UNIVERSIDAD GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS...
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UNIVERSIDAD GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS MODO SEMESTRAL TEMA: Evaluación de la capacidad antioxidante de kéfir con leche UHT descremada a diferentes tiempos de fermentación. AUTORES: Sandy Lissette Dume Ortega Emilio Iván Sánchez Carrillo TUTOR: Q. F Carlos Jefferson Valdiviezo Rogel M.Sc. PERIODO LECTIVO 2018-2019 Tl2 Guayaquil – Ecuador TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITO PREVIO PARA OPTAR POR EL GRADO DE QUÍMICOS Y FARMACÉUTICOS
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UNIVERSIDAD GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
MODO SEMESTRAL
TEMA:
Evaluación de la capacidad antioxidante de kéfir con leche UHT descremada
a diferentes tiempos de fermentación.
AUTORES:
Sandy Lissette Dume Ortega
Emilio Iván Sánchez Carrillo
TUTOR:
Q. F Carlos Jefferson Valdiviezo Rogel M.Sc.
PERIODO LECTIVO
2018-2019 Tl2
Guayaquil – Ecuador
TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITO PREVIOPARA OPTAR POR EL GRADO DE QUÍMICOS Y FARMACÉUTICOS
2
AGRADECIMIENTO
A Dios por permitirme culminar esta gran etapa de mi vida gracias a su bondad
y favor los cuales siempre estuvieron en los momentos más duros de mi vida.
A mis padres, que, de no ser por su apoyo incondicional, esfuerzo y amor no
hubiera tenido la provisión y el entendimiento de cuan importante es culminar
mis estudios.
A la Q.F Jacqueline Dranguet por su oportuna e importante ayuda para poder
realizar el presente trabajo de investigación.
A mi tutor Q.F. Carlos Valdiviezo, por compartir su experiencia y apoyo en la
realización de esta investigación.
Emilio Iván Sánchez Carrillo
3
AGRADECIMIENTO
Dedico este proyecto de titulación a Dios y a mi familia. A Dios porque
siempre ha sido mi guía y me ha dado fuerzas para seguir adelante con todo lo
que me propongo, también doy gracias a él, ya que quien me permitió conocer
personas que nos extendieron la mano para poder realizar este proyecto de la
mejor manera. A mi familia Quienes han sido mi apoyo a largo de toda mi vida
y me han motivado a seguir adelante y que apresar de las dificultades que se
puedan presentar siempre mirar el lado positivo y confiar que Dios tiene el control
de nuestras vidas.
A mis amigos de quienes siempre recibí palabras de aliento para seguir y
poder lograr esta meta, sabiendo que luego vendrán muchas más.
Y finalmente a mis docentes de quienes obtuve no solo conocimientos
sino también consejos para la vida profesional, donde también debo agradecer
al Q.F Carlos Valdivieso MsC, quien fue uno de los guías en el trabajo de
titulación, ayudándonos a siempre dar más de lo que creemos que podemos
hacer y llegar a ser buenos y responsables profesionales.
Sandy Lissette Dume Ortega
4
ÍNDICE
RESUMEN ..................................................................................................... 9
ABSTRACT.................................................................................................. 10
INTRODUCCIÓN ......................................................................................... 11
CAPITULO I ................................................................................................. 13
1.1 Planteamiento del problema ............................................................ 13
1.1 Formulación del Problema: .............................................................. 13
1.2 Justificación e importancia ............................................................... 14
1.3 Objetivos .......................................................................................... 15
1.3.1 Objetivo general ..................................................................... 15
1.3.2 Objetivos específicos ............................................................. 15
1.4 Hipótesis .......................................................................................... 15
CAPITULO II ................................................................................................ 16
2. Marco Teórico .................................................................................. 16
2.1 Tipos de leche.................................................................................. 16
2.1.1 Leche ..................................................................................... 16
2.1.2 Leche cruda ........................................................................... 16
2.1.3 Leche pasteurizada................................................................ 16
2.2 Clasificación..................................................................................... 16
2.2.1 Leche entera .......................................................................... 17
2.2.2 Leche semidescremada ......................................................... 17
2.2.3 Leche descremada................................................................. 17
2.3 Fermentación ................................................................................... 17
2.4 Tipos de fermentación...................................................................... 17
5
2.4.1 Fermentación alcohólica ........................................................ 18
2.4.2 Fermentación Láctica............................................................. 18
2.5 Principales tipos de leches fermentadas.......................................... 19
2.5.1 Yogur. .................................................................................... 19
2.5.2 Kumis. .................................................................................... 19
2.5.3 Kéfir........................................................................................ 19
2.6 Diferencias entre el yogurt y el kéfir. ................................................ 20
2.7 Kéfir ................................................................................................. 20
2.7.1 Generalidades........................................................................ 20
2.7.2 Definición ............................................................................... 21
2.7.3 Características de kéfir .......................................................... 22
2.8 Biomasa de los gránulos de Kéfir .................................................... 22
2.9 Kefiran.............................................................................................. 23
2.10 Composición Química y Nutricional De Kéfir: ............................... 24
2.11 Microorganismos de los granos de Kéfir....................................... 26
2.12 Beneficios del Kéfir ....................................................................... 28
2.13 Radicales libres y antioxidantes.................................................... 29
2.13.1 Daño o estrés oxidativo........................................................ 29
2.13.2 Radicales libres.................................................................... 29
2.14 Antioxidantes ................................................................................ 29
2.14.1 Mecanismos protectores ante el estrés oxidativo................. 30
2.14.2 Antioxidantes exógenos ....................................................... 30
CAPITULO III ............................................................................................... 31
3 Metodología ........................................................................................ 31
6
3.1 Tipo de investigación ....................................................................... 31
3.2 Lugar de trabajo............................................................................... 31
3.3 Variables .......................................................................................... 31
3.3.1 Variable dependiente ............................................................. 31
3.3.2 Variable independiente .......................................................... 31
3.3.3 Variable Interviniente ............................................................. 31
3.4 Materiales y Métodos....................................................................... 32
3.4.1 Materias Primas: .................................................................... 32
3.5 Elaboración de Kéfir......................................................................... 32
3.7 Esquema de la elaboración de kéfir. ................................................ 33
3.8 Obtención de las muestras de Kéfir para lecturas espectrofotómetroUV - visible.................................................................................................... 34
3.8.1 Análisis fisicoquímicos ........................................................... 34
3.8.2 Determinación de biomasa..................................................... 34
3.8.3 Medición de pH ...................................................................... 34
3.8.4 Acidez titulable ....................................................................... 35
3.9 Medición de la capacidad Antioxidante ............................................ 36
3.9.1 Fundamento del método DPPH ............................................. 36
3.9.2 Cuantificación de la capacidad antioxidante DPPH ............... 36
3.9.3 Procedimiento ........................................................................ 37
3.9.4 Curva patrón Trolox ............................................................... 37
3.9.5 Diseño metodológico.............................................................. 37
3.10 Medición de poder antioxidante .................................................... 38
3.10.1 Fundamento del método FRAP............................................ 38
3.10.2 Cuantificación del poder antioxidante .................................. 38
7
3.10.3 Preparación de la solución de trabajo: ................................. 39
3.10.4 Diseño metodológico............................................................ 39
CAPITULO IV............................................................................................... 41
4 Resultados .......................................................................................... 41
4.1 Biomasa........................................................................................... 41
4.2 pH .................................................................................................... 42
4.3 Acidez Titulable................................................................................ 43
4.4 Medición de poder antioxidante DPPH ............................................ 44
4.5 Medición de poder antioxidante ....................................................... 45
CAPITULO V................................................................................................ 48
5.1 Conclusiones ................................................................................... 48
Referencias bibliográficas ............................................................................ 50
ANEXOS ...................................................................................................... 57
Información Nutricional ............................................................................. 58
Anexo 2........................................................................................................ 58
Inoculación del kéfir en leche UHT ........................................................... 58
Anexo 3........................................................................................................ 61
Análisis de varianza (ANOVA).................................................................. 61
8
Contenido de Gráficos
Gráfico 1 Tasa de crecimiento en función de los tiempos de fermentación ... 41
Gráfico 2 comportamiento del pH en función del tiempo de fermentación. .. 42
Gráfico 3 Porcentaje de ácido Láctico a los tiempos de fermentación. ........ 43
Gráfico 4 Concentración de Trolox a los tiempos de fermentación .............. 44
Gráfico 5 Concentración µM de FeSO4 en análisis de FRAP...................... 45
Contenido de Tablas
Tabla1. Composición química y nutricional de kéfir ..................................... 25
Tabla 2 Microbiota presente en la bebida o en los granos........................... 27
Tabla 3 Preparación de muestras para lectura en espectrofotómetro.......... 39
Tabla 4 Medidas para la preparación de la curva estándar de FeSO4......... 39
Tabla 5 Resultados del Poder Antioxidante FRAP...................................... 45
Tabla 6 Análisis de varianza del crecimiento de Biomasa ........................... 61
Tabla 7 Análisis de varianza del pH ............................................................. 61
Tabla 8 Análisis de varianza de Acidez titulable .......................................... 61
Tabla 9 Análisis de varianza de DPPH ........................................................ 62
Tabla 10 Análisis de varianza FRAP........................................................... 62
Contenido de Figuras
Figura 1 Gránulos de Kéfir .......................................................................... 59
Figura 2 inoc ulación de kéfir en leche UHT................................................ 59
Figura 3 Leche fermentado con gránulos de Kéfir ...................................... 59
Figura 4 Pesado de los Gránulos de Kéfir .................................................. 60
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FACULTAD: CIENCIAS QUÍMICASCARRERA: QUÍMICA Y FARMACIA
UNIDAD DE TITULACIÓN“Evaluación de la capacidad antioxidante de kéfir con
leche UHT descremada a diferentes tiempos de fermentación.”
Autores: Sandy Dume OrtegaEmilio Sánchez Carrillo
Tutor: Q.F. Carlos Valdiviezo M.Sc.
RESUMEN
En el presente estudio se realizó análisis fisicoquímicos y específicos para
determinar la capacidad antioxidante en diferentes tiempos de fermentación (8,
16, y 24 horas). Utilizando una relación inicial de 1/10 en leche descremada UHT
a temperatura ambiente. Por lo que se determinó pH, tasa de crecimiento de
biomasa, acidez titulable y para la determinación de la actividad antioxidante se
fundamentó mediante FRAP y DPPH. Obteniendo como resultados una tasa de
biomasa con un crecimiento no exponencial, el pH que disminuye en función del
tiempo por lo cual su acidez titulable se ve aumentada, y en la capacidad
antioxidante para DPPH- presenta diferencias significativas de 9.347, 0.390
µM/100 mL de trolox, obtenidas a las 8 y 16 horas fermentación, en cuanto al
poder reductor de hierro medido por el método de FRAP fueron concentraciones
de 18.0625 y 5.5625 µM de FeSO4 obtenidas a las 8 y 16 horas de fermentación.
