UNIVERSIDAD NACIONAL UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICOAUTONOMA DE MEXICO

Estudio del mecanismo de regulación transcripcional por la proteína RhlR de Pseudomonas aeruginosa.

Presentado por:Gerardo Enrique Medina Basulto

Tutor:Dra. Gloria Soberón Chávez

Instituto de BiotecnologíaInstituto de Biotecnología

Doctorado en Ciencias BioquímicasDoctorado en Ciencias Bioquímicas

INTRODUCCIONINTRODUCCION

Bacteria Gram negativaBacteria Gram negativa

Patógeno oportunista Patógeno oportunista Fibrosis quísticaFibrosis quísticaQuemadurasQuemadurasInmunodeficienciaInmunodeficiencia

Producción de factores de virulenciaProducción de factores de virulenciaRamnolípidosRamnolípidosProteasasProteasasToxinasToxinasPigmentosPigmentos

Ubicua en la naturalezaUbicua en la naturaleza

Genoma de Genoma de 6.3 6.3 Mpb Mpb

Gran versatilidad metabólicaGran versatilidad metabólica

67% de G+C en su genoma67% de G+C en su genoma

Pseudomonas Pseudomonas aeruginosaaeruginosa

Organismo Feno ti po Autoi nduc torsintetasa

Regul adortransc ripcio nal

Autoi nducto r

Agrobacteriumtume faciens

Con jugación TraI TraR OOHL

Chromobacteriumviolaceum

Antibióticos, exoenzimas,violaceina

CviI CviR HHL

Erwinia carotov ora Antibioticos, exoenzimas CarI CarR OHHL

Erwinia stewartii Exopolisacárido EsaI EsaR OHHL

Escherichia coli División celular ? SdiA ?

Vibrio(Photobacterium)fischeri

Bioluminiscencia LuxI LuxR OHHL, HHL

Pseudomonasaeruginosa

Proteasa alcalina,elastasa, exotoxina A,exoenzima S,neuraminidasa,hemolisina.Quitinasa, elastasa,piocianina,ramnolípidos,RpoS

LasI

RhlI

LasR

RhlR

OdDH L

BHL

Serratia lique faciens Motilidad, fosfolipasa SwrL ? BHL

Algunos sistemas detectores de quórum en bacterias Algunos sistemas detectores de quórum en bacterias gram-negativasgram-negativas

Regulación de la transcripción

Multime-rización

Unión aAHL

LuxR

LuxR

AHL

transcripción

Promotor blanco

ARNpolimerasa

ADN

Caja lux

5´ 3´

N-terminal C-terminal

gen

Dominios de la proteína LuxR y modelo de activación de laDominios de la proteína LuxR y modelo de activación de lattranscripción por dicha proteínaranscripción por dicha proteína

HTH activación

luxI C D A B E G luxR

Caja lux

LuxR

LuxR

LuxI OHHL

+

Regulación de la bioluminiscencia en Regulación de la bioluminiscencia en Vibrio fischeriVibrio fischeri

Modelo de la biosíntesis de HHL catalizado por LuxI enModelo de la biosíntesis de HHL catalizado por LuxI enV. fischeriV. fischeri

TDP-L-ramnosa

TDP

(CH2)6

CH3

HO CH CH2 CO S ACP

Biosíntesis de ramnolípidos mostrando las reaccionesBiosíntesis de ramnolípidos mostrando las reaccionescatalizadas por RhlAB y RhlC en catalizadas por RhlAB y RhlC en P. aeruginosaP. aeruginosa..

