gema .................................................. [email protected] Prados Martins, Rodrigo ................................ [email protected] Aguilar Jurado, Carmen ........................... [email protected] Domínguez Martínez, Miguel ........................ [email protected] Serrano López, Nuria ................................. [email protected]


Departamento de Genética. Departamento de Biología Celular. Universidad de Córdoba.


Genómica funcional de la interacción patógeno-‐hospedador en especies animales de interés agroalimentario. El objetivo general es la identificación del catálogo completo de eventos moleculares que ocurren simultáneamente como consecuencia de la expresión del genoma y proteoma del patógeno y el hospedador durante la infección por microbios patógenos. El fin último es el desarrollo de mejores métodos de tratamiento y control de la enfermedad animal, contribuyendo a la identificación de dianas terapéuticas que permitan desarrollar nuevos y eficientes protocolos de prevención frente a los principales patógenos de transmisión alimentaria.


178



Arce C., Ramírez-‐Boo M., Lucena C., Garrido JJ. (2010). Innate immune activation of swine intestinal epithelial cell lines (IPEC-‐J2 and IPI-‐2I) in response to LPS from Salmonella typhimurium. Comparative, Immunology, Microbiology and Infectious Diseases 33(2): 161-‐174.

Collado-‐Romero M., Arce C., Ramírez-‐Boo M., Carvajal A., Garrido JJ. (2010). Quantitative analysis of the immune response upon Salmonella typhimurium infection along the porcine intestinal gut. Veterinary Research 41: 23 41.

Ramírez-‐Boo M., Núnez E., Jorge I., Navarro P., Fernandes LT., Segalés J., Garrido JJ., Vázquez J., Moreno A. (2011). Quantitative proteomics by 2-‐DE, 16O/18O labelling and linear ion trap mass spectrometry analysis of lymph nodes from piglets inoculated by porcine circovirus type 2. Proteomics 11(17):3452-‐3469. doi: 10.1002/pmic.201000610.

Collado-‐Romero M, Martins RP, Arce C, Moreno A, Lucena C, Carvajal A, Garrido JJ. 2012. An in vivo proteomic study of the interaction between Salmonella Typhimurium and porcine ileum mucosa. Journal of Proteomics (In press. Available on line 20 January 2012).

PONENCIA:

PROTEOMIC ANALYSIS OF PORCINE INTESTINAL RESPONSES TO SALMONELLA ENTERICA SEROVAR TYPHIMURIUM INFECTION.

RESUMEN

The enteropathogen Salmonella Typhimurium (S. Typhimurium) is one of the main causes of porcine and human enterocolitis. In this study we employed for the first time an in vivo approach coupled to 2-‐DE-‐based proteomics to explore the response of porcine ileum mucosa and mesenteric lymph nodes (MLN) to S. Typhimurium infection. Intestine was selected for analysis because this organ is supposed to be the main entry site for Salmonella in swine. Samples were collected from four control and twelve infected pigs for histological analysis, protein and RNA purification. Afterwards, expressed proteins were screened by 2-‐DE (ileum mucosa) and DIGE (MLN) and data were analyzed by bioinformatics tools to generate interaction networks, identify enriched signaling pathways and biological annotations. S. Typhimurium labeling in tissue and phagocytes infiltration were







179



analyzed by immunohistochemistry and RNA was employed to determine the relative expression of immune-‐related genes. In ileum, proteins involved in immune response (acute phase response, inflammation, and immune response regulators), apoptosis and pathogen-‐mediated cell invasion, were identified as being differentially expressed after pathogen challenge. Overall, anti-‐inflammatory signals and a possible down-‐regulation of dendritic cell maturation were observed. According to this, we identified the up-‐regulation of FK506-‐binding protein 4 (FKBP4), a negative regulator of the transcription factor IRF4 (interferon regulatory factor 4), implicated in Th2 and Th17 response. Also, proteins that could be involved in maturation of Salmonella-‐containing vacuole and in intracellular pathogen survival were up-‐regulated. The proteome response of porcine MLN to infection was associated to the induction of processes such as phagocytes infiltration, cytoskeleton remodeling and pyroptosis. Moreover, our results suggest that S. Typhimurium antigens are cross-‐presented via MHC-‐I in a proteasome-‐dependent manner in porcine MLN. Since pathogen burden in tissue was noticeably reduced at 6 days post-‐infection (dpi), we infer that host innate and adaptive immunity act in association in MLN to control S. Typhimurium dissemination in swine infections. Results derived from this study would be valuable to better characterize a possible pathogen leaded modulation of host responses in vivo.

INTRODUCCIÓN

Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium is a broad-‐host range serotype able to colonize the lower intestinal tract of a wide range of animals, including humans [1]. In swine, S. Typhimurium infection causes enterocolitis, frequently with sub-‐clinical symptoms, and can be maintained in a carrier-‐state by infected animals. Among the wide range of hazards transmitted to humans by the consumption of pork or pork products, Salmonella is considered a major health threat worldwide. According to the European Food Safety Authority (EFSA), Salmonella is the most frequently reported cause of foodborne outbreaks in the European Union [2]. Besides, it is supposed that approximately 30% of the human salmonellosis cases are caused by Salmonella enterica serovar Typhimurium. Pigs are typically asymptomatic carriers of S. Typhimurium and this commensal-‐like state establishes a significant reservoir for Salmonella contamination of food during harvest and processing. Currently, the implementation of animal breeding

180



projects and the design of effective vaccines are the base for effective and sustainable disease control; therefore, a better understanding of host responses against Salmonella infection at the mucosal barrier is crucial. Small intestine is supposed to be the main entry site for Salmonella in swine but the persistence of Salmonella is associated with gut associated lymph nodes of infected pigs [2], so it has seemed of interest to study the response of both organs to infection by Salmonella.