Palabras Claves: DPPH, FRAP, Kéfir, Leche descremada
10
FACULTAD: CIENCIAS QUÍMICASCARRERA: QUÍMICA Y FARMACIA
UNIDAD DE TITULACIÓN" Evaluation of the antioxidant capacity of kefir with
UHT skim milk at different times of fermentation "
Authors: Sandy Dume OrtegaEmilio Sánchez Carrillo
Advisor: Q.F. Carlos Valdiviezo M. Sc
ABSTRACT
In this study, physicochemical and specific analyzes were carried out to
determine the antioxidant capacity at different times of fermentation (8, 16, and
24 hours). Using an initial ratio of 1/10 in skimmed milk UHT at room temperature.
For what was determined pH, biomass growth rate, titratable acidity and for the
determination of antioxidant activity was based on FRAP and DPPH. Obtaining
as a result a biomass rate with a non-exponential growth, the pH that decreases
as a function of time for which its titratable acidity is increased, and in the
antioxidant capacity for DPPH- presents significant differences of 9,347, 0.390
μM / 100 mL of trolox, obtained at 8 and 16 hours fermentation, in terms of iron
reducing power measured by the FRAP method were concentrations of 18.0625
and 5.5625 μM of FeSO4 obtained at 8 and 16 hours of fermentation.
Key Words: DPPH, FRAP, Kefir, Skim milk
11
INTRODUCCIÓN
La leche es un alimento único que contiene valiosos macro y micronutrientes
para el crecimiento y desarrollo inicial de todos los mamíferos, así como también
se la considera como una fuente básica de energía y componentes nutricionales
para los mismos. Contiene antioxidantes no enzimáticos naturales como las
vitaminas A, C y E, carotenoides, ácido úrico, CLA y antioxidantes enzimáticos
como la catalasa, el superóxido dismutasa y el glutatión peroxidasa. Se sabe que
algunas proteínas en la leche (por ejemplo, caseína, lactoferrina, α-LA, β-LG) y
aminoácidos de la leche como la tirosina, cisteína, triptófano y lisina tienen
potencial antioxidante. Por lo tanto, se puede considerar que el sistema de
defensa antioxidante de diferentes productos de leche y productos lácteos tiene
efectos beneficiosos para la salud contra el daño de los radicales libres
(Lindmark-Månsson & Akesson, 2000).
Algunas enfermedades crónicas como el cáncer, hipertensión arterial y
enfermedades degenerativas respecto a la edad han sido relacionadas al estrés
oxidativo causado por una excesiva producción de especies reactivas
oxigenadas y radicales libres de oxígeno (Pizzino, et al., 2017). El estrés
oxidativo también puede incrementar la oxidación de la membrana fosfolípida,
proteínas y ADN, así como la modificación de lipoproteínas de baja densidad
(López-Pedrera, et al., 2016).
El kéfir ha sido fabricado y consumido desde la antigüedad por sus
propiedades nutricionales, su sabor y así como por sus beneficios potenciales
para la salud. El consumo de kéfir está aumentando entre los consumidores
debido a sus efectos; antibacterianos, antitumorales, antihipertensivos,
antioxidantes, anticitotóxicos e hipocolesterolémicos (Chen Z. , et al., 2015).
El kéfir se obtiene mediante la fermentación de la leche con microbiota mixta,
incluidas varias especies de bacterias del ácido láctico, bacterias del ácido
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acético y levaduras. la fermentación ácido-alcohólica de la leche con estos
microorganismos da como resultado un sabor refrescante y ligeramente ácido.
En cuanto a la forma de elaborar el Kéfir, existen métodos tradicionales e
industriales. La producción tradicional de kéfir implica la adición de granos de
kéfir, mientras que el kéfir industrial se ha producido mediante cultivos iniciadores
comerciales, de cultivos puros o de cepas mixtas en forma de polvo. Para la
producción se pueden utilizar leches de diferentes animales, como vacas, ovejas
y cabras, y leches de origen vegetal obtenidas de soja, coco y arroz. El tipo de
leche, y la cantidad de cultivo iniciador, las condiciones de fermentación y el
tiempo relacionadas con la temperatura y el almacenamiento afectan las
características microbiológicas, químicas y sensoriales del kéfir (Gao & Li, 2016).
Aunque la leche de vaca es ampliamente utilizada en la fabricación de
diferentes productos fermentados, hay poca información disponible sobre las
características antioxidantes del kéfir producido con este tipo de leche. Debido a
esto en este proyecto se ha utilizado la leche como medio de fermentación con
granos de kéfir al cual se le atribuye múltiples beneficios para la salud, uno de
ellos el poder antioxidante.
13
CAPITULO I
1.1 Planteamiento del problema
Los antioxidantes son sustancias que pueden prevenir efectos adversos de
distintas especies reactivas, las cuales se sabe que causan daño no solo a los
alimentos sino también a las funciones normales de los seres humanos
(Coronado , Salvador Vega , Gutiérrez , Vázquez, & Radilla , 2015).
Existen antioxidantes sintéticos desarrollados por distintas industrias, estos
son consideradas capaces de prevenir y retardar la aparición de compuestos que
causen deterioro oxidativo, se conoce que son los más usados debido a que
tienen ciertas ventajas como su alto grado de eficacia, estabilidad y acceso
económico. Pero recientes estudios toxicológicos han demostrado que dichos
antioxidantes presentan efectos considerados tóxicos, fisiológicos y a su vez
desarrollar algunos tipos de cáncer (Figueroa & Mollinedo, 2017).
Por lo cual, actualmente ha aumentado el interés en encontrar antioxidantes
naturales en alimentos ya que se cree que si son compuestos naturales pueden
llegar a ser más seguros que los sintéticos y daría como resultado que sean más
aceptados comercialmente ya sea por ser conservantes, inhibidores
enzimáticos, reguladores, entre otras funciones (Figueroa & Mollinedo, 2017).
El kéfir es un producto lácteo natural fermentado al cual se le atribuye la
longevidad de los campesinos búlgaros la cual se desarrollaba debido a su
continuo consumo, este alimento es un compuesto llamado “granos de Kéfir” esta
forma una simbiosis con una microbiota mixta de bacterias y levaduras, que al
ser fermentado con leche da beneficiosos resultados, siendo uno estos la
actividadantioxidante, la cual puede estar dada por su tiempo de Fermentación.
(Chen Z. J., et al., 2015)
1.1 Formulación del Problema:
¿Se presentan diferencias significativas en la capacidad antioxidante del Kéfir
a distintos tiempos de fermentación?
14
1.2 Justificación e importancia
Hoy en día existe una gran variedad de productos alimenticios que afirman
contener antioxidantes, pero los cuales en su mayoría no constan con estudios
científicos que confirmen dicha aseveración.
Uno de estos alimentos es la bebida a base de kéfir (tibis) el cual es un
probiótico que resulta de la relación entre diferentes microorganismos. Estos
tienen la capacidad de descomponer la sacarosa en alcohol, ácido láctico y
dióxido de carbono mediante fermentación azúcar en alcohol al que se le atribuye
actividad antioxidante, por esto, se desea demostrar si dichos productos poseen
tales propiedades antioxidantes y cuanto pueden aportar en beneficio del ser
humano. (Lopez, 2016)
Un antioxidante es una sustancia que forma parte de los alimentos de
consumo cotidiano y que puede prevenir los efectos adversos de especies
reactivas sobre las funciones fisiológicas normales de los humanos. (Pastene,
2015).
De acuerdo con Núñez, se han estudiado aproximadamente 100
enfermedades relacionadas con el desbalance del sistema oxidativo, entre otras:
cardiovasculares, cáncer, gástricas, respiratorias, neurológicas y del sistema
endocrino, siendo las de tipo cardiovascular las que tienen mayor incidencia. La
oxidación de las lipoproteínas de baja densidad parece ser la "llave maestra" en
el desarrollo del ateroesclerosis. Se plantea que la vitamina E que es
transportada por las LDL colesterol puede reducir los procesos de oxidación
(Stanner, 2011).
Debido a esto, se ha venido estudiando hace tiempo atrás el impacto en la
salud de la población, en su alimentación y consumo de suplementos ricos en
antioxidantes; los cuales han demostrado una disminución en la tasa de
mortalidad y morbilidad ocasionada por enfermedades degenerativas,
específicamente de tipo cardiovascular.
15
1.3 Objetivos
Objetivo general
Evaluar la capacidad antioxidante del Kéfir en base láctea UHT descremada
a 8h, 16h y 24 horas de fermentación.
Objetivos específicos
Analizar parámetros fisicoquímicos, Biomasa, pH y acidez titulable, a las
leches fermentadas a las 8, 16 y 24 horas.
Determinar la capacidad antioxidante general de las diferentes muestras
de leches fermentadas a diferentes tiempos de fermentación mediante la
captura del radical DPPH-
Determinar el poder reductor de Hierro en las muestras de las diferentes
leches fermentadas a diferentes tiempos mediante el método de FRAP.
Discriminar si existen diferencias significativas en el poder antioxidantes
a las 8, 16 y 24 horas de fermentación, mediante métodos DPPH- y FRAP.
1.4 Hipótesis
El Kéfir presenta diferencias significativas de su capacidad antioxidante en
diferentes tiempos de fermentación.
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CAPITULO II
2. Marco Teórico
2.1 Tipos de leche
Leche
La leche está definida por el Codex Alimentarius (Food and Agriculture
Organization of the Unite, 2011) tanto para como alimento o para elaboración de
subproductos. Señala que la misma proviene de animales lecheros por medio de
la secreción mamaria obtenida con la ayuda de uno o varios ordeños, la cual no
deber contener ningún tipo de adictivo o alguna extracción.
Leche cruda
La norma técnica ecuatoriana (NTE INEN, 2012) define como leche cruda a
la leche que no ha sido sometida a ningún tipo de tratamiento térmico
inmediatamente después de ser extraída de la ubre.
Leche pasteurizada
Se conoce como leche pasteurizada a la leche homogenizada o no, que ha
sido sometida a un tratamiento térmico que garantiza la destrucción total de
microbiota patógena, así como una casi totalidad destrucción de
microorganismos saprofitos sin alterar profundamente las características
bromatológicas de la misma (NTE INEN, 2012).
2.2 Clasificación
La norma INEN NTE 0010 clasifica a la leche pasteurizada según su contenido
de grasa en:
Entera
Semidescremada
17
Descremada
Leche entera
Producto de un ordeño higiénico proveniente de vacas sanas integro sin
ningún tipo de adulteración ni alteración, Contiene un mínimo de 3.0% de grasa.
