UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE...
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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS MODALIDAD: INVESTIGACIÓN TEMA: DETERMINACIÓN DE SAPONINAS TRITERPÉNICAS EN LA PULPA Y CORTEZA DE LOS FRUTOS DE Mimusops sp. EN DIFERENTES ESTADOS DE MADURACIÓN. TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITO PREVIO PARA OPTAR AL GRADO DE QUÍMICO Y FARMACÉUTICO AUTORES: Marcial Méndez Mario Michael Pilla Díaz Richard Andrés TUTORA: Q.F. Katherine E. Bustamante Pesantes, Mg. GUAYAQUIL – ECUADOR 2018
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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
MODALIDAD: INVESTIGACIÓN
TEMA:
DETERMINACIÓN DE SAPONINAS TRITERPÉNICAS EN LA PULPA Y
CORTEZA DE LOS FRUTOS DE Mimusops sp. EN DIFERENTES ESTADOS
DE MADURACIÓN.
TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITO PREVIO
PARA OPTAR AL GRADO DE QUÍMICO Y FARMACÉUTICO
AUTORES:
Marcial Méndez Mario Michael
Pilla Díaz Richard Andrés
TUTORA:
Q.F. Katherine E. Bustamante Pesantes, Mg.
GUAYAQUIL – ECUADOR
2018
AGRADECIMIENTOS
A Dios primeramente por bendecirnos siempre, por las fuerzas que nos otorga cada
día al levantarnos y llenarnos de motivaciones para convertir en realidad este
momento, a nuestros padres que han sido instrumentos de fortaleza, consejos y amor
que nos han brindado sin esperar nada a cambio, tan solo con el objetivo de
convertirnos en profesionales de éxitos. A nuestra tutora Dra. Katherine Bustamante,
por su incondicional apoyo moral, docente, y amiga sincera.
DEDICATORIA
A nuestros padres por ser el pilar fundamental en todo lo que somos como personas,
por toda la educación, tanto en el campo académico, como en la vida misma, por su
apoyo incondicional ofrecido durante todo este tiempo.
A nuestra querida tutora Katherine Elizabeth Bustamante Pesantes por su motivación
y gran apoyo para la culminación de esta etapa académica y para la preparación de
esta tesis, por su tiempo compartido y por impulsar el desarrollo de nuestra
formación profesional.
ÍNDICE
INTRODUCCIÓN ....................................................................................................... 1
CAPÍTULO I. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ............................................ 3
I.1 HIPÓTESIS ............................................................................................................ 3
I.2 OBJETIVO GENERAL ......................................................................................... 3
I.3 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................. 3
CAPÍTULO II. MARCO TEÓRICO ........................................................................... 4
II.1 BASES TEÓRICAS Y CIENTÍFICAS ................................................................ 4
II.1.1 GENERALIDADES .......................................................................................... 4
II.1.2 CARACTERÍSTICAS QUÍMICAS ................................................................... 5
II.1.3 SAPONINAS TRITERPÉNICAS ...................................................................... 6
II.1.3.1 PRINCIPALES NÚCLEOS ESTRUCTURALES .......................................... 7
II.1.4 SAPONINAS ESTEROIDALES ....................................................................... 9
II.1.4.1 PRINCIPALES NÚCLEOS ESTRUCTURALES ........................................ 10
II.1.5 MÉTODOS DE EXTRACCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LAS
SAPONINAS ............................................................................................................. 12
II.1.6 REACCIONES DE IDENTIFICACIÓN ......................................................... 14
II.2 ANTECEDENTES .............................................................................................. 17
CAPÍTULO III. MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................... 26
III.1 RECOLECCIÓN, SELECCIÓN Y SECADO DEL MATERIAL .................... 26
III.2 CARACTERIZACIÓN BOTÁNICA DE LA ESPECIE................................... 26
III.2.1 Evaluación macromorfológica de los frutos ................................................... 26
II.3 ALMACENAMIENTO ....................................................................................... 27
III.4 DETERMINACIÓN DE PARÁMETROS FISICOQUÍMICOS ...................... 27
III.4.1 Humedad residual (Aplicación de método gravimétrico) ............................... 27
III.4.2 Cenizas totales ................................................................................................ 28
III.4.3 Cenizas insolubles en ácido clorhídrico .......................................................... 28
III.4.4 Sustancias solubles ......................................................................................... 29
III.5 TAMIZAJE FITOQUÍMICO ............................................................................ 30
III.6 MACERACIÓN, CONCENTRADO Y ANÁLISIS DE LOS EXTRACTOS DE
LA CORTEZA Y PULPA VERDE Y MADURA DE LOS FRUTOS ..................... 31
III.6.1 Maceración ...................................................................................................... 31
III.6.2 Concentrado .................................................................................................... 31
III.6.3 Determinación de rendimiento porcentual ...................................................... 33
III.6.4 Reacción de silanización ................................................................................. 35
III.6.5 Análisis de los extractos por el sistema acoplado CG-EM ............................. 35
III.6.6 Análisis estadístico. ........................................................................................ 36
CAPÍTULO IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................... 37
IV.1 ANÁLISIS MACROMORFOLÓGICO DE LOS FRUTOS ............................. 37
IV.2 DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS FÍSICO-QUÍMICOS ............ 38
IV.3 TAMIZAJE FITOQUÍMICO ............................................................................ 41
IV.4 DETERMINACIÓN DE RENDIMIENTO PORCENTUAL ........................... 45
IV.5 ANÁLISIS DE LOS EXTRACTOS POR EL SISTEMA ACOPLADO CG-EM
................................................................................................................................... 46
CAPÍTULO V. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ............................... 57
V.1 CONCLUSIONES .............................................................................................. 57
V.2 RECOMENDACIONES ..................................................................................... 58
BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................................... 59
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla I. Descripción de los datos obtenidos en el análisis estadístico del parámetro
macromorfológico de frutos de Mimusops sp ........................................................ 37
Tabla II. Parámetros físico-químicos de la corteza de los frutos de Mimusops sp. .. 38
Tabla III. Parámetros físico-químicos de la pulpa obtenida de los frutos de
Mimusops sp. .......................................................................................................... 39
Tabla IV. Tamizaje fitoquímico del extracto etéreo de la corteza y pulpa del fruto de
Mimusops sp. .......................................................................................................... 41
Tabla V. Tamizaje fitoquímico del extracto alcohólico de la corteza y pulpa del fruto
de Mimusops sp. ..................................................................................................... 43
Tabla VI. Tamizaje fitoquímico del extracto acuoso de la corteza y pulpa del fruto
de Mimusops sp. ..................................................................................................... 44
Tabla VII. Resultados de rendimiento porcentual de la extracción de la corteza y la
pulpa de los frutos verde y maduro de Mimusops sp. ............................................ 45
Tabla VIII. Compuestos identificados por CG-EM en los extractos alcohólicos de
las cortezas de Mimusops sp. ................................................................................. 48
Tabla IX. Compuestos identificados por CG-EM en los extractos alcohólicos de la
pulpa de Mimusops sp. ........................................................................................... 53
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Representación gráfica de una estructura esteroidal y una estructura
triterpenoide pentacíclica ......................................................................................... 6
Figura 2. Representación gráfica de diferentes estructuras de sapogeninas
triterpénicas. ............................................................................................................. 9
Figura 3. Gráfico de estructuras y configuraciones de diferentes sapogeninas
esteroidales. ............................................................................................................ 12
Figura 4. Gráfico de estructura y configuración del triterpeno 3 β-hidroxi-lup-
20(29)-ene-23,28-dioico ácido. .............................................................................. 25
Figura 5. Esquema de extracción sucesiva del material vegetal con disolventes para
el tamizaje fitoquímico. .......................................................................................... 32
Figura 6. Ensayos cualitativos a realizar en cada extracto. ...................................... 33
Figura 7. Estudio macromorfológico de los frutos de Mimusops sp. ....................... 37
Figura 8. Cromatograma gaseoso analítico del extracto alcohólico de la corteza de
los frutos maduros y verdes de Mimusops sp. ........................................................ 48
Figura 9. Cromatograma gaseoso analítico de los extractos alcohólicos de la pulpa
de los frutos maduros y verdes de Mimusops sp .................................................... 53
Figura 10. Algunas estructuras aisladas de la corteza y la pulpa de los frutos
maduros y verdes de Mimusops sp ......................................................................... 56
ANEXOS
Informe antiplagio del sistema urkund ...................................................................... 63
1
INTRODUCCIÓN
A partir de tiempos antiguos el reino vegetal ha ofrecido beneficios curativos
que han sido aplicados en favor de la humanidad. Desde aquellos momentos hasta el
presente muchas personas se han dedicado con gran esfuerzo al estudio de las
propiedades medicinales que se pueden obtener a través de este reino vegetal.
Las saponinas se encuentran presentes en los materiales vegetales y son
sustancias que han sido extraídas de las semillas y frutos de diferentes especies de
plantas. Representan un gran aporte para la sociedad debido a que poseen
propiedades detergentes, y que resulta muy común su uso en la industria cosmética,
también son utilizadas en las industrias farmacéuticas debido a que algunas sirven
como materias primas para la semisíntesis de moléculas medicamentosas esteroídicas
y para obtener diferentes formas galénicas, otras poseen aplicaciones para
fitoterapias.
La familia de las Sapotáceas posee alrededor de 800 especies de árboles
perennes y arbustos distribuidas en 65 géneros.
Varias de sus diferentes especies producen frutos comestibles que resultan
beneficiosos para la subsistencia económica y otras producen importantes
compuestos con diversos usos medicinales.
2
Dentro de esta familia del reino vegetal se encuentra el género Mimusops que
alcanza 136 especies descritas y de los cuales se han informado a través de diversos
estudios la presencia de compuestos saponínicos en los frutos. Es por ello que
mediante el presente trabajo se aborda el estudio de saponinas existentes en los frutos
de la especie que crece en el Ecuador, para lo cual se plantea el siguiente problema:
3
CAPÍTULO I. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
¿Poseen la corteza y pulpa de los frutos de Mimusops sp, que crece en el
Ecuador saponinas triterpénicas?
I.1 HIPÓTESIS
• La corteza y pulpa de los frutos de Mimusops sp. que crece en el Ecuador
poseen saponinas triterpénicas.