OPO

O

PO

OH

CH3

OOH

CH3

OHOH

O

O

O O

P

OH

O

Timidina

dTDP-L-ramnosa hidroxidecanoil-ACP

+

Lipopolisacáridos

RhlABRhlABTDP

L-ramnosil--hidroxidecanoil-- hidroxidecanoato

(CH2)6

CH3

(CH2)6

CH3

O

O CH CH2 C OOH O CH CH2 COOHO

CH3

OHOH

L-ramnosil-L-ramnosil--hidroxidecanoil-- hidroxidecanoato

RhlCRhlC

(CH2)6

CH3

(CH2)6

CH3

O

O CH CH2 C O CH CH2 COOHOOH O

CH3

OOH

OH O

CH3

OHOH

BHL

RhlRautoinductorsintetasaRhlR

+ ? +

rhlA rhlB rhlR rhlI+

rhlC

-RhlR

autoinductorsintetasaRhlRRhlR

+ ? +

rhlA rhlB rhlR rhlI+

rhlC

Ramnolípidos

-

Modelo regulatorio de la producción de ramnolípidosModelo regulatorio de la producción de ramnolípidosen en P. aeruginosaP. aeruginosa

LasR

OdDHL+

OBJETIVOSOBJETIVOS

Objetivo generalObjetivo general

-Estudiar la regulación transcripcional de los genes rhlA y rhlR de Pseudomonas aeruginosa así como la interacción de la proteína RhlR con la región promotora de rhlA.

Objetivos específicosObjetivos específicos

-Determinar cuales son los factores involucrados en la expresión del gen rhlA y las condiciones necesarias para su expresión.

-Establecer el o los sitios de unión de la proteína RhlR a la región promotora del gen rhlA y las condiciones en que se presenta dicha interacción.

-Determinar cuales son los factores involucrados en la expresión del gen rhlR, sus inicios transcripcionales y las condiciones necesarias para su expresión.

RESULTADOSRESULTADOS

Silenciamiento en fase exponencial del promotor Silenciamiento en fase exponencial del promotor rhlAB.rhlAB.

Las lineas 1, 2 y 3 muestran la expresión de RhlR a las 2, 4 y 8 horas de crecimiento respectivamente. Las lineas 4, 5 y 6 muestran la expresión de RhlR a las 2, 4 y 8 horas en cultivos con 10M de C4-HSL y 0.1mM de IPTG.

Inmunodetección de RhlR a lo largo de la curva de crecimientoInmunodetección de RhlR a lo largo de la curva de crecimientoen la cepa PAO1/pECP61.5 en medio PPGAS.en la cepa PAO1/pECP61.5 en medio PPGAS.

1 2 3 4 5 6 MR

40

30

20

Expresión de Expresión de rhlA::lacZrhlA::lacZ en la cepa PAO1/pECP61.5 a lo largo en la cepa PAO1/pECP61.5 a lo largo de la curva de crecimiento en medio PPGAS.de la curva de crecimiento en medio PPGAS.

Tiempo (horas)

D.

O.

600n

m

Un

idad

es m

ille

r

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

2 4 6 8

0,01

0,1

1

10

PPGAS D. O. 600nmAIPTG D. O. 600nmPPGASAIPTG

Inmunodetección de RhlR a lo largo de la curva de crecimiento en Inmunodetección de RhlR a lo largo de la curva de crecimiento en la cepa DH5la cepa DH5/pECP61.5./pECP61.5.

Las lineas 1, 2 y 3 muestran la expresión de RhlR a las 2, 4 y 8 horas de crecimiento respectivamente. Las lineas 4, 5 y 6 muestran la expresión de RhlR a las 2, 4 y 8 horas en cultivos con 10M de C4-HSL y 0.1mM de IPTG.

1 2 3 4 5 6

MR40

3020

Expresión de Expresión de rhlA::lacZrhlA::lacZ en la cepa DH5 en la cepa DH5/pECP61.5 a lo largo /pECP61.5 a lo largo de la curva de crecimiento.de la curva de crecimiento.

Tiempo (horas)

D.

O.

600n

m

Un

idad

es m

ille

r

0

50

100

150

200

250

300

2 4 6 8

0,1

1

10

LB D. O. 600nmAIPTG D. O. 600nmLBAIPTG

0,1

1

10

Tiempo (horas)

Un

idad

es

mille

r

O.