(NTE INEN, 2012)
Leche semidescremada
Leche de vaca con un contenido de graso mayor de 1.0% y menor de 3.0 %
m/m (NTE INEN, 2012)
Leche descremada
Leche de vaca que contiene una cantidad de grasa menor o igual a 0.1% m/m
(NTE INEN, 2012)
2.3 Fermentación
La palabra fermentación es más común usarla para referirse a la actividad de
ciertos microorganismos, como bacterias y levaduras. En la fermentación se
encuentran diferentes productos tales como: etanol y ácido láctico (Carreón, y
otros, 2009).
La fermentación está dada por un proceso de tipo metabólico, donde se
obtiene energía, mediante de una serie de oxidaciones y reducciones, con un
sustrato orgánico (carbohidratos), este proceso es llevado en forma anaerobia
estricta, donde al final va a dar como producto gases, alcoholes y ácidos
orgánicos (Valenzuela, 2000).
2.4 Tipos de fermentación
Existen algunas tipas estos difieren de los productos finales que se van a
formar del piruvato. Las más comunes son la fermentación láctica y alcohólica.
Estas son las que ocurren en la elaboración del Kéfir (Catalán Garrido, 2013).
18
Fermentación alcohólica
Este tipo de fermentación está dada por un conjunto de levaduras y mohos,
las cuales producen dióxido de carbono y etanol a partir del paso de los hidratos
de carbono mediante un proceso metabólico en ausencia de oxígeno, la cual se
conoce como fermentación etanólica o alcohólica, representado bajo la siguiente
formula:
₆ ₁₂ ₆ ⟶ 2 ₂ ₅ + ₂ (Vázquez & Dacosta, 2007)
En este proceso, la glucosa pasa por una transformación a piruvato en el
glucolisis, el piruvato es convertido en dióxido de carbono y etanol en un proceso
que se lleva a cabo en dos pasos (Carreón, y otros, 2009).
Donde en la primera etapa o paso, el piruvato es descarboxilado a
acetaldehído mediante una reacción la cual es irreversible esta es catalizada por
la enzima piruvato descarboxilasa. Luego tenemos el segundo paso, donde el
acetaldehído es reducido a etanol por el medio del alcohol deshidrogenasa y de
la capacidad reductora dada por el NADH (Carreón, y otros, 2009).
Fermentación Láctica
(Catalán Garrido, 2013) cita afirma que el ácido láctico, es uno de los ácidos
que no forma parte natural de los alimentos, este es producido por la
fermentación de las BAL, estas se pueden clasificar en según la cantidad de
ácido láctico que produzcan: heterofermentativas e homofermentativas y las
homofermentativas facultativas y se basan en la siguiente reacción:
₆ ₁₂ ₆ + 2 + 2 ⟶ 2 ₃ − − + 2 y ₆ ₁₂ ₆ +2 + 2 ⟶ ₃ − − + ₃ ₂ + ₂ + 2 (Marcia &
Malespín, 2013)
El ácido láctico producido por la reducción del piruvato, forma parte del 85 por
ciento de los productos finales resultantes en la fermentación (Catalán Garrido,
2013).
19
Pero, en la fermentación Heteroláctica, los productos finales están alrededor
del 50 por ciento y el resto suele ser dióxido de carbono y etanol. Esta
fermentación se presenta mediante una ruta catabólica de fosfocetolasa, en este
proceso se produce ácido láctico, dióxido de carbono y etanol; de la misma
manera se puede presentar en la fermentación de la ribosa, donde se va a
producir acido acética y ácido láctico (Catalán Garrido, 2013).
2.5 Principales tipos de leches fermentadas.
Yogur.
(Garcia & Hernandez de Bermudez, 2015) Define como yogur al producto de
leche coagulada producto de una fermentación láctica dada por la intervención
de Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophilus a partir de una leche
fresca.
Kumis.
Posee una similitud al yogur obtenido con gránulos de kéfir, ya que contiene
la misma cantidad de ácido láctico pero una cantidad de alcohol ≥ 0.5%. El cultivo
precursor consta de Lactobacillus delbrueckii subesp. Bulgaricus y
Kluyveromyces marxianus. (Garcia & Hernandez de Bermudez, 2015)
Kéfir.
El CODEX ALIMENTARIUS 243-2003 define al kéfir como producto
fermentado inoculando gránulos de kéfir, Lactobacillus kefiri, así como también
especies del género Leuconostoc, Lactococcus y Acetobacter las cuales actúan
de manera simbiótica ,el kéfir se encuentra conformado por levaduras
fermentadoras de lactosa como Kluyveromyces marxianus y así como también
como levaduras fermentadoras sin lactosa las cuales son Saccharomyces
unisporus, Saccharomyces cerevisiae y Saccharomyces exiguus (Food and
Agriculture Organization of the Unite, 2011).
20
2.6 Diferencias entre el yogurt y el kéfir.
Como diferencia puntual existente entre la elaboración de un yogur
convencional y el Kéfir es el tipo de fermentación ya que en el yogur convencional
se presenta una reacción donde la lactosa es transformada en ácido láctico, este
proceso es conocido como fermentación láctica mientras que el kéfir se fermenta
a través de una reacción lacto-alcohólica produciendo no solo ácido láctico sino
también anhídrido carbónico y alcohol, este último a una proporción menor al 1%
(Garcia & Hernandez de Bermudez, 2015).
En el proceso de elaboración del yogur convencional intervienen
principalmente dos tipos de microorganismos: el L. bulgaricus y S. termophilus,
a igual proporción, y en pocas cantidades. En cambio, en el kéfir existe una
microbiota muy variada y compleja las cuales fermentan la caseína y la albumina
y como otras diferencias tenemos las caracterices organolépticas, donde se
remarca la consistencia de cada productos, debido a que el kéfir es más líquido
debido a la solubilidad de la caseína, pero el yogur puede ser mucho más
consistente o fluido (Garcia & Hernandez de Bermudez, 2015).
2.7 Kéfir
Generalidades
Según la historia se cree que “su origen está entre Europa del este y las
montañas del Cáucaso,” (Satir & Guzel-Seydim, 2016). Se cree que el termino
‘kéfir’ podría venir de la palabra turca Keyif, siendo el significado ‘sentirse bien’
(Can, Topuz, Derin, Durma, & Aydiner, 2009).
En la antigüedad, los que vivían en el campo preparaban el “ayrag” donde
tenían que dejar reposar la leche de los animales en obres los cuales eran
elaborados de pieles de cabras y estas tenían muy poca higiene ya que no las
lavaban y luego las colgaban muy cerca de la puerta, podía ser adentro o fuera
de la casa, eso dependería de cómo este la estación. Y los que pasaban o salían
21
tenían que golpear la bolsa para poder así mezclar el líquido. Se iba añadiendo
leche fresca según como se iba desarrollando la fermentación, para reemplazar
al “ayrag” que se iba absorbiendo (Pogačić, et al., 2013). Pasado el tiempo
observaron que la corteza blanquecina y esponjosa del interior del odre de piel
de cabra podía dar una bebida parecida o quizás mejor al “ayrag” original, esto
ocurría si se le añadía más leche, a esta bebida se la denominó kéfir. Dando
lugar a las primeras producciones de kéfir, comenzando así una larga tradición
de elaboración de kéfir. Por otro lado, para los musulmanes era considerado un
regalo de Alá, ya que durante miles de años ellos lo han consumido por lo que
ellos lo denominan “los granos del profeta Mahoma”. Por lo cual era prohibido
que cualquiera supiera de la preparación del kéfir solo lo podían hacer gente que
tuvieran su propia fe, ya que estos podían perder su mágica fuerza. Y quizás por
eso se cree que el método para elaborar kéfir estuvo escondido durante algún
tiempo (Pogačić, et al., 2013).
Definición
Se lo considera como macrocolonias compuestas por un conjunto de
diferentes levaduras y bacterias que llegan a formar una asociación simbiótica
estable, (y también el hongo filamentoso Geotrichumcandidum), responsables
de la doble fermentación, ácido láctica y alcohólica (León, 2013).
Se asemejan a gelatinosas masas compactas su color puede ser blanquecino,
amarillento u opalescente, su forma no está muy definida por lo que se dice que
es irregular y su tamaño varía, estas características dependen mucho de la
especie o lugar de origen (Moreno, 2005).
Cuando se encuentran en un medio apropiado, los granos aumentan su
tamaño y son fragmentados mecánicamente esto se debe al aumento de presión
de dióxido de carbono que se produce en su interior. Además, estando en el
medio adecuado pueden constituir granos al formar pequeñas agrupaciones y
generar su propia matriz de polisacáridos (Catalán, 2013).
22
Características de kéfir
El kéfir es una bebida láctea batida, cremosa, burbujeante y ácida, hecha a
partir de leche fermentada este lleva el mismo nombre que los granos, con una
mezcla compleja de bacterias (que incluye lactobacilos, lactococos, leuconostoc
y acetobacterias) y de levaduras fermentadoras y no fermentadoras de la lactosa
(Walstra, Geurts, & Normen, 2001).
“Con el kéfir de leche se obtiene un producto muy similar al yogurt, esto es el
resultado de una doble fermentación de los gránulos del hongo y de sus bacterias
y también de la propia leche” ( Ruiz , Villavicencio , Ochoa & Mendoza, 2017).
“La diferencia entre el kéfir y el yogur se encuentra en las cantidades
pequeñas de CO2, de alcohol y de 2 moléculas aromáticas que son producto de
la fermentación dual de las bacterias y las levaduras” (Garcia & Hernandez de
Bermudez, 2015).
2.8 Biomasa de los gránulos de Kéfir
Biomasa se lo define como el conjunto de materia orgánica que puede ser
renovable procedente de algún animal, vegetal o de la transformación natural de
la misma (Morales, 2009).
La biomasa producida por los gránulos de kéfir aumenta de manera lenta
luego fermentaciones consecutivas, dentro de un 5 a 7% de su biomasa inicial,
durante el crecimiento de la biomasa en la leche, las cantidades de
microorganismos presente en los gránulos de kéfir son distintas al producto final,
las diferencias están relacionadas directamente con las condiciones durante el
proceso de fermentación, como puede ser la temperatura, tipo de leche, tiempo
de fermentación, relación de inoculo/leche, entre otros (Farnworth, 2003).
En un estudio sobre la biomasa producida en kéfir, se observa que usando
gránulos de kéfir con leche descremada en fermentaciones hasta 30 días, se
observa que puede tener un mayor incremento de la misma que al utilizar leche
enriquecidas, donde también indican que a mayor cantidad de CO2 provoca un
23
decrecimiento de la biomasa, otro factor que puede afectar es la cantidad de
microorganismos presentes, tanto bacterias y levaduras (Z. Guzel-Seydim,
2011).