I.2 OBJETIVO GENERAL
• Realizar el estudio químico y farmacognóstico de la corteza y pulpa de los
frutos de Mimusops sp., en dos estados de maduración.
I.3 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Evaluar los parámetros físicos-químicos de la pulpa y corteza de los
frutos en dos estados de maduración, para determinar sus parámetros de
calidad.
• Realizar el tamizaje fitoquímico comparativo de la corteza y pulpa de
los frutos de la especie en dos estados de maduración.
• Valorar el método de extracción más adecuado para extraer los
compuestos saponínicos de la corteza y pulpa de los frutos.
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CAPÍTULO II. MARCO TEÓRICO
II.1 BASES TEÓRICAS Y CIENTÍFICAS
II.1.1 GENERALIDADES
Los saponósidos como también se conocen a las saponinas son glicósidos
hidrosolubles que poseen propiedades tensoactivas y hemolíticas según Mena y col.,
(2015), ambas atribuidas a sus características estructurales de naturaleza anfifílica.
Estos metabolitos pueden ejercer una amplia actividad biológica y
farmacológica, destacándose su efecto insecticida, anti-protozoos, antiinflamatorio,
leishmanicida, anti-trichomonas, anti-agregante plaquetario, broncolítico, hipo-
colesterolémico, así como su actividad citotóxica frente a varias neoplasias (Mena y
col., 2015).
Las saponinas presentes en los materiales vegetales se han utilizado desde
tiempos remotos en diversas partes del mundo por lo que señala Evans (2009), se
debe a que poseen propiedades detergentes, el uso de la raíz de Saponaria officinalis
perteneciente a la familia Caryophyllaceae en Europa y la corteza de Quillaja
saponaria procedente de la familia Rosaceae en América del Sur son ejemplos de
plantas que poseen un porcentaje elevado de saponinas y que se identifican por su
propiedad de generar espuma en una solución acuosa.
La actividad hemolítica y la alta toxicidad al entrar en contacto con el torrente
sanguíneo también forman parte de sus características. La ingesta de saponinas por
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vía oral es generalmente inofensiva en comparación con el contacto directo al
torrente sanguíneo. Sus usos pueden variar, como es el caso de la zarzaparrilla que es
rica en saponinas, pero se utiliza con amplitud en la preparación de bebidas no
alcohólicas (Evans, 2009).
Debido a que algunas se utilizan como materias primas para la semisíntesis de
moléculas medicamentosas esteroídicas, las saponinas tienen una gran importancia a
nivel industrial. Es importante resaltar que las saponinas en la industria farmacéutica
se utilizan para obtener diferentes formas galénicas, otras poseen aplicaciones para
fitoterapias, mientras que en la industria cosmética se la emplea ampliamente por sus
propiedades detergentes (Bruneton, 2017).
II.1.2 CARACTERÍSTICAS QUÍMICAS
Poseen una alta polaridad y alto peso molecular, por lo tanto se pueden
presentar algunas dificultades durante su aislamiento en un estado de pureza (Evans,
2009).
Para Donald y col., (2017), la solubilidad de las saponinas en el agua se
encuentra facilitada a pesar de su alto peso molecular, y a la existencia de residuos de
monosacáridos, además de otros grupos polares presentes en el aglicón que se forma
a partir de la hidrólisis de las saponinas.
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Dicha hidrólisis se realiza a través de ácidos para obtener una aglicona,
también denominada sapogenina y además la obtención de varios azúcares y ácidos
urónicos vinculados.
El aglicón es una porción carbonada policíclica también conocido con el
nombre de sapogenina y de acuerdo a su estructura se pueden diferenciar dos tipos de
saponinas tales como las esteroideas (tetracíclicas) y las triterpenoides tetracíclicas y
pentacíclicas (Figura 1) (Evans, 2009; Donald y col., 2017).
Figura 1. Representación gráfica de una estructura esteroidal (izquierda) y una
estructura triterpenoide pentacíclica (derecha).
Obtenido de Evans, (2009)
II.1.3 SAPONINAS TRITERPÉNICAS
Las saponinas que presentan genina de tipo triterpénica se encuentran
generalmente en algunos animales de mar. En la flora son inexistentes para
Gimnospermas, mientras que en Angiospermas se encuentran especialmente en
Dicotiledóneas tales como: Caryophyllaceae, Cucurbitaceae, Rosaceae, Sapindaceae,
entre muchas otras (Bruneton, 2017).
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Las sapogeninas triterpénicas señaladas por Donald y col., (2017) poseen un
rango de 30 a 45 carbonos por lo que poseen la capacidad de presentarse en 3
estructuras químicas diferentes, tales como: Aciclícas como el Escualeno (precursor
natural de esta familia); Tetracíclicas como el Panaxadiol y Pentacíclicas como la
Estallogenina. Estas sustancias pueden formar ésteres, o formar parte de un glicósido
(saponina) al presentarse en sus formas naturales.
Es importante resaltar que las sapogeninas pentacíclicas presentan una
subdivisión de 3 grupos: lupano, ursano y oleanano siendo las dos primeras
derivados de la α-amirina, mientras la última de la ß-amirina (Donald y col., 2017).
II.1.3.1 PRINCIPALES NÚCLEOS ESTRUCTURALES
Las sapogeninas triterpénicas pueden ejercer la ciclación del (35)-2,3-epoxi-
2,3-dihidroescualeno como es común en la mayoría de los triterpenoides. El
resultado de esta actividad corresponde en primer lugar a la producción de moléculas
tetracíclicas llamadas Dammaranos, las mismas que se presentan al estado de
heterósidos en drogas como el Ginseng, o, cuando en la ciclación se ha producido
una conformación diferente del precursor, se refiere a los Cucurbitanos que de igual
manera son tetracíclicos y poseen una distribución restringida (principalmente en las
Cucurbitaceae) (Bruneton, 2017).
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El compuesto tetracíclico de tipo Dammarano es un intermediario que tiende a
evolucionar hacia estructuras pentacíclicos tales como: oleananos, ursanos y lupanos
los mismos que a su vez pueden tener algunos reagrupamientos (Bruneton, 2017).
Las sapogeninas pentacíclicas a diferencia existen en gran número, presentan
moléculas como el Oleanano, Ursano y Lupano y son las tres estructuras que
normalmente se pueden encontrar.
Además, Bruneton, (2017) señala que más del 50% de los saponósidos que se
conocen, se derivan del Oleanano, resaltando el ácido oleanólico y de la
hederagenina.
A continuación se presentan las variaciones estructurales de las sapogeninas
triterpénicas (Bruneton, 2017). (Figura 2):
Habitualmente se presenta una insaturación en C-12(13)
Sufre variaciones debido a la frecuente oxidación de los carbonos de los
metilos en C-23 y C-28, así también en C-30
Se presentan oxidaciones de algunos carbonos cíclicos entre los cuales
tenemos: C-2, C-7, C-11, C-15, C-16, C-21, C-22. La oxidación de uno de
estos hidroxilos a cetona (sobre todo a nivel de C-11) es muy común y la
polifuncionalización puede producir, por esterificación interna o
lactonización, la formación de ciclos suplementarios.
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La genina puede encontrarse esterificada de forma parcial por ácidos
alifáticos de pequeña masa molecular como en el caso de la Escina de la
semilla del castaño de Indias, la teasaponina y los ácidos ginémicos. Cabe
resaltar que la genina a veces puede ser derivado del lanostano, el cicloartano
(Passiflora, Abrus) o de un nortriterpeno.
Figura 2. Representación gráfica de diferentes estructuras de sapogeninas
triterpénicas.
Obtenido de Bruneton, (2017).
II.1.4 SAPONINAS ESTEROIDALES
Las saponinas que presentan genina esteroidal se encuentran exclusivamente en
Angiospermas mayoritariamente en Monocotiledóneas principalmente de las familias
de las Liliáceas, Amarilidáceas y Dioscoreáceas y las triterpénicas en éstas; mientras
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que en menor cantidad en algunas dicotiledónea (Bruneton, 2017; Donald y col.,
2017).
Entre las saponinas esteroidales, son de mucha importancia aquellas que
presentan como aglicona a la hecogenina y la diosgenina, ambos son compuestos
vegetales que sirven de base para la síntesis de hormonas esteroidales (Donald y col.,
2017).
II.1.4.1 PRINCIPALES NÚCLEOS ESTRUCTURALES
Para Bruneton, (2017) las sapogeninas de tipo esteroide que tienen una
estructura de 27 átomos de carbono, normalmente presentan seis ciclos. Los ciclos E
(furánico) y F (piránico) son formalmente consecuencia de una cetalización
intramolecular que tiene lugar después de la oxidación en los carbonos C-16, C-22 y
C-26 de un precursor colestánico.
Debido a que la naturaleza del carbono C-22 es espiro, se designa esta
estructura hexacíclica con la terminología de espirostano, por lo general en plantas
frescas el hidroxilo en C-26 se asocia a una osa por lo que la estructura queda
entonces pentacíclica, en ese caso recibe el nombre de furostano. Los heterósidos
espirostánicos se hallan distribuidos de manera principal en los bulbos, las raíces y
las semillas (Bruneton, 2017).
A continuación se presentan las variaciones estructurales de las sapogeninas
esteroidales (Bruneton, 2017). (Figura 3):
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El esqueleto hexacíclico posee varios carbonos asimétricos, pero
únicamente puede tener variación en la configuración del carbono C-25, lo
que permite determinar la existencia de dos series: las neosapogeninas (25-
5, en donde el metilo es axial) o las isosapogeninas (25-R, en donde el
metilo es ecuatorial). Se puede destacar que la configuración de los
carbonos C-20 y C-22, respectivamente S y R es constante en las
sapogeninas naturales.
El doble enlace presente en los carbonos 5,6 puede conservarse como es el
caso de la Diosgenina, o puede también reducirse lo que provoca la
aparición de derivados con ciclos A/B fusionados en trans (H-5 A, ej.:
tigogenina, digitogenina) o en cis (H-5 P, ej.: esmilagenina,
sarsasapogenina).
