UNIVERSITAT DE VALENCIA Facultat de Ciències Biològiques ...
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Dirigida por el Dr. José Manuel García Verdugo y la Dra. Patrizia Casaccia-Bonnefil VALENCIA 2011 TESIS DOCTORAL SARA GARCÍA GIL-PEROTÍN PAPEL DE LOS INHIBIDORES DEL CICLO CELULAR P53 Y P27 KIP1 EN LA REGULACIÓN DE LA NEUROGÉNESIS ADULTA UNIVERSITAT DE VALENCIA Facultat de Ciències Biològiques Departament de Biologia Cel·lular i Parasitologia
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Dirigida por el Dr. José Manuel García Verdugo y la Dra. Patrizia Casaccia-Bonnefil
VALENCIA 2011
TESIS
DOCTORAL SARA GARCÍA
GIL-PEROTÍN
PAPEL DE LOS INHIBIDORES
DEL CICLO CELULAR P53 Y
P27KIP1 EN LA REGULACIÓN
DE LA NEUROGÉNESIS
ADULTA
UNIVERSITAT DE VALENCIA Facultat de Ciències Biològiques
Departament de Biologia Cel·lular i Parasitologia
“Papel de los inhibidores del ciclo celular
p53 y p27Kip1
en la regulación de la
neurogénesis adulta”
Tesis doctoral presentada por Dª Sara García Gil-Perotín y dirigida por los Drs. D.
José Manuel García-Verdugo, Catedrático de la Universitat de València, y Dª.
Patrizia Casaccia-Bonnefil, Médico e investigadora del Laboratory of Epigenetics in
Demyelinating Disorders del Hospital Mount Sinai (New York, EEUU)
Valencia, 2011
UNIVERSITAT DE VALÈNCIA
Facultat de Ciències Biològiques
Departament de Biologia Cel·lular i Parasitologia
José Manuel García Verdugo, Catedrático del Departamento de Biología
celular y Parasitología de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universitat
de València,
CERTIFICO
Que Dª. Sara García Gil-Perotín ha realizado en el Laboratorio de
Neurobiología Comparada del Instituto Cavanilles de Biodiversidad y
Biología Evolutiva de la Universitat de València, bajo mi dirección, el trabajo
experimental que ha llevado a la redacción de la presente memoria de Tesis
Doctoral, titulada “Papel de los reguladores del ciclo celular p53 y p27Kip1 en
la neurogénesis adulta”.
Revisado el trabajo, autorizo su presentación para optar al grado de
Doctor.
Y para que así conste y surta los efectos oportunos, firmo el presente
certificado en Valencia, a 20 de Mayo de 2011.
Firmado. José Manuel García-Verdugo
Yo, Sara García Gil-Perotín, declaro que soy autora del presente trabajo de
investigación y que lo he realizado en el Laboratorio de Neurobiología
Comparada del Instituto Cavanilles y de Neurobiología del Robert Wood
Johnson Medical School, bajo la dirección de los Drs. Jose Manuel García
Verdugo, Catedrático de Biología Celular de la Universitat de València, y Dra.
Patrizia Casaccia Bonnefil, actualmente profesora de Neurociencia,
Genética, Genómica y Neurología de la Facultad de Medicina de Mount Sinai
(New York, Estados Unidos).
Y para que así conste y surta los efectos oportunos, firmo el presente
documento en Valencia, a 15 de Mayo de 2011.
Firmado: Sara Garcia Gil-Perotín
La autora de esta Tesis Doctoral ha sido beneficiaria de una Beca
predoctoral BEFI del Instituto de Salud Carlos III, del Ministerio de Salud y
Consumo desde 2001 hasta 2005 (Expediente: 01/9513). Durante los últimos
5 años ha compaginado su actividad científica con un contrato de Médico
Residente en el Hospital Universitario La Fe de Valencia.
AGRADECIMIENTOS
Tomé una decisión importante en mi vida cuando decidí desviar el curso
natural de los estudios de Medicina con meta el examen MIR, y me propuse
matricularme en Bioquímica. No fue el resultado de una reflexión de meses
sino de creer en un instinto. A mitad del primer curso supe de Verdugo y sus
células madre. Han pasado ya muchos años desde el día en que entré a
aquel despacho y me presenté. Frente a mí, el que hoy es además de tutor
de tesis, mi amigo, José Manuel García-Verdugo me observaba desde su
sillón de despacho: Buenas tardes, siéntese y cuénteme por qué quiere
“usté” trabajar en “sélulas” madres. Me acuerdo que en ese momento
desconocía la magnitud del científico con el que hablaba y
despreocupadamente expliqué que desde que podía recordar siempre había
querido trabajar en Neurociencia, “veo que tiene las cosas muy claras,
cuando quiera puede “empesar” a trabajar con nosotros”. Estando ya
trabajando en el laboratorio, en mi segundo año de Bioquímica, viajé con
una beca de Relaciones Internacionales a Rutgers University en New Jersey
durante un semestre. Allí conocí a mi co-directora de tesis, Patrizia
Casaccia-Bonnefill, una mujer con mucho carácter y dedicada a la ciencia,
cuya meta es entre otras dar esperanza a los pacientes con esclerosis
múltiple. Estar en otro país y trabajar en EEUU cambió mi forma de pensar y
vivir gradualmente, incluso tras volver a Valencia, las relaciones que
establecí aún permanecen activas.
Con posterioridad y por razones ajenas a la ciencia, retomé mis
estudios como médico y me examiné para entrar en un programa de
residencia donde actualmente curso mi último año. De nuevo inmersa en el
mundo de la Medicina Clínica, no me olvido ni mantengo demasiada
distancia con la ciencia básica que es una de mis vocaciones, por eso
muchos días tras la guardia y muchas tardes tras finalizar en el hospital, me
acerco al laboratorio para no olvidarme de todo lo que he aprendido y para
aprender más.
Agradezco a tantas personas que hayan estado a mi alrededor
durante estos años. Sin esas personas la vida en el laboratorio habría sido
sólo trabajo. Por supuesto agradezco a Patrizia el haberme dado siempre el
empujón que necesitaba. Y a Verdugo, por saber sacar lo mejor de mí y
apoyarme en cualquier cosa que le he pedido, y le he pedido unas cuantas.
A todos y cada uno de los que han venido, se han quedado, se han ido…son
tantos. Almudena, Mario y Susana desde el principio, bailando salsa y
cantando en el espacioso “Neurobotánica”. Pilar, a quien tengo especial
cariño, y con la que he vivido y pretendo vivir muchos momentos
“importantes”. A Melissa, un diablillo de gran corazón que me ha hecho reír a
gusto, y a la que considero, mi alumna aventajada. A Vivian, que poquito a
poco se está convirtiendo en una científica a admirar, y que siempre
ameniza con su buen humor la salita de los ordenadores. A Marieta, que
desde aquella clase de Histología en que nos conocimos creyó en la
Neurociencia, se interesó y ha conseguido hacerse un hueco desde el que
ahora me enseña a mí. Clara, a la que ayudé un poco a tomar la decisión de
seguir el camino difícil de la ciencia. Miriam, Irene, Laura, Clara, Toni,
Salomé, las Cármenes, Ángel, Jorge, Pepa, Carol (los últimos fichajes, no
por ello menos importantes) son cada día más, pero implican que la ciencia
avanza y que sigo aquí, pese al resto de ocupaciones. Gracias a todos!
A Salva, sería injusto no nombrarlo, por haberme acompañado
durante tantos momentos decisivos, un duro 1997, un cambio de vida en el
2000.
Finalmente, y como no podía ser menos por ser tan especial, dedico
todo lo que he hecho y lo que haré en esta vida a mi familia. A Jaime por
hacerme sentir viva y por su generosidad en los meses del sprint final. A
Mateo, el duendecillo que me ha cambiado la vida. A Iñaki que vendrá
pronto. A mi padre y a mi abuela (mi segunda madre)…Pero sobre todo a
Charo, mi madre, que ya no está, y que ha sido la persona que más hizo por
mí durante 21 años, que más recuerdo cuando las cosas salen bien y a
quien más recurro cuando salen mal o no salen. Era apoyo y amiga y la
perdí poco antes de decidir cambiar mi vida. Sus genes de rebeldía están
presentes en cada uno de mis días, y aunque una vez me dijo que yo era su
talismán, se equivocaba, era completamente al revés.
Valencia, a 25 de Mayo de 2011
i
ÍNDICE
ABREVIATURAS ........................................................................................................ V
1. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................... 1
1.1. NEUROGÉNESIS ADULTA EN MAMÍFEROS .............................................................. 3 1.1.1. Centros germinales ................................................................................... 3 1.1.2. El camino migrador rostral (RMS) .......................................................... 12 1.1.3. Identificación de la célula madre neural adulta ...................................... 13 1.1.4. Estudio comparativo de la SVZ en mamíferos ....................................... 15 1.1.5. El nicho neurogénico .............................................................................. 15
1.2. REGULACIÓN DE LA NEUROGÉNESIS EN LA SVZ .................................................. 18 1.2.1. Ciclo celular y moléculas reguladoras .................................................... 20 1.2.2. Familia CIP/KIP de inhibidores del ciclo celular ..................................... 23
1.2.2.1. Papel de p27Kip1
en la regulación del ciclo celular en la SVZ ................ 24
1.2.3. Proteína supresora de tumores p53 ....................................................... 27 1.2.3.1. Papel de p53 en la regulación del ciclo celular en la SVZ .................... 31
2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS .................................................................................. 33
3. MATERIAL Y MÉTODOS ..................................................................................... 37
3.1. ANIMALES ......................................................................................................... 38 3.2. IRRADIACIÓN DEL SNC ....................................................................................... 39 3.3. INYECCIÓN DE N-ETIL-N-NITROSUREA (ENU) ........................................................ 39 3.4. PROCESADO DE LAS MUESTRAS ......................................................................... 40
3.4.1. Técnicas histológicas .............................................................................. 40 3.4.2. Cultivos celulares .................................................................................... 40
3.5. PROCESADO DE LAS MUESTRAS PARA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA ..................... 40 3.6. MARCAJE CON TIMIDINA TRITIADA (3H-THY) Y AUTORRADIOGRAFÍA ....................... 41 3.7. BROMODEOXIURIDINA ....................................................................................... 43 3.8. INMUNOHISTOQUÍMICA ....................................................................................... 43 3.9. TÉCNICA DE TUNEL PARA ESTUDIO DE APOPTOSIS ............................................... 45 3.10. CULTIVO DE NEUROESFERAS ........................................................................... 45
3.10.1. Limitaciones del cultivo de neuroesferas .............................................. 46 3.11. INFECCIÓN RETROVIRAL DE NEUROESFERAS ..................................................... 48 3.12. INFECCIÓN CON AD-CRE RECOMBINASA DE NEUROESFERAS DE RATONES
P53FLOX/FLOX
...................................................................................................... 49 3.13. RECUENTOS CELULARES ................................................................................. 49
3.13.1. Microscopia electrónica ........................................................................ 49 3.13.2. Inmunohistoquímica .............................................................................. 50 3.13.3. Neuroesferas ........................................................................................ 50
3.14. EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS Y WESTERN BLOT.................................................. 50 3.15. CO-INMUNOPRECIPITACIÓN ............................................................................. 51 3.16. EXTRACCIÓN DE ARN Y PCR CUANTITATIVA ....................................................... 51 3.17. ESTUDIO DE LA MEMORIA OLFATIVA .................................................................. 52 3.18. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS .................................................... 52
ii
4. RESULTADOS ...................................................................................................... 55
4.1. CAMBIOS MORFOLOGICOS Y FUNCIONALES EN LA SVZDE RATONES DEFECTIVOS PARA
EL GEN P53 ..................................................................................................... 56 4.1.1. p53 se expresa en la SVZ ....................................................................... 56 4.1.2. La pérdida del gen p53 produce cambios poblacionales y
ultraestructurales en la SVZ con hiperplasia celular selectiva ................. 57 4.1.3. La proliferación celular y autorrenovación en la SVZ tras la pérdida del
gen p53 se encuentran aumentadas ........................................................ 61 4.1.4. La apoptosis espontánea aumenta en ratones p53
-/- ............................. 65
4.1.5. Aumento de la diferenciación in vitro en células procedentes de la SVZ de ratones p53
-/- ....................................................................................... 67
4.1.6. El efecto de la pérdida de función de p53 en el desarrollo embrionario no es secundario a mecanismos de compensación ..................................... 70
4.2. MUTAGENESIS Y ONCOGENESIS EN LA SVZ DE RATONES DEFECTIVOS PARA EL GEN
P53 ................................................................................................................ 73 4.2.1. La administración prenatal de N-etil-N-nitrosourea (ENU) en ratones p53
-
/- origina tumores periventriculares en progenie adulta ............................ 73
4.2.2. Reclutamiento de aNSCs hacia el compartimento proliferativo en la SVZ tras administración de ENU...................................................................... 75
4.2.3. Caracterización in vitro de la SVZ tras administración de ENU ............. 76 4.2.3. La oncogénesis con Ras en ratones p53
-/- se asemeja al “second-hit”
producido con ENU .................................................................................. 78 4.2.4. Modelo de oncogénesis tras ENU en ratones p53
-/- (Figura 33) ............ 80
4.3. ANALISIS DE RATONES DEFECTIVOS P27KIP1-/-
/P53-/-
............................................. 83 4.3.1. Rescate fenotípico en el doble mutante p27
Kip1-/-/p53
-/- .......................... 83
4.3.2. La ventaja proliferativa tras la pérdida de p53 y p27Kip1
no se debe a un efecto aditivo en los dobles mutantes ...................................................... 85
4.3.3. p53 regula la autorrenovación de las aNSCs en ratones mutantes dobles p27
Kip1-/-/p53
-/- sin afectar a la diferenciación neuronal ............................. 86
4.3.4. La pérdida de función de p27Kip1
y p53 determina diferencialmente la
progresión de las aNSCs hacia linaje neuronal ....................................... 90 4.3.5. Los ratones mutantes p27
Kip1-/- presentan déficit de reconocimiento de
nuevos olores ........................................................................................... 93
4.3.6. La pérdida de función del gen p27 aumenta la apoptosis en mutantes simples y dobles ....................................................................................... 95
4.3.7. Papel de los reguladores del ciclo celular p27 y p53 en la regulación de la neurogénesis ........................................................................................ 96
4.3.7.1. p27 regula la neurogénesis a nivel postraduccional mediante la unión a
neurogenina ........................................................................................... 97 4.3.7.2. p53 actúa como represor transcripcional de genes proneurales durante
los primeros días de diferenciación .................................................. 99
5. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES ....................................................................... 101
5.1. PAPEL DE LA PROTEÍNA SUPRESORA DE TUMORES P53 EN LA SVZ ...................... 102 5.2. POTENCIAL ONCOGÉNICO DE LA PÉRDIDA DE FUNCIÓN DE P53 ........................... 107 5.3. PAPEL DEL INHIBIDOR DEL CICLO CELULAR P27KIP1 EN LA SVZ. CONVERGENCIAS Y
DIVERGENCIAS CON LA ACCIÓN DE P53. .......................................................... 111
iii
5.4. CONCLUSIONES .............................................................................................. 116
ANEXO 1. ESTUDIO COMPARATIVO DE LA SVZ EN PRIMATES Y HUMANOS. ................................................................................................................................. 119
ANEXO 1.1. SVZ EN HUMANOS ................................................................................ 120 ANEXO 1.2. SVZ EN PRIMATES ................................................................................ 123
ANEXO 2. LISTADO DE GENES TESTADOS POR PCR CUANTITATIVA ......... 128
PUBLICACIONES RELACIONADAS ..................................................................... 131
BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................................... 135
ARTÍCULOS………………………………………………………………………………149
iv
v
ABREVIATURAS 3H-Thy Timidina tritiada
aNSC Célula madre neural adulta
AraC Citosina-beta-D-arabinofuranósido
bFGF Factor de crecimiento fibroblástico básico
BO Bulbo olfatorio
BrdU Bromodeoxiuridina
Cre Recombinasa cre
Dcx Doblecortina
DG Giro dentado
EGF Factor de crecimiento epidérmico
FA Fosfatasa alcalina
FBS Suero bovino fetal
GA Glutaraldehído
GFAP Proteína glial fibrilar ácida
GFP Proteína verde fluorescente (del inglés green fluorescent protein)
KDa Kilodaltons
LCR Líquido cefalorraquídeo
ME Microscopía electrónica
MO Microscopía óptica
ODs Oligodendrocitos
PFA Paraformaldehído
PSA-NCAM NCAM modificada de ácido siálico
RER/REL Retículo endoplasmático rugoso/liso
RMS Camino migrador rostral
SCZ Zona subcallosa
SGZ Zona subgranular
SNC Sistema nervioso central
SVZ Zona subventricular
Tuj1 Beta III-tubulina
VL Ventrículos laterales
VZ Zona ventricular
wt Animal nativo (del inglés wild type)
1. INTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓN
2
Debido al gran avance que la Neurociencia ha experimentado en las últimas
décadas, uno de los grandes dogmas de principios del siglo XX ha
comenzado a tambalearse. La creencia de que nacíamos con un número fijo
de neuronas que iba menguando a lo largo de la vida ha dado paso a un
nuevo y revolucionario concepto, la neurogénesis adulta, o lo que es lo
mismo, la producción de nuevas neuronas después del nacimiento.
Si bien es cierto que nacemos con un número establecido de
neuronas maduras, durante la edad adulta persiste la formación de nuevas
neuronas a partir de células indiferenciadas que se encuentran en
determinadas localizaciones del cerebro adulto, las llamadas células madre
adultas del sistema nervioso. Este proceso generativo se había descrito con
anterioridad en peces, reptiles, pájaros y mamíferos, incluida la especie
humana, pero ha sido en estas últimas décadas cuando ha recibido un
fuerte impulso. Este descubrimiento ha durado casi un siglo, y ha dependido
en gran medida del rápido desarrollo de las técnicas histológicas e
inmunológicas, sobre todo a partir de los años 50, y de la aparición de la
microscopía electrónica. Tras numerosos trabajos y no poca discusión
científica, ahora estamos en condiciones de asegurar que la neurogénesis
adulta existe.
INTRODUCCIÓN
3
1.1. Neurogénesis adulta en mamíferos
1.1.1. Centros germinales
Hasta el momento son reconocidos unánimemente por la comunidad
científica dos centros proliferativos principales en el cerebro de mamífero
adulto donde residen las células madre neurales, el giro dentado del
hipocampo (DG, del inglés dentate gyrus)(Cameron et al., 1993) y la zona
subventricular (SVZ, del inglés subventricular zone) de los ventrículos
laterales (VL) (Doetsch et al., 1999) (Figura 1). No obstante, se ha
encontrado células con potencial proliferativo en otras regiones del sistema
nervioso central (SNC) tales como el tercer ventrículo (Xu et al., 2005), el
canal ependimario de la médula espinal (Frisen et al., 1998) y recientemente
la región subcallosa (SCZ, del inglés subcallosal zone) (Seri et al., 2006),
comprendida entre cuerpo calloso e hipocampo. En este trabajo, hemos
centrado la atención en la generación y proliferación de nuevas neuronas
que migrarán al bulbo olfatorio (BO) del ratón adulto, adquiriendo un
carácter inhibitorio (granulares y periglomerulares).
Figura 1. Centros germinales y neurogénicos en mamífero adulto (BO: bulbo olfatorio;
SVZ: zona subventricular; DG: giro dentado; SCZ: zona subcallosa). Foto obtenida en el
laboratorio de Neurobiología Comparada (ICBIBE-Valencia)
INTRODUCCIÓN
4
La mayoría de estas neuronas se generan en la SVZ y, tras ser
producidas migran de 6 a 8 milímetros hacia el BO a lo largo de lo que se ha
denominado el camino migrador rostral (RMS, del inglés rostral migratory
stream).
La SVZ es una región discontinua de células situada por debajo de
la capa ependimaria que tapiza la pared lateral de los ventrículos laterales
en la región del estriado. Normalmente su espesor es de 2-3 capas de
células aunque puede ser menor o mayor según los ejes rostro-caudal y
dorso-ventral (Mitro and Palkovits, 1981). Aunque ha sido necesario el uso
del microscopio electrónico (ME) para la identificación de los diferentes tipos
celulares que coexisten en la SVZ, es posible visualizar diferencias entre
ellos con el microscopio óptico (MO) (Figura 2).
Figura 2. Tipos celulares en la SVZ. Imagen a pequeños aumentos de la SVZ donde se
observan los diversos tipos celulares (identificadas posteriormente al ME como células tipo A
(a), B (b), C (c) y E. Las células ependimarias (e) en su polo apical poseen cilios (flecha
horizontal) hacia la luz del ventrículo (VL) e inclusiones grasas en su citosol (flecha vertical).
n=neurona, od=oligodendrocito, v=vaso sanguíneo. Escala: 5 m. Foto obtenida en el
laboratorio de Neurobiología Comparada (ICBIBE-Valencia)
INTRODUCCIÓN
5
Así es posible observar una capa de células tapizando el ventrículo
con cilios en su polo apical, núcleos redondo-ovales, y en cuyo citoplasma
existe un punteado basófilo. Estas células se corresponden con células
ependimarias. Ocasionalmente se observan gotas lipídicas en su interior, y
esto es característico de este tipo celular. Por debajo de dicha capa, células
muy diferentes comparten un mismo nicho constituyendo la SVZ per se.
Existen células próximas al ventrículo con núcleos claros e irregulares, de
tamaño intermedio, y normalmente con citoplasma claro, que corresponden
a astrocitos (esto se sabe gracias a estudios complementarios con
inmunohistoquímica y ME que han demostrado la presencia de abundantes
filamentos intermedios específicos de la estirpe astrocitaria). Otras células
sin embargo presentan núcleos pequeños y oscuros con varios nucléolos y
escaso citoplasma. Estas células se agrupan en racimo a lo largo de la SVZ,
y serán las neuronas jóvenes que comenzarán su migración hacia el BO.
Junto a estos grupos de neuronas jóvenes es frecuente encontrar un tipo
celular con características intermedias entre astrocitos y neuronas que se
considera precursor de amplificación por su alta tasa de proliferación. Por
ello es frecuente encontrar estas últimas células en mitosis. Entre otros tipos
celulares con morfología característica al MO y que ocasionalmente integran
la SVZ encontramos células endoteliales, oligodendrocitos junto a axones
mielínicos, neuronas, células picnóticas y microglía. La pared medial de los
VL forma el septum que, a diferencia de la SVZ, posee escasa celularidad.
Han sido, sin embargo, los estudios de ME los que, combinados con
el uso de marcadores celulares específicos mediante técnicas
inmunocitoquímicas, han permitido la descripción precisa de la SVZ en
roedores como primer paso en la identificación de las células madre
neurales de cerebro adulto en mamíferos (Doetsch et al., 1997). Cuatro
tipos celulares fueron identificados según sus características
ultraestructurales: células tipo A (migradoras o neuroblastos), células tipo B
INTRODUCCIÓN
6
(de naturaleza astrocitaria), células tipo C (precursores de amplificación) y
células tipo E (ependimocitos) (Figura 3).
Figura 3. Tipos celulares de la SVZ. Diagrama de los tipos celulares en la SVZ. Imagen
obtenida de la revisión (Quinones-Hinojosa and Chaichana, 2007)
Las células tipo A son las células oscuras que se observaban al MO
y son electrondensas al ME. Presentan morfología fusiforme con 1 ó 2
expansiones. El núcleo está ocasionalmente invaginado, y la cromatina es
principalmente eucromatina con 2-4 nucléolos. Su citosol es escaso con
abundantes ribosomas, algunas cisternas de retículo endoplasmático
rugoso (RER), un pequeño aparato de Golgi y numerosos microtúbulos
orientados a lo largo del eje celular. La membrana plasmática muestra
complejos de unión característicos con las células de alrededor. Las células
PARÉNQUIMA NERVIOSO
ASTROCITOS
TIPO B1
EPENDIMOCITOS PARED LATERAL DEL
VENTRICULO LATERAL
NEUROBLASTO O
CÉLULA TIPO A
CÉLULA TIPO C
ASTROCITOS TIPO B2
DIRECCIÓN DE
MIGRACIÓN
LUZ VENTRICULAR
INTRODUCCIÓN
7
tipo A además presentan un cilio primario que es corto y está orientado en
la dirección de migración con un centriolo en su base, pudiendo ser
responsable directo de la misma. Tienen la capacidad de migrar
tangencialmente desde la SVZ y a lo largo del RMS donde forman
estructuras semejantes a cadenas celulares (Figura 4). Reconstrucciones
tridimensionales han mostrado que estas cadenas están rodeadas de
astrocitos que establecen contacto con los neuroblastos de forma que no
hay ningún neuroblasto rodeado totalmente por otra célula migradora.