Proteomics studies have been carried out in order to achieve a better understanding of S. Typhimurium physiology, however, little proteomic information is available from the host point of view, and the few reported studies were carried out using in vitro infections of isolated cell lines [3]. In fact, in vivo models combined with proteomic technological advances represent unprecedented means of characterizing host-‐pathogen interactions, providing new targets for disease prevention and treatment strategies [4]. Also, in a recent work, we identified important differences in the inflammatory response at transcriptional level throughout the porcine gut upon S. Typhimurium infection [5] and ours results showed ileum mucosa as unable to up-‐regulate some proinflammatory cytokines, which could help to a more successful colonization of this site by the infecting bacteria. For these reasons, in this study we employed a model of in vivo experimental infection followed by 2-‐DE proteomics and bioinformatics data analysis to elucidate the molecular mechanisms undergone by porcine ileum mucosa and mesenteric lymph nodes (MLN) upon S. Typhimurium.

OBJETIVOS

The aim of this present study was to identify changes in host ileum and MLN proteome as a consequence of S. Typhimurium infection in vivo. Moreover, we sought to identify changes that could be directed by the pathogen in order to achieve a successful entrance and survival as intracellular pathogen in the intestine, i.e., we focused on the early porcine response to S. Typhimurium.

RESULTADOS

Although the systemic pathology induced by S. Typhimurium has been extensively studied using the mouse model, they are not still fully understood the complex molecular mechanisms underlying the intestinal infection caused by bacteria in pigs. To address this issue, in this work we employed an in vivo approach coupled to proteomic analysis to study the intestinal response to S. Typhimurium infection. After bacteria challenge, the effectiveness of the experimental infection was confirmed by the observation of clinical signs of

181



enteric disease in all infected animals. We checked bacteria presence by immunohistochemical detection, using a specific antibody, and the colonization was confirmed in all samples from infected-‐animals, but in none of the control animals.

Differences in spot intensity between gels from control and inoculated samples were identified in 71 of the 543 matched spots from porcine ileum and differentially regulated proteins upon infection were implicated in different biological functions: Acute phase response proteins, inflammation, regulation of the immune response, apoptosis, cytoskeleton remodeling and proteins that could be involved in phagocytosis and/or Salmonella-‐containing vacuole (SCV) maturation and trafficking (Fig. 1). Thus, up-‐regulation of WARS and GC would favour an inflammatory process, while the up-‐regulation of APOA4, ANXA1, SERPIN-‐3 1 and 3 3 and SERPINB1 might be indicating a

reduction in inflammatory response. Also, we have identified the up-‐regulation of some proteins known to be involved in anti-‐apoptotic signalling and in cell survival promotion and proliferation: heat shock protein beta-‐1 (HSPB1); heat shock cognate 71 kDa protein (HSPA8); thymidylate synthase; and the protein thioredoxin domain containing 5 (TXNDC5). These results and the regulations of ANX1, WARS and FCSN1 (which could be related to apoptosis induction) might be in agreement with the existence of stimuli inducing apoptosis in intestinal mucosa after pathogen challenge and the activation of cell mechanisms to prevent it. In turn, a variable regulation occurred for proteins involved in cytoskelon assembly, dynamics and signalling

Figure 1. Biological function implicated in the ileum mucosa response to S. Typhimurium infection.

182



(villin, fascin homolog 1, and debrin-‐like protein). The up-‐regulation of one of these proteins (debrin-‐like protein) could be implicated in the cytoskeleton changes related to immune response, because this protein is fundamental for successful phagocytosis of S. Typhimurium by neutrophils[6].

Phagocytosis by neutrophils, dendritic cells and macrophages is a crucial host defence to null bacterial infections [7] but this host response is also exploited by the bacterium as a mechanism for systemic spreading, since Salmonella is able to avoid its degradation by the endosome-‐lysosome route. In ileum mucosa we have identified an up-‐regulation of the proteins V-‐ATPase subunit B2 and RAB6A, which seem to be crucial players involved in controlling SVC maturation.

In MLN, 54 spots exhibiting significant abundance changes as a consequence of the bacterial challenge implicated, in general, in the modulation of diverse normal host functions upon S. Typhimurium infection. ARHGDIA (Rho GDPdissociation inhibitor 1) and ARHGDIB (Rho GDP-‐dissociation inhibitor 2) were less abundant after infection, suggesting a repression of Rho GDP-‐dissociation inhibitor activity and consequent increase of GTPases activity. The stimulation of Rho GTPases by Salmonella implies actin cytoskeleton rearrangements [8]. Also, we have found reduction of monomeric forms of actin and vimentin as well as the augment of PDLIM1 and ANXA1, which probably cause also rearrangements in the cytoskeleton of infected cells, necessary for phagosome formation and Salmonella replication. On the other hand, Salmonella activates caspase-‐1 (CASP1) via NLRC4, leading to processing and release of IL1 and IL18. This process ends in cell death by a mechanism termed pyroptosis. We found an increase mRNA expression of CASP1 and IL1mRNA levels, leading us to consider the occurrence of pyroptosis in MLN of infected pigs. Although pyroptosis represents an important innate immune effector mechanism against intracellular bacteria, Salmonella has developed strategies to overcome it. Apparently, this pathogen voids pyroptosis effectiveness by delaying its onset and infecting new macrophages after escaping from lysed cells. Nevertheless, the presence of live S. Typhimurium in tissue at 6 dpi reinforce the hypothesis that this pathogen develops some mechanism to maintain itself in MLN at low levels. In addition, our proteomic data could be indicating that S. Typhimurium appears to stimulate in the host an alternative mechanism, independent from lysosomal activity, to assure the induction of adaptive response to infection.

On the other hand, we have found upregulation of TAP and MHC-‐I mRNA as well as HSP90 and other three chaperones associated with degradation and retrotranslocation of proteins to cytosol (HSP70, BiP/HSPA5 and BRp57/PDIA).

183



Also, we have found increase of proteasome subunit beta type-‐8 (PSMB8 or LMP7), which indicating activities of proteasomes. In host cell, Salmonella is confined inside phagosomes and phagocytosed proteins reach cytosol by chaperones retrotranslocation mechanisms, via TAP, binding to MHC-‐I molecules. So we could infer that S. Typhimurium antigens are cross-‐presented via MHC-‐I in a proteasome-‐dependent manner and this mechanism probably triggers an early cytotoxic response against bacteria.

