UNIVERSIDAD DE CHILE · El objetivo principal de esta tesis es identificar SNPs del gen de nefrina...
76
UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS DEPTO. DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR Memoria para optar al título profesional de Bioquímico ANÁLISIS DE POLIMORFISMOS GENÉTICOS DEL GEN DE NEFRINA EN DIABÉTICOS CHILENOS TIPO 1 Y 2, Y SU ASOCIACIÓN CON LA NEFROPATÍA DIABÉTICA RODRIGO ANDRÉS GONZÁLEZ MORECCHIO Profesor Patrocinante Director de Memoria Dr. Sergio Lobos Camus Dr. Sergio Lobos Camus Depto de Bioquímica y Biol. Molecular Depto de Bioquímica y Biol. Molecular Fac. de Cs. Químicas y Farmacéuticas Fac. de Cs. Químicas y Farmacéuticas Universidad de Chile Universidad de Chile Santiago – Chile 2006
Transcript of UNIVERSIDAD DE CHILE · El objetivo principal de esta tesis es identificar SNPs del gen de nefrina...
UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS
DEPTO. DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR
Memoria para optar al título profesional de Bioquímico
ANÁLISIS DE POLIMORFISMOS GENÉTICOS DEL GEN DE NEFRINA EN
DIABÉTICOS CHILENOS TIPO 1 Y 2, Y SU ASOCIACIÓN CON LA NEFROPATÍA
DIABÉTICA
RODRIGO ANDRÉS GONZÁLEZ MORECCHIO
Profesor Patrocinante Director de Memoria
Dr. Sergio Lobos Camus Dr. Sergio Lobos Camus
Depto de Bioquímica y Biol. Molecular Depto de Bioquímica y Biol. Molecular
Fac. de Cs. Químicas y Farmacéuticas Fac. de Cs. Químicas y Farmacéuticas
Universidad de Chile Universidad de Chile
Santiago – Chile
2006
ii
Dedicada a todas aquellas personas que
Hicieron este trabajo posible
iii
Mis profundos agradecimientos
Lo primero es que esta tesis se la dedico a todas aquellas personas que están detrás
de este trabajo, en especial a mis padres Noris y Jaime, y a mis queridas hermanas por
todos los sacrificios y su apoyo en mi carrera, ya que sin ellos no sabría qué hacer.
Además, quiero agradecer a todos los profesores que están detrás de este trabajo en
especial a mis guías la Dra. Daniela Seelenfreund y el Dr. Sergio Lobos Camus.
También a todo el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de nuestra
querida Universidad, tanto a los funcionarios como académicos, ya que siempre me
brindaron su apoyo y ayuda cuando fue necesario.
A todos los Doctores y funcionarios del Hospital San Juan de Dios del Departamento
de Medicina Occidente de la Universidad de Chile que estuvieron involucrados en este
proyecto, en especial a la Dra. (BQ) Pilar Durruty por su apoyo y excelente disposición.
A todo el grupo de alumnos que conforma el laboratorio de Biología Molecular, un
grupo sin el cual este trabajo no su hubiese logrado, ya sea por su apoyo técnico o por
simplemente acompañarme en este proceso. Como son Alejandro Rojas, Ares Tirado,
Constanza Morales, Montserrat Balanda y Matías Gutiérrez.
A un incondicional amigo que siempre ha estado ahí cuando lo he necesitado, ya sea
para celebrar o para cosas más tristes, que es Luis Segura H.
iv
A mi queridísima y amada novia Javiera Vargas Keith, que simplemente es la razón de
todo lo que hago.
A mi amada nona Teresa Trevissi, que en paz descanse, ya que es una de las razones
del por quien soy quien soy.
Al grupo del Dr. Carlos Vio de la Pontificia Universidad Católica de Chile, en especial al
señor Carlos Céspedes por realizarnos los ensayos de inmuno histoquímica y darnos
todas las facilidades para realizar estos ensayos.
Al grupo del Dr. Rody San Martín, de la Universidad Austral de Chile por interesarse en
nuestro trabajo y enviarnos los concentrados de glomérulos de rata.
A todos los pacientes que donaron su ADN y su orina para la ciencia, y que
definitivamente sin ellos esta tesis jamás se podría haber logrado realizar.
Y a todas aquellas personas que por olvido no están aquí
En este proceso además de obtener resultados, logré aprender cosas
muy importantes y, lo que es más importante aún, conocer a gente muy
valiosa. Con todo respeto, esta tesis se las dedico a Uds.
v
Esta tesis fue realizada en el laboratorio Biología Molecular del Departamento
de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas
de la Universidad de Chile, bajo la dirección del Dr. Sergio Lobos Camus. Financiada
por el Fondo de Proyectos de Investigación y Desarrollo en Salud (FONIS SA04I2095)
“Evaluación y aplicación clínica de la nefrina como marcador bioquímico y genético
para el diagnóstico precoz de la nefropatía diabética”.
vi
INDICE GENERAL
DEDICATORIA ..................................................................................................................ii AGRADECIMIENTOS .......................................................................................................ii
FINANCIAMIENTO............................................................................................................v INDICE GENERAL ...........................................................................................................vi INDICE DE FIGURAS.......................................................................................................ix INDICE DE TABLAS .........................................................................................................x INDICE DE ANEXOS........................................................................................................xi ABREVIATURIAS ...........................................................................................................xii RESUMEN ......................................................................................................................xiv SUMMARY......................................................................................................................xvi 1. INTRODUCCIÓN .........................................................................................................1
1.1. Diabetes mellitus .........................................................................................1 1.1.1. Diabetes mellitus tipo 1 ...........................................................................1 1.1.2. Diabetes mellitus tipo 2...........................................................................1 1.1.3. Diabetes gestacional ...............................................................................2 1.1.4. Otros tipos específicos de diabetes......................................................2
1.2. Diagnóstico molecular de patologías endocrinas ...................................2 1.3. Diabetes mellitus y la nefropatía diabética...............................................4 1.4. La nefrina ......................................................................................................5 1.5. Polimorfismos del gen de nefrina..............................................................8 1.6. Splicing alternativo y nefrina ...................................................................10 1.7. HIPÓTESIS ..................................................................................................11 1.8. OBJETIVO GENERAL ................................................................................11 1.9. OBJETIVOS ESPECÍFICOS.......................................................................11
2. PACIENTES, MATERIALES Y MÉTODOS..............................................................12
2.1. Pacientes ....................................................................................................12 2.1.1. Material biológico ....................................................................................12 2.1.2. Grupo de pacientes .................................................................................12 2.1.3. Grupo control ...........................................................................................12
vii
2.2. Materiales....................................................................................................13 2.2.1. Enzimas....................................................................................................13 2.2.2. Oligonucleótidos....................................................................................13 2.2.3. Sistemas comerciales ...........................................................................14 2.2.4. Reactivos radioactivos ..........................................................................15 2.2.5. Reactivos generales...............................................................................15 2.2.6 Material fotográfico ................................................................................16
2.3. Métodos.......................................................................................................16