Las proteínas PSA-NCAM (NCAM modificada con ácido siálico), -
tubulina (Tuj1) y doblecortina (Dcx) son marcadores específicos muy útiles
en su identificación mediante inmunohistoquímica. Estas células expresan
pero no específicamente Dlx2, un factor de transcripción que también
poseen las células tipo C.
Figura 4. Cadenas migradoras. A) Sección longitudinal de una cadena de células tipo A.
Escala 5 m. B) Sección transversal. Las células tipo B y B-C flanquean las células tipo A a
modo de vaina de migración. Escala: 5 m. En ambos casos se objetivan los espacios
intercelulares entre células migradoras.
INTRODUCCIÓN
8
Las células tipo B presentan contornos irregulares que rellenan
profusamente los espacios existentes entre las células cercanas. El
citoplasma es más claro y con algunos ribosomas. El núcleo de estas
células está muy invaginado y presenta cromatina densa. Las células tipo B
son de estirpe astroglial. Los astrocitos tipo B establecen contactos célula-
célula con otros astrocitos a través de uniones tipo GAP. Son células ricas
en filamentos intermedios, constituidos entre otras por una proteína
específica, GFAP (del inglés glial fibrillary acidic protein). Otros filamentos
intermedios presentes en las células B son vimentina y nestina. Estas
células constituyen una red densa bajo la capa de ependimocitos y rodean a
las células tipo A.
En el ratón se han descrito dos tipos de células tipo B, B1 y B2. Los
astrocitos B1 se han considerado como las células madre adultas de
sistema nervioso. Ocasionalmente, las células B1 contactan la luz del
ventrículo exhibiendo un único cilio corto y recto. Este cilio tiene una
estructura 9+0 y puede iniciarse desde el interior del citoplasma de la célula.
Esta estructura recuerda a la de las células radiales de reptiles y pájaros.
Por otro lado es conocido que las células radiales embrionarias de
mamíferos también presentan un único cilio corto. Recientemente se ha
demostrado que el cilio puede jugar un papel importante en proliferación
(Han et al., 2008; Singla and Reiter, 2006). El número de células B
contactando el ventrículo aumenta tras infusión de factor de crecimiento
EGF (del inglés epidermal growth factor) (Doetsch et al., 2002a) o efrinas
(Conover et al., 2000) o tras cualquier proceso que implique regeneración
de la SVZ. El significado de este fenómeno no está claro, pero podría estar
relacionado por la captación de factores del líquido cefalorraquídeo (LCR)
para la activación de la proliferación en estas células.
INTRODUCCIÓN
9
Las células tipo C (precursores de amplificación) comparten algunas
características con las células tipo A pero son menos electrondensas, tienen
menos ribosomas y sus núcleos son más grandes, esféricos y
frecuentemente invaginados. Presentan nucléolos reticulados de gran
tamaño y con características atípicas. También se observan grandes
aparatos de Golgi, mientras que no encontramos ni filamentos intermedios
(típicos de los astrocitos) ni microtúbulos (típicos de neuroblastos). Aunque
las células tipo C forman agrupaciones en la proximidad de las cadenas de
células migradoras en la SVZ (formando complejos de unión ocasionales
con ellas) no se ha encontrado este tipo de células en el RMS. Se las
denomina precursores de amplificación pues son las células que proliferan
con mayor velocidad en la SVZ. Expresan Dlx2, pero no PSA-NCAM.
Las células tipo E (células ependimarias) son grandes y cúbicas y se
disponen formando una monocapa que separa el ventrículo lateral del
parénquima subyacente. Una característica fundamental es la presencia de
cilios y numerosas microvellosidades en su polo apical. Los procesos
laterales de células vecinas se interdigitan y permanecen en íntimo contacto
a través de complejos de unión. Ultraestructuralmente las células tipo E
presentan un citoplasma claro con pocos orgánulos a excepción del
corpúsculo basal de los cilios donde un gran número de mitocondrias se
acumulan. La mayor parte de estas mitocondrias están unidas a la base del
cilio mediante estructuras filamentosas. El núcleo es esférico y compuesto
por cromatina dispersa con grumos de heterocromatina asociados a la
envoltura nuclear. Dentro de la célula ependimaria, haces de filamentos
intermedios pueden encontrarse dispersos en el citosol en pequeñas
cantidades. Inmunohistoquímicamente, estas células expresan vimentina, S-
100 y CD24. Las células ependimarias juegan entre otros un papel esencial
en el movimiento del LCR. Algunos autores consideran incluso que estas
INTRODUCCIÓN
10
células son capaces de dividirse y diferenciarse en neuronas (Frisen et al.,
1998), sobre todo tras daño celular isquémico (Carlen et al., 2009).
Otros tipos celulares aparte de los citados se pueden encontrar
esporádicamente y en menor porcentaje en la SVZ. Entre ellos: neuronas,
células picnóticas, oligodendrocitos y microglía, que se entremezclan con el
resto de poblaciones (Figura 5).
Figura 5. Otros tipos celulares en la SVZ. A) Célula picnótica (flecha blanca). Su número
aumenta con la irradiación, otros mutágenos, y tratamientos antimitóticos. Escala: 5 m. B)
Microglía. Muy densa a los electrones, posee forma estrellada con finas expansiones y
grandes inclusiones intracelulares. Actúa como célula fagocítica en casos patológicos
eliminando los restos celulares. Escala: 2 m. C-D) Oligodendrocitos. No son frecuentes en
su forma madura en la SVZ. Suelen asociarse a axones mielínicos del estriado, también se
encuentran inmersos en el cuerpo calloso. Son células pequeñas y oscuras con núcleo
esférico de cromatina condensada en grumos (asterisco). Escala C: 1 m, D: 5 m.
*
INTRODUCCIÓN
11
Tabla 1. Características ultraestructurales de las poblaciones celulares de la
SVZ en el cerebro ratón
Estructura Tipo A Tipo B Tipo C Tipo E
Procesos Tangencial largo
Radiales entre las células
No son frecuentes
Ocasional radial claro
Núcleo Fusiforme y oscuro
Oval irregular Núcleo grande ocasionalmente invaginado
Redondo-oval
Cromatina Laxa con grumos
Laxa Intermedia Pequeños agregados
Nucléolos 1-2 grandes 1-2 grandes 2-4 grandes 1-2 pequeños
Citoplasma Escaso y oscuro
Claro Intermedio Claro (basal) y oscuro (apical)
REL + +++ ++ +
Aparato de Golgi
Pequeño Grande (sáculos delgados)
Grande Pequeño (sáculos dilatados)
Vesículas del Golgi
++ ++++ +++ +
Ribosomas libres
++++ ++ +++ ++
Mitocondria + +++ (pequeñas y redondas)
+++ +++ (largas y elongadas)
Centriolo
Cercano al núcleo y alejada del ventrículo
En el citoplasma apical
Detectado Ninguno detectado
INTRODUCCIÓN
12
Tabla 1. Características ultraestructurales de las poblaciones celulares de la
SVZ en el cerebro ratón (continuación)
Estructura Tipo A Tipo B Tipo C Tipo E
Cilio Uno (9+2) internalizado
Uno (9+0) Uno (9+2) Muchos (9+2), contactan con el ventrículo
Microtúbulos
++++ orientados en el eje longitudinal
+ ++ +
Filamentos intermedios
No tiene ++++ No tiene ++
Complejos de unión
Pequeñas adherens
Uniones GAP y pequeñas adherens
Pequeñas adherens
Grandes complejos de unión
Primeros marcadores descritos
Tuj1
Dlx2
PSA-NCAM+
Nestina
GFAP
Nestina
Dlx2
Nestina
S-100b
GFAP policlonal
Vimentina
1.1.2. El camino migrador rostral (RMS)
La SVZ se continúa rostralmente por el RMS, un camino que se expande
hasta el BO, y por donde migran las nuevas neuronas al mismo. Está
compuesto por células tipo A idénticas a las descritas en la SVZ,
rodeadas por células tipo B, que forman una vaina de aislamiento
respecto al parénquima cerebral subyacente. Estas estructuras se han
denominado gliotubos (Jankovski and Sotelo, 1996; Lois et al., 1996;
Peretto et al., 1998). Los astrocitos permanecen fijos mientras que los
neuroblastos migran a lo largo de dichas estructuras. La migración está
INTRODUCCIÓN
13
favorecida por la interacción célula-célula entre células tipo A, y por el
aislamiento de los gliotubos (Figura 4).
Al MO se observan numerosos vasos sanguíneos asociados a las
cadenas de migración. Probablemente las células endoteliales ejerzan
una función trófica sobre las células migradoras. Adicionalmente, las
células ependimarias que permiten el movimiento del LCR a través de
movimientos sincronizados y polarizados de los cilios, juegan un
importante papel en la dirección de migración como demuestran estudios
recientes (Sawamoto et al., 2006). La dirección del flujo de LCR coincide
con la dirección que siguen las células migradoras camino al BO.
1.1.3. Identificación de la célula madre neural adulta
La identificación de la célula madre neural adulta (aNSC del inglés adult
neural stem cell) se llevó a cabo de manera muy similar en SVZ y DG
(Doetsch et al., 1999; Seri et al., 2001). Se demostró que los astrocitos de
estas regiones corresponden con las aNSCs (Figura 6). De los
numerosos experimentos realizados, dos de ellos fueron clave. En un
primer experimento, tras infusión durante 6 días de una droga antimitótica
en los ventrículos, AraC (cytosine-beta-D-arabinofuranoside), se produjo
la muerte de todos los tipos celulares que proliferaban activamente en la
SVZ. En todos los casos se observó la depleción completa de las células
tipo C y A, permaneciendo únicamente en la SVZ los astrocitos, que se
dividían más lentamente y los ependimocitos que no se dividían. Poco
tiempo después, la SVZ era capaz de regenerarse completamente. Si
marcadores de proliferación como la timidina tritiada (3H-Thy) eran
inyectados tras el tratamiento con AraC, los astrocitos, las únicas células
en el momento, incorporaban 3H-Thy al dividirse, y se transformaban
secuencialmente en células C marcadas y éstas en neuroblastos
INTRODUCCIÓN
14
migradores marcados. Esto fue demostrado en un segundo experimento
mediante el uso de ratones transgénicos.
Figura 6. Los astrocitos son las células madre neurales en ratón (adaptada de
Doetsch et al., 1999). Ara-C es una droga antimitótica capaz de eliminar los precursores
de alta tasa proliferativa. A) Tras infusión de 6 días en los VL, B) la SVZ no presentaba
células tipo A (rojas) ni tipo C (verdes) (0d). Tras dos días (2d) comenzaban a aparecer
células tipo C y a los 14 días la SVZ mostraba todos los tipos celulares descritos, es decir,
estaba completamente regenerada (14d).
Los astrocitos de estos ratones expresaban, bajo el promotor de
GFAP y de forma simultánea, un receptor para un virus aviar asociado a
un marcador visible, la fosfatasa alcalina (FA). Se infectaba la SVZ con el
virus aviar que marcaba únicamente a los astrocitos. A diferentes tiempos
INTRODUCCIÓN
15
era posible observar cómo otros tipos celulares, no astrocitarios,
presentaban FA por proceder de forma directa de la transformación de
células tipo B.
1.1.4. Estudio comparativo de la SVZ en mamíferos
La proliferación celular en la SVZ se ha demostrado en muchas especies
de vertebrados mamíferos, incluyendo ratones, ratas, conejo, perros,
vacas, monos y humanos (Blakemore, 1969; Blakemore and Jolly, 1972;
Bonfanti et al., 2006; Kornack and Rakic, 2001a; Lewis, 1968; McDermott
and Lantos, 1990; Rodriguez-Perez et al., 2003; Sanai et al., 2004). La
presente tesis ha sido realizada en ratón adulto debido a limitaciones
experimentales como la necesidad de delección de los genes estudiados.
Las características morfológicas y probablemente funcionales de las
zonas ependimaria y subependimaria varían de unas especies a otras y
difieren en parte de las ampliamente descritas en roedores (Doetsch et
al., 1997). Por ello, no podemos extrapolar los resultados obtenidos a
otras especies sin ser cautos. Por otro lado, es cierto que existen
similitudes importantes entre la SVZ adulta murina y la de mamíferos
superiores como primates y humanos. Por ello, y por haber sido parte del
trabajo realizado, se describen brevemente las características
morfológicas de la SVZ en humanos y monos en el Anexo 1.
1.1.5. El nicho neurogénico
El nicho neurogénico está compuesto por los tipos celulares, moléculas y
estructuras que permiten la existencia de proliferación y neurogénesis en
ciertas áreas cerebrales. Es decir, la SVZ no debería ser vista como una
región formada por capas constituidas por diferentes tipos celulares
independientes sino como un todo, donde el papel de los vasos
sanguíneos y de las estructuras nerviosas circundantes es esencial.
INTRODUCCIÓN
16
Muchos factores tróficos y proteínas contenidos en la SVZ
(intrínsecos) o liberados de forma paracrina o endocrina (extrínsecos)
están directamente implicados en neurogénesis (Tablas 2 y 3). El nicho
neurogénico constituye pues un patrón organizado descrito ampliamente
en ratones y revisado en (Alvarez-Buylla and Lim, 2004). Puede verse
modificado en otras especies de mamíferos, pero los elementos clave
necesarios para la neurogénesis persisten en todos los modelos. También
existe un nicho neurogénico en el hipocampo, en la capa subgranular del
giro dentado formado por células madre, progenitores y vasos sanguíneos
(Palmer et al., 2000).
Tabla 2. Factores implicados en la regulación de la diferenciación en la SVZ
FACTOR EFECTO REFERENCIA
FGF2 neurogénesis (Wagner et al., 1999)
EGF neurogénesis
gliogénesis
(Doetsch et al., 2002a; Kuhn et al., 1997)
BDNF neurogénesis
supervivencia (Pencea et al., 2001b)
EPO neurogénesis (Shingo et al., 2001)
HB-EGF neurogénesis (Jin et al., 2002a)
BMP gliogénesis (Gross et al., 1996)
CNTF/LIF neurogénesis (Emsley and Hagg, 2003)
Noggin neurogénesis (Lim et al., 2000)
Serotonina neurogénesis (Banasr et al., 2004)
Dopamina neurogénesis (Van Kampen and Robertson, 2005)
INTRODUCCIÓN
17
Tabla 3. Factores implicados en la regulación de la proliferación en la SVZ
FACTOR EFECTO REFERENCIA
Isquemia (Tonchev et al., 2005)
FGF2 (Wagner et al., 1999)
EGF (Kuhn et al., 1997)
TGF (Cooper and Isacson, 2004)
IGF1 (Arsenijevic et al., 2001)
BDNF (receptor p75) (Zigova et al., 1998)
VEGF (Jin et al., 2002b)
Efrinas (Conover et al., 2000)
TNF (Wu et al., 2000)
BMP variable (Coskun et al., 2001; Lillien and Raphael, 2000; Ying et al., 2003)
CNTF/LIF autorrenovación (Shimazaki et al., 2001)
Shh (Charytoniuk et al., 2002; Palma et al., 2005)
Notch variable (Chambers et al., 2001)
Serotonina (Banasr et al., 2004)
Dopamina (Baker et al., 2004; Coronas et al., 2004)
Abeta (Haughey et al., 2002)
Wnt (beta-catenina) FGF2 (Israsena et al., 2004)
Opioides (Stiene-Martin et al., 2001)
INTRODUCCIÓN
18
1.2. Regulación de la neurogénesis en la SVZ
La regulación del número de células en las zonas germinales del sistema
nervioso depende de la interacción entre las señales extracelulares y las
propiedades “intrínsecas” de las células germinales que pueden variar
dependiendo del estado de desarrollo del organismo. Durante etapas
tempranas del desarrollo, la proliferación de células ocurre en todo lo
largo de la luz del tubo neural, en un área denominada zona ventricular
(VZ, del inglés ventricular zone). En este punto, las células proliferan muy
rápidamente y de forma característica dan lugar a células hijas idénticas
por un proceso denominado “división celular simétrica” que permite la
expansión de estructuras nerviosas primordiales (Figura 7). A medida que
el organismo se desarrolla, la necesidad de una expansión rápida
disminuye y nuevas estructuras empiezan a formarse mientras sigue
creciendo el organismo. En mitad de la gestación, aproximadamente, una
segunda zona germinal aparece cercana a los ventrículos, la SVZ. Las
células de esta región adquieren una nueva modalidad de división
caracterizada por la generación de dos células hijas diferentes, la llamada
división celular asimétrica. Una de las dos células hijas tiene la capacidad
de autorrenovarse y la otra de diferenciarse hacia un linaje específico
(Temple, 2001) .
En la SVZ adulta, el mantenimiento de la homeostasis induce a las
células madre y progenitores multipotenciales a este último tipo de
división, a menos que exista la necesidad de una expansión rápida (por
ejemplo, en caso de reparación tras daño) en cuyo caso se produce un
cambio a favor de la división simétrica. Cambios en los niveles de señales
extracelulares, alteraciones en los receptores o modificación de las
moléculas de señalización intracelulares que regulan la proliferación
INTRODUCCIÓN
19
durante el desarrollo embrionario podrían resultar en formación de
estructuras cerebrales anormales.
Figura 7. Modalidades de división celular. A) Durante el desarrollo, la expansión de las
estructuras cerebrales viene garantizada por la división celular rápida y simétrica (no
terminal). A medida que se generan nuevos tipos celulares, el patrón de división se
transforma en asimétrico. B) En el animal adulto, las células madre permanecen en los
centros germinales (como la SVZ) y es probable que se dividan de forma asimétrica
generando nuevas células madre e hijas (células tipo C). Los progenitores pluripotenciales
(células tipo C) a su vez mediante división asimétrica generarían nuevas células tipo C y
neuroblastos (células tipo A) con la habilidad de dividirse de forma simétrica
diferenciándose terminalmente y saliendo del ciclo (Q). Tras daño neuronal, la necesidad
de expansión de los precursores de amplificación conduciría a una rápida conversión
hacia división simétrica generándose nuevas células tipo A y oligodendrocitos.
INTRODUCCIÓN
20
Cambios o modificaciones de dichas señales en la edad adulta
podrían no afectar a la histoarquitectura cerebral, pero sí al número de
progenitores multipotenciales y/o células madre disponibles para
reparación tras daño. Si la proliferación disminuye, un menor número de
células estarán preparadas para responder a lesiones celulares y por
tanto fracasará la reparación, y sin embargo, si la proliferación es
descontrolada podrían resultar, contrariamente, en focos de hiperplasia y
eventualmente dar lugar a transformación neoplásica. Estos patrones
témporo-espaciales de respuesta a señales mitogénicas y antimitogénicas
vienen determinados por varios parámetros incluyendo biodisponibilidad
de las señales, la presencia de receptores específicos, crosstalk entre las
diferentes cascadas de señalización, y la modulación, a través de las
moléculas reguladoras, del ciclo celular. Todos estos eventos podrían
verse determinados por rasgos genéticos específicos, expresión de
factores de transcripción o por modificaciones epigenéticas de los
componentes de la cromatina, dando lugar a la expresión diferencial de
genes que modulan la respuesta celular en un contexto específico.
Es importante mencionar que, aunque el número de células madre
neurales se mantiene estacionario en un momento dado del desarrollo o
la edad adulta, es el resultado de un equilibrio entre proliferación,
diferenciación, migración y supervivencia de estas células.
1.2.1. Ciclo celular y moléculas reguladoras
Diversos estudios acerca de la duración del ciclo celular en la SVZ de
cerebro de ratón neonatal (Menezes et al., 1998; Schultze and Korr, 1981;
Smith and Luskin, 1998; Thomaidou et al., 1997) y adulto (Morshead and
van der Kooy, 1992; Schultze and Korr, 1981) han observado un alto
índice de proliferación en esta región.
INTRODUCCIÓN
21
El ciclo celular es un proceso mediante el cual una célula da lugar
a dos células hijas. Tiene lugar y es esencial durante el desarrollo
embrionario y persiste durante la edad adulta. Está regulado por diversas
proteínas como las ciclinas y las CDKs (cyclin dependent kinases), así
como por dos familias de inhibidores de las CDKs (CKIs) entre las que se
encuentran las familias INK4 y la familia CIP/KIP (Figura 8).
Figura 8. Fases del ciclo celular. Go: fase quiescente. G1 (del inglés Growth o Gap 1):
existe crecimiento celular con síntesis de proteínas y de ARN. Es el periodo que trascurre
entre el fin de una mitosis y el inicio de la síntesis de ADN. S (del inglés Synthesis): se
produce la replicación o síntesis del ADN. G2 (del inglés Growth o Gap 2): fase de
crecimiento. Termina cuando la cromatina empieza a condensarse al inicio de la mitosis
(M).
Las ciclinas reciben su nombre por sufrir un ciclo de síntesis y
degradación en el transcurso de cada división celular (Evans et al., 1983;
Pines, 1995). Se unen a las CDKs regulando su actividad de fosforilación.
Se clasifican en: a) ciclinas mitóticas (ciclina A y B) que actúan en las
fases S, G2 y M temprana del ciclo celular, necesarias para la entrada en
mitosis, y b) ciclinas G1 (fase de crecimiento) (ciclinas D1-3, ciclinas E1-2)
INTRODUCCIÓN
22
que se unen a las CDKs en la fase G1 del ciclo celular y son necesarias
para la entrada a fase S (fase de duplicación o síntesis de ADN (Ácido
DesoxirriboNucleico)). Las CDKs (1-4, 6) son quinasas que al unirse a las
ciclinas fosforilan proteínas diana que permiten la progresión del ciclo
celular.
Para discutir los mecanismos intracelulares de proliferación de los
progenitores neurales y aNSCs, es crítico conocer las moléculas
implicadas en la progresión de fase G1 del ciclo celular a fase S. Ésta
depende de la síntesis, ensamblaje y activación ordenada de los
diferentes complejos enzimáticos ciclina-CDK (Dyson, 1998; Nevins,
2001). Dos actividades enzimáticas principales han sido descritas: CDK4,
que actúa en G1 temprano y CDK2 que actúa en G1 tardío justo antes de
la entrada en fase S (Sherr, 1994a). Ambas actividades difieren tanto en
términos de especificidad de sustrato como en la modalidad de
regulación. CDK4, por ejemplo está regulado positivamente por ciclina D y
es inhibido por miembros de la familia INK4 (del inglés inhibitors of
CDK4). CDK2, sin embargo, es regulado positivamente por ciclina E e
inhibido por la familia CIP/KIP (del inglés kinase inhibitory proteins):
p21Cip1/WAF1, p27Kip1 y p57Kip2 (Sherr and Roberts, 1999). Los principales
sustratos de los complejos ciclina D/CDK4-6 pertenecen a la familia de la
proteína de retinoblastoma (Rb), incluyendo pRb, p107 y p130. Las
proteínas INK4 (p15Ink4b, p16Ink4a, p18Ink4c y p19Ink4d) evitan su fosforilación,
lo que a su vez favorece el secuestro por parte de las proteínas de Rb, del
factor de transcripción E2F (Sherr, 1994b). Esto produce un bloqueo en la
transcripción de genes diana de E2F, genes en su mayoría responsables
de la entrada de la célula en fase S como la ciclina A y la ciclina E
(Mundle and Saberwal, 2003; Paggi et al., 1996) (Figura 9).
INTRODUCCIÓN
23
Aparte del papel de las proteínas Rb, otro importante punto de
control/checkpoint de la transición G1/S está mediado por el gen supresor
de tumores p53 (Kastan et al., 1992) (ver apartado 1.2.3). A continuación
aclararemos algunos aspectos más concretos de cada una de estas
familias de proteínas poniendo especial énfasis en su papel en la SVZ
adulta y en el papel de las proteínas p27Kip1 y p53 en la regulación de la
neurogénesis.
Figura 9. Inhibición de los complejos ciclina D/CDK4 por la familia INK4. La transición
del ciclo celular está regulada por la actividad enzimática ciclina/CDK. La fosforilación de
la proteína del retinoblastoma (pRb) produce la liberación de factores transcripcionales de
la familia E2F/DP y la transcripción de genes implicados en la entrada a fase S. Los
principales inhibidores (familia INK4) y activadores (ciclina D y CDK4) se muestran en la
figura.