In conclusion, this study shows proteomics changes due to the interaction in vivo between the enteropathogenic bacteria S. Typhimurium and porcine ileum mucosa and our result suggests an active modulation of the porcine immune response by the pathogen. Finally, results derived from this study would also be of relevance as an in vivo model for human salmonellosis.

BIBLIOGRAFÍA

[1] Fedorka-‐Cray P, Kelley L, Stabel T, Gray J, Laufer J (1995) Alternate routes of invasion may affect pathogenesis of Salmonella typhimurium in swine. Infect Immun; 63: 2658-‐64.

Figure 2. Protein interaction networks associated to Antigen processing and presentation pathway

184



[2] Anon (2011) The European Union summary report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and food-‐borne outbreaks in 2009. EFSA J; 9:1-‐378.

[3] Shi L, Chowdhury S M, Smallwood H S, Yoon H, Mottaz-‐Brewer HM, et al (2009) Proteomic investigation of the time course responses of RAW 264.7 macrophages to infection with Salmonella enterica. Infect Immun; 77: 3227-‐33.

[4] Hartlova A, Krocova Z, Cerveny L, Stulik J (2011) A proteomic view of the host-‐pathogen interaction: The host perspective. Proteomics; 11: 3212-‐20.

[5] Collado-‐Romero M, Arce C, Ramirez-‐Boo M, Carvajal A, Garrido J J (2010) Quantitative análisis of the immune response upon Salmonella typhimurium infection along the porcine intestinal gut. Vet Res; 41: 23.

[6] Schymeinsky J, Gerstl R, Mannigel I, Niedung K, Frommhold D, et al (2009) A fundamental role of mAbp1 in neutrophils: impact on beta(2) integrin-‐mediated phagocytosis and adhesion in vivo. Blood; 114: 4209-‐20.

[7] Wick M J. Living in the danger zone: innate immunity to Salmonella (2004) Curr Opin Microbiol; 7: 51-‐7.

[8] Galán JE, Zhou D (2009) Striking a balance: Modulation of the actin cytoskeleton by Salmonella. Proc Natl Acad Sci USA; 97: 8754-‐61.

185



SEPA

SERVICIO DE PROTECCIÓN AMBIENTAL.

COMPONENTES:

RESPONSABLE: Vaquero Abellán, Manuel ............ [email protected] Gomera Martínez, Antonio ..................................... [email protected] De Toro Jordano, Ana .................................................... [email protected] Aguilar Moreno, José Emilio ............................. [email protected] Guijarro Jiménez, Clara ........................................... [email protected] López Gómez, Ana María .......................... [email protected]


Servicio de Protección Ambiental SEPA. Universidad de Córdoba. Campus de Rabanales. Colonia San José, Casa nº 4. 14014-‐Córdoba.

FUNCIONES Y SERVICIOS PRESTADOS:

1. AMBITO DE ASESORAMIENTO AMBIENTAL

Participación o intervención en las actuaciones, actividades y proyectos desarrollados en el ámbito de la Universidad que puedan afectar a sus condiciones, recursos y componentes ambientales con objeto de prevenir o minimizar el posible impacto negativo de tales actuaciones. Identificación de requisitos legales de la Universidad de Córdoba e información de ellos a las funciones responsables de su cumplimiento. Seguimiento de los aspectos ambientales asociados a las actividades e instalaciones de la Universidad, detección de los más significativos y propuesta de actuaciones dirigidas a minimizar su impacto ambiental. Asesoramiento a la comunidad universitaria, y especialmente a los órganos, Instituciones y servicios universitarios, en las cuestiones relacionadas con el medio ambiente.

186



Realización de estudios e informes ambientales en el marco de la comunidad universitaria o fuera de ella. Apoyo y coordinación en la implantación de sistemas de gestión ambiental en Centros, Departamentos, Áreas y Servicios de la Universidad. Introducción de criterios ambientales en la contratación por parte de la Universidad de proveedores de bienes, obras y servicios así como el seguimiento ambiental de los mismos.

2. AMBITO DE FORMACIÓN, INFORMACIÓN Y SENSIBILIZACIÓN AMBIENTAL

Planificación, organización y promoción de actividades y eventos que tengan como objetivo la formación, información y sensibilización ambiental de la comunidad universitaria. Promoción y coordinación de actividades encaminadas a la preservación de los recursos naturales en la Universidad. Desarrollo de acciones que potencien el proceso de sostenibilización curricular, el voluntariado ambiental universitario y la investigación ambiental en la Universidad. Recepción de sugerencias de la comunidad universitaria en temas relacionados con el medio ambiente universitario. Establecimiento de cauces de comunicación y colaboración con administraciones y entidades a través de sus órganos ambientales competentes.

3. AMBITO DE GESTIÓN DE RESIDUOS

Promoción de estrategias de recogida selectiva de residuos. Gestión de los residuos peligrosos producidos en la Universidad.


De Toro Jordano, A., Gomera Martínez A., Castaño Fuentes, J. P. (2003).Guía de Buenas Prácticas Ambientales para PYMES cordobesas: sector papelería, copistería, fotografía e informática. Córdoba: Fundación Biodiversidad, Universidad de Córdoba.

Gomera Martínez A. (Coord.), Vaquero Abellán, M., Galán Soldevilla, C., Gaju Ricart, M., Herrera Machuca, M.A., Fernández Haeger, J. (2007). 101 especies

187



en el Campus de Rabanales: Inventario fungi/flora/fauna. Córdoba: Zumaya Ambiente Creativo.

Gomera Martínez A., Vaquero Abellán M., de Toro Jordano A., Aguilar Moreno J. E., Guijarro Jiménez C (2011). Environmental Management and Education at the University of Cordoba. Ecology and Noospherology. 22: 127-‐131.

Gomera Martínez, A., Castaño Fuentes, J. P., Vaquero Abellán, M. (2003). Manual de prevención de riesgos y salud laboral en los laboratorios universitarios. Córdoba: SEPA.

Gomera, A. (2008). La conciencia ambiental como herramienta para la educación ambiental: conclusiones y reflexiones de un estudio en el ámbito universitario. Carpeta Informativa del CENEAM. Noviembre 2008.