2.3.1. Antecedentes clínicos............................................................................16 2.3.2. Parámetros bioquímicos.......................................................................16 2.3.3. Detección de albuminuria .....................................................................17 2.3.4. Estracción de ADN.................................................................................18 2.3.5. Detección de SNPs en el gen de nefrina.............................................18
2.3.5.1. SSCP-PCR ..........................................................................................19 2.3.5.2. Secuenciación....................................................................................21
2.3.6. Análisis bioinformático de las secuencias obtenidas .......................21 2.3.7. Nefrinuria .................................................................................................22
2.3.7.1. Cuantificación de proteínas presentes en la orina........................22 2.3.7.2. Concentración de proteínas presentes en la orina .......................22 2.2.7.3. Electroforesis en geles de poliacrilamida ......................................23 2.2.7.4. Electrotransferencia de proteínas ...................................................23
2.2.7.5 Inmunodetección de nefrina ............................................................23 2.2.7.5.1 Anticuerpos comerciales.............................................................24 2.2.7.5.2 Anticuerpos no comerciales .......................................................24
2.2.7.5.2.1. Diseño y síntesis del péptido antigénico ...........................24 2.2.7.5.2.2. Síntesis del anticuerpo .........................................................24
2.2.7.5.3 Western blot .................................................................................25 3. Resultados................................................................................................................26
3.1. Parámetros bioquímicos y detección de albuminuria ..........................26 3.2. Detección de SNPs en el gen de nefrina.................................................26
3.2.1. Análisis genético por SSCP-PCR .........................................................26 3.2.2. Análisis genético por secuenciación ..................................................28
viii
3.2.2.1. Análisis genético por secuenciación para la región 1..................29 3.2.2.2. Análisis genético por secuenciación para la región 2..................30
3.3. Análisis bioinformático .............................................................................32 3.4. Análisis de nefrinuria ................................................................................35
4. Discusión ..................................................................................................................37 4.1. Presencia de polimorfismos en el gen de nefrina y su posible relación con Diabetes mellitus y Nefropatía diabética......................................37
4.1.1. Validación de la técnica de SSCP-PCR................................................37
4.1.2. Polimorfismos del gen de nefrina........................................................38 4.2. Análisis de nefrinuria ................................................................................43
5. CONCLUSIONES Y PROYECCIONES ....................................................................45 6. REFERENCIAS .........................................................................................................46 7. ANEXOS ....................................................................................................................51
ix
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Estructura e interacciones de la nefrina.......................................................6
Figura 2. Gen NPHS1, polimorfismos del gen de nefrinay su ubicación en la proteína ..............................................................................................................7
Figura 3. Estructura del glomérulo y diagrama de localización de la nefrina..........8 Figura 4. Detección del polimorfismo del gen de nefrina mediante la técnica de
SSCP-PCR en muestras de pacientes DM 1 y DM 2 ...................................28 Figura 5. Ejemplo de visualización de los electroferogramas para la
secuenciación de ADN ...................................................................................32 Figura 6. Alineamiento de las distintas secuencias obtenidas por
secuenciación .................................................................................................33 Figura 7. Análisis bioestadístico de las secuencias obtenidas para el
polimorfismo SNP rs#466452 ........................................................................34 Figura 8. Western blot para nefrina en muestra de orina con el anticuerpo
diseñado contra el péptido CVSGDAKPAPDI .............................................36 Figura 9. Posibles productos resultantes del splicing alterado de la secuencia ..42
x
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Oligonucleótidos utilizados para el análisis de la “región 1” que contiene
al SNP rs#4806213 y la “región 2” que contiene al SNP rs#3814995 ......14 Tabla 2. Programas utilizados para la amplificación de las regiones 1 y 2............20 Tabla 3. Características clínicas y bioquímicas de los grupos estudiados ...........26 Tabla 4. Polimorfismo de la región 2 del gen NPHS1 en controles sanos,
pacientes DM1, pacientes DM2 y nefrópatas no diabéticos......................27 Tabla 5. Resultados de la secuenciación de la región 1...........................................29 Tabla 6. Resultados de la secuenciación de la región 2...........................................30 Tabla 7. Frecuencia del polimorfismo del gen NPHS1 determinado mediante
SSCP-PCR en pacientes DM1 y DM2 según niveles de albúmina en orina..................................................................................................................31
xi
INDICE DE ANEXOS
Anexo 1. Detalle datos pacientes Grupo Control ......................................................51 Anexo 2. Detalle datos pacientes Grupo DM1 Normoalbuminúricos......................52 Anexo 3. Detalle datos pacientes Grupo DM1 Microalbuminúricos........................53 Anexo 4. Detalle datos pacientes Grupo DM1 Macroalbuminúricos.......................54 Anexo 5. Detalle datos pacientes Grupo DM2 Normoalbuminúricos......................55 Anexo 6. Detalle datos pacientes Grupo DM2 Microalbuminúricos........................56 Anexo 7. Detalle datos pacientes Grupo DM2 Macroalbuminúricos.......................57 Anexo 8. Detalle datos pacientes Grupo Nefrópatas no Diabéticos .......................58 Anexo 9. Procedimiento de ELISA...............................................................................59
xii
ABREVIATURAS
19q13.1: Ubicación del gen NPHS1 en el cromosoma 19, en el brazo q en
la región 13.1. [γ-32P]-ATP: Adenosil trifosfato marcado radiactivamente en el fosfato con 32P.
ºC: Grado Celsius. µM: Micro molar.
µL: Micro litro. A: Adenina.
ADN: Acido desoxiribonucleico. Alb: albúmina. C: Citosina.
Cre: Creatinina. DM: Diabetes mellitus. DM1: Diabetes mellitus tipo 1.
DM2: Diabetes mellitus tipo 2.
ECA: Enzima convertidora de Angiotensina. EDTA: Acido etilen diamin tetra acético. ELISA: (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).
ESE: (Exon Splicing Enhancer) Sitio intensification del splicing del
exón.
Fw: Partidores en sentido 5´- 3´.
G: Guanina. GAG: Triplete que codifica para glutámico. GMB: Membrana basal del glomerulo.
H20dd: Agua bidestilada. HbA1c: Hemoglobina glicosilada HGP: (Human Genome Project) Proyecto genoma humano.
iECA: Inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina. IMC: Índice de masa corporal.
Kb: Kilo base. n.d.: No determinado.
xiii
ND: Nefropatía diabética. NPHS1: Gen de nefrina humano.
NS: No significativo.
mA: Mili ampere. mCi: Mili Curie.
MIT: Massachusetts Institute of Technology.
ARNm: Acido ribonucleico mensajero. pb: Pares de bases
PCR: (Polymerase Chain Reaction) Reacción en cadena de la
polimerasa. P: Probabilidad
Pfu: ADN Polimerasa del organismo Pyrococcus furiosus.
pmol: Pico mol. RT-PCR: Transcripción inversa acoplada a PCR. Rv: Partidores antisentido 3´-5´
SDS: Dodecilsulfato de sodio SNPs: (Single Nucleotide Polymorphisms) Polimorfismos de un sólo
nucleótido.
SNP rs#3814995: Polimorfismo SNP rs#3814995 del gen de NPHS1 humano SNP rs#466452: Polimorfismo SNP rs#466452 del gen de NPHS1 humano
SNP rs#4806213: Polimorfismo SNP rs#4806213 del gen de NPHS1 humano
SR: Factores proteícos reguladores del splicing ricos en serina y
arginina. SSCP-PCR: (Single-Strand Conformational Polymorphism – PCR)
T: Timina
Taq: ADN Polimerasa del organismo Thermus aquaticus.