1.2.2. Familia CIP/KIP de inhibidores del ciclo celular
La familia de inhibidores CIP/KIP puede unirse a complejos ciclina
D/CDK4, aunque con menor afinidad que los miembros de la familia INK4.
La habilidad de inhibir la entrada en fase S del ciclo depende
fundamentalmente de la formación de complejos ternarios con ciclina A o
INTRODUCCIÓN
24
E y CDK2 (Russo et al., 1996). El efecto inhibitorio lo lleva a cabo
previniendo la unión del sustrato y/o por modificación de la región amino-
terminal de CDK2 impidiendo la unión del ATP . Como miembros de esta
familia cabe destacar: p27Kip1 (codificado por el gen Cdknb1), p21Cip1/WAF1
y p57Kip2 (Matsuoka et al., 1995; Sherr and Roberts, 1999).
Los niveles de p27Kip1 se encuentran normalmente elevados durante
la fase G0/G1 del ciclo celular y disminuyen rápidamente por acción de
mitógenos, permitiendo que las células entren en la fase S. Su
abundancia está controlada por múltiples mecanismos, a saber: a)
inactivación por interacción con otras proteínas (Sherr and Roberts,
1999); b) mecanismos transcripcionales (Servant et al., 2000); c)
mecanismos traduccionales (Hengst and Reed, 1996; Millard et al., 1997;
Miskimins et al., 2001); y d) proteolisis (tras ubiquitinación, en el
proteasoma).
1.2.2.1. Papel de p27Kip1 en la regulación del ciclo celular en la SVZ
p27Kip1 es expresado por células en división de la VZ durante el desarrollo
(van Lookeren Campagne and Gill, 1998) (Figura 10) y sus niveles
aumentan a medida que aumenta el número de divisiones celulares
(Delalle et al., 1999). Esta acumulación, se ha sugerido como parte de un
mecanismo celular que regularía el alargamiento progresivo del ciclo
celular y con él, el aumento de probabilidad de salir del mismo (Tarui et
al., 2005). Estudios de la dinámica celular en progenitores embrionarios
no demostraron un alargamiento del ciclo celular en ratones mutantes
p27Kip1-/- (Goto et al., 2004), pero la probabilidad de reentrada en el ciclo
aumentaba, aumentando el tamaño de las células en división. Este
aumento de tamaño también fue observado postnatalmente (Casaccia-
Bonnefil et al., 1997; Durand et al., 1998). Además, la sobreexpresión de
p27Kip1 daba lugar a un aumento de la fracción de células en quiescencia
INTRODUCCIÓN
25
con disminución del número de células en proliferación (Tarui et al.,
2005). La expresión de p27Kip1 persiste durante la edad adulta en las
células de la SVZ y el RMS sugiriendo también un rol en la regulación de
las poblaciones en división en cerebro maduro.
Figura 10. Expresión de ARN mensajero de p27Kip1
en el desarrollo embrionario
(adaptado de Van Lookeren Campagne and Gill, 1998)(van Lookeren Campagne and Gill,
1998). El ARN mensajero de p27Kip1
se expresa por las células en división del VZ y la SVZ
durante el desarrollo embrionario y disminuye cuando estas células migran y se convierten
en postmitóticas.
La caracterización fenotípica de mutantes p27Kip1-/- (que carecían
del primer exón del gen, responsable de codificar la región N-terminal de
la proteína (Kiyokawa and Koff, 1998)) mostró un aumento en la
incorporación de bromodeoxiuridina (BrdU), marcador exógeno de células
en fase S del ciclo celular (Doetsch et al., 2002b). Analizando por
subpoblaciones con la ayuda de la ME se objetivó un incremento de dos
veces el número de células tipo C o precursores de amplificación, y una
reducción equivalente en el número de neuroblastos o nuevas neuronas
(células tipo A). Los BO de estos ratones eran hipoplásicos al nacer,
indicando que la acción de p27Kip1 sobre la neurogénesis debía comenzar
prenatalmente. El número o fracción de la población de aNSCs (células
tipo B) se encontraba inalterado. Con marcaje de timidina tritiada (3H-
Thy), otro marcador exógeno e inmunohistoquímica específica se pudo
INTRODUCCIÓN
26
corroborar que el tipo celular que estaba proliferando era precisamente el
de células tipo C, manteniéndose invariable en otras poblaciones
celulares. Estos datos sugerían que la regulación del ciclo celular en la
SVZ era dependiente del tipo celular, siendo p27Kip1 un regulador
específico de las células tipo C.
El número de clones de células (neuroesferas) obtenidos in vitro a
partir de la SVZ, era también mayor que en los ratones nativos (WT del
inglés wild type), pero no se observaron diferencias en la diferenciación
celular pese a lo esperado. La explicación que los autores daban a la
reducción en el número de células tipo A era el retraso en la progresión
del linaje neural debido a un número incrementado en las rondas de
división de las células predecesoras, o células C. Enlazando con esta
idea, un artículo reciente analiza el papel de p27Kip1 sobre la neurogénesis
en la RMS y el BO (Li et al., 2009). Las conclusiones a las que llegaron
tras observar un aumento gradual de la expresión nuclear de p27Kip1 en
neuronas jóvenes al acercarse al BO, es que el papel de esta molécula
era fundamental para la salida del ciclo celular en pro de la neurogénesis,
confirmando los datos previos obtenidos. En un intento de aportar una
explicación mecanística, los mismos autores estudiaron la expresión de
otras moléculas implicadas en la regulación del ciclo celular en ratones
defectivos para p27Kip1 observando como CDK2 y la proteína de
retinoblastoma (y asociadas) en estado fosforilado, se mostraban
aumentadas comparadas con los ratones p27Kip1+/+. Estudios in vitro en
neuroesferas cultivadas a partir de SVZ neonatal, confirmaron
indirectamente estos datos ya que los niveles de p27Kip1 eran bajos en las
células en división y aumentaban en fases tempranas de diferenciación
para después disminuir indicando su papel sobre precursores inmaduros
principalmente (Jori et al., 2003).
INTRODUCCIÓN
27
1.2.3. Proteína supresora de tumores p53
p53 es un factor de transcripción que regula el ciclo celular. Su
participación como gen supresor de tumores es esencial en los
organismos multicelulares en la prevención frente a procesos cancerosos
(Hanahan and Weinberg, 2000). Se le ha llamado también “guardián del
genoma” porque actúa también conservando la estabilidad del ADN al
prevenir la perpetuación de las mutaciones. La proteína p53 fue por
primera vez identificada en 1979 por Arnold Levine (Princeton University,
US), David Lane (Imperial Cancer Research Fund, UK) y Lloyd Old
(Sloan-Kettering Memorial Hospital, UK). Su nombre se refiere a la masa
molecular de la proteína en un gel del tipo SDS-PAGE: 53 kilodaltons
(KDa). El gen Trp53 fue clonado por primera vez en 1983 por Moshe Oren
(Weizmann Institute, Israel) (Oren and Levine, 1983). Sin embargo, su
función como proteína supresora de tumores no fue descrita hasta 1989,
cuando Bert Volgestein y Michael Kastan (Johns Hopkins School of
Medicine, US) demostraron que Trp53 era un elemento crítico en la señal
de transducción que permitía una respuesta adecuada ante daño en el
ADN.
El gen Trp53 se localiza en el cromosoma humano 17 (17p13.1),
cromosoma de ratón 11, cromosoma 10 de rata, cromosoma 5 de perro,
cromosoma 12 de cerdo. En humano, la proteína p53 está constituida por
393 aminoácidos y posee tres dominios (Figura 11): (1) N-terminal o
dominio de activación de transcripción (TAD del inglés transcription-
activation domain) que activa a los factores de transcripción, (2) Región
central o dominio de unión a ADN (DBD, del inglés DNA-binding domain)
que contiene característicamente átomos de zinc y es rica en arginina, (3)
C-terminal o dominio de oligomerización (OD del inglés oligomerization
domain).
INTRODUCCIÓN
28
Figura 11. Dominios de la proteína p53 humana. TAD (dominio N-terminal de activación
de transcripción), dominio de unión al ADN, y OD (dominio C-terminal o región de
oligomerización) (NES: nuclear export signal (señal de exportación nuclear), NLS: nuclear
localization signal (señal de localizacion nuclear)).
La tetramerización de p53 incrementa su actividad in vivo. Las
mutaciones que inactivan p53 en muchos cánceres suelen encontrarse en
el dominio DBD, y destruyen la habilidad de la proteína para unirse a sus
secuencias diana en el ADN, previniendo la activación transcripcional de
estos genes. Como tales, las mutaciones en DBD son recesivas.
Moléculas de p53 con mutaciones en el dominio OD, dimerizan con
moléculas de p53 intactas y evitan que éstas realicen su correcta función.
Estas mutaciones poseen por tanto un efecto dominante negativo en la
función de p53.
TETRÁMERO p53
INTRODUCCIÓN
29
La proteína intacta p53 actúa a diferentes niveles:
(1) Activa las proteínas de reparación del ADN cuando éste ha
sido dañado,
(2) Detiene el ciclo celular en el punto de control (checkpoint)
G1/S tras detectar daño en ADN,
(3) Inicia el proceso de apoptosis o muerte celular programada si
el daño genético resulta irreparable para la célula.
En condiciones fisiológicas p53 es ubicua y se encuentra latente e
inactiva en el núcleo celular, a bajas concentraciones, ya que se
encuentra unida a la proteína Mdm2, que previene su acción y promueve
su degradación actuando como una proteína ligadora de ubiquitina. p53
se transloca al citoplasma donde es degradada por el proteasoma (Haupt
et al., 1997; Kubbutat et al., 1997). La forma activa de p53 se induce en
respuesta a una miríada de causas de estrés, que incluyen daño en el
ADN (incluyendo UV, radiación gamma o agentes químicos), estrés
oxidativo, shock osmótico, depleción de ribonucleótidos y expresión de
oncogenes disregulada (Figura 12). La detección del daño en el ADN
tiene lugar en los puntos de control del ciclo celular, por proteína-quinasas
que fosforilan a p53 en su dominio N-terminal (la región de unión a Mdm2)
impidiendo su degradación. La vida media de p53 se incrementa
drásticamente, lo que lleva a su acumulación rápida en las células sujetas
a daño. Los oncogenes activan a p53 mediante la acción de otra proteína,
p14ARF. Algunos oncogenes, pueden incluso estimular la transcripción de
proteínas que se unen e inhiben a Mdm2. En este momento, co-
activadores transcripcionales como p300 o PCAF acetilan el extremo C-
INTRODUCCIÓN
30
terminal de p53, con lo que queda expuesto el dominio de unión al ADN, y
con ello su función activadora o represora de genes específicos.
Figura 12. Activación y actuación de la proteína p53. Ante señales de diversa índole
(estrés celular) la proteína p53 se activa (disminuye su degradación) y activa la
transcripción de genes diana que tiene como función inducir los mecanismos de
reparación del ADN, la detención del ciclo celular, y la muerte celular. Estos procesos
implican la convergencia de diferentes cascadas de señalización/regulación del ciclo
celular como se observa en esta figura.
Una vez activa, p53:
(1) activa la expresión de genes pro-apoptóticos y anti-proliferativos
(incluyendo, entre otros, bax y el gen de la proteína p21Cip1/WAF1
respectivamente). La proteína p21Cip1/WAF1 se une a los complejos
ciclina/CDKs que regulan la transición desde fase G1 del ciclo
celular hacia fase S inhibiendo su actividad;
(2) reprime genes pro-proliferativos y anti-apoptóticos (por ej. IGF-2
y bcl2 respectivamente); e
INTRODUCCIÓN
31
(3) interacciona con proteínas reguladoras (por ej. helicasas,
caspasas).
Si el gen Trp53 está dañado, la supresión tumoral se reduce
drásticamente. Aquellas personas que heredan una única copia funcional
de p53 desarrollan el síndrome de Li-Fraumeni caracterizado por la
aparición de tumores en diferentes localizaciones en edades tempranas
(Malkin et al., 1990). El gen Trp53 puede sufrir cambios postnatalmente a
través de la acción de mutágenos (químicos, radiación o virus),
incrementándose la posibilidad de que la célula afectada comience a
dividirse de forma incontrolada. Más del 50% de los tumores humanos
contiene una mutación o delección de este gen. Con frecuencia, los
tumores de origen glial en el SNC presentan delección o mutación del
gen, tanto en el adulto (Hayashi et al., 2004; von Deimling et al., 1992;
Watanabe et al., 1996) como en el paciente pediátrico (Di Sapio et al.,
2002; Sung et al., 2000).
1.2.3.1. Papel de p53 en la regulación del ciclo celular en la SVZ
En el cerebro en desarrollo la expresión de p53 se restringe a las
poblaciones en división, más que a las células que sufren procesos de
apoptosis (van Lookeren Campagne and Gill, 1998). En estado
embrionario E14, sus niveles son muy altos en células en proliferación de
la VZ, mientras que de E16 a E20 se expresa también en la SVZ y en la
placa cortical. La expresión de p53 disminuye postnatalmente quedando
restringida al RMS y la SVZ donde se co-expresa con p27Kip1 (Figura 13).
Curiosamente, el patrón de expresión de p21Cip1/WAF1, una de las
principales dianas transcripcionales de p53, difiere del de p53, indicando
que el papel de p53 en la regulación del ciclo celular de las aNSCs es, al
menos parcialmente, independiente de la expresión de p21Cip1/WAF1.
INTRODUCCIÓN
32
Figura 13. Expresión de p53 durante el desarrollo embrionario y edad adulta. El ARN
mensajero de p53 se expresa en la VZ del neocórtex y eminencia ganglionar en E14. En la
VZ, SVZ en E16-E20 e incluso en el DG ya se observa en E20. En el periodo postnatal
(P1, P7, P14, adulto) el transcrito de p53 se encuentra en poblaciones mitóticamente
activas incluyendo la SVZ, el DG, la capa granular externa del cerebelo y el RMS (HI:
hipocampo, CP: placa cortical, LV: ventrículo lateral, CA1: región hipocampal del mismo
nombre, cp: caudado/putamen, DG: giro dentado).
A pesar de los altos niveles de p53 detectados en la SVZ y la VZ
del cerebro embrionario, los ratones defectivos para p53 se desarrollan
normalmente y no muestran defectos macroscópicos en la
histoarquitectura cerebral (Donehower et al., 1992). Sin embargo, sí
heredan la susceptibilidad al desarrollo de tumores tras exposición
transplacentaria a mutágenos (Leonard et al., 2001; Oda et al., 1997).
En definitiva, diversos genes reguladores del ciclo celular se
expresan en la SVZ adulta donde probablemente ejerzan una acción que
intentaremos, al menos en parte, dilucidar a lo largo de las próximas
páginas.
2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
34
La regulación de la neurogénesis adulta se ha convertido en un punto
esencial en busca de nuevas perspectivas terapéuticas frente a
enfermedades neurodegenerativas y accidentes cerebrovasculares, de
alta prevalencia en nuestra sociedad actual. Si se consiguiera estimular la
producción celular neuronal a partir de las células madre presentes en la
SVZ podríamos aliviar los síntomas y mejorar la capacidad funcional y
calidad de vida de muchos pacientes. Por otro lado, el papel de los
progenitores multipotenciales y células madre neurales en la SVZ adulta
como origen de tumores cerebrales, concretamente de estirpe glial, ha
sido sugerida en numerosos estudios tanto de tumores humanos como
mediante el uso de ratones transgénicos (Holland et al., 2000; Ignatova et
al., 2002; Recht et al., 2003). Dicha transformación podría ser el resultado
de un fallo en el proceso de apoptosis (suicidio celular), del aumento de la
capacidad de autorrenovación de los progenitores, o de la pérdida de la
capacidad para diferenciarse de los mismos. Sin embargo, los procesos
celulares que conllevan la transformación neoplásica cerebral son aún
desconocidos.
La regulación del ciclo celular en la SVZ, ya sea para inhibir la
transformación neoplásica como para estimular la formación de nuevas
neuronas, pasa por la comprensión de cómo las moléculas que regulan
dicho ciclo (la entrada en división, la diferenciación, la quiescencia) actúan.
Gracias a la tecnología actual y a la posibilidad de generar ratones
transgénicos defectivos para ciertos genes, somos capaces de averiguar
qué funciones desempeñan y las consecuencias tras su pérdida o
sobreexpresión. En este trabajo nos hemos centrado en dos inhibidores
del ciclo celular p53 y p27Kip1 con la intención de comprender la acción que
ejercen en la regulación de los procesos celulares que acontecen en las
células madre adultas, y si su acción es sinérgica, antagónica o
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
35
complementaria sobre vías comunes. La manipulación de estas moléculas
una vez comprendida su función podría permitirnos evitar la
transformación neoplásica o sobreproducir neuronas cuando éstas sean
requeridas por pérdida secundaria a una enfermedad neurológica.
Con todos estos antecedentes nos planteamos analizar:
(1) Los cambios morfológicos y funcionales en la SVZ de ratones
defectivos para el gen p53.
Los cambios morfológicos y funcionales en la SVZ de
ratones defectivos para el gen p27Kip1 ya habían sido
estudiados y han sido descritos en la Introducción.
(2) Papel de la proteína p53 en la mutagénesis y oncogénesis en la
SVZ.
(3) Ratones defectivos p27Kip1-/-/p53-/-. Efectos sobre la regulación de
las células madre adultas en la SVZ y la neurogénesis.
3. MATERIAL Y MÉTODOS
MATERIAL Y MÉTODOS
38
3.1. Animales
Para el estudio morfológico de ratones mutantes p53-/- y su relación con la
tumorigénesis se utilizaron ratones machos adultos de 8 a 12 semanas de la
cepa C57BL/6J. Los animales mutantes defectivos para p53 (p53-/-)
presentaban una mutación del tipo Trp53Tm1Tyj y fueron obtenidos de los
laboratorios Jackson (Jax®Mice, Bar Harbor, ME, Estados Unidos). El
genotipo de las camadas obtenidas a partir de ratones heterozigóticos (p53+/-
) se confirmó mediante extracción de ADN genómico de la cola y mediante
PCR con los siguientes cebadores específicos: 5’-ACA GCG TGG TGG TAC
CTT AT-3’ (ImRo36), 5’-TAT ACT CAG AGC CGG CCT-3’ (ImRo37), y 5’-
TCC TCG TGC TTT ACG GTA TC-3’ (neo), dando lugar a un fragmento de
375 pb correspondiente a los ratones p53+/+ (nativo, wild type, wt) y uno de
525 pb en los p53-/-. Los animales p53flox/flox fueron un obsequio del Dr. Anton
Berns (Netherlands Cancer Institute, Amsterdam, Holanda), y fueron
genotipados usando los siguientes cebadores: 5’-CAC AAA AAC AGG TTA
AAC CCA G-3’ y 5’-AGC ACA TAG GAG GCA GAG AC-3’ obteniéndose una
banda de 370 pb en el caso de p53flox/flox y de 288 pb en los animales wild
type.
Para el estudio de los dobles mutantes se utilizaron ratones machos
adultos de 8-12 semanas de la cepa C57BL/6J. Los animales eran mutantes
defectivos para p53 (p53 -/-) de idéntico origen a los descritos anteriormente,
para p27Kip1 (p27Kip1-/-) y dobles mutantes (p27Kip1-/-/p53-/-). El genotipo de los
animales se confirmó mediante extracción de ADN genómico de la cola y
mediante PCR con los siguientes cebadores específicos: 5’-ACA GCG TGG
TGG TAC CTT AT-3’ (ImRo36), 5’-TAT ACT CAG AGC CGG CCT-3’
(ImRo37), y 5’- TCC TCG TGC TTT ACG GTA TC-3’ (neo), dando lugar a un
fragmento de 375 pb correspondiente a los animales p53+/+ y uno de 525 pb
en los ratones p53-/- y 5'-TGG AAC CCT GTG CCA TCT CTA T-3’ (MgK3),
MATERIAL Y MÉTODOS
39
5'CCT TCT ATG GCC TTC TTG ACG-3' (Neo-1); 5'-GAG CAG ACG CCC
AAG AAG-3' (MgK5) dando lugar a un fragmento de 500 pb correspondiente
a los ratones p27Kip1+/+ y 1000 pb en los mutantes p27Kip1-/-. En el artículo
previamente citado de Doetsch y colaboradores donde se analizaba el efecto
de la pérdida de función del gen p27Kip1 en la SVZ (Doetsch et al., 2002b), se
empleó un modelo animal caracterizado por la delección selectiva del primer
exón del gen, resultando una proteína carente de extremo N-terminal, el
dominio responsable de su actividad inhibidora de CDKs (Kiyokawa and Koff,
1998) . En este trabajo, sin embargo, se utilizaron ratones defectivos de la
totalidad del gen p27Kip1 (Fero et al., 1998). Los procedimientos
experimentales estaban de acuerdo con la directiva europea de protección
de animales de experimentación 86/609/EEC.
3.2. Irradiación del SNC
Una dosis total de 2.21 Gy se utilizó para la irradiación cerebral total con un
acelerador lineal de 6 MV de energía fotónica nominal (Chow et al., 2000).
Ratones anestesiados con una mezcla de xilazina-ketamina fueron
colocados en decúbito prono en una superficie de poliestireno a una
distancia de 99.5 cm de la fuente de radiación. La variación de dosis
estimada dentro del volumen diana fue de ± 5%. Cuatro horas tras la
irradiación, coincidiendo con el pico de apoptosis, los animales fueron
anestesiados y perfundidos como se explica en el apartado 3.4.
3.3. Inyección de N-etil-N-nitrosurea (ENU)
Hembras p53+/- embarazadas fueron inyectadas intraperitonealmente con
ENU (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) (25 mg/kg de peso corporal) como se
describe en (Leonard et al., 2001). La descendencia fue estudiada a las 6-8
MATERIAL Y MÉTODOS
40
semanas de edad, sacrificada y procesada para su estudio anátomo-
patológico y al ME.
3.4. Procesado de las muestras
3.4.1. Técnicas histológicas
Tras anestesiar a los animales con una mezcla de 2:1 ketamina-xilazina (5
l/g de peso corporal, vía intraperitoneal), se perfundió transcardíacamente
con suero salino 0.9% seguido de 100 ml de fijador de Karnovsky
(paraformaldehido (PFA) al 2% y glutaraldehido al 2.5%) en el caso de
realizarse ME o únicamente con PFA al 4% para inmunohistoquímica y
técnica de TUNEL. Los cerebros se extrajeron y se introdujeron en el mismo
fijador durante la noche. Al día siguiente se lavaron en tampón fosfato (PB,
del inglés phosphate buffer) 0.1M pH 7.0 donde se conservaron añadiendo
azida sódica a concentración de 0.05% según el tiempo previsto de
procesado para evitar contaminación fúngica. En su caso, previo a realizar
secciones con criostato se crioprotegieron los cerebros en sacarosa al 30%
durante la noche.
3.4.2. Cultivos celulares
Los animales se sacrificaron por dislocación cervical e inmediatamente
después se extrajeron los cerebros sobre un lecho de tampón Pipes (ver
apartado 3.10: cultivo de neuroesferas) a 4ºC en placas Petri, donde se
llevo a cabo la disección selectiva de la SVZ.
3.5. Procesado de las muestras para microscopía electrónica
Se realizaron secciones de 200 m con vibrátomo (Leica, Heerburgg, Suiza).
Se fijaron en osmio al 2% (Electron Microscopy Science-EMS, Hatfield, PA,
MATERIAL Y MÉTODOS
41
Estados Unidos) y acetato de uranilo al 7% (EMS), y se deshidrataron con
concentraciones crecientes de alcohol para finalmente, tras inmersión en
óxido de propileno (EMS), ser incluidas en resina del tipo araldita (Fluka,
Sigma, St Louis, MO, Estados Unidos). Se obtuvieron secciones de 70-80
nm con ultramicrotomo (Leica) y tras tinción con citrato de plomo se
observaron en un EM JEOL10 (Jeol, Tokio, Japón) en el Servicio de
Microscopía Electrónica de la Universidad de Valencia (SCSCIE).
