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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS CARRERA INGENIERÍA AGRONÓMICA IDENTIFICACIÓN DE CEPAS DE Trichoderma spp., CON CAPACIDAD DE BIOCONTROL A Moniliophthora roreri, EN SISTEMAS DE CACAO EN LA ZONA CENTRO NORTE DE LA AMAZONÍA ECUATORIANA. Autor: Oscar Emilio Palacios Riera Tutor: Ing. Leticia Vivas Vivas, MSc. Guayaquil, abril de 2019
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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
CARRERA INGENIERÍA AGRONÓMICA
IDENTIFICACIÓN DE CEPAS DE Trichoderma spp., CON CAPACIDAD DE
BIOCONTROL A Moniliophthora roreri, EN SISTEMAS DE CACAO EN LA
ZONA CENTRO NORTE DE LA AMAZONÍA ECUATORIANA.
Autor: Oscar Emilio Palacios Riera
Tutor: Ing. Leticia Vivas Vivas, MSc.
Guayaquil, abril de 2019
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DEDICATORIA
Dedico este trabajo de investigación a DIOS nuestro padre celestial por todas sus
bendiciones derramadas en mí todo el día de mi vida. Este trabajo representa el
esfuerzo por alcanzar la lucha tan anhelada de mi vida que es obtener el título de
Ingeniero Agrónomo.
A mi madre Rita Atali Palacios Riera, la mujer más importante de mi vida, por la
constante ayuda, fortaleza y apoyo que me ha brindado en los momentos más
difíciles de mi vida, que me dio todo su esfuerzo y dedicación para poder culminar
mi carrera profesional.
A mi abuela Angélica Riera (†) por haberme apoyado incondicionalmente en todo
momento, por servirme de ejemplo, por guiar mis pasos, este logro es para usted
y en agradecimiento a todo su amor.
A mis familiares hermano, tías, que me dieron la mano para poder llegar a la meta
propuesta de ser un profesional de bien.
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AGRADECIMIENTOS
A mi madre;
A la Universidad de Guayaquil en especial a la Facultad de Ciencias Agrarias y a
mis queridos docentes que supieron compartir incondicionalmente sus
conocimientos, generando en nosotros ganas de superarnos día a día.
Al Instituto Nacional Autónomo de Investigaciones Agropecuarias (INIAP), en
especial a la ESTACIÓN EXPERIMENTAL CENTRAL DE LA AMAZONÌA, por
permitirme realizar mi tesis de grado en esta institución.
Al Ing. Agr. M.Sc. Jimmy Pico, y al Ing. Agr. Cristopher Suárez investigadores del
Departamento de Protección Vegetal de la Estación Experimental Central de la
Amazonia, por brindarme incondicionalmente la confianza, sus conocimientos los
cuales contribuyeron directamente en la realización de este trabajo investigación.
A mi Tutora Académica de Trabajo de Titulación Ing. Agr. M.Sc. Leticia Vivas,
por su asesoramiento y por guiarme a culminar este trabajo con éxito.
También, agradecer en lo personal a mis amigas Elsa Abad y a la MVZ. Viviana
Ureña por brindarme su apoyo su ayuda cuando más la necesite, por tener
siempre tendida su mano amiga, por escucharme, en fin, han demostrado ser
una calidad de persona y unas excelentes amigas con la que poder contar
siempre.
A mis compañeros de aula gracias por brindarme su amistad en todos estos años
de estudio.
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FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS CARRERA INGENIERÍA AGRONÓMICA
UNIDAD DE TITULACIÓN
CERTIFICADO PORCENTAJE DE SIMILITUD
Habiendo sido nombrada Agr. Leticia Vivas Vivas MSc., tutora del trabajo de titulación “IDENTIFICACIÓN DE CEPAS DE Trichoderma spp., CON CAPACIDAD DE BIOCONTROL A Moniliophthora roreri, EN SISTEMAS DE CACAO EN LA ZONA CENTRO NORTE DE LA AMAZONÍA ECUATORIANA”, certifico que el presente trabajo de titulación ha sido elaborado por Oscar Emilio Palacios Riera con C.I. No 0951292242, con mi respectiva supervisión como requerimiento parcial para la obtención del título de Ingeniero Agrónomo.
Se informa que el trabajo de titulación: “IDENTIFICACIÓN DE CEPAS DE Trichoderma spp., CON CAPACIDAD DE BIOCONTROL A Moniliophthora roreri, EN SISTEMAS DE CACAO EN LA ZONA CENTRO NORTE DE LA AMAZONÍA ECUATORIANA”. ha sido orientado durante todo el periodo de ejecución en el programa antiplagio (URKUND) quedando el 6% de coincidencia.
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FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS CARRERA INGENIERÍA AGRONÓMICA
UNIDAD DE TITULACIÓN
REPOSITORIO NACIONAL EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA
FICHA DE REGISTRO DEL TRABAJO DE TITULACIÓN
TÍTULO Y SUBTÍTULO: IDENTIFICACIÓN DE CEPAS DE Trichoderma spp., CON CAPACIDAD DE BIOCONTROL A Moniliophthora roreri, EN SISTEMAS DE CACAO EN LA ZONA CENTRO NORTE DE LA AMAZONÍA ECUATORIANA
AUTOR: Palacios Riera Oscar Emilio
Director del Trabajo de titulación: Ing. Agr. Leticia Vivas Vivas MSc.
INSTITUCIÓN: UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD: DE CIENCIAS AGRARIAS
CARRERA: INGENIERÍA AGRONÓMICA
FECHA DE PUBLICACIÓN: No de páginas:
TÍTULO OBTENIDO: INGENIERO AGRÓNOMO
ÁREAS TEMÁTICAS: Fitopatología, cacao
PALABRAS CLAVE: Moniliophthora roreri, Trichoderma asperellum, T. aureoviride, T. harzianum, T. reesei y T. koningiopsis
RESUMEN/ABSTRACT La presente investigación se realizó en el laboratorio de Protección Vegetal de la Estación Experimental Central Amazónica (EECA) del Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIAP). Los objetivos fueron: 1) Identificar morfológicamente especies de Trichoderma, aisladas en sistemas de cacao en la zona centro - norte de la Amazonía Ecuatoriana; 2) Caracterizar morfo cultural de cepas de Trichoderma spp. aisladas en sistemas de cacao en la zona centro norte de la Amazonía Ecuatoriana, y 3) Confrontar los aislados de Trichoderma frente a Moniliophthora roreri en condiciones de laboratorio. Se usó un diseño completamente al azar con 20 tratamientos y cinco repeticiones. Los tratamientos estuvieron constituidos por 12 aislados de Trichoderma procedentes de la provincia de Napo, cinco de Orellana, una de la provincia de Sucumbíos, y comparados con una cepa nativa del Guayas (T. asperellum) y una comercial (Tricomix). Se identificaron cinco especies de Trichoderma: T. asperellum, T. aureoviride, T. harzianum, T. reesei y T. koningiopsis. El mayor crecimiento radial de los aislados de Trichoderma se obtuvieron en el medio de cultivo papa dextrosa agar; los medios CMD y SNA son los más eficientes para caracterizar las estructuras de Trichoderma. El aislado Napo Tena – 12, tuvo el mayor efecto antagónico frente a Moniliophthora roreri en condiciones de laboratorio.
No. DE REGISTRO (en base de datos): No. DE CLASIFICACIÓN:
DIRECCIÓN URL (Trabajo de titulación en la web):
ADJUNTO PDF: x SI NO
CONTACTO CON AUTOR/ES Oscar Emilio Palacios Riera
Teléfono: 0989728808
E-mail: [email protected]
CONTACTO EN LA INSTITUCIÓN: Nombre: Ing. Agr. Leticia Vivas Vivas, MSc.
Teléfono:(042)288040
E-mail: [email protected]
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IDENTIFICACIÓN DE CEPAS DE Trichoderma spp., CON CAPACIDAD DE BIOCONTROL A Moniliophthora roreri, EN SISTEMAS DE CACAO EN LA ZONA CENTRO NORTE DE LA AMAZONÍA ECUATORIANA
Autor: Oscar Emilio Palacios Riera
Tutora: Leticia Vivas Vivas
RESÚMEN
La presente investigación se realizó en el laboratorio de Protección Vegetal de la Estación Experimental Central Amazónica (EECA) del Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIAP), ubicada en la parroquia San Carlos, Cantón Joya de los Sachas, Provincia de Orellana. Los objetivos fueron: 1) Identificar morfológicamente especies de Trichoderma, aisladas en sistemas de cacao en la zona centro - norte de la Amazonía Ecuatoriana; 2) Caracterizar morfo cultural de cepas de Trichoderma spp. aisladas en sistemas de cacao en la zona centro norte de la Amazonía Ecuatoriana, y 3) Confrontar los aislados de Trichoderma frente a Moniliophthora roreri en condiciones de laboratorio. Se usó un diseño completamente al azar con 20 tratamientos y cinco repeticiones. Los tratramientos estuvieron constituidos por 12 aislados de Trichoderma procedentes de la provincia de Napo, cinco de la provincia de Orellana, una de la provincia de Sucumbíos, y comparados con una cepa nativa de la provincia del Guayas (T. asperellum) y una comercial (Tricomix). Se identificaron cinco especies de Trichoderma: T. asperellum, T. aureoviride, T. harzianum, T. reesei y T. koningiopsis. El mayor crecimiento radial de los aislados de Trichoderma se obtuvieron en el medio de cultivo papa dextrosa agar; los medios CMD y SNA son los más eficientes para caracterizar las estructuras de Trichoderma. El aislado Napo Tena – 12, tuvo el mayor efecto antagónico frente a Moniliophthora roreri en condiciones de laboratorio.
Palabras clave: Moniliophthora roreri, Trichoderma asperellum, T. aureoviride, T. harzianum, T. reesei y T. koningiopsis.