TBE: Tampón Tris 0,089 M, ácido bórico 0,089 M y EDTA 2,5 mM TBS: Solución tampón a base de Tris (Tris 19,5 mM, NaCl 137 mM, pH
8). TTBS: Tween-20 0.1% , TBS (Tris 19,5 mM, NaCl 137 mM, pH 8).
U: Uracilo
V: Volts.
xiv
RESUMEN
En el origen de la nefropatía diabética (ND) intervienen factores genéticos. La
proteína nefrina es esencial para la constitución de la barrera de filtración glomerular, y
cuando está alterada en su excreción es indicador de compromiso renal. Esta proteína
está codificada en el gen NPHS1 ubicado en el cromosoma 19 humano. En este gen
están descritos 82 SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) en su gen, 8 de los
cuales se encuentran en zonas codificantes y sólo 3 de éstos son no sinónimos
(E117K, K447E y N1077S).
El objetivo principal de esta tesis es identificar SNPs del gen de nefrina en
diabéticos chilenos tipo 1 (DM1) y tipo 2 (DM2) y relacionarlos con ND. Otro objetivo
es pesquisar la presencia de nefrinuria y relacionarla con la presencia de SNPs en el
gen de nefrina.
Para realizar estos análisis seleccionamos al azar 67 pacientes DM1, 94
pacientes DM2 (distribuidos: 32 y 36 normoalbuminúricos, 22 y 36 microalbuminúricos,
13 y 28 macroalbuminúricos, respectivamente), 22 nefrópatas no diabéticos y 36
individuos sanos. A estos pacientes se les extrajo ADN de sangre periférica, se
amplificaron 2 segmentos específicos del gen de nefrina mediante PCR (Polymerase
Chain Reaction), los cuales contenían 2 de los 3 polimorfismos no sinónimos descritos
para este gen (E117K y N1077S). Los amplificados se analizaron mediante SSCP-
PCR (Single-Strand Conformational Polymorphism) y se secuenciaron. También se
tomaron muestras de orina de todos los individuos incorporados al estudio, las cuales
xv
fueron analizadas con anticuerpos anti-nefrina, para pesquisar la presencia de
nefrinuria.
Mediante SSCP-PCR se encontraron diferencias en la migración electroforética
que sugirieron la presencia de polimorfismos para uno de los segmentos analizados,
que contenía el polimorfismo SNP rs#4806213 (N1077S). Se detectó la presencia de
una variante electroforética en el 26,8% de los pacientes DM1, 19,1% de los DM2, 18,2
% de los nefrópatas no diabéticos y 5,6% controles sanos (p<0,05 DM vs controles
sanos y diferencias no significativas en DM1 y DM2, normo-, micro- o
macroalbuminúricos). Mediante la secuenciación del ADN se detectó que en el 95% de
los casos, la variación detectada corresponde al SNP rs#466452 ubicado en el intrón
24, que también se encuentra en la región amplificada por PCR, y sólo el 5%
correspondía al SNP rs#4806213 (exón 24). En el análisis de nefrinuria no se logró
detectar nefrina por medio de tres anticuerpos anti-nefrina distintos en los diversos
grupos de pacientes.
En conclusión, la técnica SSCP-PCR es sensible, confiable y de bajo costo, es
un buen método de barrido o screening para detectar SNPs, aunque es importante
ajustar en forma especifica electroforéticas en cada caso y verificar los polimorfismos
mediante secuenciación. Los SNPs rs#3814995 y rs#4806213 del gen de nefrina se
encuentran presentes en la población chilena, pero no tendrían asociación con
diabetes ni ND. El SNP rs#466452 es más frecuente en diabéticos y la presencia de
este polimorfismo intrónico determina la aparición de una secuencia tipo ESE (Exon
Splicing Enhancer), cuya funcionalidad debe ser corroborada por medio de RT-PCR.
xvi
SUMMARY
Analysis of genetic polymorphisms of the nephrin gene in type 1 and 2 Chilean
diabetic patients, and their association with diabetic nephropathy.
Genetic factors are involved in the development of diabetic nephropathy (DN). Nephrin
protein is essential of the glomerular filtration slit, and is an indicator of renal damage.
Human nephrin is encoded by the NPHS1 gene located on chromosome 19. 82 SNPs
(Single Nucleotide Polymorphisms) have been described in its gene, 8 of which are
found in coding zones and only 3 of these are non-synonymous (E117K, K447E and
N1077S).
The main subject of this thesis is to identify nephrin non-synonymous SNPs in Chilean
diabetic type 1 (DM1) and type 2 (DM2) patients and its relationship with DN. Another
aim is to detect nephrinuria and relate it to the presence/frequency of these SNPs in
the nephrin gene.
In order to carry out these analysis, 67 DM1 patients, 94 DM2 patients (32 and 36
normoalbuminurics, 22 and 36 microalbuminurics, 13 and 28 macroalbuminurics,
respectively), 22 non-diabetic nephropaths and 36 healthy individuals were selected.
DNA was extracted from peripheral blood to amplify 2 specific segments of the nephrin
gene by PCR (Polymerase Chain Reaction) which contained 2 of the 3 described non-
synonymous polymorphisms for this gene (E117K and N1077S). The PCR-fragments
were analyzed by SSCP-PCR (Single-Strand Conformational Polymorphism-PCR) and
xvii
sequenced. Also urine samples were taken from all individuals incorporated into the
study and analyzed using polyclonal anti-nephrin antibodies to study the presence of
nephrinuria.
In the segment that contained SNP rs#4806213 (N1077S) polymorphism analyzed by
SSCP-PCR, differences in electrophoretical migration were found, suggesting the
presence of a polymorphism. This difference was found in 26.8% of DM1 patients,
19.1% of DM2, 18.2% in non-diabetic nephropaths and 5.6% in healthy controls
(p<0.05 DM1 vs healthy individuals, differences were not significant between DM1 and
DM2, normo-, micro- or macroalbuminurics). When the SSCP-PCR samples positive for
a variation in electrophoretic migration were sequenced to verify results, two SNPs
were detected: in 95% of the cases the detected variation corresponded to SNP
rs#466452 located in intron 24, also found in the PCR amplified region, and only 5%
corresponded to SNP rs#4806213 in exon 24. The use of three different antibodies in
nephrinuria analyses was not able to detect nephrin, in the different group of patients.
SSCP-PCR is a sensitive and reliable technique, and it is a good method for screening
and detecting SNPs; however it is important to verify results by direct sequencing.
SNP´s rs#3814995 and rs#4806213 are present in the Chilean population, but may
have no association with diabetes or DN. SNP rs#466452 is more frequent in DM1
patients and the presence of this intronic polymorphism determines the appearance of
an ESE site (Exon Splicing Enhancers), but the existence of a functional ESE site must
be corroborated by RT-PCR.
1
1. INTRODUCCIÓN
1.1. Diabetes mellitus
La diabetes mellitus (DM) es una enfermedad crónica, no transmisible de gran
impacto a nivel mundial y para la cual aún no existe cura. Es una enfermedad
metabólica caracterizada por una hiperglicemia causada por fallas en la secreción de
insulina, acción de ésta o ambas dando origen a diversas formas o tipos (1). En Chile
es de alta prevalencia, alrededor de un 5-6% y de creciente incidencia por los cambios
de hábitos de vida de nuestra sociedad, que llevan a mayor sedentarismo y obesidad
(2, 3). Las diversas formas de esta enfermedad incluyen:
1.1.1. Diabetes mellitus Tipo 1 (DM1): denominada con frecuencia diabetes
juvenil o diabetes insulina-dependiente. Es causada por una deficiencia
en la secreción de insulina y la mayor parte de los individuos con DM1
presentan una destrucción autoinmunológica de las células β del
páncreas (1, 2).