3.6. Marcaje con timidina tritiada (3H-Thy) y autorradiografía
Se inyectaron intraperitonealmente 50 µl de 3H-Thy de 6,7 mCi (Amersham
Biosciences, GE Healthcare, Waukesha, WI, Estados Unidos) y se sacrificó
a los animales a la hora para la detección de células en fase S del ciclo
celular. Para estudios a mayores tiempos de supervivencia se inyectaron 4
inyecciones de la dosis descrita (separadas 2 h cada una) y se sacrificó el
animal a los 30 días. Se procesó el tejido como previamente se ha descrito
y se obtuvieron cortes semifinos de 1,5 µm de grosor que fueron sumergidos
en emulsión autorradiográfica (NTB2, Kodak, Rochester, NY, Estados
Unidos) durante 4 semanas a 4ºC y reveladas (D-19, Kodak). Una célula se
consideró marcada si presentaba más de 6 granos de plata sobre su núcleo,
y si estaba marcada en tres cortes semifinos consecutivos. Una vez
detectadas, el semifino se retalló con cuchilla de vidrio y se pegó a un bloque
de araldita que se procesó para obtención de secciones ultrafinas (Figura
14).
MATERIAL Y MÉTODOS
42
Figura 14. Estudio de células marcadas con timidina tritiada. El corte semifino
seleccionado se pegó a un bloque de araldita (Superglue®) y se separó del portaobjetos de
vidrio mediante congelación con nitrógeno líquido. Posteriormente se retalló para el corte de
secciones ultrafinas con cuchilla de diamante y se cortaron ultrafinos que permitieron
identificar las células marcadas con 3H-Thy.
MATERIAL Y MÉTODOS
43
3.7. Bromodeoxiuridina
La 5-bromo-2’-deoxiuridina (BrdU, Sigma) es un análogo sintético de timidina
que se utiliza para el marcaje de células en división y su descendencia. Se
inyectó intraperitonealmente (50 µg/g de peso) sacrificando al animal tras
una hora para la detección de células en fase S del ciclo celular
(proliferación) y se inyectó la misma dosis en 4 ocasiones separadas por 2 h,
sacrificando a los 14 días de la última inyección para el estudio de
supervivencia y neurogénesis en BO. Previo a la tinción histológica se
pretrataron los cortes con ácido clorhídrico 0.1 N durante 20 minutos a 37ºC
y consecutivamente con borato sódico 0.1 M (pH 8.0) durante 10 minutos a
temperatura ambiente. Tras esto se realizó el protocolo de
inmunohistoquímica usual.
3.8. Inmunohistoquímica
Secciones de vibrátomo (50 µm) y/o criostato (20 µm), obtenidas tras la
fijación y tras tratar con el suero animal correspondiente para el bloqueo de
uniones inespecíficas fueron incubadas en anticuerpos primarios específicos
(Tabla 4) de los diferentes tipos celulares durante la noche, a 4ºC y en
agitación. En el caso del anticuerpo anti-p53 se procedió al
desenmascaramiento del antígeno con tampón citrato pH 6.1 a altas
temperaturas en olla a presión. Tras lavado del anticuerpo primario se
incubaron las muestras con anticuerpos secundarios fluorescentes (Alexa,
Molecular Probes/Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos) y biotinilados
(Vector, Burlingame, CA, Estados Unidos) visualizándose con microscopio
confocal (FV1000, Olympus, Tokio, Japón) y capturándose las imágenes con
una cámara digital Hamamatsu CCD (Hamamatsu Photonics, Tokio, Japón).
MATERIAL Y MÉTODOS
44
Tabla 4. Anticuerpos primarios
Anticuerpo Huésped Antígeno Dilución Casa comercial, # catalogo
Especificidad
GFAP
Policlonal Conejo
GFAP médu-la espinal vaca
1:2000 Dako (Glostrup, Dinamarca), Z0334
Filamentos intermedios astrocitarios
IIItubulina (Tuj1)
Monoclonal Ratón
Microtúbulos cerebro rata
1:500 Covance (Richmond, CA), MMS-435P
Neuronas jóvenes
Doblecortina (Dcx)
Policlonal Conejo
Péptido recombinante
1:200 Dako, AB2253 C-terminal de Dcx (neuronas inmaduras)
PSA-NCAM Monoclonal Ratón IgM
Meningococo B (cepa 355)
1:1000 AbCys (París), AbC0019
Neuronas migradoras
BrdU
Monoclonal Ratón
BrdU conju-gada a sero- albúmina bo-vina
1:200 Dako, M0744 Marcador exógeno de fase S
BrdU Monoclonal
Rata
BrdU conju-gada a sero- albúmina bo-vina
1:150 Abcam (Cambridge, UK), AB6326
Marcador exógeno de fase S
Anti-p53 Policlonal Conejo
Proteína p53 recombinante raton
1:500 Novocastra, Leica, NCL-p53-CM5p
Células que expresan p53
O4 Monoclonal Ratón
Hibridoma 1:10 Cedido por Dr. Bansal (U.de Farmington, ME)
Oligodendro-citos maduros
p53 (FL-393) Policlonal Conejo
Péptido (1-393 aa) sintético humano
1:500
Santacruz Biotech. (Santa Cruz, CA), SC-6243
Banda de 53 KDa en Western blot
Actina Monoclonal Ratón
Péptido sintético C-terminal
1:1000 Sigma, A4700 Banda de 42 KDa en Western blot
NeuN Monoclonal
Ratón
Núcleos celulares purificados de cerebro de ratón
1:500 Millipore, MAB377
Neuronas
MATERIAL Y MÉTODOS
45
En el caso del anticuerpo primario O4, las células vivas (antes de la fijación)
se expusieron al anticuerpo durante 30 min a 37ºC. Posteriormente se
procedió a la fijación de las mismas y se continuó con el protocolo de
inmunohistoquímica descrito.
3.9. Técnica de TUNEL para estudio de apoptosis
Se obtuvieron secciones con criostato y fueron pretratadas con una mezcla
de etanol 100% y ácido acético (2:1) durante 10 minutos a -20ºC. Tras el
pretratamiento se utilizó el kit de TUNEL Apoptag® Plus Fluorescein In Situ
Detection Kit (# S7111, Millipore, Billerica, MA) siguiendo el protocolo
adjunto con el mismo. La técnica consiste en la adición de nucleótidos
marcados (en este caso con fluoróforos) a los extremos 3’-OH de aquellas
células con ADN fragmentado (en apoptosis).
3.10. Cultivo de neuroesferas
Tras diseccionar la SVZ se mantuvo a 4ºC en tampón Pipes (Pipes 20 mM,
glucosa 25 mM, NaCl 120 mM, KCl 0.5 mM) pH 7.4. Después se disgregó en
trozos pequeños con el bisturí y se digirió con una mezcla de papaína (14
mg de papaína, 2.7 mg de EDTA, 2.7 mg de L-cisteína, 15 mL de tampón
EBSS) durante 30-45 minutos. Tras la digestión se disoció el precipitado con
una pipeta Pasteur y se resuspendió en medio control (DMEM-F12
suplementado con una mezcla hormonal (insulina, apotransferrina, sodio
selenito, progesterona, putrescina), 2mM glutamina, 15 mM HEPES y
antibiótico/antimicótico). Se sembraron del orden de 5000-10000
células/pocillo en placa de 12 pocillos. Para estudios de proliferación y
autorrenovación se utilizó medio completo (medio control, EGF 20 ng/ml,
MATERIAL Y MÉTODOS
46
bFGF 10 ng/ml, seralbúmina bovina (BSA, del inglés bovine serum albumin)
y heparina al 0.2%).
Tras 7 días in vitro (DIV) se efectuaron los recuentos y se realizó un
nuevo pase celular. Se obtuvieron alícuotas que fueron sembradas en
placas-portaobjetos multipocillo de 8 pocillos (chamberslides) pretratadas
con poli-L-lisina en medio de diferenciación (completo sin EGF ni bFGF y en
presencia de suero bovino fetal (FBS, del inglés fetal bovine serum) al 2%).
Para el análisis de proliferación y autorrenovación se utilizaron protocolos de
sembrado y fórmulas distintas. Para proliferación se sembraron 10000
células/ml y para autorrenovación 2000 (baja densidad)-10000 (alta
densidad) células/ml. Las fórmulas utilizadas fueron las siguientes:
a) Tasa de amplificación: Células viables en pase N+1/ Células
viables en pase N*100;
b) Tasa de autorrenovación: Neuroesferas (>3 células) en pase N+1/
células viables en pase N x100;
c) Tasa de autorrenovación clonal: se calculó transfiriendo
neuroesferas únicas a pocillos individuales, disgregándolas en
medio completo con factores de crecimiento y haciendo el
recuento de las neuroesferas generadas a los 5-7 DIV
3.10.1. Limitaciones del cultivo de neuroesferas
El conocimiento progresivo en la biología celular de las células madre ha
resultado en replantearse el concepto de célula madre como fue en su día
establecido por Reynolds y Weiss (Reynolds and Weiss, 1992). Las células
madre no deberían ser definidas en términos de sus propiedades
individuales en un ensayo artificial in vitro que podría alterar sus
características intrínsecas. La propiedad de célula madre o stemness es un
espectro de capacidades y la distinción de célula madre y progenitora no
MATERIAL Y MÉTODOS
47
basta hacerla en cultivo. La naturaleza clonal de una neuroesfera tampoco
puede ser confirmada pues podría tratarse de una agrupación/fusión de
células individuales. Incluso, si de clones se tratara, éstos están constituidos
por una población mixta de células progenitoras y aNSCs, y por tanto, la
stemness de una neuroesfera individual dependería del porcentaje en
aNSCs contenida (Figura 15).
Figura 15. Limitaciones del cultivo de neuroesferas. In vivo, la progresión desde el estado
de aNSC a neuroblasto, ha sido estudiada y aceptada por la comunidad científica. El modelo
in vitro con neuroesferas se ha utilizado como modelo de estudio del comportamiento de las
células madre bajo diferentes circunstancias y también ha sido aceptada su utilización. Sin
embargo hay que ser cautos a la hora de interpretar los datos obtenidos ya que el ensayo in
vitro no representa una población homogénea de células sino una mezcla de diferentes
células con diferente estado madurativo que solo parcialmente se asemejan a aNSCs.
También se ha argumentado que la multipotencialidad que presenta
una neuroesfera sería el resultado de la presencia de diferentes poblaciones
uni-, bi- o tripotenciales en ella (Gabay et al., 2003). Por tanto, las
MATERIAL Y MÉTODOS
48
neuroesferas representarían un estado más avanzado en la determinación
celular que las aNSC bona fide, y por tanto un estado menos plástico. El
cultivo de neuroesferas también ha sido criticado desde el punto de vista
molecular. Estudios en el patrón de expresión genético en las aNSCs
definidas según las propiedades mencionadas, comparado con el de las
células derivadas directamente de la SVZ mostró grandes e importantes
diferencias (Parker et al., 2005).
En conclusión, pese a que en nuestro estudio y en muchos otros de
innumerables grupos científicos, se ha recurrido al cultivo de neuroesferas
para conocer el comportamiento de las aNSCs, está claro que no podemos
despreciar estos puntos y hemos de reconocer que no podemos analizar los
datos obtenidos sin ser conscientes de ello.
3.11. Infección retroviral de neuroesferas
Las neuroesferas tras 7 DIV fueron disociadas mecánicamente e incubadas
con retrovirus MSCV-NRasV12-IRES-GFP (un obsequio del Dr. James
Downing, St Jude’s Children Research Hospital, Memphis, TN) o con MSCV-
IRES-GFP sin vector en presencia de 8 g/ml polibreno. La infección se
realizó a 37oC en constante agitación durante los primeros 30 minutos. Las
células infectadas fueron transferidas a placas de cultivo y se introdujeron en
el incubador durante 2 horas más. Se paró la reacción añadiendo medio
completo fresco a los cultivos. Al día siguiente las células fueron
centrifugadas y sembradas en chamberslides, en medio sin factores de
crecimiento para estudio de la diferenciación.
MATERIAL Y MÉTODOS
49
3.12. Infección con Ad-cre recombinasa de neuroesferas de
ratones p53flox/flox
Tras disociar las neuroesferas primarias, un número equivalente de células
(5 x 104) se resuspendió en medio libre de suero y en presencia de factores
mitógenos y 106 partículas de adenovirus-CMV-Cre (recombinasa cre)
(adquirido de Gene Transfer Vector Core, Universidad de Iowa) con
multiplicidad de infección (m.o.i.) de 35. La infección se llevó a cabo en
células resuspendidas en tubos cónicos de 15 ml (Falcon, BD, Bedford, MA)
durante una hora a 37ºC en el incubador. Después, tras centrifugar, el
sobrenadante conteniendo el virus fue descartado y el precipitado celular fue
resuspendido en medio fresco. Tras 48 h de recuperación, las células fueron
crecidas en medio completo con mitógenos para estudiar la capacidad de
formación de neuroesferas. Se extrajeron alícuotas para el estudio de
diferenciación. Tras fijación, las células fueron procesadas con anticuerpos
contra recombinasa Cre y Tuj1. La eficiencia de transferencia génica fue del
98%±1.8, calculada dividiendo el número de células DAPI+/Cre+ por el total
de células DAPI+.
3.13. Recuentos celulares
3.13.1. Microscopia electrónica
Los diferentes tipos celulares fueron caracterizados según sus
características ultraestructurales (ver Tabla 1.1 en Introducción) y
contabilizados por unidad de área tras estudio tridimensional de secciones
pertenecientes a diferentes niveles (>3 secciones por nivel y animal). Las
células 3H-Thy+ fueron estudiadas en 5-10 secciones semifinas separadas
entre ellas 7.5 m y las medias se expresaron por milímetro. Se estudiaron
longitud y área de los VL en todos los animales, controles y mutantes, y no
MATERIAL Y MÉTODOS
50
se encontraron diferencias significativas en los valores de longitud/área
medias.
3.13.2. Inmunohistoquímica
Las células BrdU+ en la SVZ se contaron en al menos 5-10 secciones por
animal a diferentes niveles del eje rostro-caudal de la SVZ e hipocampo, y se
expresaron por unidad de superficie. Las células BrdU+/NeuN+ en BO se
contaron aplicando el método del disector óptico y se expresaron por unidad
de volumen.
3.13.3. Neuroesferas
Tras la obtención de células procedentes de la SVZ se procedió al recuento
con cámara de Neubauer (tinción de azul tripán 0,4%, Sigma) y al sembrado
de 5000-10000 células/pocillo en el cultivo primario. Tras 5-7 DIV se realizó
el pase celular y se contó sobre pocillo el número de neuroesferas. Tras
disgregación suave y con cámara de Neubauer se contaron las células
viables. En el caso de neuroesferas individuales en estudios de
autorrenovación clonal se procedió de igual forma. Se utilizaron de 3-5
animales por genotipo en cada experimento y pase.
3.14. Extracción de proteínas y Western blot
Tras sacrificar los animales, se extrajeron los cerebros, se lavaron en PB 0.1
M a 4ºC y se diseccionó la SVZ. Inmediatamente después fue homogenizada
en tampón de lisis a 4ºC (Tris-HCl 50 mM pH 7.4 con NaCl 150 mM, triton X-
100 al 1%, deoxicolato sódico al 0.25%, EDTA 1 mM, SDS al 0.1%, PMSF 1
mM, y 5 g/ml de los inhibidores de proteasas aprotinina y leupeptina). Los
lisados fueron sonicados y centrifugados a 14000g durante 15 minutos a
4ºC. La cuantificación de proteínas se realizó con el kit DC (Biorad, Hercules,
CA) con BSA como estándar.
MATERIAL Y MÉTODOS
51
La proteína fue diluida en tampón de muestra (mercaptoetanol 0.5%,
glicerol al 10%, Tris 70 mM pH 6.8, azul bromofenol al 0.025%) y se cargó
en gel de poliacrilamida al 10%. Se corrió a un voltaje de 100V durante 2
horas y se transfirió a membranas de nitrocelulosa (Hybond ECL,
Amersham) que fueron incubadas con anticuerpos primarios y secundarios.
El resultado del inmunoblot se visualizó utilizando el kit ECL plus detection
system (Amersham).
3. 15. Co-inmunoprecipitación
Tras la lisis celular para obtención de proteínas, muestras procedentes de
SVZ de animales control se incubaron con anticuerpo contra p27 (sc-528
(conejo), Santa Cruz Biotech) a una concentración de 1 g por 100 gramos
de proteína total durante la noche a 4ºC. Se añadió proteína A sefarosa
durante una hora a 4ºC y en agitación y posteriormente se realizaron lavados
sucesivos (50 mM Hepes, 150 mM NaCl, 1% NP-40). Tras ello, se procesó
para inmunoblot.
3.16. Extracción de ARN y PCR cuantitativa
Tras disección en fresco de la SVZ (N=3 para cada genotipo: wild type y p53-
/-) se homogeneizaron en Trizol®. El ARN se aisló usando el Kit RNeasy Mini
(Qiagen, Hilden, Germany). 1.5 µg de ARN total fue transcrito de forma
inversa y amplificado con el kit SuperScript® First Strand Synthesis System
for RT-PCR, utilizando como primers hexámeros al azar (cat. 11904-018-
Invitrogen, Carlsbad, CA). Se procedió a amplificarlo de forma logarítmica y
fue cuantificado en una máquina ABI prism usando como mezcla de
reacción, el SYBR green. Los cebadores utilizados fueron: Math3: 5’-ATT
CAG GGC TCG AAG AGT CA-3’ y 5’-TTC CTT TGC CAG TCG AAG AGT-
MATERIAL Y MÉTODOS
52
3’, y para NeuroD: 5’-GCG AGA TCC CCA TAG ACA ACA T-3’ y 5’-CAT
TAA GCT GGG CAC TCA TGA C-3’.
3.17. Estudio de la memoria olfativa
Este apartado fue realizado por M. Spinetta (Seattle University), y aporta
resultados complementarios significativos para esta tesis. Los experimentos
de reconocimiento olfativo se realizaron como se había descrito previamente
(Spinetta et al., 2008). Durante el aprendizaje o habituación, cada ratón se
expuso en su propia caja a 4 esferas de madera (2.5 cm de diámetro), 3 de
las cuales eran familiares (recientemente sacadas de la misma caja y por
tanto impregnadas de olores propios) y una extraída de la caja de otro ratón
(olor nuevo; N-1). Ensayos de 3 minutos se llevaron a cabo para habituación
a N-1. El test de reconocimiento de olor se realizó 24 h más tarde, y se
expuso la esfera con el “olor habituado” (N-1) a la vez que una esfera
impregnada con un nuevo olor, obtenida de otra caja de otro animal (“olor
nuevo”), y otras dos de las esferas familiares. Los animales normales que
tienen intacta la memoria para los olores habituados, se detienen menos
tiempo explorándolos respecto a los nuevos olores modificado de (Magavi et
al., 2005). Alteraciones en dicha memoria conducirían a un tiempo de
exploración estadísticamente igual para los olores nuevos y los habituados o
familiares. Ningún interés en un estímulo particular se traduciría en un 25%
del tiempo de exploración/esfera, y la no exploración no implicaría ningún
déficit específico (aunque esto no se dio en nuestro estudio).
3.18. Análisis estadístico de los resultados
Dos tipos de análisis estadísticos fueron aplicados. Tests no paramétricos (U
de Mann-Whitney) se utilizaron cuando las muestras eran pequeñas o no se
MATERIAL Y MÉTODOS
53
pudo asumir una distribución normal de los datos. El nivel de significación
para rechazar la hipótesis nula se fijo en =0,05. Se utilizó para análisis de
los recuentos de células marcadas con 3H-Thy y BrdU, para recuento de
células marcadas en cultivo con marcadores específicos (GFAP, Tuj1, O4), o
en el caso del análisis de apoptosis.
En el resto de ensayos, en que se pudo asumir la normalidad de la
muestra y homogeneidad de varianza (gráfico de cajas, Levene’s test), los
datos se analizaron estadísticamente utilizando tests paramétricos como
ANOVA (con test Dunnet de comparación múltiple) al comparar más de dos
grupos o test de t de Student para pares de muestras independientes siendo
significativos valores de p<0,05.
Los experimentos de comportamiento se analizaron con test de t Student
sobre las puntuaciones diferenciales (puntuación media para nuevos olores
relativa a olores familiares), comparada con los ratones wild type. Los
resultados se consideraron estadísticamente significativos cuando p<0.05.
Los experimentos de qPCR se realizaron por triplicado para cada
genotipo y set de primers (cebadores), además de realizarse en 3 ocasiones
distintas y se analizaron, tras comprobar la homogeneidad de varianzas
(Levene’s test), con la prueba t de Student.
4. RESULTADOS
RESULTADOS
56
4.1. CAMBIOS MORFOLOGICOS Y FUNCIONALES EN LA SVZ
DE RATONES DEFECTIVOS PARA EL GEN p53
4.1.1. p53 se expresa en la SVZ
Antes de evaluar si un gen ejerce una función en una determinada región del
organismo hay que conocer si es expresado de forma específica por las
células que integran dicha región. El hecho de que el gen supresor de
tumores, p53 se expresara en la SVZ embrionaria y adulta (van Lookeren
Campagne and Gill, 1998) indicaba que podría ejercer un papel importante
en la biología de la SVZ. Mediante inmunohistoquímica, Western blot y
estudio de expresión por RT-PCR, comprobamos que en condiciones
fisiológicas, los niveles de p53 (proteína) detectados en la SVZ adulta de
ratón eran muy bajos (Figura 16), pero tras radiación holocraneal, esta
expresión aumentaba considerablemente, sobre todo en la SVZ y el RMS.
Figura 16. Expresión de p53 en la SVZ. A) RT-PCR (arriba) para la detección de ARN
mensajero de p53 en la SVZ adulta de ratón. Western blot (abajo) para la detección de
proteína p53 en extractos de proteína de SVZ. Resaltar la banda débil detectada en
comparación con las células HeLa. La actina se utilizó como control de carga. B) Detalle del
VL en ratones wild type irradiados (irrad) y no irradiados (not irrad). La detección con
anticuerpos anti-p53 solo fue posible en los ratones irradiados (flecha). Escala: 10 m.
RESULTADOS
57
Paralelamente al aumento de expresión de p53, existía un aumento
del número de núcleos picnóticos con tinción de Nissl en la región de la SVZ
y en el RMS, máximo a las 4 h de la irradiación. Aunque por la técnica nos
fue difícil identificar los tipos celulares que expresaban p53, la comparación
con otros marcadores de la SVZ y RMS, nos sugirió que pudiera tratarse de
poblaciones celulares en proliferación y migración. La capa ependimaria no
mostró marcaje, ni tampoco se observó en la región de los ganglios basales.
4.1.2. La pérdida del gen p53 produce cambios poblacionales y
ultraestructurales en la SVZ con hiperplasia celular selectiva
Una vez demostrado que p53 se expresaba en la SVZ, aunque sus niveles
eran bajos, y considerando que pudiera tener un rol en la neurogénesis
decidimos estudiar el efecto de la pérdida de función de p53 en la biología
de las células madre. Para ello utilizamos ratones mutantes p53-/- y
estudiamos dicha región al MO, mediante inmunohistoquímica y ME,
comparándola con la SVZ de ratones p53+/+. El mutante p53 utilizado,
Trp53Tm1, había sido caracterizado morfológicamente (Donehower et al.,
1992). El desarrollo embrionario no se veía afectado en estos animales pero
los ratones homocigóticos desarrollaban tumores espontáneos (fuera del
SNC) a partir de los 6 meses. No se observaron tumores cerebrales en
ratones de 6-8 semanas.
En nuestro estudio confirmamos la ausencia de alteraciones
macroscópicas ni tumores en la región de los VL, SVZ o BO de ratones
mutantes. Sin embargo, la ausencia de p53 resultó en cambios detectables
al MO, observándose un aumento de grosor en la SVZ, de distribución
heterogénea (Figura 17) de forma que los ratones p53-/- alternaban áreas de
densidad celular comparable a los animales p53+/+ con regiones de
hiperplasia. Esto se traducía en un aumento absoluto de la celularidad por
unidad de superficie de SVZ (p53-/- (n=5): 343.47 ± 13.26 células/mm2 vs.
RESULTADOS
58
p53+/+ (n=5): 255.24 ± 5.63 células/mm2). Estos cambios no se observaron
en otras regiones próximas al VL como el septum o el estriado.
Figura 17. Micrografía de secciones semifinas de ratones mutantes y controles.
Obsérvese la diferencia en densidad celular en algunas regiones en los ratones p53-/-
Escala:
10 m.