Puede existir una probabilidad de hidroxilación en los carbonos C-1, C-2,
C-5, C-6, mientras es poco posible en C-3 debido a que el hidroxilo que se
encuentra situado en el mismo es constante, también se puede producir una
hidroxilación y aunque muy raramente en C-17 o C-24 presentes en las
Liliaceae (Agigenina, convalagenina, clorogenina, cepagenina), en
carbono C-2 o C-15 presentes en las Scrophulariaceae (Gitogenina,
digitogenina), o incluso en C-12 como ocurre en las Agavaceae en donde
esta oxidación tiene gran relevancia debido a la presencia de un carbonilo,
siendo un claro ejemplo la Hecogenina y la Manogenina.
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Figura 3. Gráfico de estructuras y configuraciones de diferentes sapogeninas
esteroidales.
Obtenido de Bruneton, (2017).
II.1.5 MÉTODOS DE EXTRACCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LAS
SAPONINAS
La extracción y la separación de los saponósidos son afables debido a que se
presentan en forma de mezclas complejas en las plantas aunque en cantidades
importantes.
Según Bruneton, (2017) la alta polaridad, la respectiva fragilidad y las muy
diminutas diferencias en sus estructuras en relación a sus componentes de masa
molecular elevada produce que regularmente sea complicada y lenta la obtención de
una molécula pura e intacta. La cristalización de estas estructuras resulta casi nula,
debido a que son higroscópicas y producen puntos de fusión neto aunque con poca
frecuencia pero sin descomposición.
La mayoría de los saponósidos presentan solubilidad en diversos grados de
soluciones de etanol al 80%, esta característica permite ser empleada en varias
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técnicas que sirven para su extracción y purificación. Por lo tanto se destacan los dos
medios a emplearse para desarrollar su análisis respectivo (Bruneton, 2017):
En el caso de la extracción se debe considerar primeramente que las
saponinas presentan solubilidad en el agua y por tanto se puede realizar la
extracción mediante este disolvente, más comúnmente a ebullición, sin
embargo se debe considerar que por este medio se puede producir una
liofilización posterior y hasta la hidrólisis de los bidesmósidos, por lo tanto
normalmente se hace recurrencia al uso de alcoholes tales como el metanol
o etanol, así como a disoluciones hidrometanólicas luego de tratarse con un
proceso de deslipidación previa por éter de petróleo.
Es importante resaltar que mediante la aplicación este medio puede resultar
de mucha utilidad para provocar la inactivación de las estearasas que
comúnmente se encuentran presentes en el material vegetal, por lo cual es
recomendable realizar inicialmente un tratamiento adecuado con ácido
clorhídrico diluido. Se pueden variar las proporciones tanto de agua como
de metanol para la obtención específica de mono y bidesmósidos.
Luego de la extracción inicial y considerando el principio de los disolventes
polares que son capaces de solubilizar un gran número de compuestos,
hacen que sea frecuente se pueda partir a través de agua y n-butanol
considerando que este último solubiliza a las saponinas que precipitan luego
de la adición al medio de un disolvente orgánico como el éter etílico. Se
puede recurrir a diálisis o a cromatografía de exclusión sobre gel para el
enriquecimiento de los extractos en saponinas.
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Para el caso de la separación de las saponinas la técnica se basa en la uso de
cromatografías ya sea a través de columnas abiertas, columnas base y media
presión, CLAR, CCF - centrífuga, cromatografía flash sobre soportes
clásicos (sílice, alúmina, gel de dextranos reticulados y además sobre fases
químicamente ligadas, geles de polímeros porosos, resinas. También se usan
técnicas de cromatografía en contracorriente, sobre todo la cromatografía
en contracorriente de gota o también conocida como DCCC cuyo principio
se basa en que los productos se reparten entre una fase móvil que posee una
movilidad en forma de gotas en tubos rellenados con una fase líquida, no
miscible y estacionaria. En el caso de las saponinas con genina ácida, son
de mucha útilidad las resinas intercambiadoras, con excepción si los
productos a separar no sean sensibles a las variaciones de pH.
Por lo general casi siempre se opta por una sucesión de separaciones de
carácter cromatográficas desarrolladas en diversos soportes para lograr llegar a un
resultado muy óptimo.
II.1.6 REACCIONES DE IDENTIFICACIÓN
La identificación rápida saponinas esteroidales y triterpénicas se encuentra
basada en la presentación de un grupo de características generales que ambas poseen;
entre los ensayos de identificación se puede destacar la producción de espuma al
momento de ser agitadas las soluciones de tipo acuosas siendo esta la base de la
reacción de Selivoflo utilizada en el tamizaje fitoquímico; el ensayo clínico de
producción de hemólisis de los glóbulos rojos por la provocada por las mismas en
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donde se cuantifica su potencia; el ensayo de toxicidad en especial de los peces
(sapotoxinas) cuyo efecto es provocar parálisis de las agallas; también el ensayo con
una reacción positiva en la prueba de Liebermann - Burchard aunque comúnmente
las saponinas esteroidales en este ensayo muestran colores que van desde el azul
hasta el verde y en cambio las triterpénicas van desde el color rosado, rojo hasta el
color violeta (Donald y col., 2017).
Para la caracterización de las saponinas y de sus geninas se utilizan
generalmente reacciones coloreadas que resultan necesarias para la confirmación de
la identidad de las drogas y en ciertos casos para el control de las etapas que se
producen durante el proceso de separación (Bruneton, 2017).
A continuación se mencionan ciertas reacciones coloreadas que se pueden
emplear para la identificación de saponinas (Bruneton, 2017):
Anhídrido acético en medio sulfúrico o mejor conocido como la
reacción de Liebermann – Burchard, las coloraciones que se presentan en este
ensayo difieren si la genina es triterpénica (de rosa a rojo) o de tipo esteroidal
(azul a verde).
El empleo de vainillina, aldehído anísico y otros tipos de aldehídos
que son aromáticos y se encuentran en un medio ácido mineral fuerte, aquí se
forman productos de coloración intensa y que resultan a partir de la reacción
de los aldehídos con los productos de deshidratación de las geninas.
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Otra forma para la caracterización de saponinas se basa en métodos
cromatográficos. Cabe destacar que la Cromatografía de Capa Fina se usa
fundamentalmente en el control de la calidad de drogas con saponinas. Las
reacciones coloreadas forman parte de la revelación de las placas, no obstante la
Cromatografía Líquida de Alta Resolución es la más empleada últimamente en los
controles de pureza y valoraciones, así también para instituir la composición de
drogas que son poco o nada conocidas.
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II.2 ANTECEDENTES
Se han registrado diversos estudios acerca de compuestos saponínicos
presentes en frutos de diferentes especies del género Mimusops, destacando
primeramente un estudio realizado por Mitra y Misra, (1965) en Mimusops hexandra
– I quienes lo describen como un árbol tropical que posee frutos comestibles pero a
la vez astringentes, sus frutos presentan forma ovalada con 1.5 centímetros de largo,
un peso promedio de 21 gramos y cuya madurez se logra alcanzar entre los meses de
Abril y Junio.
Para el desarrollo de la investigación realizada el mesocarpio carnoso junto con
la piel de los frutos fueron separados de la semilla, siendo examinados por separado
el mesocarpio, la testa y el núcleo (Mitra y Misra, 1965).
Con respecto al mesocarpio, la obtención de los extractos, se realizaron de
manera sucesiva con alcohol (60L; obtenidos en el frío) y éter (5 L, mediante
extracción de Soxhlet), posterior al aislamiento de los disolventes, los extractos
fueron examinados por separado y de los componentes caracterizados se obtuvieron
cinco tipos de triterpenoides denominados:
α-spinosterol,
α- amirina acetatos.
β-amirina acetatos.
Tetrahidroxialcohol.
Monohidroxi ácido monocarboxílico,
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Mediante una caracterización adicional el último compuesto triterpenoide
mencionado produjo un éster metílico acetato; mientras tanto el Tetrahidroxialcohol
no produjo un acetato puro pero se podría definir como su derivado de benzoilo, sin
embargo tampoco hubo producción de ningún derivado con reactivo carbonilo y no
reveló absorción de banda de carbonilo en su espectro infrarrojo. A través de los
residuos de otro alcohol y con la prueba de Liebermann - Burchard siendo positivo,
también fue separado posiblemente un triterpenoide.
El extracto alcohólico de la testa en polvo produjo el β-D-glucósido de β-
sitosterol, mientras que del concentrado alcohólico liberado del esterol-glucósido dio
un enfriamiento obteniéndose quercitol.
El β-D-glucósido de β-sitosterol y la quercitina también se obtuvieron del
extracto alcohólico del grano, el primero se originó a partir de su porción soluble en
éter de petróleo en donde la hidrólisis ácida del glucósido produjo glucosa que fue
confirmada mediante el análisis por cromatografía en papel, y β-sitosterol
confirmado por el análisis de su espectro en infrarrojo; mientras la quercitina se
obtuvo mediante la refrigeración del extracto alcohólico liberado del glucósido. Cabe
señalar que la fracción de azúcar de la saponina obtenida del núcleo consistió en
xilosa, arabinosa, ramnosa y glucosa.
Años más tarde Mitra y Misra, (1967) también describieron mediante un
pequeño comunicado los constituyentes de los frutos de Mimusops elengi,
específicamente del mesocarpio y de la testa, en donde del extracto etanólico
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obtenido desde el mesocarpio del fruto se pudo identificar la presencia de saponinas
(mediante procesos de saponificación), quercitol, ácido urosílico, un nuevo
compuesto triterpenoide (a través de una fracción neutral en cromatografía usando
una mezcla de alumina; hexano y cristalización del etanol), también se pudo
identificar la presencia de glucosa mediante cromatografía de papel.
Por parte del extracto etanólico obtenido de la testa del fruto se registró la
presencia de compuestos tales como quercitol, dihidroquercitina (extraída mediante
el empleo de ethyl acetato), quercitina (oxidación con yodo a quercetina) y β-D-
glucósido de β-sitosterol.
Un nuevo estudio realizado por Mitra y Misra, (1968) describe los
componentes existentes en la raíz, hojas y mesocarpio del fruto de Mimusops
hexandra – III identificándose en este último ácido ursólico.