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IDENTIFICATION OF Trichoderma spp, STRAINS WITH BIOCONTROL CAPACITY FOR Moniliophthora roreri, IN COCOA SYSTEMS IN THE NORTHERN CENTER AREA OF THE ECUADORIAN AMAZON
Author: Oscar Emilio Palacios Riera Tutor: Leticia Vivas Vivas
SUMMARY The present investigation was carried out in the Plant Protection Laboratory of the Central Amazonian Experimental Station (EECA) of the National Institute of Agricultural Research (INIAP), located in the San Carlos parish, Canton Joya de los Sachas, Province of Orellana. The objectives were: 1) Identify morphologically Trichoderma species, isolated in cocoa systems in the central - north zone of the Ecuadorian Amazon; 2) Characterize cultural morph of strains of Trichoderma spp. isolated in cocoa systems in the northern central zone of the Ecuadorian Amazon; and 3) Confront the isolates of Trichoderma against Moniliophthora roreri in laboratory conditions. A completely randomized design was used with 20 treatments and five repetitions. The treatments consisted of 12 Trichoderma isolates from the province of Napo, five from Orellana, one from the province of Sucumbíos, and compared with a native strain of the Guayas (T. asperellum) and one commercial (Tricomix). Five species of Trichoderma were identified: T. asperellum, T. aureoviride, T. harzianum, T. reesei and T. koningiopsis. The highest radial growth of the Trichoderma isolates was obtained in the potato dextrose agar culture medium; the CMD and SNA media are the most efficient to characterize the structures of Trichoderma and the Napo Tena - 12 isolate, had the greatest antagonistic effect against Moniliophthora roreri in laboratory conditions.
Keywords: Moniliophthora roreri, Trichoderma asperellum, T. aureoviride, T. harzianum, T. reesei y T. koningiopsis.
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ÍNDICE
I. INTRODUCCIÓN .................................................................................. 1
1.1. Planteamiento del problema .......................................................... 2
1.2. Justificación ................................................................................... 3
1.3. Objetivos ....................................................................................... 4
1.3.1. Objetivo General .................................................................... 4
1.3.2. Objetivos Específicos ............................................................. 4
II. MARCO TEÓRICO ............................................................................... 5
2.1. Taxonomía de Trichoderma .......................................................... 5
2.2. Trichoderma spp ............................................................................ 6
2.3. Características morfológicas de las colonias ................................. 6
2.4. Ecología ........................................................................................ 7
2.5. Trichoderma y su efecto ................................................................ 8
2.6. Mecanismos de acción de Trichoderma ........................................ 9
2.6.1. Competencia .......................................................................... 9
2.6.2. Fungistasis ........................................................................... 10
2.6.3. Antibiosis .............................................................................. 10
2.6.4. Micoparasitismo ................................................................... 10
2.7. Trichoderma como antagonista ................................................... 11
2.8. Ciclo de vida de Moniliophthora roreri ......................................... 12
2.9. Control biológico del M. roreri ...................................................... 13
III. MATERIALES Y MÉTODOS .............................................................. 15
3.1. Ubicación del ensayo .................................................................. 15
3.2. Factores estudiados .................................................................... 15
3.3. Materiales usados en laboratorio................................................. 15
3.4. Tratamientos ............................................................................... 15
3.5. Diseño experimental .................................................................... 16
3.6. Análisis de varianza y funcional .................................................. 16
3.7. Manejo del experimento .............................................................. 17
3.7.1. Reactivación de aislados de Trichoderma spp., de la colección
de cepas del Departamento de Protección Vegetal del EECA ........... 17
xii
3.7.2. Identificación morfológica de especies de Trichoderma,
aisladas en sistemas de cacao en la zona centro - norte de la Amazonía
Ecuatoriana ........................................................................................ 18
3.7.3. Caracterización microscópica cepas de Trichoderma spp.,
aisladas en sistemas de cacao en la zona centro - norte de la Amazonía
Ecuatoriana ........................................................................................ 18
3.8. Métodos de evaluación y manejo especìfico del experimento ..... 19
3.8.1. Métodos de evaluación ........................................................ 19
3.9. Confrontación de aislados de Trichoderma frente a Moniliophthora
roreri 21
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................... 22
4.1. Identificación morfológica especies de Trichoderma, aisladas en
sistemas de cacao en la zona centro - norte de la Amazonía
Ecuatoriana .......................................................................................... 22
4.2. Caracterización macroscópica cepas de Trichoderma spp.,
aisladas en sistemas de cacao en la zona centro - norte de la Amazonía
Ecuatoriana .......................................................................................... 31
4.2.1. Crecimiento radial ................................................................ 31
4.3. Caracterización morfo cultural de cepas de Trichoderma spp. .... 33
4.4. Características morfológicas de los aislados de Trichoderma ..... 34
4.5. Unidad Formadora de Colonia .................................................... 43
4.6. Potencial antagónico de cepas de Trichoderma spp. frente a
Moniliophthora roreri en el laboratorio .................................................. 44
V. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ..................................... 45
VI. BIBLIOGRAFÌA .................................................................................. 46
xiii
Índice de Figuras del texto
Figura 1. Apariencia macroscópica y microscópica de T.asperellum ............... 23
Figura 2. Apariencia macroscópica y microscópica de T. aureoviride ............. 24
Figura 3. Apariencia macroscópica y microscópica de T. harzianum .............. 27
Figura 4. Apariencia macroscópica y microscópica de T.reesei ...................... 28
Figura 5. Apariencia macroscópica y microscópica de T.koningiopsis ............ 29
Figura 6. Apariencia macroscópica y microscópica de Tricomix producto
comercial .......................................................................................................... 30
Figura 7. Apariencia macroscópica y microscópica de T. asperellum INIAP-EELS
.......................................................................................................................... 30
Figura 8. Crecimiento radial (mm/día) de aislados de Trichoderma en tres medios
de cultivo. INIAP, EECA. 2019 .......................................................................... 32
Figura 9. Promedio de crecimiento de Trichoderma en tres medios de cultivos
.......................................................................................................................... 33
Figura 10. Promedio de largo de fiálides en medio de cultivo PDA ................. 34
Figura 11. Promedio de ancho de fiálides en medio de cultivo PDA ................ 35
Figura 12. Promedio de largo de conidias en medio PDA ............................... 35
Figura 13. Promedio ancho de conidias en medio de cultivo PDA................... 36
Figura 14. Promedio largo de clamidospora en medio de cultivo PDA ............ 36
Figura 15. Promedio de ancho de clamidospora en medio de cultivo PDA ..... 37
Figura 16. Promedio largo de fiálides en medio de cultivo CMD...................... 37
Figura 17. Promedio ancho de fiálides en medio de cultivo CMD .................... 38
Figura 18. Promedio largo de conidias en el medio de cultivo CMD ................ 38
Figura 19. Promedio ancho de conidias en el medio de cultivo CMD .............. 39
Figura 20. Promedio largo de clamidosporas en el medio de cultivo CMD ...... 39
Figura 21. Promedio ancho de clamidosporas en el medio de cultivo CMD .... 40
Figura 22. Promedio largo de fiálides en el medio de cultivo SNA................... 40
Figura 23. Promedio del ancho de fiàlides en el medio de cultivo SNA ........... 41
Figura 24. Promedio largo de conidias en el medio de cultivo SNA ................. 41
Figura 25. Promedio ancho de conidias en el medio de cultivo SNA ............... 42
xiv
Figura 26. Promedio largo de clamidosporas en el medio de cultivo SNA ....... 42
Figura 27. Promedio ancho de clamidosporas en el medio de cultivo SNA ..... 43
Figura 28. Promedio ancho de clamidosporas en el medio de cultivo SNA ..... 44
Figura 29. Potencial antagonista de aislados de Trichoderma frente a M. roreri
.......................................................................................................................... 44
Índice Figuras del anexo
Figura A 1. Características macroscópicas de los aislados de Trichoderma .... 64
Figura A 2. Observaciones de crecimiento de los aislados de Trichoderma ..... 64
Figura A 3. Repiques de los aislados de Trichoderma ...................................... 64
Figura A 4. Siembra de los aislados de Trichoderma en diferentes medios de
cultivos .............................................................................................................. 64
Figura A 5. Observaciones de las estructuras de los aislados .......................... 64
Figura A 6. Conservación de los aislados en medio de cultivo PDA ................. 64
xv
Índice de Cuadros del texto
Cuadro 1. Aislados de Trichoderma .................................................................. 16
Cuadro 2. Esquema del análisis de varianza .................................................... 17
Cuadro 3. Escala de notas cualitativas de Bell et al. ........................................ 20
Cuadro 4. Respuestas de tres medios de cultivo sobre variables morfológicas 34
Índice de Cuadros del Anexo
Cuadro A 1. Crecimiento radial de cepas de Trichoderma en tres medios de
cultivo durante 10 días ...................................................................................... 59
Cuadro A 2. Características de los aislados de Trichoderma en medio de cultivo
PDA .................................................................................................................. 61
Cuadro A 3. Características de los aislados de Trichoderma en medio de cultivo
CMD .................................................................................................................. 62
Cuadro A 4. Características de los aislados de Trichoderma en medio de cultivo
SNA .................................................................................................................. 63
1
I. INTRODUCCIÓN
El cacao (Theobroma cacao L.) es de gran importancia económica y social
en el Ecuador, pues aproximadamente el 13% de la población económicamente
activa agrícola del país se relaciona con dicho cultivo (Pro - Ecuador, 2013). En
Ecuador el año 2017 la superficie plantada es 573.516 (Ha) con una producción
de 205.955 toneladas métricas. De estas 48.517 están ubicadas en la Región
Amazónica con una producción de 3.734 toneladas métricas (ESPAC, 2017). En
la Amazonía una hectárea de cacao en edad de 6 a 10 años, se estima que
produce entre 30.000 a 40.000 mazorcas por año, dependiendo del nivel de
manejo, Moniliophthora roreri puede generar un impacto destructivo muy
significativo que sobrepasaría el 80% si estos valores lo relacionamos con la
producción de mazorcas año obtenidas en la amazonìa esto equivaldría a una
pérdida entre 24000 a 32000 mazorcas que equivale a un rango de 20 a 30
quintales de pérdida por año.
M. roreri, es un grave problema para los agricultores amazónicos, debido a
que los productores no pueden tener ingresos que satisfaga su economía, lo cual
causa desmotivación por el cultivo y se obligan buscar otras opciones de
producción o en último de los casos abandonan sus áreas de producción y migrar
hacia las ciudades. La moniliasis es capaz de provocar pérdidas de producción
de hasta un 100%, dependiendo la zona, época del año, nivel de manejo y
condiciones climáticas (Sánchez Mora & Garcés Fiallos, 2012).
La amazonìa ecuatoriana se caracteriza por presentar condiciones
apropiadas para el crecimiento virulento del patógeno; es por esta razón que su
manejo es complejo y mucho más cuando no se conoce el ciclo del hongo, su
epidemiología, en el cultivo y el tiempo oportuno para aplicar las estrategias de
manejo (Pico, Calderon, Fernández, & Díaz, 2012; Caicedo & Nieto. 2012). El
empleo de agentes microbianos, como control biológico, es reportado como una
opción eficaz frente al uso de fungicidas químicos para el control de
enfermedades (Sivila,N, 2013).