PONENCIA:

GESTIÓN DE RESIDUOS PELIGROSOS EN LOS LABORATORIOS UNIVERSITARIOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR, CELULAR, GENÉTICA Y BIOTECNOLOGÍA.

RESUMEN

En el laboratorio universitario se manejan gran cantidad de productos y se efectúan diversas operaciones que conllevan la generación de residuos, en la mayoría de los casos peligrosos para la salud y el medio ambiente. Aunque el volumen de residuos que se generan en los laboratorios es generalmente pequeño con relación al proveniente del sector industrial, se debe garantizar su correcta gestión, tanto por la obligatoriedad legal y la especial peligrosidad de algunos de ellos, como por el entorno educativo y de excelencia en el que se enmarca la Universidad.

Los principales residuos generados en los laboratorios universitarios de las áreas Biología Molecular, Celular, Genética y Biotecnología son:

Residuos biosanitarios (restos y cultivos celulares, sangre y hemoderivados, material cortante o punzante).

Residuos sólidos y líquidos de bromuro de etidio. Envases vacíos de vidrio y plástico. Material contaminado con productos químicos (papel, guantes, puntas, etc.)

Disolventes orgánicos no halogenados (metanol, alcohol, acetona, fenol) Sales y soluciones de revelado. Sales y soluciones inorgánicas (amonio, cianuro, cromo, etc.) Otros: ácidos, bases, aceites minerales.

188



Estos residuos se caracterizan por una composición química y biológica heterogénea y por una producción en cantidades pequeñas y variables con el tiempo. Este hecho, junto con la gran cantidad y variedad de unidades productoras existentes, dificulta y complejiza su control y retirada. Para optimizar este proceso, la Universidad de Córdoba, a través de su Servicio de Protección Ambiental (SEPA), ha desarrollado un procedimiento específico y normalizado de gestión de los residuos peligrosos en los laboratorios universitarios. Consta de los siguientes pasos:

1. Estudio de actividades y selección de envases

Es esencial conocer con profundidad la actividad de cada laboratorio, ya que a partir de ella se identificarán los residuos que se generan. Tras ello, se seleccionan los envases más adecuados en función del estado físico, su producción y espacio de almacenamiento.

2. Clasificación, etiquetado y llenado

Los residuos peligrosos se agrupan en grandes conjuntos en función de sus propiedades así como de su tratamiento final. Una vez clasificado el residuo, se procede a identificar el envase con su etiqueta correspondiente y se comienza el llenado, siguiendo las debidas medidas de prevención de riesgos y protección ambiental. Todos los residuos potencialmente infecciosos son esterilizados, mediante procedimientos químicos o físicos, antes de ser retirados del laboratorio.

3. Almacenamiento temporal por parte del SEPA hasta su retirada definitiva por parte de empresa gestora de residuos.

Los residuos se depositan temporalmente en almacenes ubicados en los distintos campus universitarios, previa solicitud de los grupos productores, hasta que son retirados por parte el gestor autorizado para su posterior eliminación.

Este procedimiento está certificado dentro del sistema de gestión de la calidad y medio ambiente del SEPA, conforme a las Normas ISO 9001 y 14001. Para su éxito resulta crucial la formación, información y sensibilización de los trabajadores y estudiantes.

Es asimismo necesario, tanto por razones de medioambientales como económicas, que se contemplen las posibilidades de minimización de los residuos, procurando sustituir, reutilizar o reciclar productos cuando sea posible, así como optimizando la gestión de compras, la utilización de envases y la segregación de residuos.

REFERENCIAS

189



Bultó Nubiola, M., Guardino Solá, X., Heras Cobo, C. (1992). Seguridad y Condiciones de Trabajo en el Laboratorio. Barcelona: Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo.

Espinosa Hidalgo, P. (1999). Manual de Seguridad en los Laboratorios Químicos. Granada: Universidad de Granada.

Gomera Martínez, A., Castaño Fuentes, J. P., Vaquero Abellán, M. (2003). Manual de prevención de riesgos y salud laboral en los laboratorios universitarios. Córdoba: SEPA.

Universidad de Córdoba. Servicio de Protección Ambiental (2007). Memoria de actividades del SEPA, 2001-‐2006. Córdoba.

Universidad de Córdoba. Servicio de Protección Ambiental (2010). Procedimiento de gestión de residuos. Córdoba.

Universidad de Córdoba. Servicio de Protección Ambiental (2010). Instrucción Técnica de gestión de residuos de laboratorio. Córdoba.

190



191



Listado de pósteres

Grupo BIO115 Panel 1

TÍTULO: Efecto del déficit hídrico sobre la fijación de nitrógeno y la síntesis de ureidos en cultivares sensibles y tolerantes de Phaseolus vulgaris. AUTORES: Inmaculada Coleto, Manuel Pineda y Josefa M. Alamillo. PRESENTADO EN: XIX Reunión de la Sociedad Española de Fisiología Vegetal (SEFV); Castellón de la Plana 2011.

Panel 2 TÍTULO: PVAS3, el tercer gen de asparraginasintetasa en Phaseolus vulgaris, se expresa fundamentalmente en hojas en desarrollo. AUTORES: Gregorio Gálvez-‐Valdivieso, Javier Fernández, Manuel Pineda, Josefa M. Alamillo. PRESENTADO EN: XIX Reunión de la Sociedad Española de Fisiología Vegetal (SEFV); Castellón de la Plana 2011. Grupo AGR248

Panel 3 TÍTULO: Second-‐generation sequencing and bioinformatics: Many-‐core processor approaches. AUTORES: Francisco José Esteban, David Díaz, Juan Antonio Caballero, Pilar Hernández, Sergio Gálvez, Gabriel Dorado. PRESENTADO EN: Estas Jornadas

Panel 4 TÍTULO: Second-‐generationsequencing and bioinformatics: Many-‐core MC64 web platform. AUTORES: Francisco José Esteban, David Díaz, Juan Antonio Caballero, Pilar Hernández, Sergio Gálvez, Gabriel Dorado. PRESENTADO EN: Estas Jornadas Grupo BIO301

Panel 5 TÍTULO: Disección molecular de la ruta de reparación por escisión de basesen plantas. AUTORES: Córdoba-‐Cañero, D., Morales-‐Ruiz, T., Ramiro-‐Merina, A., Roldán-‐Arjona, T. y Ariza, R.R. PRESENTADO EN: XXXIII Congreso de la Sociedad Española de Bioquímica yBiología Molecular; Córdoba 2010.