Conjuntamente con los constituyentes ya ilustrados, en el mesocarpio de
Mimusops hexandra – III se realizó una re-investigación de un éster,
presumiblemente de ácido ursólico, anteriormente ya se habían registrado otros
compuestos como el éster y los ácidos carboxilos respectivamente, junto con β-D-
glucósido de β-sitosterol y el ácido ursólico. La identificación de este ácido es
permitido debido al reportado por las mismas autoras años atrás desde la corteza,
desde entonces se ha descrito como ácido ursólico por los espectros obtenidos en co-
TLC e infrarrojo (Mitra y Misra, 1968).
20
Para aislar el ácido triterpénico ya mencionado, se realizó una extracción con
alcohol (6 x 2 L.) y hexano (10 x 8 L.) a partir de 40 kilogramos del mesocarpio de
Mimusops hexandra – III, lo que logró generar continuamente un residuo semisólido
de color oscuro de aproximadamente 600 g. Una porción de 200 gramos de la parte
soluble en hexano fue dividida en fracciones en ácido (un equivalente a 20 gramos) y
neutro (170 gramos). La fracción ácida después de la purificación alcalina y la
cromatografía (TLC) sobre alúmina lavada con ácido dio como resultado la
identificación de ácido ursólico como el constituyente principal (Mitra y Misra,
1968).
Es importante resaltar que otra porción de 100 gramos del residuo soluble en
hexano en la cromatografía empleada con la mezcla de alúmina- metanol, originó
además de los constituyentes ya informados un éster de triterpeno soluble en hexano
y que además en la cromatografía y cristalización posterior proporcionó un
compuesto positivo. El ácido ursólico solo se obtuvo después de la hidrólisis alcalina
del éster (Mitra y Misra, 1968).
Al siguiente año Mitra y Misra, (1969) publicaron un nuevo artículo basado en
el estudio de los constituyentes de los frutos y semillas en Mimusops manilkara
describiendo a esta especie como un árbol tropical, comúnmente conocida como
Sapota o Supodillu, que posee dulces frutos sabrosos cuyas bayas ovaladas, medidas
entre 5 a 10 centímetros de diámetro; con un peso entre 60 y 90 gramos, y alcanzan
su madurez entre los meses de Marzo y Septiembre. La fruta, la semilla y la corteza
21
en este estudio fueron patentadas para emplearlos en usos medicinales, aunque por
parte de la semilla se puede producir chicle resaltaron las autoras.
En referencia al estudio del fruto como material alimenticio fue realizado un
examen químico del mesocarpio, del mismo que fue obtenido una producción de
éster de ácido caprílico de α- y β-amirinas junto con sus acetatos, α-spinosterol y β-
D-glucósido de β-sitosterol. Se creó un nuevo registro de una suposición de los
capirilatos de α- y β-amirinas pues se dedujo haberlas aislado por primera vez de la
naturaleza, en tanto que la presencia de miristato, palmitato y estearato de β-amirina
en las plantas ya se encontraban registrados. En aquel estudio se menciona que los
ésteres de ácido palmítico y oleico de β-amirina y ácido caprílico, y el éster de
eritrodiol también fueron aislados de las plantas de esta familia además de la
presencia de cinamatos de las amirinas, éster de ácido graso de un esterol, caprilato
de ácido oleanólico y palmitato de los ácidos eritrodiol, betulínico y oleanólico según
reportes anteriores. La semejanza con respecto a la presencia de diferentes
constituyentes en las plantas de esta familia formaron parte de sus características
quimiotaxonómicas, lo que permitió un mejor desarrollo del artículo (Mitra y Misra,
1969).
El proceso desarrollado para el estudio de los constituyentes presentes en el
mesocarpio del fruto consistió en la extracción sucesiva con alcohol (10 L. x 4) y
hexano (10 L. x 6), posteriormente los extractos obtenidos luego de la eliminación de
los disolventes fueron analizados por separado, describiendo a continuación los
procesos para cada constituyente (Mitra y Misra, 1969):
22
β-D-glucósido de β-sitosterol: Se inició el análisis a partir del
depósito microcristalino de peso 1.56 gramos obtenido de la prueba
Lieberman - Burchard (positivo) y apartado durante el fraccionamiento del
extracto alcohólico-acuoso con hexano en la cristalización del exceso de
alcohol y fundido a una temperatura de 286 – 288 °; el compuesto fue
identificado a través de puntos de fusión mixtos, espectros superpuestos de
infrarrojo e hidrólisis ácida de β-sitosterol y glucosa. Una porción de 30
gramos del extracto de 250 gramos de hexano semisólido fue llevada a
cromatografía sobre alúmina (1:20) la cual al eluir se obtuvo a partir de las
fracciones iniciales del hexano una masa viscosa amarilla (29 gramos) y de
las últimas fracciones un blanco cristalizado (635 miligramos).
α-Spinosterol: El cristalizado de la prueba Lieberman - Burchard y
Tortelli - Jaffe (positivo) se purifica por cromatografía y se recristaliza
produciéndose α-spinosterol. La masa viscosa amarilla sobre la cristalización
del éter-alcohol (1:1) dio un producto de 10 gramos sobre alúmina (1:50) la
misma que facilitó dos fracciones, una con masa de 8,5 gramos (punto de
fusión 98 – 120 °) y la otra de 800 miligramos de masa (punto de fusión 205-
210 °). En fracciones de cristalización (alcohol), la fracción principal de masa
de 8,5 gramos produjo dos cristales productos, con puntos de fusión de 150 °
y 97 °, mientras la fracción menor de 800 miligramos proporcionó dos
productos más, con puntos de fusión de 230 ° y 220 ° respectivamente.
α-caprilato de amirina. La sustancia con masa de 3.4 gramos, punto
de fusión 150 ° de la fracción principal de purificación a través de
cromatografía, seguida de cristalizaciones, proporcionó agujas similares, con
23
puntos de fusión 158 - 160 °. El éster en cantidad de 800 miligramos fue
hidrolizado con 100 ml de hidróxido de potasio alcohólico al 4%; el resultado
de la reacción produjo α-amirina en cantidad de 599 miligramos y con puntos
de fusión 181 - 182 °.
β-caprilato de amirina. El producto de 3,6 gramos de masa, punto de
fusión 97 ° obtenido de la fracción primordial de la purificación habitual,
produjeron agujas brillantes de de β- caprilato de amirina y picos
preponderantes en los espectros de masas a 552 (M+), 408, 333, 218 y 190
m/e. El éster de 1.08 gramos de masa en la hidrólisis alcalina produjo el
neutro en cantidad de 724 miligramos como β-amirina.
β-acetato de amirina. El compuesto de 80 miligramos de masa, punto
de fusión 230° obtenido de la fracción menor en la cristalización del alcohol,
generó agujas de β-acetato de amirina, con puntos de fusión entre 232 - 234 °;
su identidad fue confirmada a través de espectros de infrarrojo superponibles
e hidrólisis alcalina; y adicionalmente con ácido acético mediante prueba
positiva de nitrato de lantano-yodo.
α-acetato de amirina. El compuesto de 180 miligramos, con punto de
fusión de 220°, y obtenida de la fracción menor en la purificación habitual,
produjo multitudinarias agujas de α-acetato de amirina, los mismos que
fueron identificados mediante una mezcla de espectros e hidrólisis alcalina a
α-amirina, con puntos de fusión entre 180 - 182 °; también mediante ácido
acético.
24
La conclusión en correspondencia al estudio del mesocarpio del fruto se basó
en la obtención de ésteres de ácido caprílico y acetatos de α- y β-amirinas, α-
spinosterol y β-D-glucósido de β-sitosterol (Mitra y Misra, 1969).
El aislamiento de un nuevo compuesto fue descrito por Jahan y col., (1995)
quienes basaron su estudio en material vegetal de Mimusops elengi que es una
especie que crece en la selva del sur de la India, específicamente en Birmania y
Pakistán. Se resalta que varias partes de la planta son utilizadas en medicina
tradicional como antifebril, astringente, purgante y estimulante.
También Jahan y col., (1995) señalan que la presencia de compuestos
saponínicos, esteroidales, terpenoides y alcaloides han sido reportadas con
anterioridad de Mimusops elengi, pero a la vez muy pocos componentes habían sido
separados o caracterizados. Por lo tanto se informó sobre el aislamiento y la
caracterización de un nuevo triterpeno pentacíclico de la serie lupeno en esta planta.
El compuesto aislado fue un nuevo triterpeno 3 β-hidroxi-lup-20(29)-ene-
23,28-dioico ácido (Figura 4). Mediante estudios químicos y espectroscópicos fue
determinada su estructura. Es muy importante señalar además que los triterpenos
conocidos como la β-amirina, lupeol, α - taraxerol y ácido ursólico también fueron
aislados de esta especie por primera vez (Jahan y col., 1995).
25
Figura 4. Gráfico de estructura y configuración del triterpeno 3 β-hidroxi-lup-
20(29)-ene-23,28-dioico ácido.
Obtenido de Jahan y col., (1995).
El espectro infrarrojo presentó absorción para un grupo hidroxi (3400 cm -1),
además de un grupo carboxilo (2730 y 1700 cm -1) y un grupo carboxílico de doble
enlace di sustituido (3075 y 1640cm -1). La formación del dimetil éster 1a y un
derivado de monoacetilo (1b) reveló la presencia de dos funciones carboxílicas y uno
hidroxilo (Jahan y col., 1995).
La oxidación con PCC en cloruro de metileno produjo el ceto diéster 1c,
confirmando la naturaleza secundaria de un grupo hidroxilo. En tanto el espectro
CNMR mostró la presencia de cinco metilos, nueve metilenos, siete metinas y cinco
carbonos cuaternarios (Jahan y col., 1995).
26
CAPÍTULO III. MATERIALES Y MÉTODOS
III.1 RECOLECCIÓN, SELECCIÓN Y SECADO DEL MATERIAL
Las muestras vegetales utilizadas fueron la corteza y pulpa de los frutos de
Mimusops sp., en dos estados de madurez, los frutos se recolectaron el 11 de Mayo
de 2018 en la zona de vegetales naturales conocido como “Jardín Botánico” y que se
encuentra ubicada en la ciudad de Guayaquil – Ecuador. La variedad vegetal se
hallaba en etapa de floración y fructificación. La caracterización botánica fue
verificada por el Biólogo Xavier Cornejo Sotomayor Ms.c y a su vez fue registrada
en el Herbario GUAY perteneciente a la Facultad de Ciencias Naturales en la
Universidad de Guayaquil con clave 13111.