2
1.1. Planteamiento del problema
Estudios realizados en los últimos años han demostrado el gran potencial
de hongos y bacterias endófitos para el control de la moniliasis (Krauss &
Soberanis, 2003; Suárez,L & Cabrales, 2008). Entre los microorganismos más
importantes están las bacterias de los géneros Pseudomonas y Bacillus y hongos
de los géneros Gliocladium y Trichoderma. Las especies de Trichoderma tienen
una gran actividad antagonista sobre patógenos como Rhizoctonia solani,
Sclerotium rolfsii, Pythium ultimum y Fusarium oxysporum, causantes de
enfermedades importantes en cultivos de rábano, clavel, crisantemo, fríjol, cafeto,
haba, tomate, cítricos, entre otros (Tovar Castaño, 2008).
El género Trichoderma tiene diferentes mecanismos para manejar las
plagas, destacándose entre ellos la competencia por espacio y nutrientes, el
micoparasitismo, la producción de compuestos inhibidores, la inactivación de
enzimas del agente patógeno y la inducción de resistencia (Harman, Howell,
Viterbo, Chet, & Lorito, 2004; Holmes, Schroers, Thomas, Evans, & Samuels,
2004).
Se ha observado que en la Amazonía existen cepas de Trichoderma, pero
no se ha identificado la especie. El DNPV de la Estación Experimental Central
Amazónica cuenta con una colección de 18 cepas nativas del gènero
Trichoderma, la misma que no se ha identificado la especie, ni se ha
caracterizado morfológica y morfométricamente, siendo necesario además
conocer también el efecto antagónico frente a M. roreri.
3
1.2. Justificación
El Ecuador está entre los países productores con significativa producción
de granos de cacao, además es de relevante importancia en la economía, por
ser un producto de exportación y que constituye una fuente de empleo para un
alto porcentaje de habitantes de los sectores rurales y urbano (Quiroz, 2006). El
cacao a causa de varios problemas fitopatológicos a nivel mundial sufre pérdidas
que se estiman cerca del 30% del rendimiento (Aneja, Gianfagna, & Hebbar,
2006). La Amazonía ecuatoriana por su condición climática no está exenta de las
enfermedades que afectan al cultivo de cacao, en varios análisis realizados por
el Dpto. de Protección Vegetal de la Estación (DNPV) Central Amazónica
perteneciente al Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias INIAP han
encontrado en repetidas ocasiones los patógenos como moniliasis
Moniliophthora roreri (Cif) Evans et al. (1978). Debido a esta problemática, el
control biológico ha despertado gran interés en detener los patógenos de plantas
y es una respuesta al creciente uso de pesticidas químicos (Suárez, L, &
Cabrales, 2008), por ello el INIAP en la amazonìa ecuatoriana a través del DNPV
ha realizado el aislamiento y purificación de cepas nativas de Trichoderma de la
parte norte de esta región (Napo, Orellana, Sucumbíos), para la obtención de
cepas con poder antagonista contra monilia para disminuir los daños en este
cultivo, así como el impacto sobre el ecosistema (Acebo et al., 2012; Contreras
& Riaño, 2013).
En la Amazonía se tienen pocos reportes del uso de Trichoderma para el
control de varios patógenos y casi nada sobre su identificación morfo-cultural e
identificación taxonómica de las especies presentes en las zonas cacaoteras de
la Amazonía norte; este trabajo contribuye a la búsqueda de una cepa y especie
con potencial antagónico sobre el causal de la monilia del cacao.
4
1.3. Objetivos
1.3.1. Objetivo General
“Identificar y caracterizar cepas de Trichoderma spp., con capacidad de
biocontrol a Moniliophthora roreri, aisladas en el norte de la Amazonía
ecuatoriana”.
1.3.2. Objetivos Específicos
Identificar morfológicamente especies de Trichoderma, aisladas
en sistemas de cacao en la zona centro - norte de la Amazonía
Ecuatoriana.
Caracterizar morfo cultural de cepas de Trichoderma spp. aisladas
en sistemas de cacao en la zona centro norte de la Amazonía
Ecuatoriana.
Confrontar los aislados de Trichoderma frente a Moniliophthora
roreri en condiciones de laboratorio.
5
II. MARCO TEÓRICO
2.1. Taxonomía de Trichoderma
El hongo Trichoderma fue identificado por Persoon en el año 1794, aislado
de un material recolectado en Alemania (Gary J. Samuels, 2006). Las especies
del género Trichoderma spp., pertenecen a un grupo de hongos filamentosos que
han sido caracterizados por sus aplicaciones en el sector agrícola como
controladores biológicos de una amplia gama de organismos patógenos.
La clasificación taxonómica del género Trichoderma según Rifai (1969) es:
Reino: Fungui
División: Ascomycota
Subdivisión: Pezizomycota
Clase: Sordariomycetes
Orden: Hypocreales
Familia: Hypocreaceae
Género: Trichoderma
El hongo Trichoderma spp. produce tres tipos de propágulos: hifas,
clamidosporas y esporas (conidias) (Sivila & Alvarez, 2013).
Muchas especies de este género son agentes de control biológico con
potencial contra un sin número de enfermedades (Weindling 1932; Chet 1987;
Jakobs et al. 1991). Los mecanismos por los que las cepas del género
Trichoderma desplazan al fitopatógenos son fundamentalmente de tres tipos.
Competición directa por el espacio o por los nutrientes (Elad & Baker, 1985; Elad
& Chet, 1987; Chet & Inbar, 1994; Bélanger, Dufour, Caron, & Benhamou, 1995)
.
6
2.2. Trichoderma spp
Trichoderma spp., es un hongo de vida libre en suelos y ecosistemas de
raíz (Gary E Harman et al., 2004a) y puede estar presente en la materia orgánica
de los suelos y en residuos de cultivos (Rincón Gonzalez, Leguizamón Caycedo,
& Arbeláez Torres, 1992; Cupull, Andreu, Pérez, Delgado, & Cuppull, 2003). El
género Trichoderma es un excelente microorganismo para ser estudiado debido
a su fácil aislamiento y cultivo, rápido desarrollo en varios sustratos y por su
condición de controlador biológico de una amplia gama de fitopatógenos
(Fernández-Larrea, 2001).
Trichoderma spp., son ampliamente utilizados en la agricultura y la industria:
las cepas de T. reesei se suelen aplicar para la producción de proteínas, y los
aislamientos de biocontrol se utilizan como bioplaguicidas, bioprotectores,
bioestimulantes, y biofertilizantes en una amplia gama de plantas (Gary E
Harman, 1998). También se utilizan como agentes de control biológico de
enfermedades vegetales y como estimuladores del crecimiento vegetal (Gary E
Harman et al., 2004; C Kubicek & Penttilä, 1998).
2.3. Características morfológicas de las colonias
Los hongos poseen características que definen muy bien sus
potencialidades como biocontroladores, por su alto poder patogénico y la
capacidad de producir epizootias; sin embargo, su producción a escala industrial
presenta algunos inconvenientes que han limitado el desarrollo de estos
organismos con amplias posibilidades entomopatogénicas y antagonistas, y es
precisamente el poder superar estas limitaciones lo que puede hacer posible su
empleo a gran escala (Fernández-Larrea, 2006).
La mayoría de las colonias de Trichoderma en su inicio son de color blanco
y con la esporulación densa se tornan de amarillento a verde oscuro. El micelio
7
es algodonoso puede ser abundante o ralo (Infante, González, Reyes, &
Martinez, 2016).
Las especies de Trichoderma producen esporas verdes en casi todos los
tipos de suelos templados y tropicales. A menudo se pueden encontrar en
material vegetal en descomposición y en la rizósfera de las plantas (Schuster &
Schmoll, 2010). Diversas especies de este género están asociadas con la
rizósfera de plantas o pueden relacionarse de manera endofítica (Gary E Harman,
Howell, Viterbo, Chet, & Lorito, 2004b). La acción de Trichoderma como
micoparásito natural se demostró por Weindling en 1932, y su utilización en
experimentos de control biológico se implementó a partir de 1970, cuando se
incrementaron los estudios de campo para su uso en cultivos de hortalizas y
ornamentales (Chet, 1990).
2.4. Ecología
Estos hongos se caracterizan por predominar en los ecosistemas terrestres
(suelos agrícolas, pastizales, bosques y desiertos) y acuáticos (Zhang,
Druzhinina, Kubicek, & Xu, 2005). Las especies de este género se encuentran
ampliamente distribuidas por todas las latitudes, y se presentan naturalmente en
diferentes ambientes, especialmente en aquellos que contienen materia orgánica
o desechos vegetales en descomposición (Martínez, Infante, & Reyes, 2013).
Las especies de Trichoderma son hongos de vida libre, comunes en el suelo
y en la rizósfera de las plantas de diferentes ecosistemas (Gary E Harman et al.,
2004).
Las especies de Trichoderma son los microorganismos que con mayor
frecuencia se aíslan de los suelos agrícolas, siendo probablemente uno de los
agentes de control biológico (ACBs) fúngicos más estudiados (G E Harman,
2006; Francesco Vinale et al., 2008).
8
Se utilizan como agentes de control biológico de enfermedades vegetales y
como estimuladores del crecimiento vegetal (Gary E Harman, Howell, Viterbo,
Chet, & Lorito, 2004; C Kubicek & Penttilä, 1998).
2.5. Trichoderma y su efecto
El crecimiento de las especies fúngicas que habitan en el suelo, sólo se
produce junto a los restos orgánicos o en la rizósfera de plantas vivas, donde los
organismos encuentran los estímulos necesarios para interrumpir su estado de
latencia (Y Elad, Chet, & Henis, 1982).
Trichoderma spp. es un hongo que puede establecer competencia por el
nitrógeno, hierro, carbohidratos no estructurales como almidón, celulosa, quitina,
pectina y microelementos (Arzate-Vega, Michel-Aceves, Domínguez-Márquez, &
Santos-Eméstica, 2006).
Se ha encontrado que especies de Trichoderma actúan como hiperparásitos
competitivos que producen metabolitos antifúngicos y enzimas hidrolíticas que
causan cambios estructurales a nivel celular del patógeno, tales como
vacuolización, granulación, desintegración del citoplasma y lisis celular
(Mohammed Ezziyyani, Perez, Sid, Requena, & Candela, 2004).