Otro estudio muestra que usando leche entera con granúlos de kéfir a una
temperatura de 25ºC constante y a 19-26 ºC, no presenta diferencias
significativas en su crecimiento tanto en biomasa húmeda y seca, sino solo una
variación en su consistencia. (Arevalo Ortiz & Arias Arroyo, 2007).
2.9 Kefiran
“Existe otro compuesto encontrado en los granos de kéfir y se lo denomina
kefiran, el principal polisacárido, es un exopolisacárido constituido por galactosa
y glucosa en cantidades similares y es producido por las BAL, bacterias
Lactobacillus kefiranofaciens” (Zajšek, Goršek, & Kolar, 2011).
“El kefiran en los gránulos de kéfir, está compuesto por polisacáridos,
proteínas y por una combinación de bacterias y levaduras” (Witthuhn, Schoeman,
& Britz, 2005).
Aunque la producción de Kefiran por parte de Lactobacillus kefiranofaciens se
la considera buena, han hecho una combinación agregando de Saccharomycesn
sp., donde se observó que esta mejora la cantidad final de Kefiran, mostrando
así la cuan necesaria es la simbiosis entre levaduras y bacterias presentes en
los granos de Kéfir (Cheirsilp, Shimizu, & Shioya, 2003).
“Según estudios este polisacárido es idóneo para enriquecer las
características viscosas de los geles que se forman en la leche. Siendo así un
aditivo que llama mucho la atención para productos fermentados” (Rimada &
Abraham, 2006).
24
“El Kefiran tiene muchas propiedades en comparación con otros polisacáridos,
siendo algunas de ellas, antibacteriana, antitumoral y fúngica. (Rodrigues,
Carvalho, Evangelista, & Schneedorf, 2005)
En los estudios de (Serafini, et al., 2014) se ha encontrado la característica de
inmunomodulación o protección del epitelio, y en (Rodrigues, Carvalho,
Evangelista, & Schneedorf, 2005) antiinflamatorias, curativas mientras que en
las investigaciones de (Chen Z. J., et al., 2015) propiedades antioxidantes.
2.10 Composición Química y Nutricional De Kéfir:
Su composición puede variar debido a que va a depender de la matriz utilizada
si es leche (vaca, cabra, oveja, etc.,) de cómo están compuestos los granos, y
de los tiempos de fermentación o hasta el proceso tecnológico de elaboración.
En la tabla 1y 2 se resume la composición química y nutricional del Kéfir
(Otles & Cagindi, 2003).
25
Tabla1. Composición química y nutricional de kéfir
Composición química y nutricional de kéfir
Valor de pH 4.0 – 4.5
Energía por 100g
Grasa (%)Proteína (%)Lactosa (%)Agua (%)
56 kcal
3.53.34.087.5
Contenido mineral
Calcio (g)Fósforo (g)Magnesio (g)Potasio (g)Sodio (g)Cloruro (g)
Por 100g
0.120.10120.150.050.10
Ácido de la leche (g)Alcohol etílico (g)Ácido láctico (g)Colesterol (mg)Fosfatos (mg)
0.80.911340
OligoelementosHierro (mg)Cobre (µg)
Molibdeno (µg)Manganeso (µg)Zinc (mg)
0.05125.55
0.36
Amino ácidosesenciales (g)Triptófano
Fenilalanina +Tirosina
LeucinaIsoleucina
TreoninaMetionina+ CisteínaLisina Valina
0.050.35
0.340.210.170.120.270.22
CompuestosAromáticosAcetaldehídoDiacetiloAcetona
----
Vitaminas (mg)ACarotenoB1B2B6
0.060.020.040.170.05
Vitaminas (mg)B12NiacinaCDE
0.50.091
0.080.11
Fuente: (Otles & Cagindi, 2003)
26
2.11 Microorganismos de los granos de Kéfir
Los granos de kéfir tienen un microbiota variable, estos se encuentran
compuestos en una matriz de exopolisacáridos, lípidos y proteínas. Su
composición principalmente de bacterias acido acéticas (BAA), bifidobacterias y
ácido lácticas (BAL), aparte de levaduras” (Guzel-Seydim ZB, 2011).
En la tabla 3 se encuentra un resumen del microbiota presente en los granos
de kéfir o bebida. En donde se muestra la extensa complejidad de especies de
microorganismos que están presentes en los mismos, especialmente las
pertenecientes a las bacterias acido lácticas. En cuanto a las bifidobacterias,
(Mar13) indican que estas se encentran en mínima cantidad.
27
Tabla 2 Microbiota presente en la bebida o en los granos
Microbiota presente en la bebida o en los granosMicroorganismos
BifidobacteriasBifidobacterium spp.Bifidobacterium bifidumBifidobacterium breveBifidobacterium choerinumBifidobacterium longumBifidobacterium pseudolongum
Bacterias ácido acéticasLb. Acetobacter lovaniensisLb. Acetobacter syzygiiLb. Acetobacter orientalisLb. Gluconobacter japonicus Lb.
Gluconobacter frateurii
Bacterias ácido lácticasLactococcus (Lc.) lactisLc.lactis subsp. lactisLc. lactis subsp. cremorisLc. raffinolactisStreptococcus thermophilusLactobacillus (Lb.) kefiranofaciensLb.kefiranofaciens subsp.
kefirgranumLb. kefiranofaciens subsp.kefiranofaciensLb. kefiriLb. parakefiriLb. plantarumLb. kéfirLb. paracaseiLb. helveticusLb. ParakefirLb. satsumensisLb. uvarum Cruz PedrozoLb. caseiLb. paracaseiLb. brevisLb. plantarumLb. delbrueckiiLb. acidophilusLb. delbrueckiisubsp. bulgaricusLb. caseisubsp. pseudoplantarumLb. buchneriLb. sunkiiLb. otakiensisLb. diolivoransLb. crispatusLb. reuteriLb. Leuconostoc (Leu.)
mesenteroidesLb. Leu. Pseudomesenteroides.
LevadurasLb. Saccharomyces (S.)
cerevisiaeLb. S. martiniaeLb. S. unisporusLb. CandidahumilisLb. CandidainconspicuaLb. Candida marisLb. CandidakefyrLb. CandidacolliculosaLb.Kluyveromyces (Klu.)
marxianusLb. Klu. siamensisLb. Klu. lactisLb. Klu. DobzhanskiiLb. Kazachatania (Kaz.)Lb. Kaz. exiguaLb. TorulosporadelbrueckiiLb. Brettanomyces anomalus
Fuente: (Rosa, y otros, 2017)
28
2.12 Beneficios del Kéfir
Salud de la piel
La leche fermentada de Kéfir aporta para la piel beneficios como:
Antioxidante natural colaborando en la elasticidad de la piel, producción de
colágeno, combate signos de la edad y combate el acné. (Arana, Yanos, &
Palma, 2017).
Salud intestinal
Restablece la microbiota intestinal especialmente periodos post diarrea,
gracias a su efecto probiótico, (Arana, Yanos, & Palma, 2017) así como también
favorece a la digestión y la frecuencia evacuatoria (Boldrini, 2009).
Salud mental
El kéfir contiene triptófano junto a su capacidad de fomentar el crecimiento de
la microbiota intestinal estimulan la liberación de Serotonina, el cual ayuda a
regular el estado de sueño y depresión. (Arana, Yanos, & Palma, 2017)
Inhibidor del desarrollo fúngico
Usado para el tratamiento de candidiasis, así como secuestrador de
micotoxinas gracias a sus productos de fermentación: ácido láctico y ácido
acético (León, 2013).
Kéfir como probiótico
La Organización Mundial de la Salud (OMS) afirma que un probiótico es un
microorganismo capaz de estimular el crecimiento de otros microrganismos ya
presentes en un mismo sitio. Tanto la bebida elaborada a base de Kéfir de agua
como de Kéfir de leche poseen una cantidad de bacterias probióticas por encima
29
de la cantidad de bacterias probióticas establecidas por la Norma INEN 2395-
2011 (Bolaños, 2011).
2.13 Radicales libres y antioxidantes
Daño o estrés oxidativo
(Venereo Gutiérrez, 2002) define como daño o estrés oxidativo a la exposición
de cualquier ser vivo a cualquier tipo de agente capaz de generar una
inestabilidad en el balance de sustancias o agentes prooxidantes contra los
mecanismos antioxidantes encargados de la liberación de las especies
metabólicas mencionadas anteriormente.
Radicales libres
Se denomina como radicales libres a toda especie química cargada o no, de
un electrón desapareado o impar en el orbital externo en su estructura atómica
que les da una configuración espacial capaz de generar gran inestabilidad.
(Venereo Gutiérrez, 2002).
Los radicales libres realizan funciones vitales para el organismo no solo formar
parte de la fagocitosis sino también en favorecer la formación de colágeno
prostaglandinas y reducir formación de catecolaminas mediante las glándulas
suprarrenales. (Venereo Gutiérrez, 2002).
2.14 Antioxidantes
Definición
(Halliwell & Gutteridge, 2015) definen como antioxidantes a “sustancias que
son capaces, a concentraciones relativamente bajas, de competir con otros
sustratos oxidables (por ejemplo, los componentes celulares) y así, inhibir o
retardar significativamente la oxidación de dichos sustratos”.
30
Mecanismos protectores ante el estrés oxidativo
Las concentraciones de radicales libres (RL) son dependientes del balance
entre la producción y eliminación por parte de enzimas y sustancias
antioxidantes.
El RL al ser colisionado por un antioxidante este le cede un electrón para de
esta manera oxidarse y transformarse en un RL débil no toxico. Los antioxidantes
se clasifican en dos grupos: exógenos o no enzimáticos y endógenos o
enzimáticos (Maria del Rosario, 2012).
Antioxidantes exógenos
Vitamina C o Ácido ascórbico
También llamada vitamina antiescorbútica porque actúa como tratamiento
preventivo y terapéutico para el escorbuto, hidrosoluble y medianamente soluble
en alcohol. Se descubrió en 1928 (Montaño, 2011).
Vitamina E
Vitamina E es el nombre común para referirse a los tocoferoles y tocotrienoles,
moléculas esenciales en la dieta de todo ser vivo, los cuales son sintetizados por
organismos fotosintéticos (San Martin, 2017).
Carotenoides
Son sustancias conocidas tradicionalmente como pigmentos de plantas y son
precursores de la vitamina A en los seres vivos (Estévez, 2016).
31
CAPITULO III
3 Metodología
3.1 Tipo de investigación
La metodología utilizada en la presente investigación será de tipo
experimental, en el cual se llevará a cabo: análisis del poder antioxidante
DPPH- y la capacidad reductora de hierro FRAP, así como también
parámetros fisicoquímicos, utilizando los Métodos de Análisis Oficiales de la
AOAC Internacional dentro de los cuales tenemos, pH, acidez titulable y
biomasa.