D.

600n

m

0

100

200

300

400

500

600

700

2 4 6 8

MC4100 600nmMC4100 AIPTG 600nmJV1065 600nmJV1065 AIPTG 600nmMC4100MC4100 AIPTGJV1065JV1065 AIPTG

A

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

2 4 6 8

Tiempo (horas)

Un

idad

es m

ille

r

D.

O.

600n

m

0,01

0,1

1

10PAO1 600nmPAO1 AIPTG 600nmPAS1 600nmPAS1 AIPTG 600nmPAO1PAO1 AIPTGPAS1PAS1 AIPTG

B

Efecto de una mutación en el gen Efecto de una mutación en el gen rpoSrpoS en la expresión de en la expresión de rhlArhlA en enE. coliE. coli (A) y en (A) y en P. aeruginosaP. aeruginosa (B). (B).

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

2 4 6 8

0,1

1

10

Tiempo (horas)

Un

idad

es

mille

r

D.

O.

600n

mpGM LB 600nmpGM AIPTG 600nmpMT LB 600nmpMT AIPTG 600nmpGM LBpGM AIPTGpMT LBpMT AIPTG

Cinética de la expresión deCinética de la expresión de rhlA rhlA en presencia de RhlR o en presencia de RhlR oLasR en LasR en E. coliE. coli..

Mecanismo de regulación transcripcional delMecanismo de regulación transcripcional delpromotor promotor rhlABrhlAB por RhlR. por RhlR.

- + - + - +

I II III

G A T C - + - + - +

0

100

200

300

400

500

600

Un

idad

es m

ille

r I II III

Mapeo del sitio de inicio transcripcional de Mapeo del sitio de inicio transcripcional de rhlArhlA y nivel y nivel de expresión en diferentes cepas de de expresión en diferentes cepas de E. coliE. coli..

I. DH5/pECP61.5II. ET8000/pECP61.5III. GMN01/pECP61.5

- Ausencia de BHL+ Presencia de BHL

1 2 3 4 5 6 7 8

CF

1 2 3 4 5

CF

prhlA frio

C4-HSL C12-HSL

Retardamiento en gel de un fragmento conteniendoRetardamiento en gel de un fragmento conteniendoel promotor de el promotor de rhlA.rhlA.

1 2 3 4 5 6

CF

RhlRA

B

C

Carriles 1A, 1B, 1C.- Fragmento sin RhlRCarril 2C.- Fragmento + RhlR -AI

GGCGGCCGCCCGTCCTGTGAAATCTGGCAGTTACCG

-35

las

box

*

*

*

*

-20

-30

-40

-50

-60

-70

*

*

Protección Protección in vivoin vivo de la región promotora de de la región promotora derhlArhlA por RhlR por RhlR

1. DH5/pMPCG-pUCP20 +AI2. DH5/pMPCG-pGMYC +AI3. DH5/pMPCG-pUCP20 +IPTG4. DH5/pMPCG-pGMYC +IPTG

G A T C 1 2 3 4

*-80

-90

Expresión de Expresión de rhlArhlA en la cepa DH5 en la cepa DH5/pECP61.5 en/pECP61.5 en presencia de diferentes concentraciones de IPTG. presencia de diferentes concentraciones de IPTG.

0

50

100

150

200

250

LB AI 10M AIPTG 0.1 AIPTG 0.5

Un

idad

es m

iller

30

MR AI 10M AIPTG 0.1 AIPTG 0.5

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

1 32

Un

idad

es m

ille

r

1.- PAO1/pECP61.5 PPGAS2.- PAO1/pECP61.5 + C4HSL3.- PAO1/pECP61.5 + C4HSL + 1mM IPTG

MR

1 2 3

30

Expresión de Expresión de rhlArhlA y concentración de RhlR y concentración de RhlRen en Pseudomonas aeruginosaPseudomonas aeruginosa..