Trichoderma, es ávido por materia orgánica, sin la cual es difícil que se
establezca en el suelo para cumplir sus funciones, y mediante la descomposición
de materia orgánica libera nutrientes en formas disponibles para la planta,
(Godes, 2007), gracias a su actividad solubilizadora de fosfatos (Valencia,
Sánchez, Vera, Valero, & Cepeda, 2007) y a la producción de ácido 3-indol
acético, sustancia promotora del desarrollo del sistema radical (Sánchez,
Valencia, & Valero, 2005).
Los hongos biocontrol del género Trichoderma han desarrollado una
asombrosa habilidad para interactuar, tanto parasitaria como simbióticamente,
9
con diferentes sustratos y organismos vivos, incluyendo plantas y otros microbios
(Harman, 1998; Kubicek & Harman, 1998).
2.6. Mecanismos de acción de Trichoderma
En la acción biocontroladora de Trichoderma se han descrito diferentes
mecanismos que regulan el desarrollo de los hongos fitopatógenos, entre estos,
los principales son la competencia por espacio y nutrientes, el micoparasitismo y
la antibiosis, los que tienen una acción directa frente al hongo fitopatógeno, Leal
(2000) citado por (Lorenzo, 2004).
Las especies de Trichoderma actúan hacia los patógenos mediante la
combinación de mecanismos de acción biológica tales como: competencia por
espacio y nutrientes, antibiosis y micoparasitismo (Infante et al., 2016).
2.6.1. Competencia Anke, Kinn, Bergquist, & Sterner, (1991), reportaron la producción de
sideróforos por Trichoderma spp; al respecto indican que el hidroxamato como
un tipo de sideróforo producido por éste, convirtiéndolo en un fuerte competidor
por el hierro del suelo, el cual es necesario para la sobrevivencia de otros
organismos.
Este tipo de antagonismo se ve favorecido por las características del agente
de control biológico como plasticidad ecológica, velocidad de crecimiento y
desarrollo, y por otro lado por factores externos como tipo de suelo, pH,
temperatura, humedad, entre otros (Infante et al., 2016).
La presencia de forma natural de Trichoderma en diferentes suelos
(agrícolas, forestales, en barbechos), se considera una evidencia de la
plasticidad ecológica de este hongo y de su habilidad como excelente competidor
por espacio y recursos nutricionales, aunque la competencia depende de la
especie (Wardle & Yeates, 1993).
10
2.6.2. Fungistasis Es la imposición por parte del controlador biológico de dormancia
especialmente de esporas fungales por medio de la limitación de nutrientes. La
más común de ésta, es la relacionada con la disponibilidad de elementos
nutritivos, siendo el carbono el más estudiado (Nilda & Vázquez, 2004).
2.6.3. Antibiosis La antibiosis es la acción directa de antibióticos o metabolitos tóxicos
producidos por un microorganismo sobre otro sensible a éstos. Algunos autores
opinan que la antibiosis no debe ser el principal mecanismo de acción de un
antagonista, ya que existe el riesgo de aparición de cepas del patógeno
resistentes al antibiótico (Mondino & Vero, 1999). En sentido estricto la antibiosis
es el antagonismo mediado por metabolitos específicos o no específicos de
origen microbiano. La combinación de enzimas hidrolíticas y antibióticos resulta
en un mayor nivel de antagonismo que la obtenida por cualquiera de los
mecanismos por sí sola (Howell, 2003; Monte, 2001; Benítez, Rincón, Limón, &
Codon, 2004).
2.6.4. Micoparasitismo La agresión directa de un hongo a otro es un proceso muy complejo que
involucra eventos secuenciales, incluye reconocimiento, ataque, penetración
subsecuente y muerte al huésped. Trichoderma spp., puede ejercer control
directo por el rango de parasitismo, detectando otros hongos y creciendo sobre
él (Benítez et al., 2004).
Las especies de Trichoderma durante el proceso de micoparasitismo
crecen quimio trópicamente hacia el hospedante, se adhieren a las hifas del
mismo, se enrollan en ellas frecuentemente y las penetran en ocasiones. La
degradación de las paredes celulares del hospedante se observa en los estados
11
tardíos del proceso parasítico (Carsolio et al., 1999), que conlleva al
debilitamiento casi total del fitopatógeno.
2.7. Trichoderma como antagonista
Una de las estrategias utilizadas para el control de patologías agrícolas es
el uso de ABC´s cuyo empleo, en conjunto con otras medidas de control y
prevención, logran disminuir considerablemente la incidencia del fitopatógeno
con el mínimo impacto para el ambiente y la salud humana (López-Ávila, 1999;
Benítez, Rincón, Limón, & Codon, 2004; Francesco Vinale et al., 2008; Alzate,
Mier, Afanador, Durango, & García, 2009).
Dentro de los biocontroladores fúngicos al género mayormente reportado
es Trichoderma, y utilizado como base de productos comerciales debido a sus
diversas cualidades para controlar Fusarium y otros fitopatógenos (Cubillos
Hinojosa, Páez Redondo, & Mejía Doria, 2011).
El género Trichoderma posee buenas cualidades para el control de
enfermedades en plantas causadas por patógenos fúngicos del suelo. Las
especies de Trichoderma actúan como hiperparásitos competitivos, que
producen metabolitos antifúngicos y enzimas hidrolíticas a los que se les
atribuyen los cambios estructurales a nivel celular, tales como vacuolización,
granulación, desintegración del citoplasma y lisis celular, encontrados en los
organismos con los que interactúa (M. Ezziyyani, Pérez, Ahmed, Requena, &
Candela, 2004; Margolles-Clark, Hayes, Harman, & Penttilä, 1996; Harman et al.,
2004). También se conoce que el género Trichoderma induce resistencia a la
planta, incrementando la respuesta de crecimiento y tolerancia al estrés,
ocasionada por factores adversos, como la presencia de fitopatógenos (Baker,
1988; Yedidia, Benhamou, & Chet, 1999; Gary E Harman, 2000; Howell, 2003;
Mohammed Ezziyyani, Requena, & Castillo, 2005).
12
Los hongos antagonistas del género Trichoderma tienen la capacidad de
actuar contra una amplia variedad de patógenos del suelo (Fusarium spp.,
Rhizoctonia spp., Pytium spp., Phytophthora spp. y Sclerotinia sp.) y del follaje
(Botrytis spp. y Peronospora sp.) (Hoyos-Carvajal, Chaparro, Abramsky, Chet, &
Orduz, 2008; Reyes, Martínez, & Infante, 2008; Tchameni et al., 2011;
Amézquita, Monsalve, & Rosero, 2010; Acebo-Guerrero, Hernández-Rodríguez,
Heydrich-Pérez, El Jaziri, & Hernández-Lauzardo, 2012; Martínez et al., 2013).
En Ecuador, se ha estudiado el efecto de cepas de T. asperellum en
condiciones de laboratorio sobre Sclerotium rolfsii (Capuz, 2009), Rhizoctonia
(Ronquillo, 2014), en condiciones de campo sobre el complejo de la marchitez
del tomate (Cevallos, 2010), melón (Lara, 2010); Borbor & Domìnguez, 2013);
también el efecto de T. koningiopsis sobre Mycosphaerella fijiensis (Osorio,
2010), donde se han observado resultados satisfactorios y con potencial para
desarrollar programas de manejo integrado.
2.8. Ciclo de vida de Moniliophthora roreri
En Ecuador, el factor crítico en el ciclo de la enfermedad es la marcada
estación seca y su importancia para determinar cómo M. roreri sobrevive entre
cosechas y la disponibilidad de fuentes de inóculo al inicio de la estación húmeda
(H C Evans, 1981).
Debido al movimiento producido por las labores de cosecha las esporas se
movilizan en el aire y bajo condiciones propicias de humedad y temperatura,
infectan constantemente los frutos que recién están formándose (Amores,
Agama, Suárez, Quiroz, & Motato, 2009). Según Jiménez (1986), para que ocurra
el proceso de infección se requiere de agua que provoque un ambiente saturado
de humedad en la epidermis del fruto.
13
Con el tiempo los síntomas aumentan en severidad y favorecen el
crecimiento del patógeno el cual, finalmente, después de varios meses de la
inoculación, es fácilmente observado en la superficie del fruto donde produce
anormalidades de formas geométricas y protuberancias o tumores (Evans,
Holmes, & Reid, 2003; Merchán Vargas, 1981).
Una vez infectado el fruto, treinta días después empiezan aparecer los
primeros síntomas iníciales de la enfermedad, a continuación se presentan unos
puntos aceitosos que se atrofian y empiezan a formarse manchas de color marrón
a los quince a veinte días, después de esta etapa empieza a formarse una capa
blanquecina que envuelve gradualmente todo el fruto y tres a cuatro días se llena
de esporas secas del hongo, tomando una coloración cremosa (Arevalo Gardini
& Zúñiga Cernades, 2004).
El patógeno infecta a frutos de cacao en cualquier estado de desarrollo;
para la germinación e infección exitosa, las conidias requieren de agua y un
ambiente con condiciones favorables. La dispersión y liberación natural de las
esporas, se efectúa libremente dentro de la plantación, lo cual es ocasionada por
los insectos, lluvias, vientos aves y especialmente cuando el hombre retira los
frutos esporulados en los árboles; para la formación de un abundante estroma o
núcleo externo Aranzazu, 1992 citado por M. Soberanis & Isela, 2009).
2.9. Control biológico del M. roreri
Se basa en la implementación de organismos vivos (microorganismos)
como herramienta base en la erradicación o reducción del inóculo de un
patógeno. Se emplean organismos antagonistas nativos para la inhibición del
crecimiento del patógeno (J. Suárez & Aranzazu, 2010).
La búsqueda de microorganismos antagonistas para el control biológico de
patógenos en cultivos de importancia económica ha despertado especial interés
debido a sus potencialidades y a la gravedad de los impactos ecológicos
14
causados por la constante y creciente aplicación de agroquímicos en los
agroecosistemas (Acebo-Guerrero, Hernández-Rodríguez, Heydrich-Pérez, El
Jaziri, & Hernández-Lauzardo, 2012; Contreras & Riaño, 2013).
Debido al ciclo de vida de M. roreri, Soberanis et al., (1999) recomendaron
la remoción semanal de mazorcas infectadas por este patógeno en el Perú.
Basados en datos históricos, Leach, Mumford, & Krauss (2002), propusieron un
aumentó en la frecuencia de remoción de mazorcas infectadas por M. roreri, con
intervalos mensuales a semanales, y con ello un aumento de rendimientos que
no solamente pagaría la mano de obra adicional, sino también mejoraría los
ingresos del productor bajo las condiciones socioeconómicas de Talamanca.