1.1.2. Diabetes mellitus Tipo 2 (DM2): denominada con frecuencia diabetes
adulta o diabetes insulino-independiente. Afecta a individuos que
presentan resistencia a la insulina o que usualmente tienen una relativa
deficiencia de insulina. La mayoría de los DM2 no requieren de insulina
para sobrevivir. Este tipo de diabetes tiene, posiblemente, muchas
causas que aún se desconocen, aunque se sabe que la obesidad
2
jugaría un papel muy importante en su desarrollo, ya que causaría algún
grado de resistencia a la insulina (1, 2).
1.1.3. Diabetes gestacional: se presenta durante el embarazo y se define
como cualquier grado de intolerancia a la glucosa que se identifique
durante el embarazo (1, 2).
1.1.4. Otros tipos específicos: éstas pueden ser causadas por defectos
genéticos en la función de las células β, por defectos genéticos en la
acción de la insulina, enfermedades del páncreas exocrino,
endocrinopatías, diabetes inducida por consumo de drogas o químicos,
por infecciones u otros síndromes genéticos (1, 2).
En todos los tipos de diabetes se altera el metabolismo de los carbohidratos,
proteínas y lípidos.
1.2. Diagnóstico molecular de patologías endocrinas
Las técnicas de diagnóstico molecular proporcionan una oportunidad sin igual
de entender las bases fisiopatológicas de los desórdenes endocrinos. La mayoría de
estas enfermedades se han asociado a mutaciones en los genes conocidos (5).
Los defectos genéticos en los genes que codifican para las hormonas, y para
los receptores o los polipéptidos de la ruta de señalización hormonal causan,
generalmente, manifestaciones complejas de enfermedades caracterizadas por la
participación de varios tejidos y expresión variable de proteínas. Las aberraciones
3
genéticas, como aneuploidía del cromosoma, corrimiento del marco de lectura de un
gen o mutaciones en genes de las proteínas reguladoras (aunque que no afecten
directamente los genes del sistema endocrino) explican, a menudo, los síntomas
clínicos, incluyendo funciones endocrinas centrales como la diferenciación sexual o
disfunciones metabólicas, como la diabetes mellitus. Pero también las alteraciones
genéticas de menor importancia como mutaciones puntuales y polimorfismos, pueden
afectar la función de los productos del gen causando enfermedades endocrinas (6).
Aún cuando la mayor parte de estas mutaciones son raras y explican solamente una
fracción pequeña de las enfermedades endocrinas, el diagnóstico molecular ofrece una
herramienta valiosa para el diagnóstico clínico en estos casos. Si los defectos
moleculares de estas endocrinopatías son conocidos, se puede realizar un diagnóstico
molecular directo. Esto es particularmente útil en enfermedades difíciles de
diagnosticar o cuando existe la posibilidad de implementar estrategias terapéuticas
preventivas, dado que los desórdenes endocrinos más comunes, tales como tiroiditis
autoinmune, diabetes mellitus, osteoporosis, desórdenes del crecimiento, y la obesidad
tienen componentes genéticos de gran importancia y, en su mayoría, desconocidos (5,
6).
Actualmente existen tres criterios para el diagnóstico de la diabetes:
1. Síntomas de diabetes más glicemia al azar ≥ a 200 mg/dl.
2. Asintomático con glicemia en ayuno ≥ a 126 mg/dl.
3. Asintomático con glicemia 2 horas post sobrecarga de glucosa ≥ a 200 mg/dl.
4
Cada uno de estos criterios, en ausencia de hiperglicemia inequívoca, debe ser
confirmado al día subsiguiente (1, 2).
1.3. Diabetes mellitus y la nefropatía diabética
En los pacientes diabéticos se presentan diversas complicaciones, tales como
nefropatía diabética, ceguera, neuropatía diabética y compromisos macroangiopáticos
(enfermedad cardiovascular). La nefropatía diabética (ND) es la complicación
microangiopática más frecuente de la diabetes mellitus (DM), presentándose en el 20-
40% de los pacientes luego de 10 años de evolución natural de la enfermedad. A pesar
de los tratamientos actuales, el 20% de los DM2 y el 50% de los DM1 con ND
desarrollan insuficiencia renal. Sin embargo, no todos los diabéticos desarrollan ND, y
sólo un porcentaje de los nefrópatas evolucionan a insuficiencia renal terminal (7,
8).
Actualmente no se dispone de un marcador genético o bioquímico para detectar
en forma precoz la predisposición a desarrollar nefropatías y, menos aún, determinar
su evolución posterior. La presencia de microalbuminuria persistente (marcador
bioquímico) es el único parámetro bioquímico disponible en este momento para
detectar la etapa de ND incipiente, sin embargo, en esta etapa el daño renal ya se ha
iniciado. Además, la medición de microalbuminuria no siempre permite predecir la
evolución a insuficiencia renal terminal, ya que no todos los pacientes diabéticos
microalbuminúricos evolucionan a una nefropatía clínica.
5
En el origen de la ND intervienen factores genéticos, metabólicos y
hemodinámicos (9). Los estudios prospectivos sugieren que el mal control metabólico
de la DM es una condición necesaria, pero no suficiente, para su desarrollo, siendo
importante la susceptibilidad genética. La ND se presenta con gran heterogeneidad
clínica y étnica. Su comienzo, progresión, severidad y respuesta terapéutica tienen
gran variabilidad individual.
La población chilena es de origen étnico múltiple, componentes genéticos indígenas
(mapuches y aymaras), de muy baja prevalencia de diabetes y caucásicos que
presentan alta frecuencia de la enfermedad. En Chile la alta prevalencia de DM se
asocia a la herencia hispana y, desde un punto de vista clínico y epidemiológico, se
comporta como en las poblaciones caucásicas. La incidencia de DM1 ha mostrado una
tasa significativamente diferente en los niños mapuches (0,42/100.000) comparados
con los caucásicos (1,27/100.000) (4).
Se ha descrito varios genes candidatos relacionados con los mecanismos
patogénicos de la ND (10). Existe consenso que su origen es multigénico (11).
1.4. La Nefrina
La nefrina es una proteína identificada recientemente (1998), que junto a la
podocina, neph1 y otras proteínas, forma parte estructural de los podocitos que rodean
el epitelio de los capilares de los glomérulos, por lo que tiene un papel fundamental en
la funcionalidad de la barrera de filtración del riñón (12). Esta barrera es crucial para
6
mantener el balance de agua y electrolitos sin perder las proteínas circulantes a través
de la orina (Figura 1 A y B).
Figura 1. Estructura e interacciones de la nefrina. A. Estructura de la proteína nefrina: Proteína estructural de la membrana de filtración glomerular de 1241 aminoácidos. Posee un extremo intracelular (C Terminal), un dominio inter membrana y una región extracelular (N Terminal). B. Interacciones que presenta la nefrina: Se muestran las interacciones con distintas proteínas intracelulares y con proteínas extracelulares.