Expresión de una fusión Expresión de una fusión rhlA::lacZrhlA::lacZ en la cepa en la cepa DH5DH5de de E. coliE. coli..

Plásmido NA AI IPTG AI + IPTG

pMPCG 2.3 0.7 (1.4) 4.1 0.3 (2.6) 1.9 0.4 (1.2) 1.9 0.4 (1.2)pMPCG/pGMYC 1.5 0.2 (0.9) 157 14 (100) 1.2 0.2 (0.7) 130 12 (83)pMPCG/pMT1 0.6 0.2 (0.3) 12.3 1.3 (7.8) 0.6 0.3 (0.3) 12.1 0.4 (7.6)

Actividad -galactosidasa (%)*

RNPRhlR-10-35las box

-10-35las box

-10-35las box

BHL

RNPRhlR

RNPRhlR

A

BI

BII

Modelos propuestos de la interacción de RhlR con elModelos propuestos de la interacción de RhlR con el promotor de promotor de rhlArhlA y con la ARN polimerasa ya sea en y con la ARN polimerasa ya sea en

presencia o ausencia de autoinductorpresencia o ausencia de autoinductor

Regulación transcripcional del gen Regulación transcripcional del gen rhlRrhlR..

0

5

10

15

20

25

30

35

Absorbancia a 600nm

PAO1/1002 LB

PAO1/1002 PPG

PAOR1/1002 LB

PAOR1/1002 PPG

0.5 1 1.5

Un

idad

es m

ille

r (1

x103 )

Expresión de Expresión de rhlR::lacZrhlR::lacZ en una cepa de en una cepa de P.P.aeruginosa aeruginosa mutante en el gen mutante en el gen lasR.lasR.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0.5 1 1.5

Un

idad

es m

ille

r (1

x103 )

Absorbancia a 600nm

PG201 LBPG201 PPGAS65E12 LB65E12 PPGAS

Expresión de Expresión de rhlR::lacZrhlR::lacZ en una cepa de en una cepa de P.P.aeruginosa aeruginosa mutante en el gen mutante en el gen rhlRrhlR

0

5

10

15

20

25

30

0.5 1 1.5

Absorbancia a 600nm

Un

idad

es m

i lle r

(1 x

1 03 )

PAK LB

PAK PPGAS

PAKN1 LB

PAKN1 PPGAS

Expresión de Expresión de rhlR::lacZrhlR::lacZ en una cepa de en una cepa de P.P. aeruginosaaeruginosa mutante en el gen mutante en el gen rpoNrpoN..

Inicios transcripcionales de Inicios transcripcionales de rhlRrhlR en en P. AeruginosaP. Aeruginosaen medio PPGAS crecida a 1.5 de Abs. 600nm.en medio PPGAS crecida a 1.5 de Abs. 600nm.

A

C T A G 1 2 3 4

P1

P2

P3

1. PAO12. PAOR1 (lasR-)3. PAK4. PAKN1 (rpoN-)

B

C T A G 1 2 3 4 5

P3

P2

P1

1. PG2012. 65E12 (rhlR-)3. PAKN14. PAK5. PAS1 (rpoS-)

Inicio transcripcional mas distal de Inicio transcripcional mas distal de rhlRrhlR en en P. P. AeruginosaAeruginosa crecida en PPGAS a 1.5 Abs. 600nm crecida en PPGAS a 1.5 Abs. 600nm