Los frutos verdes y maduros recolectados se lavaron con agua corriente y a se
dejaron secar a temperatura ambiente por un período de 4 días. De los mismos se
extrajo la pulpa y corteza, que al mismo tiempo fueron clasificados los
correspondientes a los frutos verdes y maduros. Con la ayuda de un mortero se les
retiraron sus semillas, obteniendo la corteza y la pulpa de los frutos.
III.2 CARACTERIZACIÓN BOTÁNICA DE LA ESPECIE
III.2.1 Evaluación macromorfológica de los frutos
Se utilizaron 70 frutos verdes y 80 frutos maduros a los cuales se establecieron
sus perfiles morfológicos: forma y dimensiones de ambos frutos.
27
II.3 ALMACENAMIENTO
Una vez obtenida la corteza y pulpa de los frutos en ambos estados, las
muestras vegetales se almacenaron en fundas de polietileno cubiertas con papel
aluminio en refrigeración, para su posterior análisis.
III.4 DETERMINACIÓN DE PARÁMETROS FISICOQUÍMICOS
Se realizaron por las metodologías señaladas por la WHO, (2011), realizando
los ensayos por triplicado, las mismas que se describen a continuación:
III.4.1 Humedad residual (Aplicación de método gravimétrico)
Se realizó a partir de 2 g de muestra, se utilizó una estufa de marca Mettler
Toledo a temperatura de 105º C durante 2 horas hasta peso constante y las
determinaciones de los pesos se efectuaron en una balanza analítica marca Kern
Modelo: ABS-220-4. Los cálculos se desarrollaron mediante el uso de la siguiente
fórmula:
Hg: M2 − M1
M2 − M x 100
Interpretando:
Hg = pérdida de peso por desecación (%)
M2 = masa de la cápsula con la muestra de ensayos (g)
M1 = masa de la cápsula o la muestra de ensayos desecada (g)
28
M = masa de la cápsula vacía
100 = factor matemático
III.4.2 Cenizas totales
A partir de la masa obtenida anteriormente de no menos de 2,0 ± 0,5 g, se
llevaron los crisoles a una mufla MLW Eliktro Modelo: 245.3E a temperatura de
750° C por 2 horas, la determinación de los pesos fueron realizados en una balanza
analítica marca Kern Modelo: ABS-220-4, se utilizó peróxido de hidrógeno hasta
conseguir cenizas blancas. Los cálculos se desarrollaron mediante el uso de la
siguiente fórmula:
C: M2 − M
M1 − M x 100
Interpretando:
C: porcentaje de cenizas totales en base hidratada
M: masa del crisol vacío (g)
M1: masa de crisol con la porción de ensayo (g)
M2: masa del crisol con la ceniza (g)
100: factor matemático para calculo
III.4.3 Cenizas insolubles en ácido clorhídrico
El ensayo se realizó partiendo del peso anterior obtenido de las cenizas totales,
a las cuales se le añadieron de 2 a 3 ml de ácido clorhídrico al 10 %, se tapó el crisol
con un vidrio reloj y se llevó a calentar en baño de agua por 10 minutos. Se realizó el
29
lavado del vidrio reloj con 5 ml de agua caliente y se juntó al contenido del crisol. La
solución obtenida fue filtrada a través de un papel libre de cenizas; se procedió a
lavar el residuo con agua caliente y se transfirió incluyendo el papel al crisol. Se
incineró en la mufla modelo MLW Eliktro Modelo: 245.3E a una temperatura de 700
- 750º C por 2 horas. Luego se ubicó en una desecadora hasta el alcance de
temperatura ambiente para proceder a pesar.
Los cálculos se realizaron según la siguiente fórmula:
C. ac.: M2 − M
M1 − M x 100
Interpretando:
C.ac. = Porcentaje de cenizas insolubles en ácido
M = Masa del crisol con la porción de ensayos (g)
M1 = Masa de la cápsula vacía (g)
M2 = Masa del crisol con las cenizas insolubles en HCl (g)
100 = Factor matemático
III.4.4 Sustancias solubles
Se aplicó el método en caliente y como disolventes se emplearon etanol de 98°
y agua destilada. Para ello se colocaron alrededor de 4 gramos de polvo grueso del
material vegetal secado al aire en un matraz Erlenmeyer. Luego se agregaron 100 ml
de disolvente respectivo para el ensayo y se llevó a pesar para registro de la masa
total del solvente más la muestra incluyendo al matraz. Posteriormente se agitó y
dejó reposar por 1 hora. Se acopló un condensador de reflujo al matraz y se llevó a
30
suave ebullición por 1 hora; se enfrió y se llevó a pesar. El peso total original fue
ajustado con el disolvente respectivo del ensayo durante la ejecución del
procedimiento para el material vegetal analizado. Se agitó y luego filtró por succión
mediante un filtro seco. Se trasladaron posteriormente 25 ml del filtrado a un plato de
fondo plano tarado y se llevó a evaporación hasta sequedad en un baño de agua. El
secado se realizó a 105° C por 2 horas, luego se llevó a enfriamiento en un desecador
por 30 minutos, después se pesó inmediatamente.
Los cálculos para el contenido de materia extraíble en mg por g de material
secado al aire se realizaron según la siguiente fórmula:
Interpretando:
Ss = Sustancias solubles (%)
PR = Residuo de la muestra (g)
PM = Masa de la muestra (g)
100 = Factor matemático
III.5 TAMIZAJE FITOQUÍMICO
Se realizó la identificación de metabolitos secundarios a la pulpa y corteza de
los frutos verdes y maduros secos, mediante tamizaje fitoquímico, siguiendo el
procedimiento descrito por Miranda y Cuellar (2000).
Ss =
PMX100
PR
31
El sistema de extracción fue empleado a través de disolventes de polaridad
creciente, a partir de las mismas muestras vegetales. La muestra seca se extrajo
continuamente con éter etílico, etanol y agua por un período 48 horas para conseguir
los extractos etéreo, alcohólico y acuoso, los mismos que luego fueron analizados en
los diferentes ensayos de identificación de metabolitos secundarios. Los
procedimientos realizados se describen en las figuras 5 y 6.
III.6 MACERACIÓN, CONCENTRADO Y ANÁLISIS DE LOS EXTRACTOS
DE LA CORTEZA Y PULPA VERDE Y MADURA DE LOS FRUTOS
III.6.1 Maceración
Se empleó el método de maceración por 7 días, usando como disolvente
alcohol al 98% para la extracción de los componentes de la corteza y pulpa de los
frutos en sus dos estados: verdes y maduros. Las muestras se maceraron en
recipientes cerrados y cubiertos con papel aluminio para evitar el contacto con la luz
durante el tiempo establecido, debiéndose agitar cada día.
III.6.2 Concentrado
Una vez finalizado el proceso de macerado, los extractos se filtraron
empleando gasas y papel filtro para la obtención de extractos sin residuos,
posteriormente se concentraron en un rotaevaporador de marca alemana Heildoph
Laborato modelo 4001 efficient HB digital a presión reducida y a temperatura de 60
°C aproximadamente, hasta eliminación total del disolvente.
32
Figura 5. Esquema de extracción sucesiva del material vegetal con disolventes para
el tamizaje fitoquímico.
Fuente: Miranda y Cuéllar, 2000
Extraer con 30 ml de éter etílico por maceración durante 48
horas a temperatura ambiente
Filtrar
EXTRACTO ETÉREO
Medir volumen y
calcular concentración
RESIDUO SÓLIDO
Secar y pesar
Extraer con 3 veces el peso del
residuo en volumen con etanol
por maceración durante 48 horas
EXTRACTO
ALCOHÓLICO
Medir volumen y
calcular concentración
RESIDUO SÓLIDO
Secar y pesar
Filtrar
Extraer con 3 veces el peso del
residuo en volumen con agua destilada
por maceración durante 48 horas
Filtrar
RESIDUO SÓLIDO
Secar y pesar
EXTRACTO
ACUOSO
Medir volumen y
calcular concentración
10 gramos de material vegetal
33
Extracto etéreo
•Sudán (Compuestos grasos).
•Dragendorff, Mayer y Wagner (Alcaloides).
•Lieberman – Buchard (Triterpenos y/o esteroides).
•Baljet (Coumarinas y lactonas).
Extracto alcohólico
•Resinas.
•Fehling (Sustancias reductoras).
•Tricloruro férrico (Compuestos fenólicos)
•Baljet (Lactonas y Coumarinas)
•Espuma (Saponinas).
•Lieberman – Buchard (Triterpenos y/o esteroides).
•Dragendorff, Mayer y Wagner (Alcaloides).
•Ninhidrina (Aminoácidos).
•Bontraguer (Quinonas).
•Shinoda (Flavonoides)
•Antocianidinas.
Extracto acuoso
•Fehling (Sustancias reductoras).
•Tricloruro férrico (Compuestos fenólicos).
•Espuma (Saponinas).
•Dragendorff, Mayer y Wagner (Alcaloides).
•Shinoda (Flavonoides).
•Mucílagos.
Figura 6. Ensayos cualitativos a realizar en cada extracto.
Fuente: Miranda y Cuéllar, 2000
III.6.3 Determinación de rendimiento porcentual
A partir de una muestra de cada uno de los extractos de corteza y pulpa de los
frutos en sus dos estados: verdes y maduros obtenidos mediante el método de
maceración, fueron llevadas a concentración por medio de un rotaevaporador de
marca alemana Heildoph Laborato modelo 4001 efficient HB digital, a presión
reducida, con temperatura de 60° C aproximadamente y a 100 rpm, hasta obtención
de un volumen pequeño del extracto concentrado, el mismo que fue vertido
34
posteriormente a un vaso de precipitación de marca Pirex y de 100 ml de capacidad
previamente pesado.
A continuación se registró el peso del vaso más la muestra líquida añadida,
luego se llevó a calentamiento en estufa con temperatura de 50° C hasta sequedad de
la muestra.
Una vez retirada la muestra seca de la estufa se llevó a enfriar por 5 minutos en
un desecador, transcurrido el tiempo inmediatamente se registró el peso del vaso más
la muestra seca.