En Colombia, los resultados obtenidos en prueba de antagonismo in vitro,
fue observado una inhibición en el crecimiento de M. roreri de un 95% frente a la
cepa de Trichoderma sp. en otras investigaciones en diferentes localidades se ha
reportado el efecto de este antagonista, al respecto en Zulia, pudiendo ser un
posible controlador biológico para la moniliasis, entre tanto la cepa Trichoderma
sp., de Iscalá fue del 70%, entre tanto Trichoderma sp. Cubana fue 55%. Estos
valores de inhibición por encima del 50%, los convierten en posibles
controladores biológicos (L. Suárez, 2006).
Algunas cepas de Trichoderma producen Trichodermina, dermadina,
suzukacilina, viridina, alameticina, richotoxina, metabolitos que son responsables
del mecanismo antagónico (F Vinale et al., 2006).
15
III. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. Ubicación del ensayo
La investigación se realizó en el laboratorio de Protección Vegetal de la
Estación Experimental Central Amazónica (EECA) del Instituto Nacional de
Investigaciones Agropecuarias (INIAP), ubicado en la parroquia San Carlos,
Cantón Joya de los Sachas, Provincia de Orellana, a 280 msnm, con 0°21´32” de
latitud Sur y 76°52´40” de longitud Occidental.
3.2. Factores estudiados
Aislados de Trichoderma (18 cepas nativas de la Amazonía).
Medios de cultivos: potato dextrosa agar (PDA), agar harina de maíz (CMD)
y Spezieller nährstoffärmer agar (SNA).
3.3. Materiales usados en laboratorio
Cajas petri, agua destilada, aislados, balanza, matraz, agitador, espátula,
papel aluminio, microscopio, placa porta y cubre objeto, asa, muestras, ácido
láctico, hidróxido de potasio (KOH), hipoclorito de sodio (NaClO), asa de palatino,
fosforera, marcador permanente, mechero, tijera, parafilm.
3.4. Tratamientos
Los tratamientos estuvieron constituidos por 12 aislados de Trichoderma
procedentes de la provincia de Napo, cinco de Orellana, una de la provincia de
Sucumbíos, y comparados con una cepa nativa del Guayas (T. asperellum) y una
comercial (Tricomix), los mismos que se describen a continuación:
16
Cuadro 1. Aislados de Trichoderma
No. Origen de los aislados de Trichoderma
1 Napo Tena 01
2 Napo Tena 02
3 Napo Tena 03
4 Napo Tena 04
5 Napo Tena 05
6 Napo Tena 06
7 Napo Tena 07
8 Napo Tena 08
9 Napo Tena 09
10 Napo Tena 10
11 Napo Tena 11
12 Napo Tena 12
13 Orellana Sacha 01
14 Orellana Sacha 02
15 Orellana Sacha 03
16 Orellana Sacha 04
17 Orellana Sacha 05
18 Sucumbíos Sushufindi 01
19 T. asperellum G-08 Iniap-EELS
20 Tricomix producto comercial
3.5. Diseño experimental
Se utilizó el diseño completamente aleatorizado (DCA), con 5 unidades
experimentales. Los valores fueron transformados a logaritmo de 10 para mejorar
su normalidad para el análisis estadístico.
3.6. Análisis de varianza y funcional
El esquema del análisis de varianza se observa en el Cuadro 2.
17
Para las comparaciones de las medias se utilizó la prueba de Scott & Knott
Alfa=0,05
3.7. Manejo del experimento
3.7.1. Reactivación de aislados de Trichoderma spp., de la colección
de cepas del Departamento de Protección Vegetal del EECA
Los aislados de Trichoderma de la colección de hongos biocontroladores
del laboratorio del Departamento Nacional de Protección Vegetal (DNPV) de la
EECA, conservados en silica gel, fueron reactivados en tres medios de cultivos
(ya descritos).
Las cepas conservadas en tubos de ensayo con silica gel, se mantienen
viables de cuatro a cinco años (Nakasone, Peterson, & Jong, 2004). Para el
proceso de rehabilitación de dichos aislados se utilizó la técnica de Góral (1973),
que consiste en descongelar y remover al hongo conservado en silica gel, para
ello se usó una espátula estéril y se depositó dicho contenido en un matraz de
500 ml, que previamente contenía 100 ml de medio PDA + ácido láctico, luego se
incubaron a 27 ºC hasta que se evidenció el crecimiento del hongo.
Con el crecimiento fungoso se preparó una suspensión de propágulos a
partir de los matraces con el hongo esporulado agregando 20 mL de ADE (agua
Cuadro 2. Esquema del análisis de varianza
Fuente de variación G.l.
Total (rt – 1) 99
Tratamientos (t-1) 19
Repeticiones (r – 1) 4
Error experimental (t -1) (r – 1) 76
18
destilada estéril), de ella se tomó 3 mL para sembrarlos en cajas Petri con medio
potato dextrosa agar (PDA).
3.7.2. Identificación morfológica de especies de Trichoderma, aisladas
en sistemas de cacao en la zona centro - norte de la Amazonía
Ecuatoriana
Los estudios morfológicos de las colonias de Trichoderma se realizó en los
tres medios de cultivo: harina de maíz dextrosa agar (CMD) medio sintético bajo
en nutrientes (SNA) (Nirenberg, 1976), potato dextrosa agar (PDA), los mismos
que fueron incubados durante cinco días sobre una mesa de trabajo bajo
condiciones naturales de luz y oscuridad a 29 °C (G J Samuels et al., 2000).
Para realizar la identificación morfológica de las especies
de Hypocrea/Trichoderma se utilizó la clave interactiva de (Gary J. Samuels
et al., 2006) y ésta se corroboró con las descripciones hechas por (Chaverri,
Castlebury, Overton, & Samuels, 2003), (Gary J Samuels et al., 2006) y (G J
Samuels, Lieckfeldt, & Nirenberg, 1999), (Gams & Bissett, 2002), (Park, Bae, &
Yu, 2006).
Para la identificación de los aislados, se agruparon de acuerdo a las
características morfológicas macroscópicas de las colonias, de cada uno se
seleccionó una colonia y se observaron al microscopio sus estructuras
reproductivas.
3.7.3. Caracterización microscópica cepas de Trichoderma spp.,
aisladas en sistemas de cacao en la zona centro - norte de la
Amazonía Ecuatoriana
La caracterización microscópica se realizó mediante laminillas
semipermanentes elaboradas con KOH (3%) para esto se empleó un microscopio
19
compuesto de contraste (Motic Ba 310). Se tomó muestras de las cepas de
Trichoderma spp., de cinco días de crecimiento con un asa se fijó , se adiciono
azul de metileno y se realizarán las observaciones y mediciones en el
microscopio con lentes de 40X y 100X (G J Samuels et al., 2000).
3.8. Métodos de evaluación y manejo especìfico del experimento
3.8.1. Métodos de evaluación Para el objetivo dos se consideraron las características morfoculturales de
las cepas de Trichoderma spp. aisladas en sistemas de cacao en la zona centro
norte de la Amazonía Ecuatoriana, para ello se procedió de la siguiente manera:
Crecimiento de la colonia El crecimiento radial de las colonias de las cepas de Trichoderma fueron
evaluadas en los medios de cultivo PDA, CMD y SNA, para ello se midió con una
regla milimetrada cada 24 horas, hasta que el micelio cubrió la caja Petri de 90
mm (Lieckfeldt, et al., 1998).
Características macroscópicas En la caracterización macroscópica de los aislamientos de Trichoderma
spp., se evaluó las características de las colonias tales como color, (Kornerup &
Wanscher, 1978) olor, producción de pústulas, micelio aéreo y pigmentación del
medio formación de anillos concéntricos forma de micelio, después de haber
completado su crecimiento en caja Petri a 28 ºC (Acurio & España, 2017).
Características microscópicas En el microscopio se observó y medió 24 unidades con el objetivo de 40X
las siguientes estructuras: longitud, ancho de conidias, clamidospora y fialides.
Para la identificación a nivel de especie se utilizó la clave taxonómica
20
especializada para Trichoderma (Bissett, 1991; Chaverri & Samuels, 2003; Acurio
& España, 2017).
Para determinar el potencial antagonista de cepas de Trichoderma spp.,
sobre Moniliophthora roreri en laboratorio, se utilizaron pruebas cuantitativa y
cualitativa.
En la prueba cuantitativa se evaluó el potencial inhibitorio micelial, para ello
se calcularon los valores del porcentaje de inhibición del crecimiento micelial
(PICM) según la fórmula propuesta por Liliana Suárez & Cabrales, 2008).
PICM=𝑀𝑏−𝑀𝑎
𝑀𝑏∗ 100 𝑀𝑏
Donde:
Ma = Micelio del fitopatógeno inhibido;
Mb= Micelio del fitopatógeno con crecimiento libre
En la prueba cualitativa se compararon las cepas teniendo en cuenta la
capacidad antagónica, de acuerdo con la escala de notas Bell, et al., (1982) que
se especifica en el Cuadro 3.
Cuadro 3. Escala de notas cualitativas de Bell et al.
Nivel de antagonismo
Cualificación
1 El antagonista crece totalmente sobre el fitopatógeno
2 El antagonista crece sobre las 2/3 partes sobre la caja de cultivo, inhibiendo el crecimiento y desarrollo del fitopatógeno
3 El antagonista y el fitopatógeno ocupan espacios iguales en la caja de cultivo, observándose que no hay competencia entre ellos
4 El fitopatógeno crece sobre las 2/3 partes de la caja de cultivo inhibiendo el crecimiento y desarrollo del antagonista
5 El fitopatógeno crece totalmente sobre el antagonista
21
3.9. Confrontación de aislados de Trichoderma frente a
Moniliophthora roreri
Con las colonias de los aislados de Trichoderma se procedió a confrontar
frente a M. roreri, para ello en una caja Petri que previamente contenía medio de
cultivo PDA más extracto de cacao, se colocó equidistante un disco de 5 mm de
ambos microorganismos, se incubaron a temperatura ambiente durante cinco
días. Una vez que se obtuvieron los crecimientos se procedió a evaluar el
crecimiento radial de ambos microorganismos.