Panel 6

192



TÍTULO: Active DNA demethylation: molecular basis of 5-‐methylcytosine excision by ROS1 DNA glycosylase. AUTORES: Ponferrada-‐Marín, M.I., Parrilla-‐Doblas, J.T., Martínez-‐Macías,M.I., Morales-‐Ruiz, T., Ariza, R.R., and Roldan-‐Arjona, T. PRESENTADO EN: 41st Annual Meeting of the European Environmental Mutagen Society, EEMS; Barcelona 2011. Grupo BIO278

Panel 7 TÍTULO: Novel cell wall endohydrolases dramatically involved in the strawberry fruit softening process. AUTORES: Molina-‐Hidalgo FJ, Medina-‐Puche L, Cañete-‐Gómez CJ, García-‐Caparros, N, Mérida-‐Cerro JA, Moyano-‐Cañete E, Rodriguez-‐Franco A, Caballero-‐Repullo JL, Blanco-‐Portales R, Muñoz-‐Blanco J. PRESENTADO EN: Estas Jornadas

Panel 8 TÍTULO: Caracterización funcional de un factor de transcripción de tipo bHLH (FaPRE1) implicado en el desarrollo y maduración de la fresa (Fragaria x ananassa). AUTORES: Medina-‐Puche, L, Molina-‐Hidalgo FJ, Cañete-‐Gómez CJ, García-‐Caparros, N, Mérida-‐Cerro JA, Moyano-‐Cañete E, Rodriguez-‐Franco A, Caballero-‐Repullo JL, Muñoz-‐Blanco J, Blanco-‐Portales R. PRESENTADO EN: Estas Jornadas Grupo AGR146

Panel 9 TÍTULO: Funciones biológicas de proteínas de una levadura vínica autoinmovilizada sobre Penicilliumchrysogenum usando 2-‐DE y MS. AUTORES: Teresa García-‐Martínez, Anna Puig-‐Pujol, Nieves López de Lerma, Rafael Andrés Peinado, Juan José Moreno, Juan Carlos Mauricio. PRESENTADO EN: XI Congreso Nacional de Investigación Enológica. Extensivo a Iberoamérica; Jerez 2011. GIENOL-‐2011.

Panel 10 TÍTULO: Producción de volátiles minoritarios por distintas cepas de Saccharomycescerevisiae, libres e inmovilizadas, en la fermentación parcial de mostos dulces Pedro Ximénez. AUTORES: Nieves López de Lerma, Teresa García-‐Martínez, Juan José Moreno, Juan Carlos Mauricio, Rafael Andrés Peinado. PRESENTADO EN: XI Congreso Nacional de Investigación Enológica. Extensivo a Iberoamérica; Jerez 2011. GIENOL-‐2011.

193



Grupo BIO128 Panel 11

TÍTULO: La enzima con cofactor de Molibdeno CrARC tiene una actividad dependiente de Zn. AUTORES: Alejandro Chamizo-‐Ampudia, Aurora Galván, Emilio Fernández, Ángel Llamas. PRESENTADO EN: XXXIV Congreso Nacional de la SEBBM; Barcelona 2011.

Panel 12 TÍTULO: Fotoproducción de Hidrogeno en Chlamydomonasreinhardtii. AUTORES: JoséLuis Jurado-‐Oller, David González-‐Ballester, Aurora Galván, Emilio Fernández. PRESENTADO EN: XXXIVCongreso Nacional de la SEBBM; Barcelona 2011. Grupo FQM227

Panel 13 TÍTULO: Tailor-‐made enriched oil with olive phenols: improvement of stability/ quality properties and health benefits. AUTORES: Verónica Sánchez de Medina, Feliciano Priego Capote, Carlos Ferreiro Vera, María Dolores Luque de Castro. PRESENTADO EN: 5th International Conference on Polyphenols and Health; Sitges, Barcelona 2011

Panel 14 TÍTULO: Towards a comprehensive exploitation of residues from wine production. AUTORES: Ángela Peralbo Molina, Feliciano Priego Capote, María Dolores Luque de Castro. PRESENTADO EN: The International Conferenceon Natural Products. Castres; Francia 2011 Grupo BIO202

Panel 15 TÍTULO: Hak1p es el transportador de potasio de alta afinidad en Hansenulapolymorpha. AUTORES: Maria C alvarez, Elisa Cabrera, Yusé Martín, José M. Siverio, José Ramos. PRESENTADO EN: XXXIV Congreso Nacional de la SEBBM; Barcelona 2011.

Panel 16 TÍTULO: Estudio proteómico del mutante trk1,2 de Saccharomyces cerevisiae en condición limitante de potasio. AUTORES: Samuel Gelis, Inmaculada Redondo, Casimiro Barbado, Jesús Jorrín, José Ramos.

194



PRESENTADO EN: XXXIV Congreso Nacional de la SEBBM; Barcelona 2011. Grupo BIO117

Panel 17 TÍTULO: Utilización de cianatocomofuente de nitrógenoporPseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344. AUTORES: Lara P. Sáez, Victor M. Luque-‐Almagro, Isabel Manso, Manuel Martínez-‐Luque, Conrado Moreno-‐Vivián, Mª Dolores Roldán, Francisco Castillo. PRESENTADO EN: XXXIVCongreso Nacional de la SEBBM; Barcelona 2011. Grupo BIO123

Panel 18 TÍTULO: Control of the N/C balance by 2-‐oxoglutarate in different Prochlorococcus strains. AUTORES: María Agustina Domínguez-‐Martín, Jesús Díez y José Manuel García-‐Fernández. PRESENTADO EN: 8th European Workshop on Molecular Biology of Cyanobacteria; Naantali, Turku, Finlandia 2011.