Como hemos comentado con anterioridad, la SVZ está compuesta
por distintas subpoblaciones celulares, por lo que era un punto a resolver el
saber si ese efecto de aumento de celularidad ocurría de forma generalizada
sobre todos los tipos celulares o sobre poblaciones específicas. Para ello
empleamos el ME, y recurrimos a los criterios ultraestructurales establecidos
y descritos (ver texto y Tabla 1 en Introducción). La cuantificación celular a
lo largo de los ventrículos (Figura 18) mostró un aumento significativo de las
células tipo A (91.48 ± 7.95 células/mm2, p<0.01) y tipo B (94.2 ± 9.6
células/mm2, p<0.05) en los ratones p53-/- (n=5), comparada con los ratones
wild type (Tipo A= 65 ± 3 células/mm2, Tipo B=70.8 ± 7.8 células/mm2; n=5).
Por contra, el número de células ependimarias tapizando los VL (células tipo
E) y precursores de amplificación (células tipo C) permanecía relativamente
constante (Tipo E: p53+/+: 57 ± 7.6 células/mm2y p53-/-: 65 ± 7.34
células/mm2 ; Tipo C: p53-/- : 34.35 ± 7.96 células/mm2; p53+/+: 30.17 ± 0.83
RESULTADOS
59
células/mm2). En general observamos un aumento de las células B
contactando el ventrículo, una característica de las células quiescentes al
activarse la progresión hacia célula tipo C. Sin embargo, la cantidad en
absoluto de estas células era tan baja en condiciones normales y en
mutantes que no pudimos someter los datos a análisis estadístico.
Los porcentajes de los distintos tipos celulares respecto a los ratones
wild type se mantuvieron relativamente constantes con lo que la
citoarquitectura de la SVZ no se vio muy alterada, exceptuando las
ocasionales zonas hiperplásicas que resultaron ser agrupaciones de células
tipo A. El exceso de células A se detectó en toda la longitud de los VL, pero
fundamentalmente en la esquina antero-lateral, mientras que las células B se
distribuían de forma más homogénea en el borde inferior de la SVZ.
Figura 18. Recuento de los tipos celulares tras pérdida de función del gen p53. Se
observaron diferencias significativas en las poblaciones de células tipo A y B que eran
mayores (por unidad de área en los animales p53-/-
(barras grises) que en los p53+/+
(barras
negras). *p<0.05; **p<0.01.
La distribución de estas áreas de hiperplasia fue confirmada
mediante reconstrucción celular con cámara lúcida (Figura 19).
RESULTADOS
60
Figura 19. Distribución heterogénea de la celularidad en la SVZ de ratones p53-/-
. Se
realizaron dos diagramas de colores a partir de secciones semifinas de la SVZ de p53+/+
y
p53-/-
. Cada tipo celular, tras identificación al ME, aparece representado según un código de
colores ampliamente utilizado (azul: células tipo B, rojo: neuroblastos, verde: células tipo C).
En ellos se observa claramente la distribución en regiones de hiperplasia de las células
migradoras (rojo), sobre todo en las regiones de salida de la SVZ hacia el RMS. Se observó
variabilidad en la longitud de la SVZ, pero la medida sistemática de la longitud de VL (v) en
p53-/-
(1.5 mm ± 0.03, n=6) y p53+/+
(1.63 mm ± 0.15, n=6) no mostró diferencias significativas
entre grupos. Escala 25 m.
RESULTADOS
61
Con inmunohistoquímica específica para las células tipo A (PSA-
NCAM) se objetivó la misma tendencia a un aumento de marcaje
regionalizado. Las células PSA-NCAM+ formaban numerosas agrupaciones
de 6-15 células (como se había observado previamente al ME) frente a
agrupaciones de 3-5 células observadas en ratones nativos (Figura 20).
Figura 20. Agrupaciones de células tipo A en ratones mutantes (flecha). Se localizaban
fundamentalmente en las astas dorsal y rostral de los VL. Escala: 100 m.
4.1.3. La proliferación celular y autorrenovación en la SVZ tras la
pérdida del gen p53 se encuentran aumentadas
El número de células pertenecientes a cada subtipo celular en la SVZ
dependería de un equilibrio entre el nacimiento de nuevas células y la
muerte celular programada, así como de la progresión del linaje celular.
Al observar un incremento en el número total de células y en unos
subtipos celulares específicos, y sabiendo que p53 es proteína reguladora
del ciclo celular, estudiamos el efecto de su ausencia en la tasa proliferativa
de los progenitores de la SVZ. La proliferación de células de la SVZ in vivo
se analizó contabilizando el número de células en fase S (células BrdU+ o
3H-Thy+) en animales sacrificados una hora tras inyección del marcador. El
número de células BrdU+ por unidad de superficie en niveles anteriores de la
RESULTADOS
62
SVZ de ratones p53-/- (127 ± 3.66 células/mm2; n=3) fue 62% más que en
regiones equivalentes de la SVZ de ratones wild type (77 ± 1 células/mm2;
n=3), y representaba un incremento estadísticamente significativo (=0.05)
(Figura 21).
Figura 21. Incorporación de BrdU para detección in vivo de células en fase S. Se inyectó
BrdU una hora antes de perfundir a los animales. A) Tras procesado, se realizó
inmunohistoquímica con anticuerpos anti-BrdU (verde). Escala: 120 m. B) El recuento celular
representado en diagrama de barras muestra un aumento significativo de las células en fase
S en los animales p53-/- (=0.05).
El número total de células 3H-Thy+ fue contabilizado en cortes
semifinos tras autorradiografía (Figura 22) confirmándose los datos previos
que conferían ventaja proliferativa a la SVZ de los ratones con pérdida de
gen p53 (20.64 ± 0.39 células/mm2, n=3) comparados con animales wild type
(12.92 ± 1.68 células/mm2; n=3; =0.05). También se realizó el recuento de
* *
RESULTADOS
63
células en fase M del ciclo celular (mitosis) en cortes semifinos, y lo que se
observó fue un aumento del número de células en mitosis (p53+/+: 0.84 ±
0.11 mitosis/mm, n=3; p53-/-: 1.5 ± 0.22 mitosis/mm, n=3, aunque
estadísticamente no se pudo demostrar significación.
Figura 22. Incorporación de 3H-Thy para detección in vivo de células en fase S. Se
inyectó 3H-Thy una hora antes de perfundir a los animales. A) Tras procesado, se realizó
autorradiografía y se considero 3H-Thy+ una célula si presentaba más de 6 granos de plata
sobre su núcleo a lo largo de al menos tres secciones consecutivas (flecha). Escala: 10 m.
B) El recuento celular representado en diagrama de barras muestra un aumento significativo
de las células en fase S en los animales p53-/- (=0.05).
Sabiendo que una de las propiedades de las aNSCs es la capacidad
de autorrenovación, nos preguntamos si el aumento del número de células B
en los ratones p53-/- se correspondía a un aumento de esta capacidad. Para
*
RESULTADOS
64
estudiar autorrenovación se ha estado utilizando el cultivo de células
derivadas de la SVZ según descrito por Reynolds y Weiss y otros autores
(Morshead et al., 1994; Reynolds and Rietze, 2005).
Se aislaron células de la SVZ de ratones defectivos para p53 y sus
respectivos controles, y se sembraron a altas (10000/cm2) y bajas
(2000/cm2) densidades en medio con factores de crecimiento (EGF y bFGF)
durante 7 días tras los cuales se realizaba un pase celular para renovación
del medio y los factores de crecimiento. Tras cada pase se estudió el
número de neuroesferas y tras disgregarlas, el número total de células
generadas (Figura 23).
Figura 23. La proliferación y autorrenovación in vitro están aumentadas en las células
derivadas de ratones p53-/-
. A) Imagen de campo claro de neuroesferas de ambos
genotipos. Las neuroesferas de ratón p53-/-
son de mayor tamaño como se observa en la
micrografía. Escala: 500 m. B) La capacidad de autorrenovación está aumentada en
neuroesferas de ratones p53-/-
pero es solo evidente en cultivos de baja densidad o clonales.
RESULTADOS
65
C) La tasa de amplificación también se encuentra significativamente aumentada en el
genotipo mutante (* p<0.05; *** p<0.001).
El efecto de la pérdida de p53 sobre la autorrenovación se vio que
era dependiente de la densidad celular. A altas densidades, el número de
neuroesferas obtenidas a los 7 DIV era similar entre ambos grupos, mientras
que a bajas densidades los cultivos de SVZ p53-/- tenían 70% más
neuroesferas que los p53+/+ (tasa de autorrenovación p53+/+: 3 ± 0.4
neuroesferas (pase N+1)/neuroesfera (pase N)x100 y p53-/-: 5.8 ± 0.09). Al
realizar el recuento del número de neuroesferas derivadas de una sola,
también se observaba un aumento de la capacidad de autorrenovación
(p53+/+: 8.68 ± 0.2 neuroesferas/pocillo y p53-/-: 13.96 ± 0.11
neuroesferas/pocillo, p>0.05).
Aparte del número de neuroesferas, se observó de forma consistente
en los animales mutantes un aumento del diámetro de las mismas. Esto era
debido al aumento de la tasa de amplificación, es decir el número de células
viables tras 7 DIV respecto a las previamente sembradas. En los ratones que
carecían de función p53, la tasa de amplificación fue 1,59 veces mayor
(9.025 ± 0.13 veces amplificada la población celular sembrada) que en las
neuroesferas procedentes de SVZ wild type (5.69 ± 0.05 veces amplificada
la población celular sembrada). Ambos aumentos en autorrenovación y
amplificación, así como el aumento del número de células en la SVZ in vivo,
también podían explicarse en caso de que hubiera una disminución en la
muerte celular.
4.1.4. La apoptosis espontánea aumenta en ratones p53-/-
El papel del gen p53 en la apoptosis ha sido bien estudiado y establecido
(Miyashita and Reed, 1995). Tras un estímulo dañino para el ADN, p53 se
activa y actúa reprimiendo o activando genes que desencadenan la muerte
celular programada. Ya que habíamos constatado el aumento de varias
RESULTADOS
66
subpoblaciones celulares de la SVZ, queríamos descartar o confirmar si
además de un aumento en la proliferación celular había una disminución de
las células que sufrían apoptosis espontánea.
Realizamos la técnica de TUNEL que marcaba el ADN expuesto
(radicales 3’-OH) presente únicamente en las células en proceso de
apoptosis. In vivo el número de células TUNEL+ en animales p53+/+ tanto en
valores por mm como ajustado por total de células (3.06 ± 0.56
TUNEL+/mm; 1.2% ± 0.22 TUNEL+/total células) no mostró diferencias
significativas con la SVZ p53-/- (3.86 ± 0.11 TUNEL+/mm; 1.12 % ± 0.032
TUNEL+/total células). En los animales mutantes las células TUNEL+ se
concentraban en regiones de alta celularidad (Figura 24). Sin embargo, el
análisis in vitro de las células TUNEL+ tras 7 DIV mostró diferencias hacia un
aumento de la apoptosis en animales p53-/- que fueron significativas (=0.05)
(wild type: 1.2 ± 0.6% TUNEL+/DAPI+; p53-/-: 5 ± 0.7% TUNEL+/DAPI+).
Figura 24. Apoptosis espontánea en ratones p53-/-
. A) TUNEL in vivo. La apoptosis en
ratones p53-/-
se concentraba en las regiones con hiperplasia celular observadas en la SVZ
(verde). Escala: 25 m. B) In vitro las células TUNEL+ (verde) estaban aumentadas y
concentradas en regiones de alta densidad celular (azul-DAPI) y el aumento resultó
RESULTADOS
67
significativo. Los núcleos picnóticos están señalados por flechas. Escala: 50 m.
Lo que concluimos a partir de nuestros datos fue que la apoptosis
celular espontánea, podía estar ligeramente aumentada tras la pérdida de
p53, asociada probablemente a zonas de mayor celularidad, pero en ningún
caso disminuida. Por tanto, no justificaría el aumento observado de las
poblaciones celulares de la SVZ.
4.1.5. Aumento de la diferenciación in vitro en células procedentes de la
SVZ de ratones p53-/-
Otra posibilidad que explicaría el aumento del número de células en la SVZ,
sería, el enlentecimiento o detención de la diferenciación neuronal. Teniendo
en cuenta que la ausencia de p53 es común a muchos tipos de tumores, es
una explicación plausible. Sin embargo, no habíamos observado tumores en
nuestros animales. Además, experimentos de diferenciación in vitro
realizados a partir de las neuroesferas procedentes de ambos genotipos
mostraban cómo las neuroesferas espontáneamente y en ausencia de
factores de crecimiento se diferenciaban en neuronas y células gliales.
En ratones p53+/+, el 82.13% de las células ± 10.29 fueron GFAP+
(astrocitos), 3.22% ± 1.28 eran Tuj1+ (neuronas inmaduras) y 2.66 % ± 0.42
eran O4+ (oligodendrocitos jóvenes). Por contra, en los mutantes p53-/- , el
60.39% de las células ± 7.64 eran GFAP+, 35.85% ± 6.61 eran TuJ1+ y el
5.63% ±1.51 eran O4+ (Figura 25). Estos resultados mostraban un aumento
significativo en el número de neuroblastos (11 veces, =0.05) y
oligodendrocitos (del doble, =0.05) generados a partir de neuroesferas de
p53-/- in vitro, consistente con los resultados in vivo.
Pero,…¿qué destino tenía el superávit neuronal presente en el ratón
p53-/-? Podía ser que todas las células en exceso murieran antes de llegar al
RESULTADOS
68
BO, sin embargo la magnitud de la apoptosis celular, como habíamos
constatado, no explicaba la muerte de todas las nuevas neuronas.
Figura 25. Diferenciación celular en ratones defectivos para p53. El número de
neuroblastos (Tuj1+) y oligodendrocitos (O4+) aumentaba significativamente en ratones p53-/-.
Era posible observar como los neuroblastos estaban distribuidos de forma heterogénea en el
pocillo formando agrupaciones. Escala: 180 m.
Podían quedarse en la SVZ indiferenciadas, lo que también
descartaba nuestros datos, o, por el contrario, podían migrar al BO donde
quedaba por determinar si se diferenciaban terminalmente. De todas las
células presentes en la SVZ, las células tipo B son relativamente
quiescentes, mientras que las células tipo C se dividen rápidamente y
originan las células tipo A que también se dividen y migran. Por ello, los tres
RESULTADOS
69
tipos celulares incorporan marcadores exógenos del ciclo celular como BrdU.
Para descartar si las células en fase S de todos estos tipos migraban o eran
retenidas en la SVZ, hicimos un pulso de BrdU, y estudiamos la SVZ a las 2-
4 semanas del mismo. En ambos genotipos observamos que sólo las células
tipo B retenían el marcaje. El hecho de que además se mantuvieran intactas
las proporciones entre las distintas subpoblaciones y la citoarquitectura, era
indicativo de que debía existir una correcta progresión del linaje celular y
migración hacia órganos diana.
Para confirmar este hecho y estudiar la migración y la diferenciación
terminal de las células procedentes de la SVZ hicimos un ensayo con 3H-Thy
en el que tras 4 inyecciones repetidas cada 4 horas, y tras un mes desde la
última inyección se sacrificaba al animal (Figura 26). Se pretendía con este
protocolo detectar en el BO los neuroblastos que habían llegado a través del
RMS y se habían incorporado como neuronas granulares.
Figura 26. Neurogénesis en el bulbo olfatorio de animales p53-/-
. Se encontraron
diferencias en el número de células 3H-Thy+ al mes de la última administración de timidina
* *
RESULTADOS
70
marcada para el estudio de migración y diferenciación terminal. Había una mayor
incorporación de 3H-Thy en neuronas granulares de ratones p53
-/-, y la distribución de las
mismas era normal, siendo más abundante a la salida del RMS (flecha) (* p<0.05).
La extensión de la zona ocupada por células granulares (por unidad
de área) no era diferente en animales p53+/+ (1,19 ± 0.02 mm2) respecto de
los p53-/- (1,09 ± 0.11 mm2), sin embargo el número de células granulares
3H-Thy+, mostró un aumento de 1,66 veces en ausencia de función del gen
p53 con 16.55 ± 2.07 células granulares-3H-Thy+/mm2 en el BO wild type y
26.59 ± 2.25 células granulares 3H-Thy+/mm2 en el BO mutante (p<0,05).
Estudios adicionales con pulsos de 1 h de marcador exógeno no mostraron
diferencias significativas entre genotipos, descartándose que estas células
correspondieran a células madre residentes en BO.
4.1.6. El efecto de la pérdida de función de p53 en el desarrollo
embrionario no es secundario a mecanismos de compensación
Por último, para testar si los efectos de la pérdida de función de p53 eran
directos o consecuencia de un mecanismo de compensación durante el
desarrollo embrionario, repetimos los experimentos con células aisladas de
la SVZ de animales p53flox/flox (Marino et al., 2000). La escisión de p53 la
conseguimos infectando los cultivos de neuroesferas de los animales
p53flox/flox con adenovirus cuyo vector expresaba la recombinasa Cre (Figura
27). Los ratones p53+/+ también fueron infectados para tener un control.
Tras 2 días de recuperación se fijaron las células y mediante
inmunocitoquímica para GFP se estudió la eficiencia de la infección que se
estimó en 98% ± 1.8. Los controles p53+/+ infectados con Cre se
comportaban como animales p53+/+ no infectados, generándose un número
de neuroesferas similar en ambos grupos. También observamos un
incremento, predicho, en el número de neuroesferas generadas
(autorrenovación) a partir de animales p53flox/flox infectados con Cre
RESULTADOS
71
comparado con los controles. Como la pérdida de función también
aumentaba la tasa de amplificación en p53-/- respecto a animales wild type,
también testamos esta propiedad en los ratones p53flox/flox.
Figura 27. Inhibición somática de p53 en ratones p53flox/flox
tras infección con
adenovirus-cre. A) Estructura del gen p53flox
. B) Ensayo in vitro de amplificación y
autorrenovación a partir de células de la SVZ. Tras la infección por adenovirus-cre
recombinasa, las células se comportaron de forma similar al mutante p53-/-
. C) Los ratones
p53flox/flox
infectados también presentaban mayor grado de diferenciación hacia el linaje
neuronal (Tuj1 en rojo; cre en verde; DAPI en azul), como los animales p53-/-
. Escala: 75 m
Los resultados fueron remarcablemente similares a aquellos
descritos para los cultivos de mutantes p53-/-. Igualmente ocurrió con la
capacidad aumentada para desviar la diferenciación de las neuroesferas
RESULTADOS
72
hacia el fenotipo neuronal. De este modo, concluimos que el efecto de la
pérdida del gen p53 en la autorrenovación, proliferación y diferenciación, era
resultado directo de la pérdida de función de p53 en las células de SVZ
adultas, en vez de a un mecanismo compensador durante el desarrollo
embrionario.
RESULTADOS
73
4.2. MUTAGÉNESIS Y ONCOGÉNESIS EN LA SVZ DE RATONES
DEFECTIVOS PARA EL GEN p53
4.2.1. La administración prenatal de N-etil-N-nitrosourea (ENU) en
ratones p53-/- origina tumores periventriculares en progenie adulta
Una vez determinado el efecto que ejercía la pérdida de función de p53 en la
biología de las células madre, caracterizado por un aumento de la
proliferación y autorrenovación de los progenitores neurales preservando la
capacidad de diferenciación, quisimos saber el efecto del daño en el ADN
sobre estas células que presentaban de base una ventaja proliferativa.
Trabajos previos mostraban que la exposición prenatal al compuesto
nitrogenado con propiedades mutagénicas N-etil-N-nitrosurea (ENU) y la
ausencia concomitante de la proteína p53 originaba tumores de
características semejantes al glioblastoma multiforme (GBM) (Leonard et al.,
2001; Oda et al., 1997). Por ello, administramos ENU prenatalmente y
analizamos la progenie en la edad adulta. En nuestra serie de animales y
tras la administración prenatal de ENU, en el 60% de los animales p53-/- se
desarrollaron tumoraciones cerebrales respecto al 0% en animales wild type
expuestos (Figura 28). Estos tumores se localizaban típicamente en
regiones periventriculares, en la frontera entre SVZ y cuerpo calloso o entre
SVZ y ganglios basales. Las masas tumorales eran a menudo esféricas, no
capsuladas con claros signos de infiltración parenquimatosa. La
neovascularización era frecuente en todos los neoplasmas estudiados y se
asociaba a microhemorragias y zonas necróticas en el centro tumoral. Estas
características histológicas eran indistinguibles de las previamente descritas
para los tumores gliales de alto grado como el GBM humano. En secciones
semifinas obtenidas de dichos tumores se podían observar numerosas
mitosis y células atípicas gigantes e invaginadas.
RESULTADOS
74
Figura 28. Características histológicas del tumor originado en ratones p53-/-
tras
administración de ENU. A) Micrografía de una sección sagital del cerebro teñida con
hematoxilina-eosina (H-E) donde se observa una gran masa tumoral (T) de localización
periventricular. Escala: 500 m. B) Sección semifina teñida con azul de toluidina que muestra
la masa tumoral (óvalo) invadiendo el cuerpo calloso y desplazando la mielina. Escala: 75 m.
C) El núcleo del tumor a grandes aumentos presenta zonas extensas de necrosis y
hemorragias focales típicas del glioblastoma. Escala: 50 m. D) Células pleomórficas y
anaplásicas con citoplasmas oscuros, núcleos grandes e invaginados, cromatina en grumos y
nucléolos gigantes. Escala: 10 m. E) El análisis inmunohistoquímico de la masa tumoral
mostró especificidad para GFAP (rojo) y nestina (verde). Escala: 200 m. F) Incorporación de
3H-Thy en el tumor tras 1 hora post-inyección. Las células marcadas se concentran en la
periferia del tumor. Escala: 10 m. G) Detalle a ME de una célula tumoral (izquierda)
contactando con un astrocito no tumoral (derecha). El citosol tumoral es más denso a los
electrones, y no se observan filamentos intermedios (rectángulo). Presenta vacuolas
mitocondriales (flechas negras) en comparación con las células no atípicas (flechas blancas),
aparato de Golgi de mayor tamaño (asterisco negro) comparado con el astrocito (asterisco
blanco) y abundante retículo endoplasmático dilatado (punta de flecha). Escala: 200 nm.
RESULTADOS
75
Inmunohistoquímicamente el tumor era heterogéneo con células
GFAP+ distribuidas de forma aislada alternando con células nestina+, siendo
la nestina un marcador de células inmaduras, células madre y progenitores
multipotenciales, e indicando que los tumores formados eran altamente
indiferenciados. En animales inyectados con 3H-Thy (sacrificados tras una
hora) las células en proliferación se observaban en el interior de la masa
tumoral pero sobre todo en la periferia. Ultraestructuralmente las células
tumorales poseían un citoplasma electrondenso, sin filamentos intermedios
ni microtúbulos, con un retículo endoplasmático dilatado, aparato de Golgi
aumentado de tamaño y mitocondrias con vacuolas o vesículas en su
interior, no presentes en las células no tumorales.
4.2.2. Reclutamiento de aNSCs hacia el compartimento proliferativo en
la SVZ tras administración de ENU
Para identificar los cambios ocurridos en la dinámica celular de la SVZ que
potencialmente podrían predisponer a la formación tumoral, se estudió la
SVZ en secciones semifinas de ratones p53-/- tratados con ENU tras la
incorporación de 3H-Thy y tiempos cortos de supervivencia (1 hora). Así,
detectamos las células marcadas al EM y las cuantificamos en relación con
el total de celulas de cada subpoblación (proporción relativa).
La proporción relativa de células B 3H-Thy+ en la SVZ aumentaba en
los animales p53-/- tratados con ENU comparando con los p53-/- no tratados,
mientras que la proporción relativa de células tipo A y C en fase S estaba
disminuida en aquéllos (Figura 29). Esto sugería el reclutamiento de las
celulas tipo B, de normal quiescentes, hacia el compartimento de alta
proliferación. Además, parecía asociarse un fallo en el proceso de
diferenciación habitual en la SVZ, ya que se detectaba un mayor número de
células con características ultrastructurales de transición entre el estado B y
C, y menos neuroblastos.
RESULTADOS
76
Figura 29. La exposición prenatal a ENU produce un reclutamiento de las células B en
los mutantes defectivos de p53 hacia el compartimento de alta tasa de proliferación. A)
Porcentajes celulares tras identificación al ME. Se produce un aumento de las células
pertenecientes a los fenotipos, B, C y sobre todo B-C (de características intermedias). B)
Micrografía de microscopía electrónica de transmisión donde se observan células de aspecto
intermedio B-C (asteriscos), aumentadas en número en los ratones p53-/-
tratados con ENU,
escala: 2 m.