22
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1. Identificación morfológica especies de Trichoderma, aisladas en
sistemas de cacao en la zona centro - norte de la Amazonía
Ecuatoriana
La identificación de las especies de los aislados de Trichoderma, se basó
en las características morfológicas macroscópicas de las colonias. Se
identificaron cinco especies: Trichoderma asperellum Samuels, Lieckf. &
Nirenberg, Trichoderma viride Pers., Trichoderma harzianum Rifai, Trichoderma
reesei Simmons, Trichoderma koningiopsis.
La especie T. asperellum fue identificada en los aislados de Napo Tena 01,
Napo Tena 3, Napo Tena 7, Napo Tena 8 y Orellana Sacha 04, cuyas
características macroscópicas fueron de dos a tres anillos concéntricos bien
definidos con micelio blanco y verde cuando esporuló (conidias). Los conidios
fueron de forma ovoide, también exuberantes clamidosporas, su fiàlides
septadas, característica de esta especie (Figura 1), características que se
relacionan con lo reportado por Druzhinina et al., (2011).
Por otra parte, INIAP en la Estación Experimental Litoral Sur, ha identificado
a T. asperellum, en muestras de suelo de campos cultivados con hortalizas en
las provincias de Guayas y Santa Elena; siendo las cepas SE-034 y G-008 las
mas eficientes en condiciones de laboratorio contra Sclerotium rolfsii en los
cultivos de tomate, pimiento y sandía (Capuz, 2009).
La especie T. aureoviride fue identificada en los aislados de Napo Tena 02,
Napo Tena 11 y Orellana Sacha 03 (Figura 2). La cepa Napo Tena 02 presentó
pigmentos amarillentos, al respecto se ha reportado que éstos son comunes en
muchas especies, pero no muy distintivos, esta especie muestra cristales
característicos para Trichoderma aureoviride (Gary J. Samuels, 1996).
23
Cepas Apariencia de Colonia
Conidias Clamidosporas Fialides
Napo Tena 01 T. asperellum
Napo Tena 03 T. asperellum
Napo Tena 07 T. asperellum
Napo Tena 08 T. asperellum
Orellana Sacha 04
T. asperellum
Figura 1. Apariencia macroscópica y microscópica de T.asperellum
Fuente: Autor (2018)
24
Figura 2. Apariencia macroscópica y microscópica de T. aureoviride
Cepas Apariencia de colonia
Conidias Clamidosporas Fialides
Napo Tena 02 T. aureoviride
Napo Tena 11 T. aureoviride
Orellana Sacha 03
T. aureoviride
Fuente: Autor (2018)
25
La especie T. harzianum fue identificada de los aislados Napo Tena 04,
Napo Tena 05, Napo Tena 09, Napo Tena 12 y Sucumbíos Sushufindi 01 (Figura
3), éstas presentaron micelio de color blanco haciéndose más oscuro en el
centro, casualmente desarrollando un color blanco verdoso, además, se produjo
la formación de anillos concéntricos de dos a tres anillos desarrollando un
crecimiento rápido. Los conidios son ovalados y redondos, las fialides tenían
forma de matraz, también presentaron exuberantes clamidosporas.
Características que se relaciona con lo reportado por Gams, Bissett, & Malik,
(1998).
La especie T. koningiopsis fue identificada en los aislados Orellana Sacha
01, Orellana Sacha 02 y Orellana Sacha 05 (Figura 4), el micelio presentò textura
algodonoso, color blanco, sin formación de anillos concéntricos, las conidias
fueron subglobosos de color verde, las fialides de forma flagiliformes, también
presentaron exuberantes clamidosporas globosas a subglobosas.
Características que se relacionan con lo reportado por (Bissett, 1991b).
La especie T. reesei fue identificada de los aislados Napo Tena 06 y Napo
Tena 10 (Figura 5), presentò el micelio algodonoso con formación de anillos
concéntricos, blanco el micelio, verde las conidias. Los conidios tuvieron forma
elipsoidal.
También se incluyen las características de las dos cepas comparativas, las
mismas que se muestran en las (Figuras 6 y 7). Los crecimientos de T.
asperellum cepa G08- INIAP – EELS, corresponden a aislados de la provincia del
guayas.
La identificación de las especies Trichoderma asperellum, T. harzianum, T.
viride T. reesei y T. koningiopsis, a traves de claves se relaciona con los trabajos
de (Arias & Piñeros, 2008) quienes utilizaron claves taxonómicas, teniendo en
cuenta las características macroscópicas y microscópicas; identificaron varios
26
géneros y especies de Trichoderma spp., Aspergillus, Cladosporium, Curvularia
y Penicilium.
27
Cepas Apariencia de colonia
Conidias Clamidosporas Fialides
Napo Tena 04 T. harzianum
Napo Tena 05 T. harzianum
Napo Tena 09 T. harzianum
Napo Tena 12 T.harzianum
Sucumbíos Sushufindi 01 T. harzianum
Figura 3. Apariencia macroscópica y microscópica de T. harzianum
Fuente: Autor (2018)
28
Cepas Apariencia de colonia
Conidias Clamidosporas Fialides
Napo Tena 06
T. reesei
Napo Tena 10
T. reesei
Figura 4. Apariencia macroscópica y microscópica de T.reesei
Fuente: Autor (2018)
29
Cepas Apariencia de colonia
Conidias Clamidosporas Fialides
Orellana Sacha 01
T. koningiopsis
Orellana Sacha 02
T. koningiopsis
Orellana Sacha 05
T. koningiopsis
Figura 5. Apariencia macroscópica y microscópica de T.koningiopsis
Fuente: Autor (2018)
30
Cepas Apariencia de
colonia Conidias Clamidosporas Fialides
Tricomix producto comercial
Cepas Apariencia de colonia
Conidias Clamidosporas Fialides
T. asperellum Iniap-EELS
Figura 6. Apariencia macroscópica y microscópica de T. asperellum INIAP-EEL
Figura 7. Apariencia macroscópica y microscópica de Tricomix producto comercial
31
4.2. Caracterización macroscópica cepas de Trichoderma spp.,
aisladas en sistemas de cacao en la zona centro - norte de la
Amazonía Ecuatoriana
4.2.1. Crecimiento radial
El crecimiento radial de los aislados de Trichoderma no presentaron
diferencia significativa entre sí. En el medio de cultivo PDA los aislados Napo
Tena 11 y Orellana Sacha 03 fueron los de mayor valor (Figura 8).
El análisis de los medios de cultivo mostró diferencias significativas entre
ellos (Figura 9). El medio de cultivo papa dextrosa agar fue diferente de CMD Y
SNA, durante los tres días de evaluación, fue el de mayor crecimiento de los
aislados de Trichoderma.
Cabe destacar que el medio de cultivo PDA a las 72 horas en algunas de
los aislados completaron su crecimiento mientras que los demás alcanzaron su
desarrollo a las 120 horas (Cuadro 1 Anexo).
El medio de cultivo CMD los asilados tuvieron un lento crecimiento llegando
a su crecimiento a las 168 horas, mientras que algunos tratamientos fueron a las
216 horas. Por su parte, en el medio de cultivo SNA el crecimiento fue menor,
posiblemente se deba a que éste es un medio bajo en nutrientes, pero que se
usó porque facilita la observación de estructuras que permiten la caracterización
de las especies.
32
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
Cre
cim
ien
to r
adia
l en
mm
/día
CMD SNA PDA
Figura 6. Crecimiento radial (mm/día) de aislados de Trichoderma en tres medios de cultivo. INIAP, EECA.
2019
33
4.3. Caracterización morfo cultural de cepas de Trichoderma spp.
La caracterización morfo-cultural basada en largo y ancho de las fiàlides,
conidias y clamidosporas, mediante un test estadístico a las 72 horas después
de haber repicado el hongo en diferentes medios de cultivos se obtuvo que hubo
diferencia entre los diferentes medios (Cuadro 4).
El promedio general de la longitud de la fiàlide fue igual estadísticamente
en los medios de cultivo CMD, SNA y PDA; el ancho de fiálide fue superior en el
medio CMD y estadísticamente igual al medio SNA; el largo, ancho de conidias y
clamidosporas fueron iguales estadísticamente en los medios CMD y SNA y
diferente de PDA (Cuadro 4).
PDA CMD SNA
Día 1 Día 2 Día 30,0
76,0
152,0
228,0
304,0
380,0
a
a
a
a
b
b
a
c
c
a
a
a
a
b
b
a
c
c
PDA CMD SNA
Cre
cim
ien
to d
iari
o d
e T
rich
od
erm
asp
. e
n C
2
Dias de Evaluacion
Figura 7. Promedio de crecimiento de Trichoderma en tres medios de
cultivos
34
Cuadro 4. Respuestas de Trichoderma spp a tres medios de cultivos sobre variables morfológicas
Variables Medios de cultivo1/
CMD SNA PDA C.V.(%)
Largo de Fiàlides 9,47 a2/ 9,33 a 9,31 a 1,94
Ancho de Fiàlides 2,78 b 2,64 b 2,51 c 1,58
Largo de conidias 3,41 b 3,35 b 2,77 c 1,42
Ancho de conidias 2,79 b 2,70 b 2,30 c 1,59 Largo de clamidosporas
8,70 a 8,69 a 7,65 b 1,33
Ancho de clamidosporas
7,59 a 7,59 a 6,45 b 1,51
1/ Medidas en micras
2/ Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)
4.4. Características morfológicas de los aislados de Trichoderma
Potato Dextrosa Agar (PDA)
En la variable largo de fiàlides fue superior en el tratamiento Orellana Sacha
01 con 1659.7 µm, la de menor longitud fue la cepa Napo Tena 04 con 543,9 µm
(Figura 10).
0200400600800
10001200140016001800
Larg
o d
e F
ialid
e (
mic
ras)
Tratamientos
Figura 8. Promedio de largo de fiálides en medio de cultivo PDA
35
El ancho de fiálides fue superior en el aislado T. asperellum EELS con 319.6
µm y de menor valor fue Napo Tena 02 con 195.35 µm (Figura 11).
µm
El largo de conidias fue superior en los aislados Napo tena 07 y NT 12 con
408,3 y 378.8 µm en su orden; la de menor valor fue Sucumbíos Sushufindi 01
con 191 µm (Figura 12).
050
100150200250300350
An
cho
de
fia
lide
Tratamientos
Figura 9. Promedio de ancho de fiálides en medio de cultivo PDA
050
100150200250300350400450
Larg
o d
e C
on
idia
Tratamientos
Figura 10. Promedio de largo de conidias en medio PDA
36
El ancho de conidias fue superior en el tratamiento testigo comercial
seguido de Napo Tena 07 con 331.9 y 317.5 µm en su orden; la de menor valor
fue Napo Tena 10 con 162,9 µm (Figura 13).
