UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ... · Sesión 1. Intro y conceptos básicos (Unidad...
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UNIVERSIDAD DE SONORA
POSGRADO EN BIOCIENCIAS
MICROBIOLOGÍA MOLECULAR (2442)
Material Didáctico
Elaboró: Dra. Kadiya Calderón Alvarado
MICROBIOLOGÍA MOLECULAR (2442)
Unidad: CentroDivisión: Ciencias Biológicas y de la SaludDepartamento: Investigaciones Científicas y Tecnológicas (DICTUS)Eje Temático: Optativa / especializaciónCréditos: 8
Teoría: 3 horas a la semana por semestre
Dra. Kadiya del Carmen Calderón Alvarado
TEMARIO DEL CURSO
CALENDARIO DE ACTIVIDADESSesión 1. Intro y conceptos básicos (Unidad 1)Sesión 2. Extracción y manipulación de AN (Unidad 2) Sesión 3. Reacción en cadena de la polimerasa (Unidad 5)Sesión 4. Examen 1 (unidades 1,2 y 5)Sesión 5. Sesión especial Investigador invitado externoSesión 6. Endonucleasas y enzimas de restricción (Unidad 3)Sesión 7. Técnicas de hibridación (Unidad 4)Sesión 8. Bibliotecas genómicas (unidad 6)Sesión 9 Examen 2 (unidades 1-6)Sesión 10. Secuenciación de ADN (Unidad 7) Sesión 11. Citogenética molecular (Unidad 8)Sesión 12. Microarrays (Unidad 9)Sesión 13. Exámen 3 (unidades 7-9)Sesión 14. Calificaciones finales
UNIDAD 1. Introducción y conceptos básicos
Elaboró: Dra. Kadiya del C. Calderón Alvarado
UNIVERSIDAD DE SONORA
POSGRADO EN BIOCIENCIAS
MICROBIOLOGÍA MOLECULAR (2442)
1. Dogma central de la biología molecular
BiologíaMolecular:Conjuntodeprocesosbásicosquellevanalmantenimientodelainformacióngenética(replicación)yasuexpresión(transcripciónytraducción).
ADN
ARNm
Proteína
TRANSCRIPCIÓN
TRADUCCIÓN
aminoácidos
Genes X, Lewin B, 2009.
ADN
Bases moleculares de la genética
Genes (ADN)
Transcripción (ARNm)
Traducción (ARNt)
Proteína
Replicación
Células hijas
Célula parentalMantenimiento de la información genéticaLa replicación del ADNposibilita el flujo de la información genética de una generación a la siguiente.Cada célula fruto de una división celular recibe una copia del cromosoma idéntica a la de la célula progenitora.
Genes X, Lewin B, 2009.
HERRAMIENTAS MOLECULARESSon las técnicas de laboratorio que se usan para aislar o extraer ácidos nucleicos en alta pureza para su posterior manipulación.
a) Amplificar una región de interés
b) Clonación de fragmentos en bacterias u otros vectores como virus
c)Utilizar enzimas de restricción para ver si por una mutación se gana o se pierde un sitio de restricción.
d) Perfiles de biodiversidad
e) Análisis de metagenómica, transcriptómica o proteómica.
Viables pero no cultivables
*Métodos tradicionales:
*Siembra en medios de cultivo selectivos ó diferenciales.
* Pruebas bioquímicas.* Tinciones, etc.
*Métodos moleculares
¿Qué es la microbiología?
Woese, C., & Fox, G. (1977)
¿Porqué estudiar microbiología?
Enfoquesenelestudiodelosmicroorganismos:Microbiologíatradicional:Sefundamentaenelestudiodelosmicroorganismosaisladosencultivopuro.
Estudiodesuscaracterísticasindividuales
SecuenciacióndeADN:• Filogenia• Identificacióndefunciones
Genómica(1970):Análisisdelmaterialgenético delosorganismos.Apartirdelassecuenciadegenesesposible:• Comprenderlasrelacionesevolutivas (filogenia)• Conocerlascapacidades metabólicas delosmicroorganismos
Muchosmicroorganismoshanevolucionadocreciendojuntosencomunidades,altamenteestructuradasycondivisiónderoles.
Susactividadescolectivas sonvitalesparaelfuncionamientodelabiosfera,einfluencianlavidaysaludhumanas.
Microbiologíatradicionalygenómica:
Limitacionesenmicrobiologíaambiental:• Losmicroorganismos no funcionanindividualmente
• Losmicroorganismos interaccionan:
• Entresí• Asociándoseconotrosseresvivos• Conelentornofísicoenelquehabitan
Porlotanto,esimportanteestudiarlaestructura delascomunidadesmicrobianasparaentendersudinámica yasídescubrirlafunción delosmicroorganismosenlossistemas
ambientalesàMETAGENÓMICA.Philip
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Meta(griego) =quetrasciende
• Ramadelascienciasbiológicas, quetratadecomprenderlabiologíaanivelde comunidadensuentornonatural,trascendiendoalosorganismosindividuales.
• Ramadelametodologíacientífica, quedesarrollaherramientas quepermitencomprenderlacomposicióngenéticaysufunciónencomunidadesmicrobianascomplejas.