Los cálculos para la determinación del rendimiento porcentual se realizaron
según la siguiente fórmula:
R %: Peso residuo
Peso muestra 𝑥 100
Donde:
(Vaso + muestra) – (Vaso vacío) = Peso muestra
(Peso final) – (Vaso vacío) = Peso residuo
35
III.6.4 Reacción de silanización
Los extractos metanólicos fueron silanizados utilizando 50 µL de BSTF [bis
(trimetylsilyl)-trifluorocetamida; Merck] durante 45 min a 110º C, antes de ser
sometido a análisis por el sistema acoplado CG-EM (Huetos, 2004).
III.6.5 Análisis de los extractos por el sistema acoplado CG-EM
Los extractos silanizados se analizaron mediante el uso de un cromatógrafo de
gases Agilent Technologies acoplado a un espectrómetro de masas (sistema 7890A
GC y 5975C inerte XL MSD con detector de triple eje). Las condiciones de trabajo
fueron las siguientes: Columna capilar HP-5, 5% Phenyl Methyl Siloxan 325° C: 30
m x 320 µm x 0.25 µm. La temperatura inicial del horno se mantuvo a 70° C durante
2,0 minutos, luego se aumentó a 300° C a 5° C/min, donde se mantuvo por 6
minutos. Tiempo de corrida 52 min. El espectrómetro de masas fue operado a 70eV
en modo full scan desde 40-1000 μ ma. Temperatura de la fuente 230° C,
temperatura del cuadrupolo 150° C. Temperatura del inyector: 280° C, volumen de
inyección 2 µL con gas portador helio a 1 mL/min. Los compuestos se identificaron
mediante la comparación de sus espectros de masas y la referencia de masa de Wiley
9th con NIST 2011 MS Library tomando en cuenta aquellos con un porcentaje de
similitud del 95% o superior.
36
III.6.6 Análisis estadístico.
Los resultados fueron procesados estadísticamente determinado el valor medio,
la desviación estándar y el coeficiente de variación. Además, se realizaron las
pruebas de ANOVA y TUKEY para analizar las diferencias entre las
determinaciones realizadas. Para el análisis de datos se usó el paquete estadístico
RStudio.
37
CAPÍTULO IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
IV.1 ANÁLISIS MACROMORFOLÓGICO DE LOS FRUTOS
En el estudio de la macromorfología de los frutos verdes y maduros se tomó en
consideración el largo y ancho de los mismos (figura 7).
Figura 7. Estudio macromorfológico de los frutos de Mimusops sp.: a) fruto verde;
b) fruto maduro.
Fuente: Autor
Los frutos son redondos, presentan de una a dos semillas según su estado de
madurez y poseen dimensiones promedios de 2,94 cm de largo y 3,16 de ancho
cuando está verde, mientras que al madurar reducen su tamaño a 2,85 de largo y 2,96
de ancho. Se efectuó un análisis de tipo estadístico comparativo para los parámetros
evaluados, los resultados se refieren en la tabla I.
Tabla I. Descripción de los datos obtenidos en el análisis estadístico del parámetro
macromorfológico de frutos de Mimusops sp.
PARÁMETRO (cm)
CÁLCULOS ESTADÍSTICOS
VALOR
MEDIO
DESVIACIÓN
ESTÁNDAR CV
FRUTO
ENTERO
LARGO FV 2,943 0,192 0,064
FM 2,852 0,223 0,077
ANCHO FV 3,161 0,241 0,069
FM 2,963 0,263 0,083
Fuente: Autor
a
a
b
b
38
En la tabla se puede apreciar la existencia de una pequeña diferencia entre las
dimensiones evaluadas de los frutos enteros en su estado verdoso y al madurar la
cual no llega a ser de significación.
IV.2 DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS FÍSICO-QUÍMICOS
Dentro del estudio de una droga vegetal se encuentra la determinación de un
conjunto de parámetros físico-químicos, los cuales son indispensables para garantizar
su calidad y pureza, lo que se traduce en el valor intrínseco de la misma.
A la corteza y pulpa de los frutos verde y maduro de la especie en estudio se le
realizaron diversos ensayos para determinar los parámetros físico-químicos de
calidad, tales como: humedad residual, cenizas totales, cenizas insolubles en ácido
clorhídrico, sustancias solubles en etanol al 98% y en agua; los resultados se exponen
en las tablas II y III.
Tabla II. Parámetros físico-químicos de la corteza de los frutos de Mimusops sp.
PARÁMETRO PORCENTAJE
FV FM
HUMEDAD RESIDUAL (%) 9,15 10,48
CENIZAS TOTALES (%) 3,84 3,34
CENIZAS INSOLUBLES EN HCl (%) 1,50 1,26
SUSTANCIAS SOLUBLES EN ETANOL AL 98%
(%)
4,74 5,93
SUSTANCIAS SOLUBLES EN AGUA (%) 8,22 10,12
Fuente: Autor
39
Tabla III. Parámetros físico-químicos de la pulpa obtenida de los frutos de
Mimusops sp.
PARÁMETRO PORCENTAJE
FV FM
HUMEDAD RESIDUAL (%) 9,96 10,65
CENIZAS TOTALES (%) 4,08 2,77
CENIZAS INSOLUBLES EN HCl (%) 1,39 1,59
SUSTANCIAS SOLUBLES EN ETANOL AL 98%
(%) 5,77 9,10
SUSTANCIAS SOLUBLES EN AGUA (%) 10,53 11,82
Fuente: Autor
La humedad residual puede establecerse por el método azeotrópico o por el
método gravimétrico, el primero, para cuando hay sustancias volátiles, en este
trabajo fue empleado el método gravimétrico. Para este parámetro las Normas y
Farmacopeas establecen, en dependencia del órgano vegetal, un contenido entre 8 y
14 % (Lou-Zhi-cen, 1980; WHO, 1998; Miranda y Cuéllar, 2012). En el estudio
efectuado a la corteza y la pulpa de los frutos maduros y verdes, el promedio de las
determinaciones estuvo dentro del intervalo exigido.
Los valores de humedad residual para la pulpa, fueron ligeramente superiores
en comparación con la corteza.
Las cenizas totales se definen como residuos que se obtienen al incinerar una
droga y su determinación está incluida dentro de los parámetros de calidad de interés
a evaluar para el análisis de un material vegetal. Constituyen, además, una base para
juzgar la pureza e identidad de este, brindando información relativa a la posible
adulteración con materias inorgánicas o cuerpos extraños que posea la misma, o la
cantidad de estos en su contenido (Miranda y Cuéllar, 2012).
40
Algunas farmacopeas plantean un índice de cenizas totales de hasta el 5 %
(Lou-Zhi-cen, 1980; WHO 1998) y otra como la Farmacopea China refiere un 15 %
(Commission, 2015), aunque los valores pueden variar significativamente en
dependencia del material vegetal y lugar de colecta. El valor obtenido para ambos
órganos vegetales fue similar, siendo ligeramente más elevado para la pulpa de los
frutos verdes, y las cortezas de los frutos maduros, aunque en todos los casos se
enmarcan en el límite establecido por la farmacopea.
La cantidad de cenizas insolubles en ácido clorhídrico al 10 %, son también
parámetros que ayudan a evaluar la pureza de la droga. Las cenizas insolubles en
ácido, pueden estar relacionadas a la presencia de metales pesados. El límite
establecido por las normas y Farmacopeas establece un valor máximo del 2 %.
Tanto para la corteza como para la pulpa de los frutos en los dos estados de
maduraciones estudiadas, los valores se encuentran dentro de los límites establecidos
sin marcadas diferencias entre ellos.
La determinación de sustancias extraíbles o solubles es uno de los índices
numéricos más importantes para seleccionar los mejores disolventes en el proceso de
extracción. Se utilizaron diferentes menstruos, etanol al 98% y agua y los resultados
revelaron que se obtiene mayor rendimiento de sustancias extraíbles de manera
general en agua, tanto para la corteza como para la pulpa.
41
Se debe señalar que los frutos maduros presentaron mayores porcentajes de
sustancias solubles tanto en alcohol como en agua y que la pulpa presentó mayor
rendimiento que la corteza.
Los resultados sugieren que las drogas presentan una composición elevada en
metabolitos de polares.
IV.3 TAMIZAJE FITOQUÍMICO
En las tablas IV a VI, .se presentan los resultados de los ensayos realizados en
el tamizaje fitoquímico:
Tabla IV. Tamizaje fitoquímico del extracto etéreo de la corteza y pulpa del fruto de
Mimusops sp.
EXTRACTO ETÉREO
ENSAYO METABOLITO CORTEZA PULPA
FV FM FV FM
SUDÁN ACEITES Y
GRASAS ++ +++ ++ +++
BALJET LACTONAS Y
COUMARINAS - - - -
LIEBERMANN -
BUCHARD
TRITERPENOS -
ESTEROIDES ++ +++ ++ +++
DRAGENDORFF ALCALOIDES - - - -
Leyenda FV= fruto verde; FM = fruto maduro; + presencia, ++ abundante; +++ muy
abundante
Fuente: Autor
La presencia de triterpenoides está en correspondencia con lo referido por
Cooker, (1962); Misra y col. (1966, 1967, 1968 y 1974) y Fayek y col, (2012) para
diferentes órganos vegetales de la especie.
42
Se ha informado que los triterpenoides han mostrado varios efectos
farmacológicos tales como antiinflamatorio, anti-ulceroso, antibacteriano, antiviral
(incluyendo anti-VIH), hepatoprotector, inmunomodulador, hipolipidémico y para
reducir el colesterol, anticoagulante, anticancerígeno, etc. (Szakiel y col., 2012).
También se ha reportado actividad antitripanosomal (Hoet y col., 2007).
Los esteroles se han investigado como uno de los posibles métodos alternativos
seguros para reducir los niveles de colesterol en plasma y el colesterol LDL. Por otra
parte, se ha discutido evidencia de los efectos beneficiosos de los esteroles vegetales
en trastornos como xantomatosis cutánea, cáncer de colon y la hiperplasia de próstata
(Moghadasian, 2000; Plösch y col., 2006).