3.2 Lugar de trabajo
Todos los análisis fueron realizados en una Industria Farmacéutica de la
ciudad de Guayaquil.
3.3 Variables3.3.1 Variable dependiente
Capacidad secuestradora de radical DPPH-
Poder reductor del hierro FRAP
Tasa de crecimiento de biomasa
Acidez titulable
pH
3.1.1 Variable independiente
Tiempo de fermentación
3.1.2 Variable Interviniente
Temperatura ambiente
Humedad relativa
32
3.2 Materiales y Métodos3.2.1 Materias Primas:
Kéfir comercial
Leche descremada de vaca UHT: Tetra pack de 1L, (véase ficha técnica
en Información Nutricional
3.3 Elaboración de Kéfir
Se realizó una adaptación de los gránulos de kéfir.
Se separaron los gránulos de kéfir del líquido (leche descremada) que los
contenía, se lavaron con agua desmineralizada estéril y se escurrieron.
Luego se inoculo gránulos kéfir en la leche descremada UHT a utilizar en una
relación 1/10, en vaso de precipitación de capacidad adecuada y se tapó con
papel parafilm y se encubó a temperatura ambiente por 24 horas.
Luego, se procedió a tomar el pH final, se separaron los gránulos de la
preparación con ayuda de un tamiz plástico, se lavaron con agua
desmineralizada estéril, se escurrieron y se tomó la biomasa final.
3.4 Obtención de leche fermentada con gránulos de kéfir a 8h, 16 y 24horas.
Procedimiento
Se inocularon 10.0 g de gránulos de kéfir en 100 mL de leche descremada
UHT, (relación 1:10), en vasos de precipitados de capacidad adecuada.
Se midió el pH inicial de la preparación (gránulos de kéfir más leche
descremada), se taparon los vasos de precipitados con papel parafilm y se
incubó cada preparación a temperatura ambiente. Luego se midió el pH de cada
preparación cada 3 horas.
Posteriormente se separaron los gránulos de kéfir de la leche fermentada con
ayuda de un tamiz, se escurrieron y se les determinó la biomasa final.
33
3.5 Esquema de la elaboración de kéfir.
recepción
lavado
escurrido
inoculación
incubación
leche fermentada
incubar
leche fermentada
incubar
leche fermentada
Agua Tipo 1
Tamiz
plásticoTº ambiente1/10 en leche UTH
descremada
8h inicial/Tº
ambiente
Gránulos de
Kéfir
Tomar
muestras
Tomar muestras
16 h/ Tº ambiente
Tomar muestras
24h/ Tº
ambiente
34
3.6 Obtención de las muestras de Kéfir para lecturas espectrofotómetroUV - visible.
Muestras de Kéfir (2g) fueron mezcladas con 20ml de solución acuosa con
metanol (70:30% v/v) a temperatura ambiente en la oscuridad por 4 horas con
agitador magnético. Los extractos fueron centrifugados a 1,420 × g por 10
minutos y filtrados a través de papel filtro cualitativo (Whatman grado 2, 8-μm
porosidad).
3.6.1 Análisis fisicoquímicos
Se determinó biomasa, pH y acidez titulable, (aceptando un valor entre 0.60 a
1.0%) A cada una de las leches fermentadas obtenidas en las diferentes
temperaturas de ensayo.
3.6.2 Determinación de biomasa
Se realizó de acuerdo al método gravimétrico propuesto por Andreja Goršek
y Marko Tramšek al inicio y al final de cada proceso de fermentación.
Procedimiento
- Se filtraron los gránulos de kéfir con un tamiz plástico.
- Se escurrieron los gránulos de kéfir con el tamiz plástico.
- Se colocaron en una porta muestra estéril.
- Se pesaron en una balanza analítica.
3.6.3 Medición de pH
Se midió el pH al inicio, cada 3 horas a cada una de las fermentaciones de 8h,
16 y 24 h respectivamente
Procedimiento
Se calibró el pH-metro con buffer pH 4 y buffer pH 7 y se tomó una muestra
de la leche en fermentación de la siguiente manera:
- Inicialmente, con un agitador estéril se homogenizó la leche en fermentación.
35
- Se separaron los gránulos de kéfir de la leche fermentada (con ayuda de un
tamiz plástico).
- Al líquido se le tomó el pH sumergiendo el electrodo directamente en la leche
en fermentación. Esto se realizó por triplicado, y se reportó el promedio de dichos
valores.
- Se unieron nuevamente los gránulos de kéfir con el líquido en fermentación
en el vaso de precipitados donde se estaba monitoreando la fermentación
inicialmente.
Se tapó el contenedor, nuevamente con papel parafilm. Y se colocó en la
temperatura de incubación que correspondía la fermentación.
3.6.4 Acidez titulable
Se determinó el porcentaje de acidez, a cada una de las leches obtenidas en
el proceso de fermentación, por el Método titrimétrico de la AOAC 947.05.
Procedimiento
En un Erlenmeyer de 50 mL, se pesaron 10.0 g de muestra (leche fermentada)
y se diluyó al doble del volumen utilizando agua desmineralizada libre de CO2.
Se agregaron 3 gotas de fenolftaleína agitando en cada adición. Luego con
una solución de NaOH 0.1 N, se valoró la muestra hasta que el primer color rosa
fuese persistente.
Se reportó la acidez como porcentaje de ácido láctico por peso, aceptando
valores entre 0.5-1.5 % declarados en la Norma Técnica Andina (NORMA
TÉCNICA ANDINA PNA 16 007:2007, 2007) para leches fermentadas con Kéfir.
- Esta determinación se realizó de una sola vez, en las 9 fermentaciones.
- Se realizaron los cálculos utilizando la siguiente ecuación:
36
% = .Donde:
N=Normalidad del hidróxido de sodio.
0.09 Mili equivalente del ácido láctico
3.7 Medición de la capacidad Antioxidante3.7.1 Fundamento del método DPPH
Consiste en la medición a 517 nm de la reducción del radical libre estable 2,2-
difenil-1-picril hidrazilo (DPPH). La absorbancia característica de este radical que
posee un color violeta intenso disminuye en presencia de un antioxidante (que
sea capaz de capturar un electrón libre) u otro radical. Es posible por tanto
cuantificar la capacidad capturadora de radicales libre que poseen ciertos
compuestos mediante la determinación del grado de decoloración que provoca
a una solución etanólica de DPPH. (Brand-Williams, Cuvelier, & Berset, 1995).
3.7.2 Cuantificación de la capacidad antioxidante DPPH
Reactivos:
DPPH, 2,2 difenil-1-picrilhidrazil Sigma código D9132 PM 394.3; Trolox
C, Amerchan
Metanol calidad para análisis Grado HPLC.
Materiales:
Espectrofotómetro U.V. Spectronic 21 D
Centrifuga 800-1 Zeny
Agitador magnético
Micropipetas de 1-1000 µL,
Micro-tubos de ensayo y puntas para las pipetas automáticas
37
3.7.3 Procedimiento
Se usó la metodología descrita por Sahin en el cual se emplearon 0.25 mL del
extracto y 0.18mL de DPPH hasta enrazarla con metanol a un volumen de 3mL
(concentración 6 x 10-5 M) incubándolas durante 30 minutos en la oscuridad por
triplicado.
3.7.4 Curva patrón Trolox
La curva patrón de trolox se incubo x 10 minutos en la oscuridad a unas
concentraciones de 5 µM; 10 µM; 15 µM; 20 µM; 25 µM,
Luego las absorbancias fueron tomadas usando un Espectrofotómetro
(Spectronic 21D) a 517 nm. Los resultados fueron expresados como mg Trolox/
100 ml.
3.7.5 Diseño metodológico
1. Se pesaron 3.94mg de DPPH en 100ml de Metanol grado HPLC
2. Después de dejar que se establece la reacción se agregó la solución de
trolox
3. Se realizaron lecturas a 571 nm tomando un blanco inicial y esperando
hasta los 30 minutos de reacción
4. Se preparó una curva de calibración de trolox a las concentraciones
mencionadas en la sección 3.8.3
5. Se prepararon las soluciones en adición de las muestras a la
concentración mencionada en la sección 3.8.3 y se leyeron de igual
manera que en el paso 3
6. Se obtuvieron los valores de absorbancias, se realizó la interpolación de
datos con la curva patrón de trolox y se realizaron los análisis estadísticos
respectivos.
38
3.8Medición de poder antioxidante
3.8.1 Fundamento del método FRAP
Consiste en medir la capacidad de la muestra para reducir el hierro férrico a
ferroso. A un pH bajo se coloca en el medio de reacción el complejo Fe3+-TPTZ,
este complejo en presencia de agentes reductores se reduce a Fe2+-TPTZ que
desarrolla un color azul intenso con un máximo de absorción a 593 nm. Las
condiciones del ensayo favorecen la reducción del complejo y están ajustadas
para que la formación de color solo ocurra por efecto de la muestra que se añade
y no por causas artefactuales. Los estudios se realizan estableciendo
comparaciones con grupos controles, blancos o patrones, según lo establezca el
protocolo de estudio en cuestión (CEIEB, 2004).
3.8.2 Cuantificación del poder antioxidante
Reactivos:
Acetato de sodio anhidro PM 82,03; 2g por cada 100 determinaciones o
Acetato de sodio tri-hidratado PM 136,08; 4 g por cada 100
determinaciones
Ácido acético PM 60,05 =1,052 99,7 %
2,4,6-tripiridil-s-triazina (TPTZ) Aldrich 15,528-4 PM 312,34
Ácido clorhídrico 37% =1,19;.
FeCl3 x 6 H2 O 0,02 M PM 182,21;
FeSO4 x 7 H2O PM 278;
Materiales:
Espectrofotómetro U.V. Spectronic 21 D
Centrifuga 800-1 Zeny
Micropipetas de 5-1000 L
Micro-tubos de ensayo
39
3.8.3 Preparación de la solución de trabajo:
La solución reactiva de trabajo se prepara de la forma siguiente: mezcle 25
mL de la solución amortiguadora acetato 300 mM pH 3,6 con 2,5 mL de la
solución reactivo de TPTZ y adicione 2,5 mL de la solución reactivo de FeCl3.
Rotule como solución reactiva para FRAP. Esta solución se prepara
inmediatamente antes de realizar las determinaciones y se utiliza a temperatura
ambiente.
Procedimiento
Los procedimientos se basaron en la metodología propuesta por Benzie-
Strain.
Tabla 3 Preparación de muestras para lectura en espectrofotómetro
Espectrofotómetro (593 nm)
Ensayo Sol. reactivo Muestra H2O destilada
Blanco 900 - 120
Muestra 900 30 90
Mezcle y realice una lectura a los 15 segundos y otra a los 4 minutos
Realización de la curva de calibración.