El largo de la clamidospora fue superior en el aislado Napo Tena 08 con
1397.2 µm, la de menor valor fue Napo Tena 03 con 603.4 µm (Figura 14).
050
100150200250300350
An
cho
de
Co
nid
ia
Tratamientos
Figura 11. Promedio ancho de conidias en medio de cultivo PDA
0200400600800
1000120014001600
Larg
o d
e C
lam
ido
spo
ra
Tratamientos
Figura 12. Promedio largo de clamidospora en medio de cultivo PDA
37
El ancho de la clamidospora fue mayor en el aislado Napo Tena 08 con
1275 µm, el de menor valor fue Napo Tena 10 con 504.2 µm (Figura 15).
Agar Harina de Maíz (CMD)
En la variable largo de fiálides fue superior en el tratamiento Orellana Sacha
05 y Orellana sacha 02 con 1292.3 y 1256.8 µm en su orden; la de menor longitud
fue la cepa Napo Tena 04 con 679.8 µm (Figura 16).
0200400600800
100012001400
An
cho
de
Cla
mid
osp
ora
Tratamientos
Figura 13. Promedio de ancho de clamidospora en medio de cultivo PDA
0200400600800
100012001400
Larg
o d
e F
ialid
e
Tratamientos
Figura 14. Promedio largo de fiálides en medio de cultivo CMD
38
En la variable ancho de fiálides fue superior en el tratamiento Napo Tena 07
con 375.8 µm, la de menor longitud fue la cepa Orellana Sacha 05 con 249.9 µm
(Figura 17).
En la variable largo de conidias fue superior en el tratamiento Orellana
Sacha 03 y Napo Tena 07 con 459.9 y 439.8 µm en su orden; la de menor longitud
fue la cepa Napo Tena 08 con 269.9 µm (Figura 18).
050
100150200250300350400
An
cho
de
Fia
lide
Tratamientos
Figura 15. Promedio ancho de fiálides en medio de cultivo CMD
050
100150200250300350400450500
Larg
o d
e C
on
idia
Tratamientos
Figura 16. Promedio largo de conidias en el medio de cultivo CMD
39
En la variable ancho de conidias fue superior en el tratamiento T. asperellum
EELS y Napo Tena 07 con 337.3 y 334.6 µm en su orden; la de menor longitud
fue la cepa Napo Tena 08 con 222.1 µm (Figura 19).
En la variable largo de clamidosporas fue superior en el tratamiento Orellana
Sacha 02 1486.5 µm, la de menor longitud fue la cepa Sucumbíos Sushufindi con
627.5 µm (Figura 20).
050
100150200250300350400
An
cho
de
Co
nid
ia
Tratamientos
Figura 17. Promedio ancho de conidias en el medio de cultivo CMD
0200400600800
1000120014001600
Larg
o d
e C
lam
ido
spo
ra
Tratamientos
Figura 18. Promedio largo de clamidosporas en el medio de cultivo CMD
40
En la variable ancho de clamidosporas fue superior en el tratamiento
Orellana Sacha 02 1319.8 µm, la de menor longitud fue la cepa Napo Tena 12
con 554.4 µm (Figura 21).
Spezieller Nährstoffärmer Agar (SNA)
En la variable largo de fiálides fue superior en el tratamiento Orellana Sacha
02 1306.9 µm, la de menor longitud fue la cepa Napo Tena 05 con 669.8 µm
(Figura 22).
0200400600800
100012001400
An
cho
de
Cla
mid
osp
ora
Tratamientos
Figura 19. Promedio ancho de clamidosporas en el medio de cultivo CMD
0200400600800
100012001400
Larg
o d
e F
ialid
e
Tratamientos
Figura 20. Promedio largo de fiálides en el medio de cultivo SNA
41
En la variable ancho de fiálides fue superior en el tratamiento Napo Tena 07
con 330.9 µm, la de menor longitud fue la cepa Orellana Sacha 01 con 229.8 µm
(Figura 23).
En la variable largo de conidias fue superior en el tratamiento Napo Tena
07 con 422.1 µm, la de menor longitud fue la cepa Sucumbíos Sushufindi 01 con
245.5 µm (Figura 24).
050
100150200250300350
An
cho
de
Fia
lide
Tratamientos
Figura 21. Promedio del ancho de fiàlides en el medio de cultivo SNA
050
100150200250300350400450
Larg
o d
e C
olo
nia
Tratamientos
Figura 22. Promedio largo de conidias en el medio de cultivo SNA
42
En la variable ancho de conidias fue superior en el tratamiento Orellana
Sacha 04 con 371.7 µm, la de menor longitud fue la cepa Napo Tena 08 con
206.1 µm (Figura 25).
En la variable largo de clamidosporas fue superior en el tratamiento Orellana
Sacha 02 con 1471.2 µm, la de menor longitud fue la cepa Sucumbíos Sushufindi
01 con 623.6 µm (Figura 26).
050
100150200250300350400
An
cho
de
Co
nid
ias
Tratamientos
Figura 23. Promedio ancho de conidias en el medio de cultivo SNA
0200400600800
1000120014001600
Larg
o d
e C
lam
ido
spo
ra
Tratamientos
Figura 24. Promedio largo de clamidosporas en el medio de cultivo SNA
43
En la variable ancho de clamidosporas fue superior en el tratamiento
Orellana Sacha 02 con 1308.4 µm, la de menor longitud fue la cepa Napo Tena
12 con 555.8 µm (Figura 27).
En la variable crecimiento de Trichoderma en los medios de cultivos PDA,
CMD y SNA fueron diferentes entre sí. Esto se relaciona con los resultados
obtenidos por Burgos, (2017), indica que el medio de mayor crecimiento del
hongo es el PDA y SNA de menor crecimiento.
4.5. Unidad Formadora de Colonia
El tratamiento que obtuvo diferencia estadística y con más alto promedio de
colonias fue Napo Tena 06 con 2,949 UFC (Figura 28).
0200400600800
100012001400
An
cho
de
Cla
mid
osp
ora
Tratamientos
Figura 25. Promedio ancho de clamidosporas en el medio de cultivo SNA
44
4.6. Potencial antagónico de cepas de Trichoderma spp. frente a
Moniliophthora roreri en el laboratorio
En la Figura 29, el test de confrontación de los aislados de Trichoderma
frente a M. roreri, mostraron diferencia estadística, obteniéndose los mejores
resultados sobre el patógeno fue el tratamiento Napo Tena – 12, demostrándose
su potencial antagónico a nivel de laboratorio.
00,5
11,5
22,5
33,5
Pro
me
dio
de
Un
idad
es
Form
ado
ras
de
Co
lon
ia
Tratamientos
Figura 26. Promedio ancho de clamidosporas en el medio de cultivo SNA
01020304050607080
Co
nfr
on
taci
on
Mo
nili
a -
Trichoderma
Tratamientos
Figura 27. Potencial antagonista de aislados de Trichoderma frente a M. roreri
45
V. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
De acuerdo a los resultados se concluye que:
Se identificarón cinco especies de Trichoderma: T. asperellum, T.
aureoviride, T. harzianum, T. reesei y T. koningiopsis.
El mayor crecimiento radial de los aislados de Trichoderma se
obtuvieron en el medio de cultivo potato dextrosa agar; los medios
CMD y SNA son los más eficientes para caracterizar las
estructuras de Trichoderma.
El aislado Napo Tena – 12, tuvo el mayor efecto antagónico frente
a Moniliophthora roreri en condiciones de laboratorio.
En base a las conclusiones se recomienda:
Continuar con la búsqueda de microorganismos antagonistas de
Moniliophthora roreri.
Evaluar dosis y frecuencias de los aislados de Trichoderma en
condiciones de campo para determinar el efecto antagonista frente
a Moniliophthora roreri.
Realizar pruebas de eficacia en condiciones de campo con los
mejores tratamientos de los estudios de laboratorio.