Por otra parte para la especie se ha informado la presencia de numerosos ácidos
grasos, tanto saturados como insaturados, presentando éstos últimos propiedades
antioxidantes (Misra y col., 1966 y 1974; Fayek y col., 2012; Sathish y co., 2015;
Chivandi y col., 2016).
El extracto alcohólico (tabla V) respondió positivo a casi todos los ensayos,
con excepción de los de alcaloides, catequinas, resinas y quinonas. Fue notoria la
presencia de compuestos fenólicos en general, entre ellos antocianidinas, flavonoides
y taninos, aunque estos últimos en menos proporción. Dichos compuestos fueron
detectados en estudios previos efectuados a extractos de diferentes órganos de la
especie, donde se informó la presencia de: Ácido cafeico, miricetina-3-O-α-L-
ramnósido, galocatequina, catequina, epicatequina, ácido gálico, metilclorogenato,
43
metil-4-O-galoil clorogenato, ácido 4-O-galoilclorogénico, leucodelphinidina,
leucocianidina, leucoperalgonidina, dihidromiricetina, quercetina, miricetina,
dihidroquercetina, apigenina-7-O-α-L-ramnósido, miricetina-3-O α-L-
ramnopiranósido, dihidromiricetina y kaempferol (Misra y col., 1974; Shui y col.,
2004; Sharma y col., 2009; Chanda & Nagi, 2010; Fayek y col., 2012; Kaneria &
Chanda, 2012; Almeida y col., 2015 y Baky y col., 2016).
Tabla V. Tamizaje fitoquímico del extracto alcohólico de la corteza y pulpa del fruto
de Mimusops sp.
EXTRACTO ALCOHÓLICO
ENSAYO METABOLITO CORTEZA PULPA
FV FM FV FM
DRAGENDORFF ALCALOIDES - - - -
BALJET LACTONAS Y
COUMARINAS - - - -
LIEBERMANN -
BUCHARD
TRITERPENOS -
ESTEROIDES ++ ++ ++ ++
FEHLING AZ. REDUCTORES + + + +
ESPUMA SAPONINAS ++ ++ ++ ++
SHINODA FLAVONOIDES ++ + +++ +
CLORURO
FÉRRICO TANINOS + + + +
CATEQUINAS CATEQUINAS - - - -
RESINAS RESINAS - - - -
ANTOCIANIDINAS ANTOCIANIDINAS + +++ ++ +++
BORNTRAGER QUINONAS - - - -
NINHIDRINA AMINOÁCIDOS + ++ +++ ++++
Leyenda FV= fruto verde; FM = fruto maduro; + presencia, ++ abundante; +++ muy
abundante
Fuente: Autor
Los compuestos fenólicos tienen demostrado actividad antioxidante,
hepatoprotectora, son antiinflamatorios, antitumorales, antivirales, previenen la
enfermedad cardíaca coronaria (Takuo y Hideyuki, 2011; Shashank y Pandey, 2013),
44
presentan propiedades analgésicas (Arunachalam y col., 2011), entre otras
actividades.
Los flavonoides y las antocianidinas fueron más abundantes tanto en la corteza
como en la pulpa de los frutos maduros. Las saponinas y los triterpenos presentaron
abundancias muy semejantes tanto en la corteza como en la pulpa de ambos frutos.
Es de señalar que los aminoácidos, presentaron mucha mayor abundancia en la
pulpa de los frutos y en particular de los maduros. Se destaca también la presencia de
azúcares en los extractos.
En el extracto acuoso (tabla VI) resultaron negativos los ensayos para
alcaloides, flavonoides y lactonas y cumarinas.
Tabla VI. Tamizaje fitoquímico del extracto acuoso de la corteza y pulpa del fruto
de Mimusops sp.
EXTRACTO ACUOSO
ENSAYO METABOLITO CORTEZA PULPA
FV FM FV FM
DRAGENDORFF ALCALOIDES - - - -
FEHLING AZ.
REDUCTORES ++ ++++ ++ ++++
ESPUMA SAPONINAS +++ +++ +++ +++
SHINODA FLAVONOIDES - - - -
CLORURO
FÉRRICO TANINOS ++ ++ + ++
BALJET LACTONAS Y
COUMARINAS - - - -
NINHIDRINA AMINOÁCIDOS ++ ++ +++ +++
MUCÍLAGOS MUCÍLAGOS AMARGO DULCE AMARGO DULCE
Leyenda FV= fruto verde; FM = fruto maduro; + presencia, ++ abundante; +++ muy
abundante
Fuente: Autor
45
Los aminoácidos se mantuvieron abundantes fundamentalmente en la pulpa del
fruto. Las saponinas mostraron abundancia similar en los dos órganos del vegetal,
independiente del grado de maduración y los azúcares resultaron mucho más
abundantes en la corteza y pulpa de los frutos maduros.
Ambos frutos dieron ensayo positivo a mucílagos, pero los frutos verdes
presentaron un sabor amargo, mientras los maduros eran dulces.
IV.4 DETERMINACIÓN DE RENDIMIENTO PORCENTUAL
La corteza y pulpa de los frutos verdes presentaron valores porcentuales
inferiores a los maduros. Los resultados se exponen en la tabla VII
Tabla VII. Resultados de rendimiento porcentual de la extracción de la corteza y la
pulpa de los frutos verde y maduro de Mimusops sp.
EXTRACTO ALCOHÓLICO
PARÁMETRO CORTEZA PULPA
FV FM FV FM
RENDIMIENTO % 14 28 15 33
Fuente: Autor
Como se observa, los rendimientos obtenidos para los extractos alcohólicos de
la corteza y la pulpa de los frutos maduros, duplicaron los valores obtenidos para los
frutos verdes, lo cual hace suponer que el proceso de maduración favorece la
46
presencia de compuestos de polaridad mediana, debido a procesos de
biotransformación.
IV.5 ANÁLISIS DE LOS EXTRACTOS POR EL SISTEMA ACOPLADO CG-
EM
El cromatograma gaseoso analítico de los extractos alcohólicos de la corteza de
los frutos se presenta en la figura 8.
Como se observa en los cromatogramas hay mayor cantidad y abundancia de
compuestos en el extracto de los frutos maduros, en comparación con los frutos
verdes. El equipo registró, para el caso de la corteza de los frutos maduros un total de
296 compuestos y para los frutos verdes un total de 181 compuestos. De éstos se
pudieron identificar por comparación de sus espectros de masa con los de la
biblioteca del equipo y considerando sólo aquellos que presentaban un porcentaje de
similitud mayor del 95%, un total de 37 compuestos para los frutos maduros y de 16
para los frutos verdes. Los resultados se muestran en la tabla VIII.
47
Figura 8. Cromatograma gaseoso analítico del extracto alcohólico de la corteza de los
frutos maduros y verdes de Mimusops sp.
Fuente: Autor
48
Tabla VIII. Compuestos identificados por CG-EM en los extractos alcohólicos de
las cortezas de Mimusops sp
CORTEZA
FRUTO MADURO FRUTO VERDE
Pico Tr
min Compuesto
%
Abund. Pico
Tr
min Compuesto
%
Abund.
1 13,30 Ácido butanodioico 1,58
2 13,69 Ácido propanoico 0,18 1 13,70 Ácido propanoico 1,91
3 13,69 Ácido-2-butenodioico 0,79
4 15,11 4-metil-catecol 0,09
5 16,95 Ácido decanoico 0,13
6 19,44 Ácido-L-treònico 0,18 2 19,42 Ácido-L-treònico 0,39
7 20,07 Arabinofuranosa 0,51
3 21,17 Ácido fenil-acético 1,59
8 21,64 Ácido-n-butírico 0,04
9 23,68 Nokatona 18,18
4 24,26 2-deoxy-ribosa 13,31
10 24,84 D(-)-fructofuranosa 16,73
11 25,79 Ácido-tetradecanoico 0,51
5 25,90 Pregnan-3α,17-diol-
20-ona
15,55
6 26,30 D-arabinopiranosa 0,84
7 26,40 D-galactosa 1,64
12 26,52 L(-)-sorbosa 2,51 8 26,52 L(-)-sorbosa 5,18
13 26,90 D(-)-arabinofuranosa 5,59
14 27,33 Palmitato de metilo 0,41
15 27,50 Ácido cinámico 0,97 9 27,54 Ácido cinámico 2,34
16 27,73 Ácido n-
pentadecanoico 0,09
17 27,88 Ácido benzoico 2,28 10 27,89 Ácido benzoico 12,03
18 28,38 D(-)-manopiranosa 0,60
19 28,65 Palmitato de etilo 0,37
20 29,64 Ácido hexadecanoico
(Palmìtico) 6,43 11 29,64
Ácido hexadecanoico
(Palmìtico) 11,63
21 31,13 Estearato de metilo 0,18
22 32,10 Hexadecanoamida
(Palmitamida) 0,93
23 32,56
Ácido 9,12-
octadecadienoico
α-linoléico
0,83 12 32,54
Ácido 9,12-
octadecadienoico
α-linoléico
0,79
24 32,69 Ácido trans 9-
octadecenoico 3,31
25 32,78 Ácido cis 13-
octadecenoico 0,18
13 33,22 Ácido octadecanoico
esteárico
25,06
26 33,28 Ácido araquidónico 0,37
27 33,75
Ácido 9,12,15-
octadecatrienoico (α-
linolénico) 0,18
28 35,22 9-octadecenoamida
Oleamida 7,36 14 35,18
9-octadecenoamida
Oleamida 5,68
29 35,62 Tetradecanamida 1,72
49
15 39,34 sucrosa 1,19
30 41,17 Ácido 9-octadecenoico 1,16
31 41,94 Escualeno 0,27
32 46,14 α-tocoferol 1,21
33 49,27 α-amirina 0,79
16 40,39 Heneicosano 0,24
34 49,92 Acetato de β- amirina 1,35
35 50,03 Acetato de α-amirina 4,0
36 50,75 Ácido ursólico 14,03
37 51,68 Acetato de cicloartenol 3,82
Fuente: Autor
Es de señalar que estos extractos estuvieron mayormente constituidos por
ácidos orgánicos y azúcares. En los frutos maduros el porcentaje de ácidos orgánicos
fue de 33,2 % y la de azúcares de 25,94 %; mientras que para los frutos verdes los
valores fueron 70,95% para los ácidos orgánicos y 20,97 para los azúcares, lo cual
responde a la naturaleza de la acidez de los frutos verdes en relación con los
maduros.