Todos estos datos indicaban que la transformación neoplásica de las
células de SVZ en ratones p53-/- adultos tras exposición prenatal a ENU
estaba precedida de cambios importantes en la dinámica de las poblaciones
que componen la SVZ, incluyendo la hiperproliferación de aNSCs (células
tipo B) y la acumulación de células indiferenciadas con características
intermedias entre células tipo B y C, incapaces de progresar hacia el linaje
neuronal o glial maduros.
4.2.3. Caracterización in vitro de la SVZ tras administración de ENU
Para verificar la naturaleza celular autónoma de estos efectos y definir los
cambios que conducían a la transformación tumoral, aislamos células de la
SVZ de animales p53-/- tratados con ENU, y de animales p53+/- y
comparamos su comportamiento in vitro.
RESULTADOS
77
Una posibilidad era que el tratamiento con ENU modificara la
capacidad de autorrenovación de estas células. Evaluamos la capacidad de
autorrenovación con selección clonal celular (es decir, la habilidad de cada
neuroesfera de generar agregados clonales). La capacidad de
autorrenovación se agotaba rápidamente tras tres pases de neuroesferas
procedentes de animales p53+/- tratados y de animales p53-/- y p53+/- no
tratados, indicando que las células de la SVZ que formaban estos cultivos
eran con alta probabilidad progenitores de proliferación, pero no células
madre (Figura 30).
Figura 30. Comportamiento in vitro de células de la SVZ tras tratamiento con ENU. A)
Autorrenovación clonal tras tratamiento con ENU, muestra un efecto dependiente del
haplotipo, y del número de pases celulares, observándose importante aumento de la misma
en neuroesferas terciarias, solo en animales defectivos para las dos copias de p53. B) Gran
tamaño de neuroesferas tratadas con ENU respecto a las no tratadas. Escala: 1 mm.
p53-/- ENU p53-/-
p53-/- ENU p53-/- p53+/- ENU p53+/-
secundarias terciarias
RESULTADOS
78
En contraste, las neuroesferas procedentes de animales mutantes
defectivos para p53-/- expuestos a ENU retenían la habilidad de
autorrenovarse incluso tras 3 pases, aparte de caracterizarse por la
formación de neuroesferas de gran tamaño. De este modo, la ventaja
proliferativa que confería la pérdida de p53, asociada al aumento de la
capacidad de autorrenovación inducida por la exposición a ENU,
modificaban las propiedades de las aNSCs, haciéndolas más proclives a
desarrollar tumores gliales de alto grado.
Una explicación alternativa de la abundante presencia de células
inmaduras in vivo en animales p53-/- tratados con ENU era que éste
modificara la habilidad de los progenitores multipotenciales de la SVZ de
diferenciarse hacia los diferentes linajes neurales. Lo que hicimos fue
estudiar la diferenciación de las neuroesferas de ratones tratados o no con
ENU mediante el uso de marcadores inmunohistoquímicos de diferenciación
como TuJ1, GFAP, O4 y nestina (Figura 31). La diferenciación ocurría
normalmente en cultivos de animales p53+/- tratados con ENU y animales no
tratados, de acuerdo con la ausencia de generación de tumores
espontáneos. Sin embargo, las células aisladas de animales p53-/- tratados
no se diferenciaban a los diferentes linajes y retenían características típicas
de células inmaduras, incluyendo morfologías simples e inmunorreactividad
para nestina. Algunas células eran tanto nestina+ como GFAP+ y mostraban
tendencia a crecer como agregados celulares. Otras células eran nestina- y
GFAP+, pero con largas y voluminosas expansiones a diferencia de la típica
morfología astrocitaria.
4.2.3. La oncogénesis con Ras en ratones p53-/- se asemeja al “second-
hit” producido con ENU
Estos cambios en las propiedades antigénicas y morfología celular se
asemejaban a aquellos detectados en las masas tumorales in vivo. Para
RESULTADOS
79
confirmar la predisposición que las células p53-/- tenían para formar tumores
transfectamos con Ras, un oncogen que asociado al déficit de p53 generaba
tumores (von Deimling et al., 1992). Mientras la infección con el vector viral
por sí sola no alteraba las propiedades de las células procedentes de p53-/-
(Figura 32), la sobreexpresión de formas constitutivamente activas de Ras
producía un fenotipo transformado de estas células caracterizado por la
persistencia de inmunorreactividad a nestina, crecimiento de agregados
celulares y morfología inmadura con voluminosas expansiones celulares y
pequeños somas, de igual manera que lo observado en ratones mutantes
expuestos a ENU.
Figura 31. Las células derivadas de SVZ de ratones p53-/- tratados con ENU tienen la
diferenciación y las propiedades de adherencia al sustrato comprometidas. A y C) p53-/-
;
B y D) p53-/- tratados con ENU (nestina en verde; GFAP en rojo; DAPI en azul marcando
núcleos celulares). Se observan grandes agregados celulares de células nestina+ (inmaduras)
y células GFAP+ morfológicamente atípicas comparadas con animales no tratados. Escala: 75
m.
ENU p53-/- p53-/-
RESULTADOS
80
Figura 32. Efecto del tratamiento con ENU y la transformación oncogénica de las
células de SVZ con oncogen Ras. A y C) Vector no oncogénico; B y D) Oncogen ras-V12
(nestina en verde; GFAP en rojo; DAPI en azul marcando núcleos celulares). Tras
transformación tumoral de las aNSCs, se observa similar tendencia a formar agregados de
células inmaduras nestina+ y, de las células GFAP+ a adoptar morfología aberrante en
ratones p53-/- que expresan de forma constitutiva el oncogen Ras. Escala: 75 m.
4.2.4. Modelo de oncogénesis tras ENU en ratones p53-/-
En los ratones nativos, la SVZ contiene cadenas migradoras compuestas por
neuroblastos (en rojo) envueltos por gliotubos formados por las células
GFAP+ o astrocitos (en azul) (Figura 33). Las células tipo C (en verde) son
progenitores de alta tasa proliferativa, dispuestas de forma dispersa entre
cadenas. Las células tipo B son relativamente quiescentes, mientras que las
células tipo C son precursoras de las células tipo A. En presencia de p53, el
número de células de cada población viene determinado por un equilibrio
vector Ras-V12
RESULTADOS
81
entre generación (debida a autorrenovación y/o proliferación), y eliminación
(debida a apoptosis o progresión del linaje neural). En ausencia de p53, sin
embargo, ambos compartimentos proliferativos (lento y rápido representados
por las poblaciones de astrocitos y células tipo C) presentan una ventaja
proliferativa, con rápida diferenciación hacia neuroblastos, resultando en la
formación de agrupaciones de células tipo A y B, sobre todo en las regiones
de salida hacia el BO. Estos cambios están parcialmente compensados por
un leve incremento de la muerte celular en las regiones hiperplásicas. La
asociación del déficit de función p53 con la activación del oncogén Ras o la
exposición a ENU, induce un aumento de la población de células de fenotipo
intermedio B-C por reclutamiento o activación de la proliferación de los
astrocitos quiescentes, asociada a una alteración de la diferenciación. Estos
cambios generan el sustrato para la génesis de glioblastomas
periventriculares.
Figura 33. Modelo de oncogénesis en ratones defectivos para el gen p53 tras
exposición a ENU. (V= ventrículo lateral)
RESULTADOS
82
Los dos últimos apartados (Apartados 4.1, 4.2) se corresponden con una
publicación de nuestro grupo.
RESULTADOS
83
4.3. ANALISIS DE RATONES DEFECTIVOS p27Kip1-/-/p53-/-
Conociendo la función que ambos genes reguladores del ciclo celular p53 y
p27 ejercían sobre la neurogénesis adulta, basándonos en los estudios
previos (Doetsch et al., 2002b; Gil-Perotin et al., 2006), y sabiendo que
mutaciones en estos genes se asociaban a la formación de tumores,
obtuvimos un doble mutante con la creencia de que los fenotipos
combinados originarían un fenotipo tumoral, y nos ayudarían a dilucidar las
funciones de esos genes en la SVZ adulta, y los mecanismos oncogénicos
potenciales en la misma. Sin embargo, y para nuestra sorpresa, los ratones
p27Kip1-/-/p53-/- no desarrollaban tumores en el SNC. Por ello, realizamos un
estudio en profundidad a nivel morfológico y molecular respecto a ratones
wild type, y a los genotipos individuales que describimos a continuación.
4.3.1. Rescate fenotípico en el doble mutante p27Kip1-/-/p53-/-
El análisis morfológico de la SVZ de los dobles mutantes mostró áreas de
hiperplasia de distribución hetérogenea de forma similar a la observada en
los ratones con pérdida de función del gen p53 (Figura 34). El estudio
ultraestructural revelaba diferencias en la distribución y composición celular
(Figura 35). La pérdida aislada de p53 resultaba en un aumento global en la
celularidad (324.7 ± 29.9 células/mm2) concretamente de la población de
células tipo A (118.9 ± 7.6 células/mm2) respecto a los animales wild type
(células totales: 247 ± 3.3 células/mm2; células tipo A: 67.6 ± 0.42
células/mm2) (p<0.001) (Capítulo 4.1.). Los neuroblastos de la SVZ de
animales p27Kip1-/- estaban disminuidos (26.6 ± 4.88 células/mm2) (p<0.001),
dato consistente con hallazgos previos (Doetsch et al., 2002b). El mutante
doble presentaba un número de neuroblastos comparable al wild type (67.8 ±
8.1 células/mm2) sugiriendo una posible complementación genética de la
pérdida del gen p27Kip1 al asociar con la pérdida del gen p53, en cuanto a la
generación de nuevas neuronas. El número total de células por unidad de
RESULTADOS
84
superficie tendía a ser mayor que en el ratón nativo, pero no se hallaron
diferencias estadísticamente significativas (266.4 ± 4.5 células/mm2).
Figura 34. Secciones semifinas de la SVZ (A) wild type, (B) p53-/-
, (C) p27Kip1-/-
, (D) p53-/-
/p27Kip1-/-
. Existe una diferencia de grosor de la SVZ, siendo mayor en ratones p53-/-
y p27Kip1-/-
/p53-/-
(flechas).
Hay mitosis coincidiendo con hiperplasia (asterisco). Escala: 10 µm (lv:
ventrículo lateral).
El número de células tipo B también estaba significativamente
aumentado en los ratones defectivos para p53-/- (97.4 ± 6.78 células/mm2)
(p<0.05) respecto a ratones wild type (78.6 ± 0.02 células/mm2). Las células
tipo C aumentaban en ausencia de p27 tanto en mutantes individuales (41.9
± 3.78 células/mm2) (p<0.05) como en dobles mutantes (43.7 ± 0.1
células/mm2) (p<0.001) respecto a los ratones nativos (30.8 ± 2.11
células/mm2). Estos datos sugerían que tanto p53 como p27Kip1 regulaban
diferencialmente el número de las distintas subpoblaciones de la SVZ.
RESULTADOS
85
Figura 35. Subpoblaciones de la SVZ en ratones defectivos p53, p27 y dobles mutantes.
Gráfico de barras mostrando el número medio por unidad de área de las distintas poblaciones
celulares en la SVZ (*p <0.05, ***p<0.001).
4.3.2. La ventaja proliferativa tras la pérdida de p53 y p27Kip1 no se debe
a un efecto aditivo en los dobles mutantes
Como los dobles mutantes carecían de dos importantes reguladores de la
proliferación, nos sorprendió que el número total de células por unidad de
área no fuera aditivo o sinérgico. Para conocer el efecto diferencial de la
pérdida de estos genes en la proliferación de la SVZ, realizamos un recuento
de mitosis en las secciones ultrafinas que habíamos analizado y además
utilizamos la incorporación de 3H-Thy como marcador exógeno de fase S del
ciclo celular.
El número de mitosis en los animales p53-/- era similar al detectado
en ratones p27Kip1-/- (p53-/- =1,5 ± 0,10 mitosis/mm2; p27Kip1-/- =1,65 ± 0,14
RESULTADOS
86
mitosis/mm2) ambos dos veces más que en el caso de ratones wild type
(0.84 ± 0.05 mitosis/mm2). Curiosamente, el número de mitosis en los
animales p27Kip1-/-/p53-/- era mayor que el de los wild type pero no resultante
de un efecto aditivo (1.82 ± 0.009 mitosis/mm2). No realizamos análisis
estadístico de estos datos pues el número de mitosis era muy pequeño. Los
estudios con 3H-Thy tras un único pulso y sacrificio del animal a la hora
mostraron similares resultados (wt=13.5 ± 1.32; p53-/-=20.64 ± 0.39, p<0.01;
p27Kip1-/-=17.441 ± 0.081, n.s; p27Kip1-/-/p53-/-=19.37 ± 5.81, n.s.).
Para conocer la contribución relativa de cada subpoblación celular de
la SVZ al compartimento proliferativo, analizamos el fenotipo de las células
3H-Thy+ con ME, corrigiendo el número obtenido con el total de células de
cada subtipo. En todos los animales, el compartimiento de alta proliferación
estaba constituido por células tipo C principalmente (73-75%). La pérdida de
función de p27Kip1-/- no producía cambios evidentes en la contribución de los
tipos celulares A y B al compartimento proliferativo (Tipo A=14%; Tipo
B=13%). Sin embargo la deleción de p53 llevaba consigo el reclutamiento de
las células tipo B a dicho compartimento (24%), pudiendo implicar un cambio
en el modo de división de estas células, con aumento de la autorrenovación,
y un decremento relativo de las células A en proliferación (1%). En la
ausencia de ambos genes, la distribución relativa de las células en
proliferación, era similar a la observada en la ausencia individual de p53
(Tipo A (2%), Tipo B (23%)), prevaleciendo su efecto en cuanto a la
capacidad de autorrenovación (Figura 36).
4.3.3. p53 regula la autorrenovación de las aNSCs en ratones mutantes
dobles p27Kip1-/-/p53-/- sin afectar la diferenciación neuronal
Para confirmar que la capacidad de autorrenovación era dependiente
del gen p53 (tanto en simples como en mutantes dobles) teníamos que
valorar dos posibles explicaciones. La primera posibilidad era que la
RESULTADOS
87
ausencia de p53 aumentara la autorrenovación (como resultado de un
cambio del modo de división desde asimétrico (una célula B o madre da
lugar a otra célula madre y a una célula hija (C o A)) a simétrico (una célula
madre B da lugar a dos células madre B) y además la neurogénesis se viera
afectada. La otra posibilidad era que la ausencia de p53 aumentara la
autorrenovación de las aNSCs sin afectar la neurogénesis, estando intacta la
progresión hacia células tipo C y ésta hacia célula tipo A. En los ratones p53-
/- observábamos un aumento de las neuronas inmaduras (células tipo A), lo
que contradecía la primera hipótesis. En los ratones p27Kip1-/-, quedaba por
explicar si el déficit de células tipo A en la SVZ, cuya proliferación era
normal, era debida a un stop en la diferenciación, o si por el contrario, era
debida a un incremento selectivo de la muerte en estas células o a un
aumento de la capacidad migradora hacia el BO.
Figura 36. Tipos celulares en fase de proliferación. Se identificaron las células marcadas
con 3HT-Thy tras un pulso (verde: células tipo C; azul: células tipo B; rojo: neuroblastos). El
porcentaje de células tipo B en proliferación aumentaba en los mutantes con déficit para p53
(individuales o dobles), disminuyendo el de las células tipo A. Los ratones defectivos para
p27Kip1-/-,
pese a tener aumentada la proliferación, no mostraban ventaja proliferativa selectiva
para ninguna subpoblación.
Para contrastar nuestras hipótesis, y estudiar la autorrenovacion
celular de las aNSCs de los diferentes genotipos, utilizamos el ensayo de
RESULTADOS
88
neuroesferas, cultivando células derivadas de la SVZ. De forma meramente
descriptiva, y tras observación en microscopio de contraste de fases, el
tamaño de las neuroesferas de animales p53-/- era un 50% mayor que las de
ratones wild type, mientras que las neuroesferas obtenidas de SVZ de
ratones p27Kip1-/- eran de tamaño comparable al ratón nativo, aunque el
número de las mismas era mayor (Figura 37). Las neuroesferas de los
dobles mutantes eran mayores y en mayor número que en wild type
indicando lo que posteriormente cuantificamos como tasa de amplificación y
autorrenovación aumentadas.
Figura 37. Tamaño y patrón de adherencia diferencial. Los ratones con pérdida de función
del gen p53 mostraban tendencia a adherirse a la placa de cultivo comparado con los ratones
wild type y p27Kip1-/-
. Además el número de neuroesferas y el tamaño indicaban características
diferenciales entre los distintos genotipos. Escala: 0.5 mm.
Las neuroesferas de los ratones p53-/- mostraron la mayor capacidad
de autorrenovación (sembrado de alta densidad) comparándolas con las
procedentes de SVZ wild type (=0.05) (Figura 38). Los ratones p27Kip1-/-, y
los dobles mutantes también mostraron esta tendencia aunque no fue
estadísticamente significativa. Una explicación podría ser que a altas
densidades de sembrado, la diferencia en autorrenovación era menos
evidente (Capítulo 4.1.).
RESULTADOS
89
En cuanto a la capacidad de proliferación, medida como tasa de
amplificación, era mayor tras pérdida de función de p53 (p53-/- y en p27Kip1-/-
/p53-/-) (respecto al wild type), y casi el doble que en ratones p27Kip1-/- y con
tendencia a ser mayor que en los wild type. Estos resultados eran
compatibles con los datos previos obtenidos con ME y 3H-Thy.
Figura 38. Efecto de la delección de p53 y/o p27Kip1 en la regulación de la proliferación
y habilidad clonogénica de las células de SVZ in vitro. A) Cuantificación de la tasa de
autorrenovación a altas densidades, mostrando diferencias significativas en ausencia de p53.
B) Cuantificación de la tasa de amplificación celular. *p<0.05; **p<0.01.
Durante la expansión en placas de cultivo observamos una
característica peculiar del crecimiento de estas neuroesferas. Según el
genotipo, tras varios pases celulares, presentaban patrones de adherencia
RESULTADOS
90
diferenciales a la placa (en presencia de laminina como sustrato adherente).
Los animales defectivos para p53 (simples o dobles mutantes) tendían a
adherirse a la placa de cultivo, adoptando una expansion radial de
prolongaciones celulares, mientras que las neuroesferas de wild type y
ratones p27Kip1-/- adoptaban morfología esférica y crecían libremente en el
medio. Esto fue observado de forma consistente en todos los ensayos
realizados.
4.3.4. La pérdida de función de p27Kip1 y p53 determina diferencialmente
la progresión de las aNSCs hacia linaje neuronal
Al gen p27Kip1se le atribuye la función de favorecer la salida de las células
del ciclo celular y así comenzar la diferenciación (Durand et al., 1998;
Vernon et al., 2003). A este respecto, quisimos estudiar en profundidad el
efecto que su pérdida tenía en las aNSCs, ya que el número de neuroblastos
era significativamente menor que en los ratones wild type tras el estudio al
ME. Por el contrario, en los ratones defectivos para p53, habíamos
comprobado un aumento significativo de la neurogénesis.
Para ello, disociamos las neuroesferas que teníamos en cultivo, las
sembramos en placas con laminina, y las cultivamos en ausencia de
mitógenos durante 7 a 10 DIV (Figura 39). Efectivamente, había diferencias
en cuanto a la cantidad de neuroblastos generados en los diferentes
genotipos. Mientras que las células que expresaban el marcador de
neuronas inmaduras Tuj1+ procedentes de neuroesferas de los animales
p53-/- eran el triple respecto a los ratones wild type (wt=19% ± 1 (células
Tuj1+/células DAPI+%); p53-/-=62% ± 4.1, =0.05), la proporción de células
Tuj1+ derivadas de ratones p27Kip1-/- era significativamente menor (p27Kip1-/-
=5% ± 0,97, =0.05). El fenotipo del doble mutante, sin embargo, mostraba
una compensación entre genotipos que resultaba en la ausencia de
diferencias respecto de los animales wild type (p27Kip1-/-/p53-/-=20% ± 3,1,
RESULTADOS
91
n.s.). Inmunohistoquímica in vivo de la SVZ para Tuj1 o Dcx mostraron
también diferencias entre genotipos (Figura 40).
Figura 39. Neurogénesis diferencial tras pérdida de los reguladores del ciclo p53 y
p27Kip1
. Gráfico de barras indicando el número de células Tuj1+ respecto al total de núcleos
celulares (DAPI). Se observaba un incremento del mismo en los animales p53-/-
y un
decremento en los animales p27Kip1-/-
comparándolo con el resto de genotipos, como hemos
descrito previamente (* =0.05).
Estos datos, igual que los obtenidos con el estudio ultraestructural
sugerían, en primer lugar, que el efecto de la pérdida de p53 sobre la
autorrenovación no estaba reñido con la diferenciación celular, y en segundo
lugar que p53 y p27Kip1 ejercían un papel opuesto en la neurogénesis,
desconociendo si éste era sobre la misma o distinta vía de señalización.
RESULTADOS
92
Figura 40. Las deleciones de p53 y p27Kip1
presentan efectos opuestos sobre la
neurogénesis in vivo e in vitro. Imagen obtenida con microscopio confocal que muestra la
SVZ adulta (izquierda) y los neuroblastos obtenidos tras diferenciar neuroesferas en medio de
cultivo sin factores de crecimiento (derecha). Las células Tuj1+ son más abundantes en los
animales p53-/-
y menos en los animales p27Kip1-/-
compensándose ambos efectos en los
mutantes dobles. Escala: 10 m.
Para confirmar que los cambios observados en la SVZ tanto in vivo
como in vitro se correspondían con cambios en la neurogénesis en BO,
inyectamos BrdU en animales de los cuatro genotipos y permitimos una
supervivencia de 14 días para observar las células que incorporaban BrdU
en la SVZ tras su migración hacia el BO. Además, estudiamos doble marcaje
RESULTADOS
93
con NeuN, marcador de neuronas granulares maduras, para identificar las
células procedentes de la SVZ que se habían diferenciado e integrado en el
BO (Figura 41).
Los resultados eran los esperables con una mayor neurogenesis en
BO en los animales p53-/-(wt=31.77± 3 células/mm3; p53-/-=50.41 ± 2.7
células/mm3; p<0.01) y un menor número de células doblemente marcadas
en el ratón deficiente para p27 (p27Kip1-/-=22.54 ± 2.5 células/mm3; p<0.05),
ambos cambios estadísticamente significativos. Los dobles mutantes no
mostraron diferencias con respecto a los animales nativos (p53-/-/p27Kip1-/-
=37.25 ± 7 células/mm3).
4.3.5. Los ratones mutantes p27Kip1-/- presentan déficit de
reconocimiento de nuevos olores
Los neuroblastos que se generan durante la edad adulta en la SVZ migran al
BO donde se integran en las redes neuronales responsables de la
familiarización a nuevos olores (Magavi et al., 2005). Dado que los animales
p53-/-, p27Kip1-/- y p27Kip1-/-/p53-/- mostraban diferencias en el número de
neuroblastos, nos preguntamos si las diferencias celulares entre genotipos
podrían ser observadas en relación con su comportamiento olfativo tras
exposición a un nuevo olor. Los experimentos fueron analizados sin
conocerse el genotipo de los ratones. Los ratones se habituaban a nuevos
olores y luego se exponían a olores familiares. El comportamiento
exploratorio hacia ambos tipos de olores fue registrado. El animal wild type
tiene un comportamiento caracterizado por aumento del tiempo exploratorio
hacia los olores nuevos (Figura 42). De forma interesante, los ratones p53-/-
mostraban una tendencia a pasar más tiempo explorando nuevos olores,
mientras que los mutantes p27Kip1-/- dedicaban menor tiempo explorando
nuevos olores, y más tiempo explorando olores habituados, sugiriendo una
alteración en la habilidad para retener información olfatoria.
RESULTADOS
94
Figura 41. Neurogénesis en bulbo olfatorio tras pérdida de los genes p53 y p27Kip1
. A)
Las células BrdU+(verde)/NeuN+(rojo) representan las nuevas neuronas incorporadas en el
BO. Los núcleos se muestran teñidos con DAPI (en azul). Se observan claras diferencias
entre los animales p53-/-
(con neurogénesis aumentada) y p27Kip1-/-
con menor número de
nuevas neuronas (Escala: 50 m). B) Detalle (Escala: 10 m).