A

C T A G 1 2

P4

1. PAO12. PAOR1 (lasR-)

B

C T A G 1 2

P4

1. PAO12. PAO9001 (vfr-)

-24

GGCGTTTCAT

rhlB

GTGCCGAGGT GCTGCTGCCC TGCGCCCACG ACCAGTTCGA CAATGCCGAA -348

CGGCTGGTCC GGCTCGGCTG CGGGATGCGC CTGGGCGTGC CATTGCGCGA -298

-35

GCAGGAGTTG CGCGGGCTGG TGGCGCTTGC TCGAGGACCC GGCCATGGCG -248

-10 VFR

GCGGCCTGTC GGAATTGTCA CAACCGCACA GTATCGCTTG -198

CGGTAAAGCG GCCCAGGTGG TCGAACGTTG TCATAGGGAG GGGGATGCGC -148

GATGGCTGAA GGCTGCGTCC TGAACGGTGC TGGCATAACA GATAGGGTTG -98

CCATGATTTT GCCGTATCGG CAAGGCTGCG CGCTTGACAG CGTCATACCC -48

-10 -10

CGGGCCAATT CTGCTGTGAT GCATTTTATC GATCAGGGCT TACTGCAATG +3

AGGAATGACG GAGGCTTTTT GCTGTGGTGG GACGGTTTGC GTAGCGAGAT G +54

P 1P2

P 3

rhlR

las box 1

-35 -35

-12

P4

pRD58-1

las box 3

las box 2

Oligo 2

Oligo 1

Secuencia nucleotídica de la región corriente arribaSecuencia nucleotídica de la región corriente arriba de de rhlRrhlRmostrando los elementos mostrando los elementos reguladores reguladores importantesimportantes..

rhlAB

rhlI

lasB

rhlR1

rhlR2

rhlR3

T C C T G T G A A A T C T G G C A G T T C C C T A C C A G A T C T G G C A G G T

A C C T G C C A G T T C T G G C A G G T

G G C T G C G C G C T - T G A C A G C G

C G G T G C T G G C A - T A A C A G A T

C C C T G C G C C C A CG A C C A G T T

Alineamiento de las probables cajas Alineamiento de las probables cajas laslas encontradas en la encontradas en la región reguladora de región reguladora de rhlRrhlR con otras cajas con otras cajas laslas reportadas. reportadas.

A A N T G T G A N N N N N N T C A C A N T T

A A A T G T G A T C T A G A T C A C A T T T

A A T T G T C A - C A A C C G C A C A G T A

E. coli CRP lasRrhlR

Alineamiento de la probable caja VFR encontrada en la región Alineamiento de la probable caja VFR encontrada en la región reguladora de reguladora de rhlRrhlR con la caja VFR presente en con la caja VFR presente en lasRlasR y con la y con la

secuencia consenso para la unión de CRP de secuencia consenso para la unión de CRP de E. coliE. coli..

0

2

4

6

8

10

12

14

AI+IPTG

Un

idad

es m

ille

r

Expresión de Expresión de rhlR::lacZrhlR::lacZ en una fusión que carece en una fusión que carecede una de las probables cajas de una de las probables cajas laslas en en E. coliE. coli

DH5/pRD58-1DH5/pRD58-2

Influencia del medio de cultivo en la expresión de Influencia del medio de cultivo en la expresión de rhlRrhlR y y en la producción de ramnolípidos.en la producción de ramnolípidos.

Glucosa 1.5% Glucosa 1.5% 150mM NH4Cl

Glicerol 0.75% Gluconato 1.5%

Expresión de Expresión de rhlRrhlR y producción de y producción de ramnolípidos en fase estacionaria tardía de la ramnolípidos en fase estacionaria tardía de la

cepa PAO1 en medio M9 modificado.cepa PAO1 en medio M9 modificado.

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

Un

idad

es

mille

r

100

200

300

400

500

600

700

800

900

0

g/m

l

Concentración de ramnolípidos

Actividad galactosidasa

Expresión de Expresión de rhlRrhlR y producción de ramnolípidos en y producción de ramnolípidos enfase estacionaria de la cepa PAO1 en medio PPGASfase estacionaria de la cepa PAO1 en medio PPGAS

modificado.modificado.U

nid

ad

es m

ille

r

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

50000

100

150

200

250

300

350

400

450

500

0

50

Tris HCl +PO4 MOPS - Buffer

Actividad galactosidasa

Concentración de ramnolípidos

g/m

l

Expresión de Expresión de rhlRrhlR y producción de ramnolípidos y producción de ramnolípidos de la cepa PAO1 en medio LB modificadode la cepa PAO1 en medio LB modificado