La nefrina es una proteína de adhesión celular de la familia de las
inmunoglobulinas (13). El gen que la codifica (NPHS1) se encuentra en el cromosoma
19, específicamente en la región 19q13.1, posee 29 exones, 28 intrones y 25,87 Kb
(Figura 2 A). La nefrina posee un dominio de transmembrana, en su porción
extracelular posee 8 módulos semejantes a inmunoglobulinas y 1 módulo semejante a
fibronectina III. El gen NPHS1 se expresa en riñón, páncreas, cerebro y médula ósea
(13, 14).
7
Figura 2. Gen NPHS1, polimorfismos de este gen y su ubicación en la proteína. A. Esquema del gen NPHS1 (nefrina): Ubicación del gen NPHS1 en el cromosoma 19, específicamente en la región 19q13.1. Se muestra una ampliación en la que se representan los 29 exones. B. Esquema de polimorfismos intrónicos y exónicos del gen NPH1: mediante el análisis de los polimorfismos exónicos e intrónicos se han podido identificar dos polimorfismos no sinónimos en exones del gen NPHS1: SNP1 dbSNP: rs#4806213 (N1077S) con un cambio de Asparragina a Serina (AAT a AGT) y SNP2 dbSNP: rs#3814995 (E117K) con un cambio de ácido glutámico a lisina (GAG a AAG). C. Ubicación de los SNPs no sinónimos en la estructura de la proteína nefrina: El SNP1 se encuentra en la parte intracelular, muy cercana a la membrana del podocito y el SNP2 en la región extracelular, muy cercano al extremo amino-terminal de la proteína.
La nefrina consta de 1241 aminoácidos, es parte estructural de los podocitos
que rodean el epitelio de los capilares de los glomérulos y tiene un papel esencial en la
estructura de la membrana de filtración glomerular (12) (Figuras 1B, 3 A y 3 B).
También participa en la transducción de señales intracelulares, importantes para la
funcionalidad y supervivencia del podocito (15). Reportes recientes indican que la
nefrinuria o alteraciones en el metabolismo de la nefrina son un buen indicador de
enfermedades renales genéticas y adquiridas (16, 17). Se ha observado una
redistribución de la nefrina en riñón asociado a proteinuria, independiente del origen de
la enfermedad (18). Los pacientes DM1 con nefropatía pueden presentar nefrina en la
8
orina, comprobándose una relación entre la presencia de nefrinuria y daño renal,
independiente del grado de severidad (19).
Figura 3. Estructura del glomérulo y diagrama de localización de la nefrina A. Estructura del glomérulo: Se muestra la ubicación de los podocitos y de la membrana basal del glomérulo. B. Diagrama de la localización de la nefrina (inmunogold) en la membrana de filtración glomerular
1.5. Polimorfismos del gen de nefrina
El Proyecto Genoma Humano (Human Genome Project, HGP) ha permitido
establecer que individuos no relacionados tienen un 0,1% de diferencia en su
secuencia de ADN, fundamentalmente debido a la presencia de los denominados
polimorfismos de una base o Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs). Es de interés
estudiar SNPs con el objeto de asociarlos a susceptibilidad de ciertas enfermedades y
así diagnosticarlas con fines de prevención y terapia oportuna, siendo importante
conocer la existencia de polimorfismos de determinadas proteínas relacionadas con
ND.
9
A la fecha se han descrito más de 60 mutaciones en el gen NPHS1, las cuales
producen síndrome nefrótico cuando generan proteínas truncadas (en finlandeses) y
patologías menos severas en el caso de mutaciones tipo missense (16, 20). También
se han descrito diversos SNPs, que en su mayoría se ubican en intrones o
corresponden a cambios silentes cuando ocurren en exones.
Están descritos 82 SNPs en el gen de nefrina humana
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=snp&cmd=search&term=NPHS1), 8
en exones y los restantes en intrones. De los 8 SNPs descritos en las regiones
codificantes, 5 corresponden a cambios sinónimos o aparentemente silentes (es decir,
se mantiene el mismo aminoácido en la posición correspondiente de la proteína). Los
tres SNPs restantes son no sinónimos, en los que cambia un aminoácido, alterando la
estructura primaria de la proteína (19, 21). Los 3 SNPs no sinónimos corresponden a
los cambios aminoacídicos E117K (SNP rs#3814995), que produce un cambio de ácido
glutámico a lisina, debido al cambio del codón GAG por AAG en el exón 3 del gen de
nefrina; K447E (SNP rs#28939695), que produce un cambio de lisina a ácido
glutámico, debido al cambio del codón AAG por GAG en el exón 11 y el SNP N1077S
(SNP rs#4806213), que produce un cambio de asparragina a serina, debido al cambio
del codón AAT por AGT en el exón 24 (Figuras 2 B y 2 C).
La presencia de SNPs intrónicos no necesariamente son silentes, pues dichos
cambios podrían alterar un proceso de splicing de la secuencia del ADN y modificar a
la proteína resultante (22, 23). Se han descrito ciertas zonas en el ADN que determinan
que un exón actúe como tal, o que este actúe como intrón, o viceversa (22, 24, 25).
10
1.6. Splicing alternativo y nefrina
Los intrones son cortados del ARNm inmaduro por un sistema específico que
reconoce secuencias definidas que se encuentra cerca de los límites con exones.
Estas secuencias son llamadas "sitio dador" que corresponde a una GT (GU en el
ARNm) y son comunes en casi en todos los intrones en el extremo 5’, un "sitio aceptor"
en el extremo 3´ que corresponde a una AG. En el centro de los intrones existe una
secuencia consenso denominada “sitio de ramificación” y, un sitio rico en pirimidinas
ubicado 18-40 bases río arriba del punto de splicing 3´ denominado “tracto
pirimidinico”. Este proceso se lleva a cabo por un conjunto de ribonucleoproteínas
denominado spliceosoma, que reconocen señales codificadas en los alrededores de
los sitios de splicing, regulando la maquinaria de maduración del ARNm y el proceso
de traducción posterior (23, 24, 26).
Se ha visto un splicing alternativo del gen de nefrina (NPHS1) característico que
causa síndrome nefrótico congénito finlandés (27).
En esta tesis se decidió hacer un estudio de los polimorfismos del gen de
nefrina porque esta proteína es esencial en la barrera de filtración glomerular y en la
mediación de la transducción de señales en el podocito. Así alteraciones en esta
proteína podrían estar predisponiendo a ciertos pacientes con DM a presentar ND. De
esta manera, la detección de estos polimorfismos ayudaría al diagnóstico precoz de
ND en pacientes con DM.
11
1.7. HIPÓTESIS
Existe una relación entre determinados polimorfismos del gen de nefrina y la
presencia de nefropatía diabética en pacientes diabéticos chilenos tipo 1 y 2.
1.8. OBJETIVO GENERAL
El objetivo de este trabajo es pesquisar la presencia de SNPs en el gen de
nefrina en pacientes con DM1 y DM2 para estudiar su posible relación con la nefropatía
diabética.
1.9. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Montar la técnica de SSCP – PCR para la detección de polimorfismos del gen
de NPHS1 en pacientes chilenos con diabetes tipo 1 y 2.
2. Identificar estos polimorfismos en el gen NPHS1 y relacionarlos con la
presencia de nefropatía diabética de pacientes diabéticos tipo 1 y tipo 2
chilenos.