Panel 19 TÍTULO: Uptake and Utilization of glucose by Prochlorococcus SS120. AUTORES: Muñoz-‐Marín, M.C., Gómez-‐Baena, G., Díez, J, Beynon, R., Luque, I. and García-‐Fernández, J.M. PRESENTADO EN: ESF Research Conference on Molecular Bioenergetics of Cyanobacteria; Sant Feliu 2011. Grupo TEP169

Panel 20 TÍTULO: Torta de colza (Brassicanapus) y glicerina como sustrato para el crecimiento del microorganismo oleaginoso Rhodotorula toruloides. AUTORES: DE Leiva-‐Candia, S Pinzi, IL García, MF Ruz-‐Ruiz, MI Gregorio-‐Arenas, MP Dorado. PRESENTADO EN: Estas Jornadas Grupo BIO139 L1 Panel 21 TÍTULO: Aberrantly spliced In 1-‐ghrelin variant is overexpressed in acromegaly,

disease and non-‐functioning pituitary adenomas, where it can increase aggressive features: in vivo and in vitro studies. AUTORES: Raúl M. Luque , Manuel D. Gahete, Alejandro Ibáñez-‐Costa, Eva Venegas-‐Moreno, Giselle F. Taboada, Leonardo Vieira Neto, José Cordoba-‐

195



Chacón, Laura Lopez-‐Sanchez, Luis Jimenez-‐Reina, Miguel A. Japon, María Ángeles Gálvez, Pedro Benito-‐Lopez, Alfonso Soto-‐Moreno, Michael D. Culler, Mônica R. Gadelha, Alfonso Leal-‐Cerro, Rhonda D. Kineman, Justo P. Castaño. PRESENTADO EN: Targeting the pituitary: Expert knowledge forum; Berlín (Alemania) 2011.

Panel 22 TÍTULO: Evidence for a direct, selective effect of kisspeptin on pituitary growth hormone and luteinizing hormone release in a primate model (Papio anubis). AUTORES: Raúl M. Luque, Jose Córdoba-‐Chacón, Manuel D. Gahete, Manuel Tena-‐Sempere, Rhonda D. Kineman, Justo P. Castaño. PRESENTADO EN: The 7th International Congress of Neuroendocrinology; Rouen (Francia) 2010.

L-‐2 Panel 23 TÍTULO: Heterodimerization of adiponectin receptors 1 and 2 modulates the cellular response to adiponectin. AUTORES: Almabouada F, Diaz-‐Ruiz A, Peinado-‐Mena JR, Gracia-‐Navarro F, Malagón MM, Vázquez-‐Martínez R. PRESENTADO EN: XIV Congreso de la Sociedad de Biología Celular. Málaga 2011.

Panel 24 TÍTULO: Necc2 as a novel component of caveolae. Role in growth factor signaling. AUTORES: Andrés Trávez, Yoana Rabanal, José Alberto Díaz-‐Ruíz, Socorro Navarro, Francisco Gracia, Rafael Vásquez, Mª del Mar Malagón. PRESENTADO EN: Estas Jornadas Grupo BIO276

Panel 25 TÍTULO: Dietary fat modulates calorie restriction-‐induced changes of apoptotic markers in mouse skeletal muscle. AUTORES: López-‐Domínguez J.A., López-‐Lluch G., Fernández del Río L., Navas P., Ramsey J.J., Burón M.I., Villalba J.M. PRESENTADO EN: XIV Congreso de la Sociedad Española de Biología Celular; Málaga 2011.

Panel 26 TÍTULO: Growth alterations of mouse embryonic fibroblasts lacking the antioxidant enzyme NAD(P)H:quinoneoxidoreductase 1 (NQO1): A role for NRF2?. AUTORES: Ariza J., Jódar L., Gutiérrez-‐Casado E., González-‐Reyes J.A., de Cabo R., Villalba J.M.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22van%20Dinther%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Korchynskyi%20O%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ten%20Dijke%20P%22%5BAuthor%5D

196



PRESENTADO EN: XIV Congreso de la Sociedad Española de Biología Celular; Málaga 2011. Grupo BIO272

Panel 27 TÍTULO: Los mutantes de C. elegans deficientes en neuroliguina tienen afectada la ruta serotoninergica que controla la tasa de locomoción, la fluoxetina (Prozac) la restablece. AUTORES: Patricia G. Izquierdo, Fernando Calahorro y Manuel Ruiz-‐Rubio PRESENTADO EN: II Jornadas de Jóvenes Investigadores (IMIBIC); Córdoba 2011.

Panel 28 TÍTULO: Las neuroligina-‐1 humana y de rata son funcionales en Caenorhabditis elegans: aplicaciones en autismo. AUTORES: Fernando Calahorro y Manuel Ruiz-‐Rubio PRESENTADO EN: II Jornadas de Jóvenes Investigadores (IMIBIC); Córdoba 2011. SEPA

Panel 29 TÍTULO: Centro de almacenamiento temporal de residuos peligrosos en la Universidad de Córdoba. AUTORES: de Toro Jordano, A., Gomera Martínez, A., Aguilar Moreno, J.E., Guijarro Jiménez, C., Vaquero Abellán, M. PRESENTADO EN: Seminario Permanente de la Comisión para la Calidad Ambiental, el Desarrollo Sostenible y la Prevención de Riesgos de la CRUE; Alicante 2010.

Panel 30 TÍTULO: Estrategia para la difusión de buenas prácticas en protección ambiental y prevención de riesgos en los laboratorios universitarios. AUTORES: Aguilar Moreno, J.E., Gomera Martínez, A., de Toro Jordano, A., Guijarro Jiménez, C., Vaquero Abellán, M. PRESENTADO EN: Seminario Permanente de la Comisión para la Calidad Ambiental, el Desarrollo Sostenible y la Prevención de Riesgos de la CRUE; Alicante 2010.