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

LB LB +MOPS LB LB +MOPS

1.5 A 600nm Fase estacionaria tardía

400

200

100

0

300

g/m

l

Actividad - galactosidasa

Concentración de ramnolipidos

Un

idad

es m

ille

r

CONCLUSIONESCONCLUSIONES

I.                        El operón rhlAB se transcribe principalmente en fase estacionaria aún en presencia de RhlR y BHL desde la fase exponencial de crecimiento. Este silenciamiento de la expresión en fase exponencial puede estar relacionado con la respuesta astringente o con la presencia de algún represor. II.                        La expresión del promotor del gen rhlA es parcialmente dependiente del factor s en tanto no tiene un efecto directo en este proceso como había sido propuesto anteriormente. III.                        Existe una interacción directa y específica entre el regulador transcripcional RhlR y la región promotora de rhlA, la cual ocurre tanto con la proteína RhlR sola, como acomplejada con BHL. IV.                 La conformación tomada por RhlR varía dependiendo de si esta acoplado o no al autoinductor, como se manifiesta por las diferencias en la extensión que cubre del promotor de rhlA en estas dos condiciones. V.                        Cuando RhlR está acomplejado con BHL, funciona como un regulador positivo de rhlA, en tanto cuando no lo está funciona como un regulador negativo.

La región regulatoria de rhlR posee cuatro promotores, tres de los cuales muestran diferencias en su expresión dependiendo de la presencia de reguladores transcripcionales tales como LasR, Vfr, y RpoN que actuan como reguladores positivos, en tanto rhlR posee una autorregulación negativa por RhlR. 

La región promotora de rhlR presenta tres probables cajas las y una probable caja Vfr. 

La expresión de rhlR no solo depende de una alta densidad celular, sino de la composición del medio. Esta dependencia correlaciona con la existencia de una compleja estructura de su región promotora. 

La regulación de la expresión de rhlR muestra que es un punto importante en la respuesta del sistema detector de quórum a factores ambientales así como para la producción de ramnolípidos, sin embargo la presencia de RhlR no es suficiente para producirlos.

VI.

VII.

VIII.

IX.

GacS

GacA

GacA-P

PO4

CitoplasmaVfr

lasR lasI

N-3-odDHL

LasRrhlRrhlI

RhlR

LasI

RhlI

N-BHL

lasB

lasA

apr

xcprhlAB

rpoS

HCNLectinas

s

?

(-)

QscR + AI(?)

Biopelículas

rhlC PA1131

qscR

(-)

2(phzABCDEFG)?

RsaL

PQS

ppGpp

( - )

Modelo de regulación de algunos factores de virulenciaModelo de regulación de algunos factores de virulenciaen en P. aeruginosaP. aeruginosa, mostrando los dos sistemas detectores, mostrando los dos sistemas detectores

de quórum y otros reguladores importantes.de quórum y otros reguladores importantes.

PERSPECTIVASPERSPECTIVAS

1. Determinar cual es el factor responsable del “silenciamiento” en fase exponencial de la expresión de rhlAB. 2. Determinar cuales son las bases importantes de la caja las de rhlAB para la especificidad y afinidad por la proteína RhlR. 3. Demostrar que la caja VFR putativa encontrada en la región promotora de rhlR es en efecto una secuencia de pegado de esta proteína. 

4. Determinar cual o cuales de las tres cajas las encontradas en la región promotora de rhlR son funcionales, así como determinar si son sitios de pegado de LasR, de RhlR o de ambos. 5. Medir la concentración de autoinductores en los sobrenadantes de los medios utilizados, para determinar si la síntesis de autoinductores es el factor limitante para la producción de ramnolípidos en algunas condiciones de cultivo.