Tabla 4 Medidas para la preparación de la curva estándar de FeSO4
Concentración del patrón
FeSO4
mL de la solución
madre
mL de agua destilada
1 000 M 1 0
800 M 800 0,200
400 M 400 0,600
200 M 200 0,800
100 M 100 0,900
3.8.4 Diseño metodológico
1. Se pesaron 31.2mg de TPTZ en 10ml de Ácido Clorhídrico 40mM
40
2. Se agregó 25ml de la solución buffer de Acetato de Sodio trihidratado
3. Se adicionaron 2.5ml de TPTZ y 2.5ml de FeCl34. Se realizaron lecturas a 593 nm tomando un blanco inicial y esperando
hasta los 5 minutos de reacción
5. Se preparó una curva de calibración de FeSO4 a las concentraciones
mencionadas en la sección 3.9.4
6. Se obtuvieron los valores de absorbancias, se realizó la interpolación de
datos con la curva patrón de FeSO4 y se realizaron los análisis
estadísticos respectivos.
Análisis Estadísticos. Las variables se examinaron mediante un análisis de
varianza (ANOVA). El análisis de los datos fue realizado empleando el paquete
estadístico Labtools y Primer.
41
CAPITULO IV
4 Resultados
Una vez aplicada el diseño experimental propuesto, se obtuvo los resultados
de los análisis planteados de biomasa, pH, acidez titulable y capacidad
antioxidante DPPH- y FRAP realizados a las muestras de 8, 16 y 24 horas de
fermentación, cabe recalcar que el valor de la capacidad antioxidante a las 24
horas no pudo ser cuantificada lo cual se explica en los siguientes resultados:
4.1 Biomasa
Gráfico 1 Tasa de crecimiento en función de los tiempos de fermentación
Como se puede observar (gráfico 1) la tasa de crecimiento mostró un declive
0,673; 0,588; 0,542 siendo este inversamente proporcional al tiempo de
fermentación 8,16 y 24 respectivamente. El valor de la tasa de crecimiento de la
biomasa se calculó mediante la fórmula de crecimiento poblacional compuesto
debido que a que no existe una cinética de crecimiento estándar del Kéfir ya que
este posee una amplia gama de microorganismos en su composición.
0,673
0,5880,542
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
0,800
Tasa
de
crec
imie
nto
de la
bio
mas
a (%
)
Horas de fermentación
8 16 24
42
4.2 pH
Gráfico 2 comportamiento del pH en función del tiempo defermentación.
El (gráfico 2) muestra el Comportamiento del pH en función del tiempo, como
se aprecia existió un decrecimiento del parámetro fisicoquímico para el cultivo
de Kéfir durante el proceso de fermentación, pasando de un pH ligeramente
ácido (6,66) en el tiempo inicial, a un pH ácido (3.97) a las 24 horas de
fermentación.
El comportamiento en función del pH muestra un decrecimiento relacionado
al tiempo de fermentación debido a que en el proceso de fermentación tiene
productos resultantes que acidifican el medio y los cuales aumentan por el
tiempo de fermentación, así como; son la formación de alcohol (etanol), ácido
láctico y CO2 (Tejada, 2015)
6,66
6,23
5,44
4,78
4,72
4,10
3,97
01234567
0 5 10 15 20 25 30
Ph
Tiempo de fermentación
Determinación de pH
43
4.3 Acidez Titulable
Gráfico 3 Porcentaje de ácido Láctico a los tiempos de fermentación.
En el (Gráfico 3) La acidez titulable representada como porcentaje de ácido
láctico según la Norma Técnica Andina, Se reportó la acidez como porcentaje de
ácido láctico por peso, aceptando valores entre 0.5-1.5 % valores obtenidos de
Norma Técnica Ecuatoriana INEN NTE 2395 Leches Fermentadas (NTE INEN
2395, 2011).
Cumple en el proceso de fermentación hasta las 16 horas, mientras que para
las 24 horas éste excede el rango permisible de ácido láctico para leches
fermentadas descrito en el mismo.
1,017
1,280
1,511
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
1,400
1,600
8 16 24
Cont
enid
o en
%Ác
ido
láct
ico
Tiempo de fermentación (horas)
% Acidez titulable
44
4.4 Medición de poder antioxidante DPPH
µM Trolox/ 100 ml D.E. Tiempo de fermentación (H)9.347±0.004a 8
0.390±0.002b 16
No cuantificable 24Leyenda: Letras diferentes representan diferencias significativas.
Gráfico 4 Concentración de Trolox a los tiempos de fermentación
Se puede observar que a las 8 horas de fermentación se obtiene una actividad
relacionada a una concentración de trolox de 9.347 µM/100ml que difiere
estadísticamente del resultado a las 16h, en cuanto a las 24 horas no fue
cuantificable mediante este método.
9,347
0,390 No Cuantificable0,0001,0002,0003,0004,0005,0006,0007,0008,0009,000
10,000
8 16 24
µM T
rolo
x/10
0 m
l
Horas de fermentación
Capacidad secuestradora e¯ DPPH¯
µM Trolox/ 100 ml
45
4.5 Medición de poder antioxidante
Tabla 5 Resultados del Poder Antioxidante FRAP
Muestras Concentración µM FeSO4Kéfir 8 Horas 18.0625 ± 0.004b
Kéfir 16 Horas 5.5625 ± 0.002c
Kéfir 24 Horas No cuantificableLeyenda: Letras diferentes representan diferencias significativas.
Gráfico 5 Concentración µM de FeSO4 en análisis de FRAP
En el (gráfico 5) representa los resultados del efecto reductor de Hierro Fe3
en presencia del kéfir, donde los datos en la (tabla 6) evidencian que en relación
al control positivo Trolox 100µM donde vemos una diferencia significativa a las 8
y 16 horas pero a su vez el de 8 horas no es significativo a los resultados del
Trolox por lo cual no reportan efecto reductor marcado del producto con relación
al Trolox (control positivo), sin embargo, los valores de Fe2+ son valores
considerables lo que significa que tiene cierto poder reductor. El valor de las
24horas tampoco fue cuantificable mediante este método.
18,06
5,56
No cuantificable0,002,004,006,008,00
10,0012,0014,0016,0018,0020,00
8 horas 16 horas 24 Horas
Conc
entr
acio
n µ
M Fe
SO4
Horas de fermentación
FRAP
46
4.6 Discusión
Realizando un análisis global de los resultados podemos corroborar que no
existe un crecimiento exponencial de la biomasa del kéfir (Grafico 1), la causa de
los mismos han sido atribuidas a una elevada producción de CO2, dicha afirmación
se puede confirmar en la investigación propuesta por (Z. Guzel-Seydim, 2011).
La acidez titulable estuvo dentro del rango de 0.5 -1.5% en las 8 y 16 pero para
las 24 horas este dio un valor fuera del permitido según la INEN NTE 2395:2011,
estos resultados se deben a una mayor producción del ácido láctico durante el
proceso de fermentación, donde las BAL fermentan la lactosa para obtener ácido
láctico, lo que concuerda con lo planteado por (Tejada, 2015).
La capacidad capturadora del radical DPPH demuestra la existencia de
diferencias estadísticamente significativas (p<0.05) para la capacidad
secuestradora de radical DPPH entre el Kéfir obtenido a las 8 horas de
fermentación (Tabla 5 y Gráfico 4) y kéfir a las 16 horas.
Para los resultados de FRAP una vez aplicada la técnica y realizada la
extrapolación de los valores comparados respecto al control positivo Trolox en
una curva de FeSO4, se obtuvo como resultado que los tiempos de fermentación
8 y 16 horas difieren significativamente del Trolox, sin embargo, entre ellos
también se mostró diferencias estadísticas significativas de las 8 horas de
fermentación respecto a las 16h. Siendo sus valores 697.4375, 18.0625 y 5.5625
de µM FeSO2 obtenidas para el trolox, 8 y 16 horas de fermentación
respectivamente.
Cabe recalcar que la muestra de las 24 horas no pudo ser cuantificable debido
a que según lo estipulado por (Lopez-Rojo, H, Garcia-Pinilla, & Cornejo-Mazon,
2017) la capacidad antioxidante a este tiempo de fermentación es reducida a
causa de la concentración de ácido láctico, enzimas intracelulares y
extracelulares
Como resultados del pH y acidez titulable en cada una de las muestras se
pudo observar cómo fue cambiando de ligeramente ácido hasta ácido, esto se
47
debe a la producción de ácido láctico que aumenta en el transcurso del tiempo,
lo que trae consigo una disminución del pH, estrictamente relacionado a los
componentes de la leche ya que según (Araujo-Osorio & Hernández-Sánchez,
2007) tanto el pH como la acidez titulable se ven afectados, por ende a su vez
esto actúa en la concentración de compuestos antioxidantes, debido a que con
un pH acido se ve disminuida su concentración, por cual se puede inferir que hay
un aumento de procesos oxidativos y por consecuente la formación de productos
de oxidación, concordando con lo que argumenta (Miranda, Gormaz, Romero, &
Silvestre, 2011).
48
CAPITULO V
5.1Conclusiones
Luego de las investigaciones realizadas y posteriormente de efectuar los
respectivos análisis en las muestras de Kéfir a distintos tiempos de fermentación,
se establece las siguientes conclusiones:
La tasa de crecimiento de la biomasa y el pH mostraron un
comportamiento decreciente en función del tiempo de fermentación, este
último en relación a un incremento en el porcentaje de acidez titulable
condicionado por un aumento en la formación de ácido láctico como
producto de fermentación láctica. A las 24 horas de fermentación la acidez
titulable mostró un valor que excede los límites permisibles de acuerdo a
la norma INEN -2395-2011.
El kéfir de leche mostró el mayor efecto en la capacidad secuestradora de
radical DPPH representado como µM de Trolox/ 100 ml, a las 8 horas de
fermentación que difirió estadísticamente de las 16 horas, mientras que a
las 24 horas este efecto no fue detectable.
El poder reductor de hierro férrico reflejó un comportamiento similar a la
capacidad antioxidante total, siendo las horas 8 de fermentación donde se
obtuvo mayor concentración de hierro ferroso.
Una vez analizados los resultados (Anexo 3 Tablas 9-10) por el método
de ANOVA (P=0.05) se puede concluir que si existen diferencias
estadísticamente significativas entre los distintos tiempos de fermentación
más no existen diferencias marcadas en cuanto al poder antioxidante con
respecto al estándar.
49
5.2 Recomendaciones
Se recomienda realizar análisis de identificación con el fin de determinar
a qué metabolito se le otorga la actividad antioxidante kéfir.
Se propone realizar estudios pre-clinicos para demostrar los posibles
beneficios para la salud citados en el presente trabajo de investigación.
50
Referencias bibliográficas(s.f.).
Ruiz , Villavicencio , Ochoa & Mendoza. (2017). Beneficios del kéfir para la salud.