197



Índice de autores

Abril Díaz, Nieves ........................... 89 Agüera Morales, Eduardo .............. 35 Aguilar Benítez de Lugo Enrique ....... 155 Aguilar Jurado, Carmen ............... 177 Aguilar Moreno, José Emilio ........ 185 Aguilar Urbano, Miguel ................. 23 Alcaide Molina, Miguel ................. 75 Alejandre Durán, Encarna ........... 171 Alhama Carmona, José .................. 85 Almabouada Farid ....................... 137 Alvarez Morales, María C............... 95 Amil Ruiz, Francisco. ...................... 47 Archidona Yuste, Antonio ............ 115 Arevalo Rodríguez, Miguel .......... 129 Ariza Gómez, Julia ....................... 151 Barbancho Medina, Manuel ........ 177 Bárcena Ruiz, José Antonio .......... 143 Barranco Navero, Diego ................ 81 Bellido Cabello de Alba, M. Luz .... 39 Blanco Moreno, Rafael ................ 105 Blanco Portales, Rosario. ............... 47 Bravo Ruiz, Gustavo .................... 167 Burgos Marín, Rafael ................... 171 Burón Romero, María Isabel ........ 151 Caballero Domínguez, Fco Javier ...... 105 Caballero Molina, Juan Antonio .... 29 Caballero Repullo, José Luis. ......... .47 Cabello Díaz, Juan Miguel .............. 23 Calahorro Núñez, Fernando ........ 171 Calero Dueñas, Fernando ............. 95 Cañete Gómez , Carlos,.................. 47 Carmona Cabello, Miguel ............ 143 Castaño Fuentes, Justo P ............. 137 Castillo Rodríguez, Francisco ....... 105 Cebolla Ramírez, Angel ................ 129 Chamizo Ampudia, Alejandro ........ 71 Chanclón García, Belén ................ 137 Chicano Gálvez, Eduardo ............... 85 Coleto Reyes, Inmaculada ............. 23 Contreras Luque, Israel ............... 171 Córdoba Cañero, Dolores .............. 41

Córdoba Chacón, José ................. 137 Corral Ramos, Cristina ................ 167 de la Hera, Concepción ............... 167 de Miguel Rojas, Cristina ............ 167 de Toro Jordano, Ana .................. 185 Delgado de la Torre, M. Pilar .........75 Di Pietro, Antonio ........................ 167 Díaz González, David ......................29 Díaz Leal, Juan Luis .........................23 Díaz-‐Ruiz, Ruiz, Jose Alberto ....... 137 Díez Dapena, Jesús .......................111 Domínguez Martín, Mª Agustina ...... 111 Domínguez Martínez, Miguel ...... 177 Dorado Pérez, Gabriel ....................29 Dorado Pérez, María del Pilar ..... 123 Echevarría-‐Zomeño, Sira ............. 115 El Ghalid, Mennat ....................... 167 Elena Pérez Nadales ................... 167 Escribano Fernández, Mªde la Paz ... 105 Esteban Risueño, Francisco José ....29 Fernández Cisnal, Ricardo ..............85 Fernández del Río, Lucía .............. 151 Fernández Peralbo, M. Auxiliadora .....75 Fernández Reyes, Emilio ................71 Ferreiro Vera, Carlos ..................... 75 Gahete Ortíz, Manuel David ........ 137 Galván Cejudo, Aurora ...................71 Gálvez-‐Valdivieso, Gregorio ...........23 García Barbado, Casimiro ..............95 García Caparrós, Nicolás. ...............47 García Fernández, José Manuel .. 111 García Galiano David ................... 155 García García, Transito ..................95 García Martínez, Teresa .................65 García Mauricio, Juan Carlos ..........65 García Navarro, Socorro .............. 137 García-‐Ortiz, Mª Victoria ................41 Garrido Pavón, Juan José ............ 177 Garrido, José. .................................47 Gascón Luna, Félix ..........................35 Gelis, Samuel .................................95







198



Gomera Martínez, Antonio .......... 185 Gómez Baena, Guadalupe ........... 111 Gómez Chaparro, José Luis ............ 85 González Ballester, David ....... 71,163 González Fernández, Raquel ........ 115 González Granja, Aitor .................. 39 González Izquierdo, Patricia ....... 171 González Ojeda, Raúl ................... 143 González Reyes, José Antonio ..... 151 González Roncero, Mª Isabel ....... 167 González Sánchez, Zahira .............. 71 Gracia Navarro, Francisco ............ 137 Gregorio Arenas, Marta Inés ....... 123 Guijarro Granados, Teresa .......... 171 Guijarro Jiménez, Clara ................ 185 Gutiérrez Casado, Elena .............. 151 Guzmán Ruiz, Rocío ..................... 137 Hernández Molina, Pilar ................ 29 Herrera Vega, Rito ........................ 95 Higuera Sobrino, José Javier .......... 71 Ibáñez Costa, Alejandro ............... 137 Ibáñez García, María Isabel ........ 105 Jiménez Marín, Ángeles ............... 177 Jiménez Munguía, Irene .............. 143 Jorrín Novo, Jesus V ..................... 115 Jurado Carpio, Juan ....................... 89 Jurado Oller, José Luis .................... 71 Jurado Ruiz, Luis Pedro .................. 23 Khraiwesh, Husam ....................... 151 Koutinas, Apostolis ...................... 123 Lambert Rodríguez, Rocío .............. 23 Leiva Candia, David Eduardo ....... 123 León Téllez Silvia ......................... 155 Llamas Azúa, Ángel ........................ 71 Llanes Ruiz, Diego ........................ 177 López Barea, Juan .......................... 85 López Barneo, José ........................ 21 Lopez de Lerma Extremera, Mª Nieves 65 López Domínguez, José Alberto ... 151 López Fernández, Loida .............. 167 López García, Isabel ..................... 123 López Gómez, Ana María ............ 185 López Sánchez, Laura ................... 137