LascomunidadescomplejasNO puedensertotalmentecaracterizadas
Metagenómica(J.Handelsman,1998)Handelsman, J. et al. 1998. Chemistry & Biology 5 (10): R245–R249
Aplicacióndetécnicasparaelestudiodirectodelascomunidadesmicrobianasensusentornos
naturales,sinnecesidaddeaislarycultivarindividualmentelasespeciesenellaboratorio
Basadasenlarecuperacióndelosácidosnucleicos (ADN/ARN)apartirde
muestraambientales
Conjuntodelosgenomasdeunentorno=METAGENOMA
entorno
comunidad
metagenoma
Metagenómicaenlaecologíamicrobiana
Zou et al., 2018.
• Estudiosdeladiversidadfilogenéticadelascomunidadesdemicroorganismos,usandofundamentalmenteel16SrRNAcomomarcadorà estructura
• Monitorizarypredecircambiosenlospatronesdediversidaddelascomunidadesdemicroorganismos,enfuncióndelascondicionesambientalesà dinámica.
Aplicacionesdelamicrobiologíamolecularenlaecologíamicrobiana
• Examinargenes/operonesenbuscadeenzimasdeinterés,conaplicacionesmédicas,industriales,etc.
• Examinarmecanismosdesecreción,regulación,ytransduccióndeseñales,asociadosagenesdeinterés.
Spor et al., 2016; Calderón et al., 2017
Metagenómicaaplicadaalaevaluacióndeladiversidadmicrobiana
Técnicasquenorequierenextraccióndeácidosnucleicos:
- Hibridacióninsituconfluorescencia(FISH)
Técnicasbasadasenlaextraccióndeácidosnucleicos(ADN/ARN):
- Construccióndebibliotecasmetagenómicas.
- Fingerprinting:• Electroforesisengelcongradientedesnaturalizanteodetemperatura
(DGGE/TGGE)• Polimorfismoconformacionaldecadenasencilla(SSCP)• Polimorfismodelalongituddefragmentosderestricciónterminales
(T-RFLP)
- PCRyRT-PCRentiemporeal(RealTimePCR)(cuantitativas).
- Microarrays(ChipsdeADN)
- Secuenciaciónmasiva(High-throughputsequencing,Deepsequencing,NextGenerationSequencing).
ARNribosómicobacteriano.
§ ARNr23S§ ARNr5S§ proteínas
§ ARNr16S§ proteínas
Ribosomabacteriano
• LasecuenciadebasesdelgendelARNr 16Stieneinterésfilogenético(cronómetromolecular).
• SepuedendiferenciareidentificarbacteriasapartirdelasecuenciadesugendelARNr 16S.
50S
30S
Subunidadgrande
Subunidadpequeña
Genes X, Lewin B, 2009.
Estructura secundariadel ARNr 16S deEscherichia coli
5’
3’
Zonas conservadas
Zonas hipervariables
Regionesespecíficas de grupo:
• división• reino• familia• género• especie
Diseño de cebadores (primers) y sondas (probes)
EstructurasecundariadelARNr16SdeEscherichiacoli
V1 66-99nt
V2137-242nt
V3433-497nt
V4576-682nt
V81243-1294nt
V91435-1465nt
V71117-1173nt
V6986-1043nt
V5 822-879nt
Hay9regionesconsideradashipervariablesenlasecuenciadel16SrRNAdebacterias(V1aV9)
Yarza et al., (2014).
Estructura secundaria del ARNr 18S eucariota (Saccharomyces cerevisiae)
V7
V8
V5
V4
V3
V9
V1
V2
V6
http://nar.oxfordjournals.org/content/suppl/2001/12/18/30.1.183.DC1/varmaps.htmldoi:10.1093/nar/30.1.183Nucleic AcidsResJanuary1,2002vol.30no.1183-185
750 μm de diámetroThiomargarita namibiensis
500 μm de longitudEpulopiscium fishelsoni
100 μm
protozoo
Wolffia globosa
Planta con flores,400μm diametro
200 µm
Tamaño, forma y asociaciones.
Tamaño de los procariotas: muy variable
Industria farmacéutica y cosmética, industria alimentaria: • Expansores del plasma (dextrano)• Espesantes y emulgentes de alimentos, cosméticos,
fármacos, pinturas, agroquímicos (xantano, alginato, otros)• Aditivos de la industria de extracción del petróleo (xantano)
Importancia industrial de los productos microbiológicos
Recordatorio….... La envuelta celularPared celular
Bacterias Gram positivas y Gram negativas
Gram negativas
Membrana plasmática
Capa de mureína
Porina
Espacio periplásmico
Membranaexterna
LPS
Gram positivas
Capa de mureína
Membrana plasmática
Ácidosteicoicos
Ácidoslipoteicoicos
Piliofimbrias.
Importanciayfuncionesdelospiliadhesivos•Fijaciónsobresuperficiessólidas(vivasoinertes)
•Formacióndebiopelículas•Evasióndelas defensasinmunes
Adhesinasà
Importantesfactoresdevirulenciadelosmicroorganismospatógenos
5µm
•Todos los pili adhesivos en Gram positivas y Gram negativas son responsables de la adhesión específica de los patógenos a los tejidos de su hospedador, facilitando la colonización e invasión.
Aplicaciones:
Industria de lácteos y quesos, embutidos
Fabricación de pan y bebidas alcohólicas
F. láctica
F. butírica F. propiónica
F. alcohólica
Disolventes y explosivos
F. butanólica
queso suizo
Fermentaciones
Viables pero no cultivables (VBNC)Artículo para discusión
¿Cómo distinguir entre Resucitación, sobrevivencia y recrecimiento?
Pintó et al., 2013