3. Determinar la presencia de nefrinuria (nefrina en la orina) a través de western
blot y relacionarla con la presencia de determinados polimorfismos en el gen de
la nefrina.
12
2. PACIENTES, MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. Pacientes
2.1.1. Grupo de pacientes
Se seleccionaron en forma secuencial aleatoria 65 pacientesDM1 y 97 DM2
que se controlan en la Unidad de Diabetes del Hospital San Juan de Dios, y 22
paientes nefrópatas no diabéticos del Hospital Clínico de la Universidad de Chile. Se
formaron 7 grupos de pacientes: DM1 normoalbuminúricos (n = 31), DM1
microalbuminúricos (n = 21), DM1 macroalbuminúricos (n = 13), nefrópatas no
diabéticos (n = 22), DM2 normoalbuminúricos (n = 34), DM2 microalbuminúricos (n =
36) y DM2 macroalbuminúricos (n = 28). Todos firmaron una carta de consentimiento
informado, con mención a la obtención y análisis de ADN.
2.1.2. Grupo control
Constituido por 38 individuos chilenos sanos, no diabéticos y
normoalbuminúricos (n=38). Se excluyeron embarazadas, menores de 18 años,
mayores de 80 años y los con IMC mayor de 35. Todos firmaron una carta de
consentimiento informado, con mención a la obtención y análisis de ADN.
Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Servicio de Salud
Metropolitano Occidente de la Facultad de Medicina de la Universidad de Chile.
13
2.2. Materiales
2.2.1. Material biológico
• Extracto riñón de rata.
• Extracto riñón humano.
• Extracto glomérulo de rata.
2.2.2. Enzimas
Se utilizaron las enzimas:
• Pfu ADN polimerasa de Stratagene (La Jolla, CA, EEUU).
• Taq ADN polimerasa de Invitrogen (Carlsbad, CA, EEUU).
• T4 polinucleótido quinasa de Promega (Madison, WI, EEUU).
• Proteinasa Qiagen de QIAgen (Alemania).
• Proteinasa K de US Biological (Swampscott, MA, EEUU).
2.2.3. Oligonucleótidos
Los oligonucleótidos utilizados para este estudio se muestran en la tabla 2.1.
Todos fueron diseñados utilizando el programa PrimerQuestsm (Integrated DNA
Technologies) y se enviaron a sintetizar al Servicio de Síntesis de oligonucleótidos de
Integrated DNA Technologies (Coralville, IA, EEUU) (http://www.idtDNA.com) a través
de Fermelo S.A. (Santiago, Chile).
14
Tabla 1. Oligonucleótidos utilizados para el análisis de la “región 1” que contiene
al SNP rs#4806213 y la “región 2” que contiene al SNP rs#3814995.
Tamaño Ubicación ORIENTACIÓN PARTIDORES REGIÓN 1 amplificado en el gen NPHS1
Sentido (FW) 5’-ACAGCCTGTTGTCTGGGATTCACT-3’ Exón 2
Bases 535 a la 738 Antisentido (RV) 5’-GACCTTCAGTATGCAGCAACCACA-3’
203 pb
Tamaño Ubicación ORIENTACIÓN PARTIDORES REGIÓN 2
amplificado en el gen NPHS1
Sentido (FW) 5’-GAGGTAAGGGATCAGAGCCTGAGA-3’ Exón 24
Bases 20186 a la 20429 Antisentido (RV) 5’-CCATACCCAGGATGGAGAGGATCA-3’
244 pb
Se muestran las secuencias de los partidores (Fw y Rv), tamaño de los amplificados resultantes y la ubicación en el gen NPHS1 humano. Se tomó como base número 1 el inicio de la transcripción del gen NPHS1 de acuerdo a la secuencia consenso publicada por el proyecto genoma humano.
2.2.4. Sistemas Comerciales
• Extracción de ADN de sangre humana. “QIAamp DNA blood minikit” de
QIAgen Gmbh (Hilden, Alemania).
• Purificación de ADN. “EZNA Cycle pure kit” de Omega Bio-Tek Inc. (Doraville,
GA, EEUU).
• Evaluación de albuminuria. “Bayer-DCA 2000” de Bayer Diagnostics,
Diabetes Care Division (Elkhart, IN, EEUU).
• Concentración de proteínas presentes en la orina. “Minicon B15 Clinical
Simple Concentrators” de Millipore Corporation (Billerica, MA, EEUU).
• Eliminación de albúmina. “Montage Albumin Deplete Kit” de Millipore
Corporation (Billerica, MA, EEUU).
15
• Cuantificación de proteínas. “Bio-Rad Protein Assay” de Bio-Rad
Laboratorios, Inc. (Drive Hercules, CA, EEUU).
• Quimioluminiscencia. “Super signal West Pico Chemiluminescent substrate”
de Pierce (Rockford, IL, EEUU).
2.2.5. Reactivos Radioactivos
El desoxirribonucleótido [γ-32P]-ATP se obtuvo de Perkin Elmer Life Sciences,
Inc. (Boston, MA, EEUU).
2.2.6. Reactivos Generales
• De Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, EEUU) se utilizó nitrocelulosa
0.45 µM Trans-Blot Transfer medium.
• De FMC Bioproducts (Rockland, NY, EEUU) se utilizó agarosa SEAKEM® LE.
• De Invitrogen (Carlsbad, CA, EEUU) se utilizó estándar de peso molecular para
proteínas BenchmarckTM.
• De Merck (Darmstadt, Alemania) se utilizaron acido bórico, acrilamida, etanol,
glicerol, HCl, NaOH y metanol.
• De Sigma Chemicals Co. (St. Louis, MO, EEUU) se utilizaron azul de
bromofenol, glicina, N,N,N´,N´-Tetrametiletilendiamina y xilen cianol.
• De TLC (Santiago, Chile) se utilizó alcohol isopropílico.
• De US Biological (Swamspscott, MA, EEUU) se utilizaron EDTA, Tris Base y
SDS.
16
• De Promega (Madison, WI, EEUU) se utilizaron β–mercaptoetanol y formamida.
• De Winkler (Santiago, Chile) se utilizaron bisacrilamida y Tween 20.
2.2.7. Material Fotográfico
Para las fotografías en blanco y negro, se utilizaron películas Polapan 667 de
Polaroid (Cambridge, MA, EEUU). Para autorradiografía se utilizaron películas KODAK
BioMax XAR-5 de Eastman Kodak Company (Rochester, NY, EEUU). También se
utilizaron pantallas de intensificación de rayos X “Valumax Cassette” de Optex &
Rarex.
2.3. Métodos
2.3.1. Antecedentes clínicos
Se registró sexo, edad, duración de la diabetes, IMC, existencia de hipertensión
arterial, dislipidemia y uso de iECA en todos los pacientes pertenecientes a cada uno
de los grupos.
2.3.2. Parámetros bioquímicos
Se extrajo sangre periférica para determinar HbA1c y creatinina. De la misma
muestra se obtuvo leucocitos para la extracción de ADN y el estudio de los
polimorfismos del gen de nefrina. Las muestras de sangre se almacenaron a - 60 ºC.