Revista Científica Mundo de la Investigación y el Conocimiento., 296-311.
2395, N. I., & Ecuatoriana, N. T. (2011). Leches Fermentadas. Requisitos .
segunda revisión.
Arana, M. V., Yanos, J. A., & Palma, M. I. (2017). Beneficios del kéfir para la
salud. Revista Científica Mundo de la Investigación y el Conocimiento. , 296-
311.
Arana, M. V., Yanos, J. A., & Palma, M. I. (2017). Beneficios del kéfir para la
salud. ReciMundo, 297-311. doi:10.26820/recimundo/1.4.2017.296-311
Aránzazu, P., Sonia, S., & Oteo, J. A. (4 de Noviembre de 2014). Obtenido de
https://www.seimc.org/contenidos/ccs/revisionestematicas/serologia/ccs-
2012-revisionesEIMC-EnfermedaddeLyme.pdf
Araujo-Osorio, J., & Hernández-Sánchez, H. (2007). Obtenido de
https://smbb.mx/congresos%20smbb/morelia07/TRABAJOS/Area_III/Cartel
es/CIII-59.pdf
Arevalo Ortiz , F., & Arias Arroyo, G. (2007). a comparative study of the effect of
constant and environmental temperatures in the biomass production from the
microbiota of kefir grain. Ciencia y Investigacion.
Arslan, S. (2015). A review: Chemical, microbiological and nutritional
characteristics of kefir. CYTA J. Food , 13:340–345.
Autor Rodriguez et al. (2017). Avances En El Estudio De La Bioactividad
Multifuncional Del Kéfir. INTERCIENCIA.
Badel, S., BERNARDI, T., & MICHAUD, P. (2011). New perspective for
Lactobacilli exopolysaccharides. Biotechnol. Adv. , 29, 54-66. .
Barukčić, I. L., Gracin, A. R., Jambrak, & Bož, R. (2017). Comparison of chemical,
rheological and sensory properties of kefirproduced by kefir grains and
commercial kefir starter. . Mljekarstvo, 67:169–176.
Bolaños, O. V. (2011). repositorio Ug. Obtenido de
http://repositorio.ug.edu.ec/bitstream/redug/7976/1/BCIEQ-%20T-
%200006%20Bola%C3%B1os%20Ortega%20Ver%C3%B3nica%20Valeria
51
Boldrini, G. (2009). Universidad Fasta. Obtenido de
http://redi.ufasta.edu.ar:8080/xmlui/bitstream/handle/123456789/498/2009_
N_095.pdf?sequence=1
Brand-Williams, W., Cuvelier, M. E., & Berset, C. (1995). Use of a free radical
metthod to evaluate antioxidant activity. Lebensm Wissu Technol , 28:25-30.
Can, G., Topuz, E., Derin, D., Durma, Z., & Aydiner, A. (2009). Effect of kefir on
the quality of life of patients being treated for colorectal can. Oncol. Nurs.
Forum, 36: E335-E342.
Carreón, O., Ramos, A., Leija, S., Leal, L., Jiménez, A., & Fernández, M. (2009).
Etanol. Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de
México, 13 (3): 79-102. Obtenido de
http://cybertesis.uach.cl/tesis/uach/2012/fch834o/doc/fch834o.pdf
Catalán Garrido, J. E. (junio de 2013). Evaluación A Nivel De Laboratorio De La
Capacidad Fermentativa De Los Granos De Tibicos Utilizando Como
Sustrato Único El Jugo Del Eje De La Inflorescencia De La Piña (Ananas
Comosus) Para Ser Aprovechado Como Posible Bebida Probiótica.
Guatemala,. Obtenido de biblioteca.usac.edu.gt/tesis/08/08_1340_Q.pdf
Catalán, J. E. (Junio de 2013). Evaluación A Nivel De Laboratorio De La
Capacidad Fermentativa De Los Granos De Tibicos Utilizando Como
Sustrato Único El Jugo Del Eje De La Inflorescencia De La Piña (Ananas
Comosus) Para Ser Aprovechado Como Posible Bebida Probiótica.
Guatemala.
CEIEB. (2004). Determinación de la capacidad secuestradora de DPPH.
Universidad de La Habana.
Cheirsilp, B., Shimizu, H., & Shioya, S. (2003). Enhanced kefiran production by
mixed culture of Lactobacillus kefiranofaciens and Saccharomyces
cerevisiae. J. Biotechnol, 100:43-53.
Chen, Z. J., Shi, X., Yang, B., Nan, Y., Liu, & Wang., Z. (2015). Chemical and
physical characteristics and antioxidant activities of the exopolysaccharide
produced by Tibetan kefir grains during milk. Int. Dairy J., 43:15–21.
Coronado , M. H., Salvador Vega , L., Gutiérrez , R. T., Vázquez, M. F., & Radilla
, C. V. (2015). Antioxidants: present perspective for the human health. Rev
Chil Nutr Vol. 42, Nº2, 207-212.
52
de Oliveira Leite, A., M, M. A., Miguel, R., Peixot, A. S., Rosado, J., Silva, . . .
Paschoalin. (2013). Microbiological, technological and therapeutic properties
of kefir: A natural probiotic beverage. Braz. J. Microbiol., 44:341–349.
DE VUYST, L., DE VIN, F., & KAMERLING, J. P. (2001). Recent developments
in the biosynthesis and applications of heteropolysaccharides from lactic acid
bacteria. . Int. Dairy J. , 11, 687-707. .
Estévez, S. R. (2016). Obtenido de https://eprints.ucm.es/38583/2/T37552.pdf
Farnworth, E. (2003). Handbook of Fermented Functional Foods. Series Editor
G. Mazza, Ph.D. Obtenido de
.Disponible.en:http://books.google.com.sv/books?id=gpcXqEj6g
Figueroa, S. L., & Mollinedo, O. (2017). Actividad antioxidante del extracto
etanólico del mesocarpio del fruto de Hylocereus undatus “pitahaya” e
identificación de los fitoconstituyentes. Trabajo de Pregrado. Universidad
Wiener, Perú. Obtenido de
http://repositorio.uwiener.edu.pe/bitstream/handle/123456789/924/TITULO
%20-
%20Mollinedo%20Moncada%2C%20Ofelia.pdf?sequence=1&isAllowed=
Food and Agriculture Organization . (2011). FAO. Obtenido de
http://www.fao.org/input/download/standards/332/CXS_206s.pdf
Food and Agriculture Organization. (2003). Obtenido de
http://www.fao.org/input/download/standards/400/CXS_243s.pdf
Food and Agriculture Organization of the Unite, F. (2011). Milk and milk products.
Codex Alimentarius.
fundaciondelcorazon. (Septiembre de 2016). Obtenido de
http://www.fundaciondelcorazon.com/prevencion/riesgo-
cardiovascular/colesterol.html
Gao, X., & Li. (2016). Chemical and microbiological characteristics of kefir grains
and their fermented dairy products: A review. . Cogent Food Agric, 2:127–
152.
García Garibay, M., & Quintero, R. y. (2004). Biotecnología Alimentaria. Mexico
D.F:: Limusa grupo editores. Obtenido de
http://books.google.com.sv/books?id=2ctdvBnTa18C&pg=PA178&dq=
53
Garcia, T. J., & Hernandez de Bermudez, R. (Marzo de 2015). Obtenido de
http://ri.ues.edu.sv/id/eprint/7662/1/16103581.pdf
Guzel-Seydim. (2011). Functional properties of kefir. Food Sci.
Guzel-Seydim ZB, K.-T. T. (2011). functional properties of kefir. Food Sci., 51:
261-268.
Halliwell, B., & Gutteridge, J. (2015). Free radicals in Biology and Medicine.
Clarendon: Oxford.
Heras, A. R. (s.f.). Obtenido de https://www.webconsultas.com/dieta-y-
nutricion/dieta-equilibrada/micronutrientes/minerales/calcio-1828
JIANZHONG, Z., XIAOLI, L., HANHU, J., & MINGSHENG, D. (2009). Analysis of
the microflora in Tibetan kefir grains using denaturing gradient gel
electrophoresis. . Food Microbiol. , 26, 770-775. .
KIM, Y., KIM, J. U., OH, S., KIM, Y. J., KIM, M., & KIM Y KIM S, S. (2008).
Technical optimization of culture conditions for the production of
exopolysaccharide (EPS) by Lactobacillus rhamnosus ATCC 9595. Food Sci.
Biotechnol., 17, 587-593.
Kitts, D. D. (2005). Antioxidant properties of casein-phosphopeptides. Trends
Food Sci. Technol. , 16:549–554.
Kooiman, P. (1968). The chemical structure of kefiran, the water-soluble
polysaccharide of the kefir grain. Carbohydr. Res., 7, 220-221.
Kullisaar, T. E., Songisepp, M., Mikelsaar, K., Zilmer, T., Vihalemm, & Zilmer, M.
(2003). Antioxidative probiotic fermented goats’ milk decreases oxidative
stress-mediated atherogenicity in human subjects. Br. J. Nutr. , 90:449–456.
León, P. Á. (2013). UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATA. Obtenido de
http://sedici.unlp.edu.ar/bitstream/handle/10915/32500/Documento_complet
o__.pdf?sequence=1
Lindmark-Månsson, H., & Akesson, B. (2000). Antioxidative factors in milk. Br. J.
Nutr., 84:S103–110.
López, A. (2012). Antioxidantes, un paradigma en el tratamiento de
enfermedades. Rev Asociación Nac Científica Estudiantes Medicina
(ANACEM).
54
Lopez, J. (AGOSTO de 2016). Obtenido de
https://tesis.ipn.mx/bitstream/handle/123456789/25012/L%C3%93PEZ%20
ROJO%20JUAN%20PABLO.pdf?sequence=2&isAllowed=y
López-Pedrera, C., Barbarroja, N., Jimenez-Gomez, Y., Collantes-Estevez, E.,
Aguirre, M., & Cuadrado, M. (2016, Marzo). Retrieved from
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27018059
Lopez-Rojo, J., H, H. S., Garcia-Pinilla, S., & Cornejo-Mazon, M. (Enero de
2017). Obtenido de https://www.redalyc.org/pdf/620/62052087007.pdf
Marcia, P. E., & Malespín, R. J. (Abril de 2013). Obtenido de
http://ribuni.uni.edu.ni/820/1/38797.pdf
Maria del Rosario, P. (Febrero de 2012). Obtenido de
http://imgbiblio.vaneduc.edu.ar/fulltext/files/TC112329.pdf
Miranda, M., Gormaz, M., Romero, F. J., & Silvestre, D. (2011). Estabilidad de la
capacidad antioxidante y pH en leche humana refrigerada durante 72 horas:
estudio longitudinal. Nutrición Hospitalaria, 722-728.