46
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58
ANEXOS
59
Cuadro 1 A. Crecimiento radial de cepas de Trichoderma en tres medios de cultivo durante 10 días
Tratamientos
Medios de cultivo1/
CMD SNA PDA
24 48 72 96 120 144 168 192 216 24 48 72 96 120 168 192 216 168 24 48 72 96 120
Napo Tena 01
2,2 2,8 3,2 3,4 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 1,6 2,2 2,7 2,9 3,2 3,3 3,5 3,5 3,5 1,9 2,8 3,2 3,4 3,6
Napo Tena 02
2,2 2,8 3,0 3,4 3,4 3,6 3,4 3,6 3,4 1,7 2,4 2,7 2,9 3,1 3,3 3,5 3,5 3,5 2,4 3,2 3,5 3,5 3,5
Napo Tena 03
2,4 3,0 3,7 3,2 3,7 3,2 3,7 3,2 3,7 1,7 2,4 2,9 3,2 3,2 3,4 3,4 3,5 3,4 1,8 2,9 3,7 3,0 3,7
Napo Tena 04
2,2 2,6 3,7 3,2 3,7 3,2 3,7 3,2 3,7 1,7 2,6 2,8 3,4 3,2 3,5 3,4 3,6 3,4 2,0 3,1 3,6 3,3 3,6
Napo Tena 05
2,4 3,1 3,0 3,3 3,3 3,3 3,6 3,4 3,6 1,7 2,7 2,9 3,3 3,1 3,5 3,4 3,6 3,4 2,3 3,3 3,6 3,3 3,6
Napo Tena 06
2,6 3,3 3,5 3,4 3,5 3,4 3,5 3,4 3,5 1,7 2,7 2,8 3,2 3,3 3,5 3,5 3,5 3,5 2,5 3,2 3,6 3,4 3,6
Napo Tena 07
2,4 2,9 3,6 3,3 3,6 3,3 3,6 3,3 3,6 1,6 2,7 2,8 2,6 3,0 3,1 3,3 3,4 3,6 1,9 3,0 3,6 3,3 3,6
Napo Tena 08
2,2 2,9 3,6 3,4 3,6 3,4 3,6 3,4 3,6 1,7 3,0 3,0 3,3 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 1,9 3,2 3,6 3,3 3,6
Napo Tena 09
2,2 2,4 3,5 3,4 3,5 3,4 3,5 3,4 3,5 1,7 2,7 2,9 3,0 3,2 3,3 3,5 3,5 3,5 1,9 3,1 3,5 3,5 3,5
Napo Tena 10
2,3 2,8 3,4 3,2 3,6 3,4 3,6 3,4 3,6 1,8 2,9 3,0 2,9 3,4 3,2 3,6 3,3 3,6 2,2 3,3 3,6 3,3 3,6
Napo Tena 11
2,1 2,6 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 1,7 2,9 3,0 3,5 3,4 3,6 3,4 3,6 3,4 2,6 3,3 3,6 3,4 3,6
Napo Tena 12
1,6 2,3 3,2 3,3 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 1,7 2,2 2,5 3,0 3,0 3,3 3,4 3,5 3,5 1,6 2,4 3,0 3,3 3,7
60
Orellana Sacha 01
2,3 3,0 2,4 2,8 2,8 3,2 3,2 3,4 3,5 1,7 3,0 3,1 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 1,7 2,9 3,5 3,5 3,5
Orellana Sacha 02
2,3 2,8 3,2 3,5 3,4 3,5 3,4 3,6 3,4 1,7 2,5 2,8 3,4 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 1,9 2,9 3,3 3,6 3,3
Orellana Sacha 03
2,1 2,8 3,0 3,2 3,3 3,5 3,5 3,5 3,5 1,7 2,9 3,0 3,3 3,4 3,5 3,5 3,5 3,5 2,6 3,3 3,6 3,3 3,6
Orellana Sacha 04
2,2 2,8 2,9 3,2 3,3 3,5 3,5 3,5 3,5 1,7 2,3 2,6 2,9 3,2 3,3 3,5 3,5 3,5 1,8 3,0 3,6 3,3 3,6
Orellana Sacha 05
2,2 2,9 3,1 3,3 3,4 3,5 3,4 3,5 3,4 1,7 2,6 2,8 3,2 3,4 3,5 3,5 3,5 3,5 2,0 3,1 3,5 3,5 3,5
Sucumbíos Sushufindi 01
2,1 2,8 3,2 3,4 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 1,7 2,5 2,7 3,0 3,1 3,3 3,4 3,6 3,4 2,4 3,3 3,6 3,4 3,6
T. Asperellum Iniap-EELS
2,1 2,8 3,0 3,2 3,1 3,4 3,4 3,5 3,4 1,8 2,3 2,6 2,9 3,1 3,3 3,4 3,5 3,5 2,2 3,0 3,4 3,5 3,4
Tricomix producto comercial
2,2 2,6 3,1 3,4 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 2,0 2,9 3,0 3,5 3,4 3,6 3,4 3,6 3,4 1,8 2,8 3,3 3,3 3,6
C.V (%) 7,3 8,1 3,2 3,9 2,9 3,1 1,8 2,9 1,8 23 3,9 2,9 2,4 1,9 1,5 1,4 1,2 1,3 7,8 3,5 2,5 3,8 2,2
61
Cuadro 2 A. Características de los aislados de Trichoderma en medio de cultivo PDA
Tratamientos Variables medidas en micras
Largo Fialides Ancho Fialides Largo
Conidias Ancho
Conidias Largo
Clamidosporas Ancho
Clamidosporas
NT – 01 2,98 c 2,38 c 2,47 c 2,42 c 2,98 b 2,91 b
NT – 02 2,93 c 2,29 e 2,31 e 2,26 f 2,86 c 2,78 c
NT – 03 2,82 d 2,29 e 2,32 e 2,29 e 2,78 d 2,72 d
NT – 04 2,87 d 2,42 b 2,28 e 2,24 f 2,81 d 2,77 c
SS – 01 2,72 e 2,41 b 2,30 e 2,29 e 2,83 c 2,77 c
NT – 05 2,88 d 2,38 c 2,31 e 2,27 f 2,78 d 2,77 c
NT – 06 2,90 d 2,39 c 2,34 e 2,31 e 2,92 b 2,84 b
NT – 07 3,01 c 2,43 b 2,61 a 2,50 a 2,89 c 2,82 c
NT – 08 2,81 d 2,34 d 2,36 d 2,25 f 3,08 a 3,04 a
NT – 09 2,95 c 2,37 c 2,39 d 2,33 e 2,80 d 2,70 d
NT – 10 2,72 e 2,31 e 2,31 e 2,21 g 2,77 d 2,70 d
NT – 11 2,97 c 2,33 d 2,32 e 2,21 g 2,79 d 2,72 d
NT – 12 2,88 d 2,42 b 2,58 a 2,45 b 2,79 d 2,75 c
OS – 01 3,16 a 2,30 e 2,53 b 2,35 d 2,84 c 2,76 c
OS – 02 3,13 a 2,37 c 2,52 b 2,34 d 2,82 d 2,75 c
OS – 03 3,01 c 2,42 b 2,56 a 2,31 e 2,88 c 2,76 c
OS – 04 3,08 b 2,41 b 2,49 c 2,39 c 2,87 c 2,75 c
OS – 05 3,07 b 2,39 c 2,52 b 2,39 c 2,84 c 2,78 c
Tricomix 2,99 c 2,48 a 2,57 a 2,52 a 2,94 b 2,87 b
T. Asperellum 0,03 b 2,50 a 2,49 c 2,40 c 2,97 b 2,91 b
C.V(%) 5,29 2,87 3,03 3,08 3,29 3,58 Signif. Estadist. ** ** ** ** ** **
62
Cuadro 3 A. Características de los aislados de Trichoderma en medio de cultivo CMD
Tratamientos Variables medidas en micras
Largo Fiàlides Ancho Fiàlides Largo
Conidias Ancho
Conidias Largo
Clamidosporas Ancho
Clamidosporas
NT – 01 2,92 d 2,42 c 2,47 g 2,42 c 2,96 c 2,91 c
NT – 02 2,92 d 2,44 b 2,54 d 2,47 b 2,88 d 2,83 d
NT – 03 2,95 c 2,47 b 2,43 g 2,38 d 2,84 e 2,80 d
NT – 04 2,83 e 2,46 b 2,45 g 2,42 c 2,84 e 2,78 e
SS – 01 2,91 d 2,43 c 2,49 f 2,43 c 2,79 f 2,76 e
NT – 05 2,82 e 2,46 b 2,45 g 2,41 c 2,88 d 2,84 d
NT – 06 2,96 c 2,46 b 2,46 g 2,42 c 2,94 c 2,89 c
NT – 07 3,02 b 2,57 a 2,64 a 2,52 a 3,03 b 2,88 c
NT – 08 2,93 d 2,44 b 2,43 g 2,35 e 2,89 d 2,83 d
NT – 09 2,88 d 2,45 b 2,49 f 2,42 c 2,85 e 2,82 d
NT – 10 2,97 c 2,45 b 2,45 g 2,41 c 2,88 d 2,82 d
NT – 11 2,99 c 2,47 b 2,50 f 2,42 c 2,86 d 2,92 d
NT – 12 2,83 e 2,43 c 2,57 c 2,40 c 2,81 f 2,74 e
OS – 01 3,05 b 2,42 c 2,58 c 2,43 c 3,04 b 2,96 b
OS – 02 3,09 a 2,40 c 2,62 b 2,50 a 3,16 a 3,11 a
OS – 03 3,04 b 2,44 b 2,66 a 2,50 a 2,98 c 2,92 c
OS – 04 2,98 c 2,47 b 2,52 e 2,46 b 2,93 d 2,85 d
OS – 05 3,10 a 2,39 c 2,55 d 2,43 c 2,99 c 2,94 b
Tricomix 2,97 c 2,46 b 2,59 c 2,48 b 3,02 b 2,96 b
T. Asperellum 3,02 b 2,46 b 2,62 b 2,53 a 2,96 c 2,90 c
C.V (%) 2,99 2,38 1,84 1,70 2,63 2,73
Signif. Estadist. ** ** ** ** ** **
63
Cuadro 4 A. Características de los aislados de Trichoderma en medio de cultivo SNA
Tratamientos Variables medidas en micras
Largo Fiàlides Ancho Fiàlides Largo
Conidias Ancho
Conidias Largo
Clamidosporas Ancho
Clamidosporas
NT – 01 2,96 c 2,41 c 2,47 d 2,43 d 2,98 c 2,91 c
NT – 02 2,92 c 2,37 d 2,52 c 2,50 b 2,89 d 2,83 d
NT – 03 2,90 c 2,38 d 2,48 d 2,46 c 2,84 e 2,80 d
NT – 04 2,85 d 2,45 b 2,49 d 2,46 c 2,83 e 2,78 e
SS – 01 2,82 d 2,42 c 2,38 e 2,33 f 2,79 e 2,76 e
NT – 05 2,82 d 2,41 c 2,41 e 2,34 f 2,88 d 2,84 d
NT – 06 2,94 c 2,42 c 2,39 e 2,37 e 2,95 c 2,89 c
NT – 07 3,01 b 2,51 a 2,62 a 2,50 b 3,02 b 2,89 c
NT – 08 2,87 d 2,40 c 2,41 e 2,31 f 2,90 d 2,84 d
NT – 09 2,90 c 2,41 c 2,48 d 2,45 d 2,87 d 2,82 d
NT – 10 2,85 d 2,39 d 2,49 d 2,46 c 2,89 d 2,82 d
NT – 11 2,88 d 2,40 c 2,49 d 2,47 c 2,86 d 2,80 d
NT – 12 2,85 d 2,42 c 2,58 b 2,42 d 2,81 e 2,74 e
OS – 01 3,07 a 2,35 d 2,56 b 2,40 e 3,02 b 2,96 b
OS – 02 3,10 a 2,39 d 2,58 b 2,44 d 3,16 a 3,11 a
OS – 03 3,05 b 2,43 c 2,62 a 2,43 d 2,97 c 2,92 c
OS – 04 3,01 b 2,44 b 2,62 a 2,57 a 2,93 d 2,85 d
OS – 05 3,08 a 2,39 d 2,54 c 2,40 e 2,99 c 2,94 b
Tricomix 2,96 c 2,46 b 2,57 b 2,48 c 3,02 b 2,96 b
T. Asperellum 3,04 b 2,47 b 2,56 b 2,48 c 2,97 c 2,91 c
C.V (%) 3,75 2,93 2,64 2,92 2,72 2,70
Signif. Estadist. ** ** ** ** ** **
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Figura A 2. Siembra de los aislados de Trichoderma en diferentes medios de cultivos
Figura A 2. Repiques de los aislados de Trichoderma
Figura A 4. Observaciones de crecimiento de los aislados de Trichoderma
Figura A 4. Características macroscópicas de los aislados de Trichoderma
Figura A 6. Observaciones de las estructuras de los aislados
Figura A 6. Conservación de los aislados en medio de cultivo PDA