Lucena Martínez, Concepción ..... 177 Luque Almagro, Víctor Manuel ... 105 Luque Carabot, Evelio.................... 35 Luque de Castro, María Dolores .... 75 Luque Huertas, Raúl Miguel . 101,137 Macías Gómez, María Isabel ......... 71 Malagón Poyato, Mª del Mar. ..... 137 Maldonado Alconada, Ana M. ..... 115 Manfredi Lozano María ............... 155 Manso Cobos, Isabel María ......... 105 María Jesús Vázquez Villar .......... 155 Martín Borreguero, Pilar ............ 171 Martínez Aguilera, Esther ........... 167 Martínez Fuentes, Antonio Jesús ..... 137 Martínez Galisteo, Emilia ............ 143 Martínez-‐Macías, Mª Isabel .......... 41 McDonagh, Brian ......................... 143 Medina Fernández, Fco. Javier ...... 35 Medina Navarro, Teresa ............... 95 Medina Puche, Laura. .................... 47 Mellado Miranda, Joaquín ............ 39 Mérida Cerro, Juan Antonio, ......... 47 Michán Doña, Carmen M. ............. 89 Molero Murillo, Laura ................. 137 Molina Gómez, Mari Carmen ...... 115 Molina Hidalgo, Francisco Javier. .. 47 Morales Prieto, Noelia .................. 95 Morales Ruiz, Teresa ..................... 41 Moreno Castellanos, Natalia Rocío ... 137 Moreno García, Jaime ................... 65 Moreno Herrera, Antonio ........... 137 Moreno López, Angela ................ 177 Moreno Vigara, Juan ..................... 65 Moreno Vivián, Conrado ............. 105 Morera Sanz, Luiz ........................ 177 Moyano Cañete, Enriqueta. .......... 47 Muñoz Alamillo, Josefa.................. 23 Muñoz Blanco, Juan. .................... .47 Muñoz Díez, Mª Concepción ......... 81 Muñoz Gómez, Lourdes Laura .... 143 Muñoz Marín, María del Carmen ..... 111 Navarro Loro Víctor ..................... 155 Navarro Velasco, Gesabel ............ 167







mailto:[email protected]@uco.es




199



Ocaña Calahorro, Francisco J ......... 71 Olaya Abril, Alfonso ..................... 143 Onieva Jiménez, Rocío ................... 71 Orozco Solano, Mara Isabel .......... 75 Osuna Jiménez, Inmaculada ......... 89 Padilla Peña, Alicia ....................... 143 Palomo Buitrago, Mª Encarnación .... 137 Parrilla Doblas, Jara Teresa ............ 41 Peinado Amores, Rafael Andrés .... 65 Peinado Peinado, José ................. 143 Peralbo Molina, Ángela ................ 75 Pérez Jiménez, Margarita .............. 29 Piedras Montilla, Pedro ................. 23 Pineda Priego, Manuel .................. 23 Pinilla Jurado Leonor ................... 155 Pinzi, Sara .................................... 123 Ponferrada Marín, Mª Isabel ......... 41 Porras Tamayo, Elena .................... 65 Pozo Salas, Anabel ....................... 137 Prados Martins, Rodrigo .............. 177 Priego Capote, Feliciano ................ 75 Prieto Álamo, M. José .................... 89 Pueyo de la Cuesta, Carmen .......... 89 Quiles Luque, Francisco Antonio ... 23 Rabanal Ruiz, Yoana..................... 137 Rallo Romero, Luis ......................... 81 Ramiro Merina, Ángel .................... 41 Ramos Ruiz, José ........................... 95 Redondo López, Inmaculada ....... 115 Rincón Fernández-‐Pacheco, David .... 137 Rivero Cortés, Esther ................... 137 Roa Rivas Juan ............................. 155 Roca, Mª Gabriela ....................... 167 Rodríguez Ariza, Rafael .................. 41 Rodríguez Castillo, Estrella ............ 81 Rodriguez Franco, Antonio. ........... 47 Rodríguez Ortega, Manuel José ... 143 Roldán Arjona, Mª Teresa.............. 41 Roldán Ruiz, María Dolores ......... 105 Romero Balsera, Mª Auxiliadora 171 Romero Porras, Raquel ............... 171

Romero Rodríguez, Cristina ......... 115 Romero Ruiz Antonio ............ 59, 155 Ruiz Rubio, Manuel .................... 171 Ruiz Jiménez, José .........................75 Ruiz Pino Francisco ...................... 155 Ruiz Roldán, Carmen .................. 167 Ruiz Villén, María Concepción ........35 Ruiz-‐Laguna, Julia ..........................89 Ruz Ruiz, María Francisca ............ 123 Sáez Melero, Lara Paloma ........... 105 Salcedo Espinosa, Manuel ..............35 Sánchez de Medina Baena, Verónica ..75 Sánchez López, Fernando ...............35 Sánchez Lucas, Rosa .................... 115 Sánchez Raya, Mª Araceli ........... 171 Sánchez Vázquez, Vicente .......... 171 Sánchez-‐Garrido Miguel Angel .... 155 Santana Martín, Ulises ...................95 Sanz Luque, Emanuel .....................71 Sanz Santos, Gema ...................... 177 Schäfer, Katja .............................. 167 Segorbe Luque, David ................. 167 Serrano López, Nuria ................... 177 Sghaier-‐Hammami, Besma .......... 115 Simova, Lyudmila ........................ 115 Tena Aldave, Manuel................... 115 Tena Sempere Manuel ................ 155 Tienda Carril, Pilar .......................171 Torgler, Catherine ....................... 129 Toribio Menéndez-‐Valdés, Fermín ... 111 Trávez García, Andrés Ricardo .... 137 Trujillo Navas, Mª Isabel................ 81 Túnez Fiñana, Isaac ........................35 Turrà, David ................................ 167 Valero Galván, José ..................... 115 Vaquero Abellán, Manuel ........... 185 Vazquez Martinez, Rafael ............ 137 Velasco Umpiérrez, Isabel ........... 129 Villa Osaba, Alicia ........................ 137 Villalba Montoro, José Manuel ....151









Fundación Torres Gutiérrez

V JORNADAS DE DIVULGACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN EN … · v jornadas de divulgaciÓn de la...

Documents

Transcript of V JORNADAS DE DIVULGACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN EN … · v jornadas de divulgaciÓn de la...