Montaño, A. M. (2011). Obtenido de
http://repositorio.puce.edu.ec/bitstream/handle/22000/5354/T-PUCE-
5580.pdf;sequence=1
Morales, L. T. (2009). Aumento de la biomasa de los gránulos. Obtenido de
https://www.dspace.espol.edu.ec/bitstream/123456789/10768/2/TESIS%20
BIOMASA.pdf
Moreno, R. D. (2005). Determinación De Las Características Microbiológicas,
Bioquímicas, Fisicoquímicas Y Sensoriales Para La Estandarización Del
Proceso De Elaboración De Tepache. TESUAMI.
Moreno, R. D. (2005). DETERMINACIÓN DE LAS CARACTERÍSTICAS
MICROBIOLÓGICAS, BIOQUÍMICAS, FISICOQUÍMICAS Y SENSORIALES
PARA LA ESTANDARIZACIÓN DEL PROCESO DE ELABORACIÓN DE
TEPACHE. TESUAMI.
NORMA TÉCNICA ANDINA PNA 16 007:2007. (2007). Obtenido de
http://www.minagri.gob.pe/portal/download/pdf/direccionesyoficinas/dgca/no
rmatividad-lacteos/Normas_Andinas/PNA_Leches_Fermentadas_16007.pdf
NTE INEN 10, ,. N. (2012 ). LECHE PASTEURIZADA. REQUISITOS.Quinta
revisión.
55
NTE INEN 2395, N. T. (2011). LECHES FERMENTADAS. REQUISITOS.
Núñez, A. (2011). Terapia antioxidante, estrés oxidativo y productos
antioxidantes: retos y oportunidades. Rev Cubana Salud Pública. .
Otles, S., & Cagindi, O. (2003). Kefir: A Probiotic Dairy-Composition, Nutritional
and Therapeutic Aspects. Pakistan Journal of Nutrition, 2 (2): 54-59.
Pastene, E. (2015). Estado actual de la búsqueda de plantas con actividad
antioxidante. Revista Chilena de Nutrición .
Pizzino, G., Irrera, N., Cucinotta, M., G, P., Mannino, F., Arcoraci, V., . . . Bitto,
A. (2017, Julio). Retrieved from
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28819546
Pogačić, T., Šinko, S., Zamberlin, Š. Y., Pogačic, T., Šinko, S., Zamberlin, S., &
Samaržija, ,. D. (2013). Microbiota of kéfir grains. Faculty of agriculture
university of Zagreb. department of dairy science, 3-14.
Pokorný, Yanishlieva, & Gordon. (2001). Antioxidants in Food. Woodhead
Publishing.
Prado, M., R, L. M., Blandón, L. P., Vandenberghe, C., Rodrigues, G. R., Castro,
V., . . . Soccol, C. R. ( 2015). Milk kefir:Composition, microbial cultures,
biological activities, and related products. Front. Microbiol. , 6:1177.
Quiñones, M. (2012). Los polifenoles, compuestos de origen natural con efectos
saludables sobre el sistema cardiovascular.
Ramírez-Benítez, J., Vales, B. T., Caamal-Velázquez, H., Lizama-Uc, G., & N,
R.-Á. (16 de Octubre de 2016). Research Gate. Obtenido de
https://www.researchgate.net/publication/309386051_PRODUCCION_DE_
BIOMASA_EN_LA_FERMENTACION_DE_LECHE_POR_GRANULOS_DE
_KEFIR
Rimada , P., & Abraham, A. G. (2006). Effects of different fermentation
parameters on quality characteristics of kefir. Int. Dairy J., 16, 33-39.
Rodrigues, K. L., Carvalho, J. C., Evangelista, J., & Schneedorf, J. M. (2005).
Anti-inflammatory properties of kefir and its polysaccharide extract.
Inflammopharmacology, 13, 485-492.
ROJO, J. P. (Agosto de 2016). Obtenido de
https://tesis.ipn.mx/bitstream/handle/123456789/25012/L%C3%93PEZ%20
ROJO%20JUAN%20PABLO.pdf?sequence=2&isAllowed=y
56
Rosa, D. D., M, M. S., Dias, L. M., Grześkowiak, A., Reis, L. L., Conceição, . . .
Peluzio. (2017). Milk kefir: Nutritional, microbiological and health benefits. .
Nutr. Res. Rev. , 30:82–96.
Sabokbar, N. F., Khodaiyan, M, & Moosavi-Nasab. (2015). Optimization of
processing conditions to improve antioxidant activities of apple juice and
whey based novel beverage fermented by kefir grains. . J. Food Sci.
Technol., 52:3422–3432.
Sah, B. N., Vasiljevic, S., McKechnie, & Donkor., O. N. (2015). Effect of
refrigerated storage on probiotic viability and the production and stability of
antimutagenic and antioxidant peptides in yogurt supplemented with
pineapple peel. . J. Dairy Sci. , 98:5905–5916.
SAIJA, N., WELMAN, A., & BENNETT, R. (2010). Development of a dairy-based
exopolysaccharide bioingredient. . Int. Dairy J., 20, 603-608. .
salud, D. (Octubre de 2015). Obtenido de
https://quierocuidarme.dkvsalud.es/salud-para-todos/glucosa-que-es
San Martin, B. (Noviembre de 2017). Obtenido de
https://www.tesisenred.net/handle/10803/462069#
Satir, G., & Guzel-Seydim, Z. (2016). How kefir fermentation can affect product
composition? Small Rum, 134: 1-7.
Serafini, F., Turroni, P., Ruas-Madiedo, G. A., Lugli, G., Milani, S., & Duranti, N.
(2014). Kefir fermented milk and kefiran promote growth of Bifidobacterium
bifidum PRL2010 and modulate its gene expression. Int. J. Food, 178, 50-59.
Servicio Ecuatoriano de Normalizacion. (04 de 2012). Obtenido de
https://archive.org/details/ec.nte.0010.2012/page/n3
Stanner, S. (2011). A review of the epidemiological evidence for the "antioxidant
hypothesis".
Tejada, T. R. (Octubre de 2015). Universidad Nacional de Colombia. Obtenido
de http://bdigital.unal.edu.co/50910/1/9147159.2015.pdf
Valenzuela, E. (2000). Guia de hongos (MICR 105 – MICR 112 – MICR 240 –
MICR 323). Instituto de Microbiología, Facultad de Ciencias., 51 p. Obtenido
de http://cybertesis.uach.cl/tesis/uach/2012/fch834o/doc/fch834o.pdf
Vázquez, H., & Dacosta, O. (2007). Obtenido de
http://www.ejournal.unam.mx/ict/vol0804/ICT000800404.pdf
57
Venereo Gutiérrez, J. (2002). Revista Cubana Medica Militar. Obtenido de
http://www.bvs.sld.cu/revistas/mil/vol31_2_02/MIL09202.htm
Walstra, P., Geurts, T., & Normen, A. (2001). Ciencia de la leche y tecnología de
los productos lácteos. Acribia.
Wang, Y., Ahmed, Z., Feng, W., Li, C., & Song, S. (2008). Physicochemical
properties of exopolysaccharide produced by Lactobacillus kefiranofaciens
ZW3 isolated from Tibet kefir. Int. J. Biol. Macromol., 43, 283-288.
Welman, A. D., & Maddox, I. S. (2003). Exopolysaccharides fron lactic acid
bacteria: perspectives and challenges. Trends Biotechnol. , 21, 269-274.
Witthuhn, R. C., Schoeman, T., & Britz, T. J. (2005). Characterisation of the
microbial population at different stages of kefir production and kefir grain
mass cultivation. Int. Dairy J, 15, 383-389.
Z. Guzel-Seydim, 1. T.-T.-F. (2011). Effect of different growth conditions on
biomass increase in kefir grains.
Zajšek, K., Goršek, A., & Kolar, M. (2011). Characterisation of the
exopolysaccharide kefiran produced by lactic acid bacteria entrapped within
natural kefir grains. Int. J. Dairy Technol., 64, 544-548.
Zulueta, A. A., Maurizi, A., Frígola, M. J., Esteve, R., Coli, & Bustiri, G. (2009).
Antioxidant capacity of cow milk, whey and deproteinized milk. . Int. Dairy J.
19:380–385., 19:380–385.
ANEXOS
Anexo 1
58
Información Nutricional
Anexo 2
Inoculación del kéfir en leche UHT
59
Figura 2 Inoculación de kéfir en leche UHT
Figura 3 Leche fermentado con gránulos de Kéfir
Figura 1 Gránulos deKéfir
60
Figura 4 Pesado de los Gránulos de Kéfir
61
Anexo 3
Análisis de varianza (ANOVA)
Tabla 6 Análisis de varianza del crecimiento de BiomasaANÁLISIS DE VARIANZA
Origen delas
variaciones
Sumade
cuadrados
Gradosde libertad
Promediode los
cuadrados
F Probabilida
d
Valorcríticopara F
Entregrupos
100,985132
2 50,492566 4150,8012
5
3,7673E-10
5,14325285
Dentro delos grupos
0,07298721
6 0,01216453
Total 101,058119
8
Tabla 7 Análisis de varianza del pHANÁLISIS DE VARIANZA
Origen delas
variaciones
Sumade
cuadrados
Gradosde libertad
Promediode los
cuadrados
F Probabilida
d
Valorcríticopara F
Entregrupos
45,9244929
6 7,65408214 0,34206241
0,90659893
2,57271164
Dentro delos grupos
469,90175
21 22,3762738
Total 515,826243
27
Tabla 8 Análisis de varianza de Acidez titulableANÁLISIS DE VARIANZA
Origen delas
variaciones
Sumade
cuadrados
Gradosde libertad
Promediode los
cuadrados
F Probabilida
d
Valorcríticopara F
Entregrupos
0,366821672
2 0,183410836
476,899866
2,44293E-
07
5,14325285
Dentro delos grupos
0,002307539
6 0,00038459
Total 0,369129211
8
62
Tabla 9 Análisis de varianza de DPPH
Tabla 10 Análisis de varianza FRAP
ANÁLISIS DE VARIANZAOrigen de
lasvariaciones
Sumade
cuadrados
Gradosde libertad
Promediode los
cuadrados
F Probabilida
d
Valorcríticopara F
Entregrupos
153,5133554
2 76,75667768
11870321,5
3
1,61427E-
20
5,14325285
Dentro delos grupos
3,87976E-05
6 6,46627E-06
Total 153,5133941
8
ANÁLISIS DE VARIANZAOrigen de
lasvariaciones
Sumade
cuadrados
Gradosde
libertad
Promediode los
cuadrados
F Probabilida
d
Valorcríticopara F
Entregrupos
448,354009
2 224,177005
19399933,1
3,698E-21
5,14325285
Dentro delos grupos
6,9333E-05
6 1,1556E-05
Total 448,354078
8