17
2.3.3. Detección de albuminuria
Se evaluó la albuminuria en orina aislada de la mañana, en ausencia de
infección del tracto urinario, estado febril o menstrual, con el sistema Bayer-DCA 2000
que utiliza anticuerpos monoclonales. Se expresó la albuminuria (Alb) en relación a la
creatinina (Cre) excretada (Alb/Cre = mg de albuminuria/g de creatininuria), con un
coeficiente de variación intraensayo menor de 6,6 % y una sensibilidad y especificidad
superior al 90%.
Se clasificaron como normo-albuminúricos, micro-albuminúricos y macro-
albuminúricos los pacientes con valores Alb/Cre <30 mg/g, entre 30 y 300 mg/g y >300
mg/g respectivamente, en dos de tres determinaciones, en días no consecutivos en un
plazo menor a 6 meses. Los pacientes no suspendieron el consumo de inhibidores
ECA.
Los pacientes DM1 macroalbuminúricos tenían una historia de nefropatía de
más de 6 meses y los nefrópatas no diabéticos correspondieron a individuos con
nefropatía proteinúrica, con velocidad de filtración glomerular mayor a 15 ml/minuto
(fórmula de Cockroft).
18
2.3.4. Extracción de ADN
Se extrajo ADN de 200 µl de sangre periférica, mediante el sistema QIAmp DNA
blood minikit. A temperatura ambiente, se les agregó 20 µl de proteinasa Qiagen (o en
su defecto proteinasa K), se incubó a 56º C durante 10 minutos y se agregó 200 µl de
etanol frío (4º C). Las muestras de sangre se cargaron en columnas de sílica Qiagen,
se centrifugaron durante 1 min a 6000xg. Las columnas se lavaron dos veces con los
amortiguadores comerciales Qiagen (tampón de lavado AW1 y AW2) y se agregó 200
µl del tampón AE. Finalmente se incubaron durante 1 min a Tº ambiente y luego de
centrifugar durante 3 min a 6000xg, se recuperó el filtrado. Se obtuvo ADN de alta
pureza en concentración de alrededor de 0,3 µg/µl, medida a 260 y 280 nm, cuya
integridad fue analizada mediante electroforesis en geles de agarosa al 1%.
2.3.5. Detección de SNPs en el gen de nefrina
A modo de screening o de barrido, los amplificados de no más de 300 pb se
analizaron mediante SSCP-PCR. Este procedimiento se utiliza para la detección de
mutaciones puntuales que afectan la conformación del ADN (28, 29). Posteriormente
algunas de las muestras que presentaron un patrón de SSCP-PCR característico
fueron secuenciadas para confirmar la presencia del polimorfismo.
19
2.3.5.1. SSCP-PCR
Las regiones analizadas correspondieron a fragmentos cortos amplificados
mediante PCR con partidores específicos (Tabla 1), marcados en forma terminal
utilizando el ribonucleótido [γ-32P]-ATP y T4 polinucleótido quinasa. La reacción de
fosforilación necesaria para llevar a cabo una reacción de amplificación posteriormente
contenía 1 pmol de partidor, 0,1 pmol de quinasa de fago T4, y 1 pmol de γ-32P-ATP,
en un volumen final de 0,25 µL, reacción que fue escalada hasta 40 veces según la
cantidad a utilizar.
Se amplificaron dos segmentos del gen de nefrina: una zona que comprende
parte del exón 2 que denominamos “Región 1” y otra zona que comprende parte del
exón 24 y parte del intrón 24 que se denominó “Región 2” (Tabla 1). Ambas zonas
fueron amplificadas mediante PCR utilizando partidores específicos diseñados en el
laboratorio (Tabla 1). Para la amplificación por PCR se utilizó la enzima ADN
polimerasa Pfu, de baja tasa de errores, puesto que posee la subunidad correctora de
la ADN polimerasa. La reacción de amplificación contenía: 1 µl de ADN (0,3 µg/µl), 1 µl
de tampón Pfu, 0,2 µl de dNTP, 0,5 µl MgCl, 0,25 µl de partidor Fw y 0,25 µl de partidor
Rv (ambos a 25 pmol/µl), previamente marcados en su extremo 5´ con γ-32P-ATP, y 0,2
µl de ADN polimerasa Pfu, en un volumen final de 10 µl. Los programas de
amplificación que se utilizaron para cada pareja de partidores se resumen en la tabla 2.
Los productos la amplificación por PCR se analizaron en geles de agarosa al
0,8%, para evaluar su pureza. Confirmada la amplificación específica del fragmento,
20
éstos se mezclaron con tampón de carga (azul de bromofenol al 0,05%, xilen-cianol al
0,05%, formamida al 95%, NaOH 10 mM y EDTA 20 mM), se desnaturaron a 98º C
durante 5 minutos y se colocaron en hielo, antes de cargar los geles. Se cargó
aproximadamente el 10% del volumen de la reacción de PCR en cada bolsillo de geles
de poliacrilamida al 6% (39:1 acrilamida/bisacrilamida) en tampón TBE (Tris 0,089 M,
ácido bórico 0,089 M y 2,5 mM de EDTA). Los geles (18x18cm) se sometieron a
electroforesis a 15ºC (con un sensor de temperatura) en cámaras Protean IIxi de
BioRAD durante 21 hrs a 40 watts. Se incluyó un control de fragmentos de ADN de
doble hebra (sin desnaturar) mezclado con el mismo tampón de carga, pero sin NaOH.
Luego los geles se secaron en papeles Whatmann 3MM durante 30 minutos a
80ºC en secador de geles “Gel Dryer”de BioRad y se colocaron en contacto con
películas X-OMAT-AR, las que se expusieron a -80ºC durante 12 horas en presencia
de pantallas de intensificación de rayos X “Valumax Cassette”, antes de ser reveladas.
Tabla 2. Programas utilizados para la amplificación de las regiones 1 y 2.
A 1 Hold 30 Ciclos 1 Hold
Temperatura 94.0ºC 94ºC 58ºC 72ºC 4ºC
Tiempo 5 min 45 seg 1 min 45 seg B
1 Hold 35 Ciclos 1 Hold Temperatura 94.0ºC 94ºC 59ºC 72ºC 4ºC Tiempo 5 min 45 seg 1 min 45 seg
A. Programa de amplificación utilizado con la pareja de partidores de las regiones 1 y 2
para SSCP-PCR. B. Programa de amplificación utilizado con la pareja de partidores de las regiones 1 y 2
para secuenciación.
21
2.3.5.2. Secuenciación
Las muestras que mostraron un perfil electroforético característico, se
sometieron a secuenciación de ADN, en Macrogen Inc. (Geumchun-gu, Seúl, Corea).
El 60% de las muestras que mostraron un perfil electroforético positivo y el 10% de los
negativos se sometieron a secuenciación de ADN.
Para la amplificación por PCR se utilizó como enzima Taq ADN polimerasa. La
reacción de amplificación contenía: 4 µl de ADN (0,3 µg/ul), 5 µl de tampón Taq, 1 µl de
dNTP, 3 µl MgCl, 0,4 µl de partidor Fw, 0,4 µl de partidor Rv, y 0,8 µl de Taq ADN
polimerasa, en un volumen final de 50 µl.
Para la purificación de los amplificados se utilizó el sistema comercial “EZNA
Cycle pure kit”. El producto obtenido luego fue analizado mediante electroforesis en
geles de agarosa al 1%.