RESULTADOS
95
En los dobles mutantes el tiempo exploratorio hacia nuevos olores
era indistinguible del wild type, apoyando una vez más el concepto de que
tanto p53 como p27Kip1 juegan papeles opuestos en la neurogénesis adulta.
Figura 42. Reconocimiento de olor en los diferentes genotipos. A diferencia de los
animales p53-/-
y wild type, los ratones p27Kip1-/-
mostraban una disminución del tiempo
exploratorio para olores nuevos respecto a los habituados (respecto a p53: ***p < 0.001);
respecto al animal wild type †p<0.01).
4.3.6. La pérdida de función del gen p27 aumenta la apoptosis en
mutantes simples y dobles
La disminución del número de neuroblastos en los ratones defectivos para
p27 podría ser secundaria al incremento de muerte celular en este subtipo
específico. Previamente, se había mostrado que el ratón p27Kip1-/- tenía
aumentada la apoptosis (Doetsch et al., 2002b). Tras estudio de muerte
RESULTADOS
96
celular con la técnica de TUNEL, observamos que el número de células
TUNEL+ por unidad de longitud era de 16 ± 0.1 células/mm para p27Kip1-/-,
mientras que en los dobles mutantes las células TUNEL+ eran únicamente
1.4 ± 0.2 células/mm, no siendo significativamente diferente que los wild type
o p53-/- (wt=3.06 ± 0.56 células/mm; p53-/- =3.86 ± 0.11 células/mm) (Figura
43; Figura 24). En efecto, se producía un aumento de apoptosis en los
mutantes defectivos para la proteína p27 que podría estar afectando a
células tipo A, y que no ocurría en el resto de genotipos, cuya magnitud no
explicaba, al menos en su totalidad, el decremento significativo en el número
de neuronas de nueva formación.
Figura 43. Apoptosis en ratones p27Kip1-/-
y dobles mutantes. Se observaba la tendencia al
aumento de la muerte por apoptosis (núcleos TUNEL+ en verde (flechas)) en los mutantes
defectivos para p27, siendo indistinguible del wild type en los ratones p27-/-
/p53-/-
(Escala: 25
m).
4.3.7. Papel de los reguladores del ciclo celular p27 y p53 en la
regulación de la neurogénesis
Dados los resultados obtenidos, decidimos buscar una explicación
mecanística a la neurogénesis diferencial en los distintos genotipos.
RESULTADOS
97
4.3.7.1. p27 regula la neurogénesis a nivel postraduccional mediante la
unión a neurogenina
La neurogenina (Ngn) es un factor de transcripción proneural tipo bHLH
(basic helix-loop-helix) implicado en la formación de neuronas (Morrison,
2001). La concentración intracelular de Ngn se regula mediante la
degradación por el proteasoma (Vosper et al., 2007). Previamente, se había
demostrado durante el desarrollo embrionario la función de p27Kip1 en la
regulación de la estabilidad de la neurogenina 2 (Ngn2). Ejercía su función
mediante su unión directa, protegiéndola de su degradación (Nguyen et al.,
2007). Debido al efecto negativo de la pérdida función de p27Kip1 sobre la
formación de nuevas neuronas, nos preguntamos si el efecto descrito
durante la embriogénesis se reproduciría en células adultas de la SVZ.
Realizamos co-inmunoprecipitación de extractos proteicos
procedentes de la SVZ y BO de ratones wild type con anticuerpos anti-p27 y
anti-p53 (Figura 44). Tras observar en Western blot, sólo se formaba
complejo entre p27Kip1 y Ngn2, no existiendo interacción de Ngn2 con p53.
Nuestra hipótesis sugería que, en ausencia de la función estabilizadora de
p27Kip1, las células de la SVZ no formarían neuroblastos debido a la
degradación proteosomal de la Ngn2, ya que esto impediría el inicio del
programa neurogénico. Para probar esta hipótesis, cultivamos células de
mutantes p27Kip1-/- y wild type, y las pusimos en condiciones de diferenciación
añadiendo al grupo experimental el inhibidor del proteosoma MG132. A los
1, 3 y 5 DIV se compararon las células Tuj1+ entre grupos control y
experimental para ambos genotipos. En presencia de MG132, las células
p27Kip1-/- generaban el mismo número de neuroblastos que las wild type tras
3 DIV, sin observarse cambios entre grupos a 5 DIV. MG132, reestablecía el
número de neuronas Tuj1+ en los mutantes, sugiriendo que en condiciones
fisiológicas, p27Kip1 tendría un papel protector de Ngn2 favoreciendo la
RESULTADOS
98
entrada en neurogénesis, ya en etapas tempranas del proceso de
diferenciación.
Figura 44. Regulación postraduccional de la neurogénesis por la proteína p27. A)
Coinmunoprecipitación de extractos proteicos de BO y SVZ de ratones wild type. Se utilizó
anticuerpos contra Neurogenina 2 (Ngn2) y se realizó Western blot con anticuerpos anti-p27 y
anti-p53. El extracto de proteína muestra la expresión en la SVZ y BO, aunque solo p27 se
une a Ngn2. B) Recuento de células marcadas por TuJ1 en ratones p27Kip1-/-
y wild type tras
diferenciación 1 o 3 DIV en ausencia (control-ctrl) y presencia de 5 m del inihibidor del
proteosoma MG132. *** = p < 0.001.
RESULTADOS
99
4.3.7.2. p53 actúa como represor transcripcional de genes proneurales
durante los primeros días de diferenciación
Dado que la función que p53 ejerce en la regulación negativa de la
neurogénesis no estaba mediada por Ngn2, pensamos que el efecto ejercido
por p53 podría ser consecuencia de una activación/represión de genes
diana, implicados en la diferenciación hacia la estirpe neuronal. Basándonos
en literatura previa, hicimos un estudio de transcripción de genes implicados
en la neurogénesis mediante PCR cuantitativa. El listado de genes testados
se describe en el Anexo 2. Obtuvimos ARNm de neuroesferas de ratones
wild type y p53-/- a diferentes puntos de la diferenciación: DIV 1, 3, 7
realizando un estudio inmunohistoquímico con anti-Tuj1 en paralelo. La
tinción con dicho marcador, reveló la presencia de células Tuj1+, incluso
tempranamente, a 3 DIV (Figura 45) más abundantes en los mutantes
defectivos. Entre los genes implicados en la regulación de la neurogénesis
testados: familia Id de proteínas, NeuroD, Math3, Mash1, nanog,… y otros
genes relacionados con la función de p53: p63, p73delta, p73, apaf1, PCNA,
p21, PUMA, Bcl2,… solo encontramos diferencias significativas en el caso
de los transcritos de los genes proneurales NeuroD y Math3 en los extractos
de ratones p53-/- comparándolos con ratones wild type. Estos datos sugerían
que p53 regulaba negativamente la expresión de estos factores
neurogénicos bHLH, por tanto su ausencia tenía efectos neurogénicos.
Este último apartado de resultados se corresponde con una
publicación actualmente en 2ª revisión por European Journal of
Neuroscience (Gil-Perotin et al., 2011- Referencia: EJN-2011-05-18339(R)).
RESULTADOS
100
Figura 45. La ausencia de función de p53 determina un aumento en la neurogénesis
asociada al aumento de expresión de los genes proneurales NeuroD y Math3. Curso
temporal de neurogénesis a partir de células de la SVZ de animales p53-/-
y wild type a 1, 3 y
7 días in vitro (DIV) tras retirada de mitógenos en condiciones de diferenciación. El número de
neuroblastos (Tuj1+) de morfología madura (con expansiones citoplasmáticas y mayor
inmunorreactividad) es mayor a 3 y 7 DIV en los mutantes p53, indicando, al menos, una
precocidad en la neurogénesis. Escala: 50 µm. B) Tras qPCR para NeuroD y Math3, los
transcritos de ARNm aislados en neuroesferas derivadas de ratones p53-/-
y wild type a
diferentes DIV, mostraban unos mayores niveles de expresión en caso de ausencia de p53 (*,
**, *** = p < 0.05, 0.01, 0.001).
5. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
102
Actualmente existe la evidencia de que las células madre pueden jugar
diversos papeles en la Biología. Entre los más atrayentes para el campo de
la Neurociencia, está la posibilidad de reparar o regenerar diversos tejidos u
órganos (García-Olmo et al., 2008). Sin embargo, si bien estas células
podrían servir para la regeneración tisular en caso de lesión, hay que valorar
la otra cara de la moneda. Por un lado, la activación excesiva de la
proliferación o el acortamiento telomérico se han relacionado con el
agotamiento de las células madre endógenas y, por tanto, con el
envejecimiento tisular (Doetsch et al., 2002a; Ferron et al., 2009). Por otro,
una hiperactividad descontrolada puede causar la formación de tumores
cerebrales como se ha descrito ampliamente (Germano et al., 2010; Recht et
al., 2003). El equilibrio entre estos tres pilares, en condiciones fisiológicas,
depende del balance entre la proliferación, la diferenciación y la muerte
celular, dependientes todos ellos de múltiples cascadas de señalización
celular y molecular. Este trabajo analiza el papel de dos moléculas
reguladoras del ciclo celular en la biología de las aNSCs de la SVZ y su
implicación en estos procesos dinámicos, y de cómo su alteración podría
conllevar el desequilibrio que determine una menor regeneración tras lesión,
un envejecimiento prematuro o un aumento en la generación de tumores
cerebrales.
5.1. Papel de la proteína supresora de tumores p53 en la SVZ
La pérdida de función de p53 se detectaba de forma temprana en tumores
cerebrales de estirpe glial (Aka et al., 1993; von Deimling et al., 1992; Zhu et
al., 2005), y su expresión se había demostrado en las áreas germinales en el
cerebro adulto, incluida la SVZ (van Lookeren Campagne and Gill, 1998).
Esto no implicaba a priori que las células madre de dichas regiones
neurogénicas fueran el origen de tumores, sin embargo, existía la posibilidad
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
103
de que la ausencia de p53 jugase un papel potencial en la génesis de
tumores gliales a partir de cambios en el comportamiento de células madre
de la SVZ. Por esa razón, analizamos los ratones defectivos para dicho gen.
Un hecho que nos sorprendió es que, pese a los estudios que
mostraban mutaciones de p53 en tumores gliales, en el análisis de nuestras
muestras de ratones adultos jóvenes (8 semanas de edad), no se observó la
formación espontánea de tumores cerebrales. Esto había sido confirmado
previamente por otros autores que encontraron tumores espontáneos en
localizaciones extracerebrales, sobre todo linfomas, en ratones de mayor
edad (6 meses) (Donehower et al., 1992) pero no cerebrales sin que se
conozca hasta el momento la causa de este fenómeno. A la luz de estos
datos, se podría pensar que este modelo no era apto para el estudio in vivo
de la oncogenicidad en mutantes p53-/-. Sin embargo, un primer análisis de
las muestras cerebrales mostró cambios a nivel celular en estos animales y
proseguimos el estudio en profundidad.
Se detectaron áreas hiperplásicas en regiones periventriculares de la
SVZ adulta, caracterizadas por agregados de células GFAP+, glía madura, y
neuroblastos. El estudio histológico de estas regiones recordaba a pequeños
“microtumores” de bajo grado (localizados, aspecto maduro de las células,
escasas figuras mitóticas) como los que se describen en etapas tempranas
de la formación de glioma en ratas expuestas prenatalmente a mutágenos o
en gliomas humanos de bajo grado con mutaciones del gen p53 (Di Sapio et
al., 2002). Tras un análisis histológico más exhaustivo, incluyendo la
ultraestructura, observamos que la pérdida de función de p53 determinaba
un incremento global en la celularidad de la SVZ, probablemente a expensas
de las áreas hiperplásicas, que afectaba fundamentalmente a las
subpoblaciones de células tipo A y B. El incremento del número de células
podía ser el resultado de varias condiciones: a) aumento de la
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
104
proliferación/autorrenovación, b) disminución de la muerte celular por
apoptosis, y/o c) disminución de la diferenciación/migración.
Dado que la proteína p53 participa en la regulación de la proliferación
vía la activación transcripcional de genes anti-proliferativos como p21Cip1/WAF1
o la inhibición de otros pro-proliferativos como IGF-2, una posibilidad
bastante plausible era que el aumento de la densidad celular en la SVZ en
ausencia de p53, fuera secundaria a la expansión de las aNSCs y los
progenitores multipotenciales. De este modo, lo que confería la pérdida de
p53 era una ventaja proliferativa en las células de la SVZ. Parcialmente en
contra de esta hipótesis se encuentra el hecho de que en la SVZ adulta los
patrones de expresión de p53 y p21Cip1/WAF1 no eran coincidentes (van
Lookeren Campagne and Gill, 1998). Aunque podría ser que otras dianas
transcripcionales de p53 estuviesen implicadas en este efecto, no se han
estudiado exhaustivamente en el presente trabajo. Los estudios de
proliferación tanto in vivo, utilizando marcadores exógenos de fase S del
ciclo celular, o como in vitro mediante el cultivo en suspensión de células de
la SVZ, mostraron un aumento neto de la proliferación y la autorrenovación
como causas del aumento en la densidad celular.
Pero… ¿se trataba de un aumento de proliferación específico de una
subpoblación de la SVZ? En los estudios de expresión realizados tras
irradiación cerebral total, llamaba la atención que las zonas de mayor
expresión de p53 (y mayor concentración de núcleos picnóticos) no solo
afectaban a la SVZ sino que también las regiones de la RMS y entrada al
BO, es decir, todos los tipos celulares de la SVZ podían verse implicados,
incluidas las células migradoras. Sin embargo, estudios de identificación
celular con 3H-Thy, permitieron concluir que existía un aumento significativo
en la autorrenovación de células tipo B (aNSCs) a expensas de la menor
proliferación de neuroblastos, manteniéndose constante la proliferación de
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
105
los precursores tipo C. Por tanto, se trataba de una activación selectiva y
específica de la proliferación de las aNSCs. Este cambio de modalidad de
división de las aNSCs de asimétrica hacia una división simétrica, sugería un
cambio pre-oncogénico, ya que la progresión tumoral no es más que la
expansión de las células cancerígenas mediante división simétrica
(Mantamadiotis and Taraviras, 2011).
No era excluyente que existiera una disminución de la apoptosis que
contribuyera al aumento en la celularidad de la SVZ en ausencia de función
de p53. Más teniendo en cuenta que p53 es un supresor tumoral,
esencialmente por su actividad pro-apoptótica tras daño en el ADN,
estudiada desde hace varias décadas (Chow et al., 2000; Miyashita and
Reed, 1995; Vogelstein et al., 2000). Sin embargo, si bien es cierto que p53
está implicado en la apoptosis tras daño al material genético, vía la
activación de genes efectores como Bax (Miyashita and Reed, 1995), su
papel en la apoptosis espontánea o en la apoptosis durante el desarrollo
embriológico están en debate. El grupo de Van Lookeren y cols. encontró
células TUNEL+ (en proceso de apoptosis) a lo largo de la RMS durante el
desarrollo que no expresaban p53 o ninguna de sus dianas, lo que les llevo
a la conclusión de que la muerte neuronal en el estado embrionario era
independiente de p53 (van Lookeren Campagne and Gill, 1998). Tampoco
se observaban alteraciones morfológicas macroscópicas en ratones jóvenes
del genotipo p53-/-, lo que implicaba un desarrollo parcialmente normal
(Donehower et al., 1992). En contraposición con lo previo, en una revisión
mas reciente, se relaciona la función de p53 con la muerte neuronal durante
el desarrollo, y en neuronas postmitóticas del sistema nervioso periférico en
el adulto. Los autores discuten el papel antagónico de p53 (pro-apoptótico) y
otro miembro de la familia p53, p73 (en concreto de su forma truncada o
delta) (anti-apoptótico) que actúan simultáneamente en la regulación de la
muerte celular en el SNC (Miller et al., 2000). Nosotros no encontramos
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
106
diferencias significativas en la tasa de muerte celular in vivo, aunque sí in
vitro, donde había un aumento de la misma en los ratones defectivos.
Probablemente esta diferencia entre métodos experimentales se debió a un
bajo número de células TUNEL+ in vivo que imposibilitó el análisis
estadístico adecuado. Era evidente, observando las muestras estudiadas
que existía un aumento de las células TUNEL+ en la regiones de hiperplasia,
y en el caso de los cultivos, en aquellas regiones de mayor celularidad. En
conclusión, el incremento en la celularidad de la SVZ no era atribuible a una
disminución en la apoptosis espontánea, sino que existía incluso un aumento
compensatorio de la apoptosis en las regiones de hiperplasia, que podría
estar asociado a la regulación positiva de genes pro-apoptóticos o negativa
de genes anti-apoptóticos (como por ejemplo, aquellos de la familia de
genes de p53 como delta-p73) y/o ser secundario a la ausencia de soporte
trófico.
Por último, teníamos que descartar un defecto en la migración o
diferenciación de las células de la SVZ en su camino hacia el BO, que
provocara la acumulación de las mismas en regiones germinales. La
diferenciación no solo estaba preservada en los mutantes p53-/- sino que
estaba acelerada, encontrándonos con un mayor número de neuroblastos y
oligodendrocitos tanto in vivo en la SVZ como in vitro en condiciones de
diferenciación, ya desde etapas tempranas. Diversos estudios han
confirmado estos resultados (Armesilla-Diaz et al., 2009; Ferreira and Kosik,
1996; Ferron et al., 2009; Meletis et al., 2006). ¿Este aumento de la
neurogénesis en las regiones proliferativas se traducía en un mayor número
de neuronas maduras en el BO? Para estudiar la migración y la
diferenciación terminal de los progenitores de la SVZ se hicieron estudios de
incorporación de 3H-Thy tras 30 días de supervivencia, que mostraron un
incremento de neuronas granulares (maduras) en el BO marcadas con 3H-
Thy en los mutantes p53-/-. Dicho de otra forma, no había una interrupción en
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
107
la progresión hacia el linaje neuronal maduro, ni en la migración e
incorporación en el tejido diana que explicaran el aumento de celularidad en
la SVZ.
En un estudio muy reciente, de forma similar al papel atribuido a p53,
se atribuye a p73 un papel inhibidor de la neurogénesis (Gonzalez-Cano et
al., 2011), y sería un hecho a descartar que variaciones adaptativas en los
niveles de expresión del resto de miembros de la familia p53 fueran los
responsables de los cambios observados. Esto se resolvió mediante el uso
de ratones transgénicos flox-flox permitiendo la delección postnatal
(mutación somática) de dicho gen que condujo a los mismos cambios que en
los ratones defectivos. Además, entre los diversos genes testados por PCR
cuantitativa se encontraban los genes de la familia p53 (isoformas incluidas)
y no se observaron cambios en su expresión en los animales p53-/- respecto
a los nativos.
En definitiva, en los animales sin expresión de p53, existía un
aumento en la proliferación y autorrenovación de las aNSCs, con un
aumento compensatorio de la apoptosis en las áreas de hiperplasia, y se
mantenía preservada la migración y diferenciación celular. Este equilibrio
entre los distintos procesos celulares, evitaba la aparición de tumores
cerebrales espontáneos en animales p53-/-.
5.2. Potencial oncogénico de la pérdida de función de p53
p53, entre otras moléculas, forma parte de los mecanismos etiopatogénicos
de la muerte neuronal tras isquemia (Li et al., 1997). Además, su
sobreexpresión se ha relacionado con el deterioro neurológico que
determina el envejecimiento, asociado a una disminución de la capacidad
regenerativa de las células madre adultas en los centros germinales
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
108
(Medrano et al., 2009). De estas premisas, y de nuestros resultados previos
surge la siguiente pregunta: dado que de la ausencia de función de p53 se
deriva un aumento neto del número de neuronas que se incorporan en el
tejido diana ¿Representaría la pérdida de p53 una ventaja en cuanto a
regeneración? ¿sería su inhibición un riesgo potencial para la formación de
tumores?
Como hemos indicado, las células madre son células pluripotentes
con capacidad de proliferación y autorrenovación indefinidas, que por sus
características han sido comparadas con las células tumorales. Los trabajos
que las relacionan con cáncer son innumerables. Según nuestros resultados,
la ausencia de p53 confiere una ventaja proliferativa, y carece de la actividad
supresora tumoral que protege frente a la formación y progresión de
neoplasmas. Hemos comprobado inicialmente que en ratones defectivos
para p53 no hay formación espontánea de tumores, principalmente por la
preservación de la diferenciación celular. Sin embargo, una alteración de la
capacidad de las céllulas de la SVZ para diferenciarse, por un estímulo
genético o ambiental, podrían poner en marcha el mecanismo irreversible del
cáncer. Para descartar o confirmar que el ratón p53-/- condicionase un
estado pre-oncogénico, administramos un mutágeno utilizado en un modelo
animal de glioblastoma, N-etil-N-nitrosurea (ENU).
Se conoce que la exposición prenatal de ratones p53-/- a ENU
produce un daño en el ADN que sirve de estímulo mutagénico y conduce a
la transformación celular hacia tumores del tipo glioblastoma. Tambien
sabíamos de antemano que en ratones nativos o con déficit de un único
alelo del gen p53, no se formaban tumores cerebrales, pero en ausencia
completa de p53, aparecían tumores astrocitarios de alto grado en un 60%
de los ratones expuestos a ENU (Leonard et al., 2001). Conociendo el
fenotipo de los ratones p53-/- en la SVZ, quisimos comprobar el efecto de
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
109
ENU sobre estos mismos animales y en esta misma región. Observamos
que la exposición prenatal a ENU producía un mayor aumento de las
poblaciones celulares proliferativas B (quiescentes) y C (de alta tasa de
proliferación), con aumento de la capacidad de autorrenovación de las
aNSCs. A diferencia de los ratones p53-/- no tratados con ENU, los animales
expuestos presentaban afectación de la diferenciación celular, siendo
frecuente encontrar células detenidas en fenotipos precursores intermedios
(células tipo B-C). Comprobamos que en los ratones defectivos para p53, el
efecto de ENU sobre las aNSCs in vitro, era comparable al de la
transformación oncogénica con la forma activa Ras (expresada
constitutivamente), ya que en ambos casos, las células derivadas de la SVZ
perdían la capacidad para diferenciarse, y adquirían características
histológicas tumorales, proponiéndolas nuestro modelo como células
iniciadoras de tumores gliales. El mecanismo molecular implicado no se
analiza en este trabajo, pero existen varias explicaciones potenciales a este
comportamiento. ENU, como agente alquilante, induce mutaciones al azar
en el genoma de las células de la SVZ, pudiendo afectar a la función o a los
niveles de moléculas reguladoras, y, consecutivamente, a la dinámica
celular. El que en nuestro modelo experimental se afecten únicamente las
células de la SVZ y no otros tipos celulares a priori, indica además una
susceptibilidad diferencial al efecto de ENU, que podría depender, por
ejemplo, del estado madurativo de las células. En apoyo a esto último, la
evidencia descrita de la ausencia de formación tumoral cuando la exposición
de ENU ocurre en la etapa adulta (Capilla-Gonzalez et al., 2010; Slikker et
al., 2004).
Basándonos en nuestros datos y en la literatura relacionada
podemos concluir que la falta de función de p53 no es suficiente para la
génesis de tumores en ratones, sino que la transformación neoplásica
requiere el sinergismo entre el déficit de p53 y estímulos adicionales como
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
110
la exposición prenatal a ENU, la transformación con oncogen Ras (Reilly et
al., 2000), o la exposición constitutiva concomitante de factores de
crecimiento como PDGF (Hesselager et al., 2003). El estímulo continuado
mediante infusión de PDGF, también es capaz, en ausencia de mutaciones
de p53 (pero no en sentido contrario), de formar lesiones tumorales en la
SVZ, siendo la célula diana (la que expresa su receptor) la célula tipo B
(Jackson et al., 2006), sugiriendo de nuevo la posibilidad de que la aNSC
sea la célula de origen tumoral. Por otro lado, la pérdida de p53 no sinergiza
con la activación del receptor EGFR en astrocitos (otro modelo experimental
de glioma, de mayor grado). Existe la evidencia de que la amplificación de
EGFR se ha asociado frecuentemente con mutaciones o deleciones de
Ink4a/Arf pero no con mutaciones de p53 (Bachoo et al., 2002; Holland et
al., 1998). Todos estos datos en su conjunto indican la existencia de al
menos dos mecanismos de génesis de glioblastoma: uno Ink4a/Arf
dependiente (p53-independiente) y otro p53-dependiente. Finalmente,
aunque los resultados de este trabajo sugieren una transformación
neoplásica célula-dependiente potenciada por la pérdida de función de p53,
no se puede excluir la posibilidad de que dicha transformación sea el
resultado de mecanismos autocrinos o paracrinos secundarios.