Por otra parte la diferencia en composición observada en los cromatogramas, se
pudo constatar que de los 16 compuestos identificados en los frutos verdes solo 8
fueron encontrados en los frutos maduros, mientras que de los 37 encontrados en los
frutos maduros, solo 9 estuvieron presentes en los frutos verdes.
Esto hace pensar, que durante el proceso de maduración del fruto, existen
transformaciones biogenéticas responsables de los cambios en la composición
química observada.
De los compuestos identificados para los frutos verdes, el ácido octadecanoico
(esteárico), fue el mayoritario, con un 25,6 % de abundancia, le siguió en intensidad
50
el esqueleto esteroidal pregnan-3α, 17-diol-20-ona (15,55%) y los compuestos: 2-
deoxy-ribosa (13,31 %); ácido benzoico (12,03 %) y el ácido hexadecanoico
(Palmìtico) con un (11,63 %), los restantes componentes del extractos se encuentran
en concentraciones menores al 10%.
En el extracto de los frutos maduros los componentes mayoritarios fueron el
azúcar D (-)-fructofuranosa (16,73 %) y el triterpeno pentacíclico Ácido ursólico
(14,03 %). En este extracto, aunque con concentraciones inferiores a un 10%, fueron
identificados α-amirina (0,79 %); acetato de β- amirina (1,35 %); acetato de α-
amirina (4,0 %) y el acetato de cicloartenol (3,82 %), que son junto con el núcleo del
ácido ursólico los principales esqueletos de las saponinas triterpénicas pentacíclicas y
tetracíclicas. Lo que demuestra la existencia de estos compuestos en la especie
estudiada.
Se destacan en ambos extractos la presencia de amidas de ácidos grasos las
cuales no habían sido informadas con anterioridad.
Por otra parte el extracto de la pulpa de los frutos en los dos estados de
maduración fueron también analizados por el sistema CG-EM y los cromatogramas
analíticos de los extractos se presentan en la figura 9.
Al igual que en la corteza en los cromatogramas de los extractos de la pulpa de
los frutos se observan diferencias, en el caso de los frutos verdes se observa una
mayor cantidad de compuestos en el extracto, en comparación con los frutos
51
maduros. Sin embargo la intensidad de los picos cromatográfico indica una mayor
abundancia de los componentes para el extracto de los frutos maduros.
El equipo registró, para el caso de la pulpa de los frutos maduros un total de
161 compuestos y para los frutos verdes un total de 254 compuestos, contrario a lo
obtenido para la corteza. De éstos se pudieron identificar por comparación de sus
espectros de masa con los de la biblioteca del equipo y considerando sólo aquellos
que presentaban un porcentaje de similitud mayor del 95%, un total de 22
compuestos para los frutos maduros y de 34 para los frutos verdes. Los resultados se
muestran en la tabla IX.
Otra diferencia en la composición observada en los cromatogramas, fue que de
los 22 compuestos identificados en los frutos maduros solo 10 fueron encontrados en
los frutos verdes, mientras que de los 34 encontrados en los frutos maduros, solo 10
estuvieron presentes en los frutos verdes.
52
Figura 9. Cromatograma gaseoso analítico de los extractos alcohólicos de la pulpa de
los frutos maduros y verdes de Mimusops sp.
Fuente: Autor
53
Tabla IX. Compuestos identificados por CG-EM en los extractos alcohólicos de la
pulpa de Mimusops sp
PULPA
FRUTO MADURO FRUTO VERDE
Pico Tr
min Compuesto
%
Abund. Pico
Tr
min Compuesto
%
Abund.
1 8,88 Ácido-2-
furanocarboxílico 0,29
2 10,52 Ácido propanodioico 0,14
3 11,64 Succinato de etilo 0,29
1 13,21 Catecol 0,41
4 13,32 Ácido butanodioico
Succínico 1,60 2 13,29
Ácido butanodioico
Succínico 1,33
5 13,40 Notkatona 3,88
6 14,25
Ácido 2-trans-
butenodioico
Fumárico
0,59 3 14,27
Ácido 2-trans-
butenodioico
Fumárico
0,53
4 15,05 Metil-catecol 0,09
7 18,36 L-prolina 5-oxo 2,98 5 18,37 L-prolina 5-oxo 0,96
8 19,42 Ácido treónico 0,29 6 18,99 Ácido treónico 0,14
9 20,05 Arabinofuranose 1,19
10 21,05 Ácido D-arabinoico 0,29
7 21,55 Ácido dodecanoico
Laúrico 0,04
8 22,58 Ácido octanodioico
Subérico 0,48
11 23,67
Ácido -9,12-
Octadecadienoico
Linoleico
40,20
9 24,77 D(-)-fructofuranosa 6,22
12 25,29 Jasmonyl isoleucina 10,46 10 24,96 Jasmonyl isoleucina 10,77
11 25,62 Glucofuranosa 4,98
12 2576 Ácido tetradecanoico
Mirístico 0,50
13 26,51 L(-)-sorbosa 1,06
14 27,02 Palmitato de metilo 0,65
13 27,50 Ácido cinámico 1,19 15 27,53 Ácido cinámico 0,67
16 27,72 Ácido-n-
pentadecanoico 0,24
14 27,87 Ácido benzoico 2,54 17 27,88 Ácido benzoico 1,21
15 28,62 Palmitato de etilo 0,29 18 28,64 Palmitato de etilo 0,29
19 29,19 Äcido palmitoleico 0,12
16 29,65
Ácido
hexadecanoico
(Palmìtico)
21,97 20 29,62 Ácido hexadecanoico
(Palmìtico) 11,42
21 30,62 Ácido petrosénico
metil éster 0,12
22 30,91 Ácido margárico 0,16
23 31,12 Estearato de metilo 0,09
24 32,10 Palmitamida 1,64
17 31,41 Ácido α-linolénico 1,79
18 32,66 Ácido 9-trans
octadecenoico 2,84
54
25 32,67 Ácido 11-cis-
octadecenoico 2,17
26 32,80 Ácido 13-trans
octadecenoico 0,29
19 33,75 Ácido araquidónico 0,59
27 34,82 Ácido nona decanoico 0,14
20 35,27 Oleamida 5,53 28 35,29 Oleamida 8,52
29 36,42 Ácido eicosanoico 0,58
30 38,57 14-β-pregnano 0,21
21 41,92 Escualeno 0,29
31 46,12 α-tocoferol 0,29
32 46,80 5,8-epoxi-15-nor-
labdano 0,5
33 50,70 Urs-12-en-24-oico-3-
oxo-metil éster 4,16
34 51,63
9,19-ciclolanostan-3-
ol-24-metileno-
acetato-3β
1,62
Fuente: Autor
Con relación a la pulpa en los extractos también se observó una composición
mayoritaria de ácidos orgánicos y azúcares. En los frutos maduros el porcentaje de
ácidos orgánicos fue de 74,03 % y la de azúcares de 1,19 %; mientras que para los
frutos verdes los valores fueron 9,6 % para los ácidos orgánicos y 12,26 % para los
azúcares.
De los compuestos identificados para los frutos maduros, el ácido 9,12-
octadecadienoico (linoleico), fue el mayoritario, con un 40,20 % de abundancia,
seguido por el ácido hexadecanoico (palmítico) con un 21,97 %. En el extracto de los
frutos verdes el componente mayoritario fue el ácido hexadecanoico (11,42 %).
En el extracto de los frutos verdes, aunque con concentraciones inferiores a un
10%, fueron identificados 14 β-pregnano (0,21 %); 5,8-epoxi-15-norlabdano (0,5 %);
urs-12-en-24-oico-3-oxo-metil éster (4,16 %) y el 9,10-ciclolanostan-3-ol-24-
metileno-acetato 3β (1,62 %), que conforman los principales esqueletos de las
55
saponinas triterpénicas, lo que reitera la existencia de estos compuestos en la especie
estudiada.
Otro aspecto importante a señalar es la presencia tanto en la pulpa de los frutos
verdes como maduros de Jasmonoil isoleucina (10,77 y 10,46 % respectivamente), la
cual es una fitohormona que se informa por primera vez para la especie.
Algunas estructuras de los compuestos identificados se presentan en la figura
10.
56
α-amirina β- amirina
Ácido ursólico Cicloartenol
Jazmonyl-isoleucina Oleamida
Figura 10. Algunas estructuras aisladas de la corteza y la pulpa de los frutos maduros
y verdes de Mimusops sp.
Fuente: Autor
57
CAPÍTULO V. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
V.1 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos permiten arribar a las siguientes conclusiones:
Se establecieron los parámetros físicoquímicos de las drogas crudas (corteza y
pulpa), determinándose que tanto para la corteza como para la pulpa de los
frutos en los dos estados de maduraciones estudiados, los valores se encuentran
dentro de los límites establecidos sin marcadas diferencias entre ellos.
Mediante tamizaje fitoquímico se determinó la presencia de aceites y grasas,
triterpenos-esteroides, azúcares reductores, saponinas, flavonoides, taninos,
antocianidinas y aminoácidos tanto en la corteza como en la pulpa en los dos
estados de maduración, sin diferencias marcadas.
Se realizó una extracción por maceración de la corteza y la pulpa de los frutos
en los dos estados de maduración y el análisis por CG-EM permitió comprobar
abundantes ácidos orgánicos y azúcares, así como los núcleos fundamentales
de las saponinas.
Se encontraron marcadas diferencias en la composición química de los
extractos de la corteza y la pulpa en los dos estados de maduración.
58
V.2 RECOMENDACIONES
Profundizar en la composición química de los órganos estudiados, empleando
otros disolventes.
Llevar a cabo análisis por HPLC-MS de los extractos para poder determinar
los glicósidos saponínicos
59
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63
ANEXOS
INFORME ANTIPLAGIO DEL SISTEMA URKUND
La similitud encontrada en el proyecto de titulación cuyo tema es Determinación de
saponinas triterpénicas en la pulpa y corteza de los frutos de Mimusops sp. en
diferentes estados de maduración fue del 7%, según lo certifica el sistema
URKUND.