Por tanto, y respondiendo a la pregunta inicial, el riesgo de inhibir p53
como diana terapéutica en caso de lesión neuronal aguda (traumática o
isquémica) o lesiones neurodegenerativas propias del envejecimiento para
inducir la regeneración, está lejos de ser completamente segura, y por ello
consideramos un riesgo su aplicación clínica en el momento actual. Esto no
descarta que en determinadas patologías, y con esquemas terapéuticos
concretos la inhibición de p53 pueda ser beneficiosa. Este es el caso
descrito en un reciente (y esperanzador) trabajo, que muestra un modelo de
isquemia cerebral en ratón. Tras inhibición selectiva y transitoria de p53 con
un principio activo endovenoso (pifitrina-), se producía un aumento de las
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
111
células BrdU+ tanto en la SVZ (inicial) como en las áreas lesionadas de la
corteza (a los 21 días), y un alto porcentaje de estas últimas co-expresaba
marcadores neuronales maduros, traduciéndose esto, en una mejoría
funcional neuronal (Luo et al., 2009). No descartamos pues, que se pueda
continuar trabajando en este campo de la terapéutica, pero siempre
valorando el riesgo-beneficio de actuaciones sobre p53, y teniendo en
cuenta sus efectos celulares tanto al inhibirlo como al sobreexpresarlo.
5.3. Papel del inhibidor del ciclo celular p27Kip1 en la SVZ.
Convergencias y divergencias con la acción de p53.
Mutaciones en el gen Cdknb1, que codifica para la proteína p27Kip1 son
detectadas con frecuencia en cáncer. En el caso de tumores gliales, su
ausencia se relacionaba con mal pronóstico (Park et al., 2004).
Paralelamente a p53, p27Kip1 también se expresaba en la SVZ adulta (van
Lookeren Campagne and Gill, 1998), por lo que podía ejercer un papel
regulador en la dinámica de sus poblaciones celulares. La pérdida de
función de p27Kip1, como se había demostrado en trabajos previos,
determinaba una ventaja proliferativa en la población de células tipo C de la
SVZ asociada a una disminución en el número de neuroblastos o neuronas
jóvenes (células tipo A) (Doetsch et al., 2002b). Consideramos interesante el
estudio en profundidad de los ratones defectivos p27Kip1-/- para confirmar
dichos hallazgos, así como el estudio del mutante compuesto p53-/-/p27Kip1-/-
que permitiera esclarecer el mecanismo de acción de ambas moléculas en
combinación o de forma contrapuesta, en lo referente a la proliferación y
neurogénesis en la SVZ, e incluso su potencial oncogenicidad.
Los dobles mutantes carecían de gliomagénesis espontánea, y
aunque se detectaba un aumento de la proliferación, como en el análisis
independiente de los mutantes individuales, el efecto no era sumatorio ni
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
112
sinérgico. Esto conllevaba un aumento neto de la celularidad en la SVZ, que
tampoco determinaba alteraciones de la citoarquitectura, más allá de la
formación de regiones de hiperplasia comparables a las observadas en el
mutante p53-/- y ausentes en el p27Kip1-/-. Se observó además un patrón
diferencial de adherencia en placa de cultivo de células derivadas de la SVZ
que mostraba una mayor adherencia e invasividad cuando p53 se
encontraba ausente. Aunque desconocemos la causa y no ha sido
investigada en este trabajo, la pérdida de función de p53 determina
(mediante su unión al promotor) el aumento de expresión de una proteína de
reciente descubrimiento, FAK (del inglés, Focal Adhesión Kinase)
(Golubovskaya and Cance, 2011; Hsia et al., 2003; Schaller et al., 1992).
Esta interrelación podría ser la responsable de los patrones de adherencia
diferenciales y alterados en nuestro estudio. En condiciones normales, FAK
contribuye a la regulación de las señales originadas en las integrinas y los
receptores de factores de crecimiento y que resultan en cambios en la
adhesión celular, el crecimiento independiente de anclaje, el estímulo de la
motilidad celular y la inhibición de la apoptosis. Al ser sobreexpresada (como
en el caso de los animales p53-/-), o expresada de forma anómala, se ha
demostrado su implicación en el control de la supervivencia celular, así como
en la proliferación, la motilidad y la invasividad de las células tumorales.
Sería de interés continuar investigando en esa dirección.
Un hallazgo relevante en el estudio de los diferentes genotipos, fue
el hecho de que ambos genes ejercieran papeles contrapuestos en la
neurogénesis adulta y que sus efectos antagónicos acabaran
complementándose en el ratón p53-/-/p27Kip1-/-. Los ratones p53-/-/p27Kip1-/-
mostraban un número de neuroblastos comparable con los animales wild
type, como se demostró apoyándonos en múltiples datos, tanto
ultraestructurales, inmunohistoquímicos, moleculares, y de comportamiento.
Previamente se había descrito que ratones defectivos para el primer exón de
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
113
Cdknb1 (que codifica la región N-terminal de p27Kip1 (Kiyokawa and Koff,
1998)) se caracterizaban por un número disminuido de neuroblastos.
Posibles explicaciones incluían: la disminución de la neurogénesis (es decir,
de la generación de neuroblastos), el aumento de muerte celular, la
dispersión celular (dependiente del extremo C-terminal de p27Kip1(McAllister
et al., 2003)) , o una combinación de varios de estos mecanismos. De hecho,
en estos ratones había una mayor apoptosis, pero no se podían descartar
las otras posibilidades. Los ratones estudiados por nosotros carecían
completamente del gen Cdknb1 (Fero et al., 1998), y mostraban igualmente
una disminución del número de células neuronales inmaduras asociada a un
incremento de apoptosis. Ausente el fragmento C-terminal de p27Kip1 se
descartaba el papel del citoesqueleto y la dispersión celular en estos efectos.
La proteína p27Kip1 modula la neurogénesis en el cerebro en
desarrollo mediante la unión de su extremo N-terminal al factor de
transcripción proneural, Ngn2, regulando su estabilidad al protegerlo de la
ubiquitinación, y de la degradación posterior en el proteasoma (Nguyen et
al., 2007). La ausencia de Ngn2 durante el periodo de determinación
neuronal podría determinar la muerte de las células con dicho programa
genético, aumentando la apoptosis y disminuyendo la formación de nuevas
neuronas. Nosotros comprobamos la existencia de una interacción similar en
el ratón adulto entre p27Kip1 y Ngn2, tanto en extractos procedentes de la
SVZ como del BO. Además, la inhibición del proteasoma in vitro con MG132
en cultivos de células de la SVZ, rescataba el bajo número de neuroblastos
detectado en cultivos defectivos para p27Kip1, sobre todo a los 1 y 3 DIV en
condiciones de diferenciación. Aquí es importante mencionar que, tras 5 DIV
no se observaban dichas diferencias o no eran significativas. Que la
diferencia fuera más evidente a tiempos cortos de diferenciación podría
explicarse como que MG132 solo ejerciera su función durante las etapas
tempranas del programa genético neurogénico, y no después de ya tomada
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
114
la “decisión” acerca del destino celular, en etapas más tardías de la
diferenciación. De hecho, la expresión de Tuj1, como marcador de neuronas
inmaduras in vitro, comenzaba tempranamente en DIV3, como pudimos
observar en animales nativos donde se estudió su patrón temporal de
expresión. En definitiva, ésta podría ser la explicación de cómo p27Kip1 regula
postranscripcionalmente la neurogénesis adulta. Estudios con marcadores
exógenos a largos tiempos de supervivencia demostraron que el efecto
negativo para la neurogénesis secundario a la pérdida del gen p27 se
extendía a la diferenciación terminal en la región del BO.
La pérdida de p53 rescataba el déficit neuronal secundario a la
ausencia de p27Kip1. Sin embargo, el mecanismo de acción, mediante el cual
p53 regula negativamente la neurogénesis, no está esclarecido, y es el
objeto de recientes trabajos. La supresión de la actividad de p53 en
neuronas fetales de cerebelo aceleraba su diferenciación terminal (Ferreira
and Kosik, 1996), y en neuroesferas de BO embrionario favorecía la
diferenciación neuronal (Armesilla-Diaz et al., 2009). Por el contrario, el
fenotipo de ratones transgénicos expresando una forma truncada pero
transcripcionalmente activa de p53 mostraba un número reducido de células
madre neurales en la SVZ y de neuronas en el BO (Medrano et al., 2009). La
interacción observada para p27Kip1 con Ngn2 no ocurría entre p53 y dicha
proteína, por lo que nos preguntamos si p53 regularía a nivel transcripcional
a otros factores de transcripción proneurales. De entre los genes que
estudiamos, solo detectamos la expresión precoz de NeuroD y Math3 en
células procedentes de SVZ p53-/-. Este hallazgo era compatible con un
trabajo previo, en el que una línea celular de progenitores astrocitarios
derivada de cerebros fetales deficientes para p53-/-, resultaba en la
generación precoz de células Tuj1+ con aumento de expresión de dichos
genes (Horiuchi and Tomooka, 2005). Un trabajo reciente, implica la cascada
de señalización de la proteína Notch (implicada en función neuronal y
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
115
desarrollo) en dicho efecto (Ferron et al., 2009). Y aunque la función de p53
como regulador se ha asociado a la activación o represión transcripcional de
genes diana, actualmente se valoran otras formas de regulación como la
secreción de exosomas dependiente de p53, exosomas con proteínas
efectoras que ejercen su acción fusionándose a los tipos celulares diana (Yu
et al., 2006; Yu et al., 2009). Por tanto, somos conscientes de que aunque el
mecanismo propuesto por nuestro trabajo puede explicar el aumento de la
neurogénesis, no es el único que ha sido sugerido en la literatura, y que
probablemente, la función reguladora por p53 dependa de múltiples
mecanismos moleculares convergentes.
En conclusión, el último apartado de nuestro estudio sugiere que p53
y p27Kip1 modulan diferencialmente la neurogénesis regulando la compleja
red transcripcional neurogénica (Figura 46).
Figura 46. Acción de las proteínas reguladoras p53 y p27 sobre las células
madre.
Regulación transcripcional
Regulación de la secrecion de exosomas
Regulación posttranscripcional
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
116
5.4. Conclusiones
- p53:
(1) se expresa en la SVZ adulta
(2) actúa regulando negativamente la proliferación y
autorrenovación de las aNSCs (células tipo B)
(3) actúa regulando negativamente la neurogénesis, aumentando
la formación de neuronas tras la pérdida de su función, en
relación con cambios en los niveles de expresión de los genes
proneurales Math3 y NeuroD
(4) no ejerce una función apoptótica significativa en la SVZ adulta,
cuyos mecanismos de muerte celular deben ser p53-
independientes
(5) su pérdida no es suficiente para la formación de tumores de
estirpe glial, pero supone un estado predisponente al asociarse
a estímulos mutagénicos adicionales
(6) ejerce un papel potencial en la adherencia al sustrato e
invasividad celular
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
117
- p27:
(1) se expresa en la SVZ adulta
(2) actúa regulando negativamente la proliferación de la
subpoblación de células tipo C o precursores de alta tasa de
proliferación
(3) actúa regulando positivamente la neurogénesis e inhibiendo la
muerte neuronal, estabilizando su unión a la proteína proneural
neurogenina 2, al inicio del programa neurogénico, impidiendo
su degradación por el proteasoma.
(4) su pérdida de función conlleva un aumento de apoptosis,
desconociéndose el mecanismo responsable
(5) su pérdida no es suficiente para la formación de tumores, ni
siquiera en asociación con la mutación completa del gen p53
ANEXO
ANEXO
120
ANEXO 1
Anexo 1.1. SVZ en humanos
La existencia de neurogénesis en el hipocampo ha sido demostrada en
humanos. Fue demostrada en tejido postmortem de pacientes con cáncer
que habían sido tratados con BrdU. Tras inmunohistoquímica se observaron
células en giro dentado doblemente marcadas para BrdU y marcadores
neuronales específicos (NeuN, calbindina o enolasa neuronal) (Eriksson et
al., 1998). Sin embargo, no está claro que exista formación de nuevas
neuronas en el BO como ocurría en ratón. Hasta ahora sólo se reconoce que
en las paredes de los VL existen células con características astrogliales que
proliferan y que, en determinadas condiciones de cultivo, se diferencian a
neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. Estas células han sido identificadas
como células madre neurales adultas en humanos (Sanai et al., 2004). La
citoarquitectura de los VL humanos, y por tanto de la SVZ, es muy diferente
de la de roedores (Figura anexo 1.1). La SVZ humana se puede dividir en
tres capas distintas:
(1) una única capa de células ependimarias en contacto con la luz
ventricular. Estas células mandan expansiones radiales hacia la red
glial que forma el neuropilo y hacia la capa 2
(2) una capa hipocelular o capa GAP con pocas células y básicamente
formada por expansiones astrocitarias y ependimarias. En ocasiones
se pueden encontrar neuronas y una estructura característica
formada por células ependimarias ectópicas o epéndimo desplazado.
El epéndimo desplazado es característico de esta capa y está
formado por 5 a 20 células. Estas células son ultraestructuralmente
idénticas a las células ependimarias con largos complejos de unión
entre ellas. Se organizan formando estructuras esféricas con cilios y
ANEXO
121
microvellosidades interactuando hacia el centro donde en ocasiones
aparece incluso una luz ventricular,
(3) una capa de astrocitos (astrocytic ribbon) formando una banda desde
donde mandan sus expansiones hacia la capa GAP. Estos astrocitos
son voluminosos y han sido identificados como aNSC humanas. A
diferencia de los ratones, en humanos, la capa GAP separa las
células madre de los VL. Aunque un hecho interesante es que, al
igual que los astrocitos en la SVZ murina, en ocasiones se observan
prolongaciones astrocitarias en contacto con el ventrículo. También
encontramos en esta capa axones mielínicos, oligodendrocitos y un
incremento progresivo de contactos sinápticos, y finalmente
(4) una zona transicional dentro del parénquima nervioso que comienza
con la aparición de somas neuronales.
Las células que proliferaban (BrdU+, mitosis, Ki-67+) se encontraron
siempre lejos de la capa ependimaria y eran GFAP+ pertenecientes a la
capa 3 o banda de astrocitos (Quinones-Hinojosa et al., 2006; Sanai et al.,
2004). Las células derivadas de la SVZ humana, que expresaban GFP (del
inglés green fluorescent protein) bajo el promotor de GFAP (mediante
transfección con vectores retrovirales) se aislaron por FACS (del inglés
fluorescence-activated cell sorting). Estas células fueron capaces de formar
clones de células madre in vitro, demostrando que los astrocitos eran
capaces de proliferar en respuesta a factores de crecimiento reproduciendo
su comportamiento en ratones. Estas neuroesferas, en medio de
diferenciación y tras la retirada de los factores de crecimiento dieron lugar a
oligodendrocitos, neuronas y astrocitos indicando que sus células eran por
definición aNSCs. Solo se encontraron células que expresaban marcadores
de neuronas migradoras (Tuj1, PSA-NCAM) en niveles anteriores del eje
rostro-caudal cerebral. Eran células elongadas con morfología de células
ANEXO
122
migradoras pero en ningún caso se encontraron cadenas de migradoras que
pudieran recordar a las descritas en ratones. Este hallazgo podría ser el
resultado de la falta de calidad del material humano utilizado o de la edad de
los individuos de donde los tejidos estudiados procedieron, pero también al
grado de neurogénesis en BO humano, que es escaso comparado con
roedores. Las células migradoras podrían existir en una RMS hacia el BO
pero marcadores específicos no fueron capaces de unirse o los criterios
morfológicos ultraestructurales no fueron los idóneos por ser un tejido
deteriorado. Por ello el estudio comparado de cerebro de primates supone
un avance en el conocimiento de la SVZ humana.
Figura anexo 1.1. Estructura en capas de la SVZ humana. La SVZ en humanos esta
formada una capa constituida por células ependimarias que lanzan su expansiones hacia una
segunda capa conectándose con expansiones astrocitarias. Esta capa carece de cuerpos
celulares-GAP (vacío). La tercera capa esta constituida por los cuerpos celulares de los
astrocitos. Por debajo de esta capa se encuentra el parénquima nervioso de los ganglios
basales (imagen obtenida de (Quinones-Hinojosa and Chaichana, 2007)
CAPA EPENDIMARIA
CAPA GAP
PARENQUIMA NERVIOSO
VENTRICULO
ANEXO
123
Anexo 2.1. SVZ en primates
La proliferación celular en la SVZ de primates se ha demostrado mediante la
utilización de marcadores como PCNA (del inglés proliferating cell nuclear
antigen), RNR (del inglés ribonucleotide reductase), 3H-Thy o BrdU y, al igual
que en ratones, han sido descritas cadenas de células migradoras PSA-
NCAM/Tuj1+ (Kornack and Rakic, 2001a; Kornack and Rakic, 2001b). Según
estos autores la tasa de generación, migración y/o diferenciación
comparadas con ratón son mucho menores en primates y para visualizar
neuronas marcadas con BrdU en BO se necesitaría esperar 75 días en
comparación con 7-10 días en ratón. En los primates del Viejo Mundo
(Macaca mulatta) se observaron células marcadas en la SVZ, tracto olfatorio
y BO, 2 horas tras inyección de BrdU. La mayoría de las células BrdU+ en la
SVZ se encuentran en la región más ventral y lateral, correspondiéndose con
la región subependimaria adyacente a los núcleos de la base. En el tracto
olfatorio, las células marcadas son elongadas respecto al eje del mismo. El
hecho de que células en proliferación se encuentren en el BO confirmaba
que las células residentes del BO del mono retienen potencial proliferativo en
monos. En ningún caso las células ependimarias fueron positivas para este
tipo de marcadores (Pencea et al., 2001a).
La autora de esta tesis ha estudiado de forma precisa la organización
de la SVZ en primates del tipo Macaca mediante el uso de marcadores
moleculares y ME aportando nuevos datos que puedan esclarecer el sentido
y el mecanismo de neurogénesis en mamíferos superiores (Gil-Perotin et al.,
2009). La organización de la SVZ en Macaca fascicularis reproduce, con
algunas diferencias, la observada en humanos. Los ventrículos laterales
están tapizados por una capa, a menudo pseudoestratificada, de células
ependimarias, cúbicas o cilíndricas, con múltiples cilios en la superficie
apical que es la que contacta con la luz del ventrículo. Existe una capa vacía
ANEXO
124
de cuerpos celulares por debajo de la monocapa ependimaria que
dependiendo de las zona estudiada puede ser más delgada o más gruesa, y
que está formada casi exclusivamente por expansiones astrocitarias o
ependimarias (Figura anexo 2.1.). Esta capa es idéntica a la descrita en
humanos con el nombre de capa GAP. Los somas de los astrocitos que
originan las expansiones de la capa GAP forman una banda que se extiende
en paralelo a la superficie del ventrículo, la banda astrocitaria, también
descrita en humanos pero no en roedores.
Figura anexo 2.1. SVZ en monos (Macaca Fascicularis) (leyenda en pagina siguiente)
ANEXO
125
Figura anexo 2.1. SVZ en monos (Macaca Fascicularis). A) Imagen panorámica de los
ventrículos laterales (lv). Escala: 1 mm). B) La SVZ en Macaca fascicularis(Mf), como ocurre
en humanos es mas ancha (flecha) que en ratones y con menor celularidad. Escala: 10 m).
C) La región dorsal que linda con el cuerpo calloso (cc) es una monocapa de células
ependimarias y axones mielínicos. Escala: 10 m). D) El septum, medial a los VL es una capa
de celulas ependimarias y ocasionales astrocitos y microglia. Escala: 10 m. E) El asta ventral
del VL (vhSVZ) posee gran celulaidad asociada a grandes vasos y se expande rostralmente
hacia el BO. Escala: 25 m. F) Micrografia al microscopio electrónico que muestra las capas
que constituyen la SVZ en primates. Escala: 5 m) (lv: ventrículo lateral, cc: cuerpo calloso,
bg: ganglios basales).
El parénquima nervioso a partir de esta capa está constituido por un
entramado de fibras, mielina y neuronas que forman parte de los ganglios de
la base. Mediante el uso de la microscopía confocal, observamos que las
células en SVZ se organizan de manera más parecida a humanos que a
roedores, y que expresan los mismos marcadores celulares específicos del
linaje celular al que pertenecen. Sin embargo, aunque en humanos está en
entredicho la existencia del RMS per se (Curtis et al., 2007; Quinones-
Hinojosa et al., 2006), los Macaca sí que lo presentan y se asemeja bastante
al de ratón (Figura anexo 2.2).
Las células migradoras se organizan formando cadenas rodeadas de
expansiones astrocitarias como veíamos al hablar de la SVZ de ratón,
aunque estas cadenas están menos ramificadas y las células más
densamente empaquetadas. En este caso, la envoltura glial es tan ancha
que podría considerarse una prolongación de la capa GAP adventricular. La
anchura y el número de células de las cadenas va disminuyendo hasta
hacerse mínimo a la altura del BO. En Macaca fascicularis hemos
encontrado tipos celulares de gran similitud con respecto a los descritos
previamente por nuestro grupo en ratón. Así existen células ependimarias,
células tipo B, y células tipo A o neuroblastos.
ANEXO
126
Figure anexo 2.2. Camino migrador rostral (RMS) en el cerebro de mono (leyenda en
página siguiente)
ANEXO
127
Figure anexo 2.2. Camino migrador rostral (RMS) en el cerebro de mono. A) Diagrama
del RMS superpuesto a corte sagital de cerebro en fresco. Comenzando en el asta ventral de
la SVZ (vhSVZ), el camino migrador se expande en vertical y luego horizontalmente (tracto
olfatorio (OT) adentrándose en el BO. Escala: 1 cm). B, C) el vhSVZ (B) se compone de
cadenas de células migradoras a lo largo de un camino plagado de vasos sanguíneos. En el
detalle (C) se observan los astrocitos de núcleos mas claros flanqueando a las células
migradoras (asteriscos negros y blancos respectivamente). Escala: B: 250 m, C: 10 m). D-
J) Tracto olfatorio. Secciones coronales donde se observa el RMS en su centro, de morfología
excéntrica, y rodeado de un espacio hipocelular (sombreado en verde) similar a la capa GAP
de la SVZ. En una sección longitudinal, axones mielínicos acompañan en paralelo a estas
células (flechas en G). El grosor y la celularidad disminuyen a medida que se acercan al BO.
Escala: D: 200 m, E:15 m, F: 200 m, G:25 m, H:15 m, I: 200 m, J:10 m) K-L) Bulbo
olfatorio. Las cadenas migradoras compuestas por menos de 2-3 células se encuentran en el
centro rodeadas de células granulares. Escala: K: 75 m, L: 25 m).
Sin embargo, aunque en Macaca no hemos encontrado células tipo
C, datos en primates del Nuevo Mundo, concretamente el Marmoset (género
Callithrix), nos desvelan que sí que existen células con características
intermedias entre células B y A que podrían corresponderse con dichos
precursores (Sawamoto et al., 2010). El hecho de que no se encuentren
células C en Macaca fascicularis podría deberse a que el número de células
migradoras en la SVZ es muy reducido y no harían falta células de
amplificación.
Las ventajas del estudio en primates son, entre otras, la posibilidad de
extrapolar al humano, no sin precaución, los datos obtenidos, y la capacidad
de manipular a los individuos mediante ensayos genéticos o farmacológicos
con mayor flexibilidad que en humanos.
ANEXO
128
ANEXO 2. LISTADO DE GENES TESTADOS POR PCR
CUANTITATIVA
- Dianas transcripcionales de p53
p21
Bax
PUMA
IGFBP1
- Familia p53 de genes
p63
p73
p73Tap (delta)
- Genes implicados en la diferenciación
Mash1
Btg2
Familia Hes (Hes1, Hes5, Hes6)
Math3
NeuroD
Ngn2
Nanog
Id2
Bmp4
Noggin
ANEXO
129
- Otros genes:
p27
Olig2
Fgf2
GFAP
Dlx2
NCAM
Integrin
Nestin
Cited2
Rab3b
Stathmin
PDGF
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