2.3.6. Análisis Bioinformático de las secuencias obtenidas
Para el análisis bioinformático se utilizaron diversas herramientas, tales como
programas para alinear las secuencias obtenidas con las secuencias consenso
publicadas y analizar la presencia de polimorfismos en estas secuencias, como son
las herramientas MegAlign y EditSeq del programa Lasergene 6.00 de ADNStar Inc. ,
así como distintos servidores. Se utilizó el servidor del MIT llamado RESCUE-ESE
(http://genes.mit.edu/burgelab/rescue-ese/), el cual identifica hexámeros de
oligonucleótidos, dentro de intrones y exones y predice si presentan actividad ESE (22,
22
30). También se utilizó el servidor ESEfinder del Cold Spring Harbor Laboratory
(http://rulai.cshl.edu/tools/ESE/) que identifica los hexámeros descritos para unirse a
cada una de las 4 proteínas SR identificadas hasta la fecha (31).
2.3.7. Nefrinuria
Se evaluó en orina aislada de la mañana (segundo chorro), en ausencia de
infección del tracto urinario, estado febril o menstrual. Las muestras de orina se
almacenaron a – 20 ºC hasta su análisis.
2.3.7.1. Cuantificación de proteínas presentes en la orina
Para la cuantificación de proteínas se utilizó el sistema comercial Bio-Rad
Protein Assay, el cual se basa en el método descrito por Bradford (Bradford, 1976), que
consiste en la incubación de 50 a 400 µl de orina (según el grado de enfermedad y la
cantidad de proteinuria), con 200 µl de azul de Coomasie G-250 Biorad, completando
el volumen a 1 ml con H20dd, durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se midió la
absorbancia a 595 nm en un espectrofotómetro de doble haz (Shimadzu UV-160A).
Para la curva de calibración se utilizó albúmina de suero bovino Biorad.
2.3.7.2. Concentración de proteínas presentes en la orina
Se procedió a concentrar las muestras de orina tomando 5 ml y
concentrándolos 50 veces en columnas Minicon B15 concentrator de Milipore, hasta
23
llegar a un volumen final de 100 µl. Se trabajó a temperatura ambiente. Los
concentrados de oriina se alacenaron a – 20 ºC.
2.3.7.3. Electroforesis en geles de poliacrilamida.
Se utilizaron geles desnaturantes de poliacrilamida (acrilamida/bisacrilamida
30:0,8). Se utilizó un gel concentrador de 5% y un gel separador al 10%. Los
concentrados proteicos se desnaturaron con amortiguador de muestra (10% glicerol,
64 mM Tris-HCL pH 6,8; SDS al 2%, azul de bromofenol al 0,01% y β-mercaptoetanol
al 5%) durante 7 minutos a 95 ºC. Se cargaron 100 µg de proteína total para la
detección de nefrina. Los geles se sometieron a electroforesis en amortiguador de
corrida (glicina 0,2 M, Tris Base 25 mM, SDS al 0,1 %) a 200 V durante 45 min. La
electroforesis se realizó en la cámara Mini Protean 3 Cell (Bio-Rad).
2.3.7.4. Electrotransferencia de proteínas
La electrotransferencia de proteínas se realizó a membranas de nitrocelulosa
de 0,45 µm Trans-Blot transfer medium (Bio-Rad), en amortiguador de transferencia
(glicina 0,2 M, Tris Base 25 mM y metanol al 10%) a 200 mA durante 180 min. La
electrotransferencia se realizó en la cámara Mini Protean 3 Cell (Bio-Rad).
2.3.7.5. Inmunodetección de nefrina
Se ensayaron distintos anticuerpos policlonales anti-nefrina, correspondientes a
dos lotes de un anticuerpo comercial purificado de cabra (Santa Cruz Biotechnology,
Inc.) y un segundo anticuerpo anti nefrina de conejo sintetizado por Biosonda SA.
24
2.3.7.5.1. Anticuerpos comerciales: Nephrin (N-20): sc-1900, lote II
G2004 y lote II H0905
Anticuerpo policlonal purificado de cabra, dirigido contra una región cercana al
extremo amino-terminal de la nefrina humana. (Santa Cruz Biotechnology, Inc.).
2.3.7.5.2. Anticuerpos no comerciales
Se sintetizó un anticuerpo policlonal no comercial purificado de conejo a través
de Biosonda SA (Santiago, Chile), diseñado contra un péptido de la proteína nefrina
(Princeton BioMolecules) y sintetizado por Century Biochemicals (EE.UU.).
2.3.7.5.2.1. Diseño y síntesis del péptido antigénico
El diseño del péptido predijo un péptido inmunogénico analizando la secuencia
aminoacídica de la proteína nefrina. La secuencia predicha fue CVSGDAKPAPDI, la
que presenta un 100% de identidad entre las secuencias de nefrina de rata y nefrina
humana en esta región.
2.3.7.5.2.2. Síntesis del anticuerpo
El péptido antigénico en los laboratorios de Biosonda SA se acopló a
hemocianina de Concholepas concholepas para inmunizar dos conejos de la cepa New
25
Zealand, para obtener los sueros inmunes, según el protocolo descrito (32, 33).
Posteriormente los sueros fueron evaluados mediante ELISA directo con el péptido
(Anexo 9).
2.3.7.5.3. Western blot
Las membranas de nitrocelulosa se incubaron durante una hora a temperatura
ambiente (TA) con solución de bloqueo (leche descremada al 6%). Luego se lavaron
las membranas por agitación con TTBS (Tween-20 al 0,1%, TBS (Tris 19,5 mM, NaCl
137 mM, pH 8), y se incubó con el anticuerpo primario durante toda la noche a 4ºC
(para ambos anticuerpos). Posterior a la incubación con los respectivos anticuerpos,
las membranas se lavaron con TTBS (4 lavados de 10 minutos), y luego se incubó
durante 1 hr a TA con el anticuerpo anti-IgG de conejo conjugado con peroxidasa,
diluido 1:10.000 en TTBS. Para el revelado mediante quimioluminiscencia se utilizó el
sistema Super signal West Pico Chemiluminescent substrate. Las membranas de
nitrocelulosa se pusieron en contacto con películas X-Omat AR en pantallas de
intensificación de rayos X “Valumax Cassette”.
Como controles positivos para la técnica se utilizaron el péptido contra el cual
se diseñó el anticuerpo, extracto de riñón de rata (gentileza del Sr. Carlos Céspedes de
la Pontificia Universidad Católica de Chile), extracto de riñón humano y extracto
purificado de glomérulo de rata (gentileza del Dr. Rody San Martín de la Universidad
Austral de Chile).
26
3. RESULTADOS
3.1. Parámetros bioquímicos y detección de albuminuria.
En la tabla 3 se presentan las características bioquímicas y los valores de
albuminuria de todos los individuos incorporados al estudio, distribuidos en 8 grupos.
Tabla 3. Características clínicas y bioquímicas de los grupos estudiados.
Hombre/Mujer Edad DM IMC Hipertensos Uso IECA HbA1c Albuminuria Creatinina Dislipidemia GRUPOS
N (n/n) (años) (años) (Kg/m2) (%) (%) (%) (mg/g) (mg/dl) (%)
DM1 normoalbuminúricos 31 8/23 41±15 19±10 25±4 16 19 8,5±1,9 11,8±7,1 0,8±0,3 10
DM1 microalbuminúricos 21 11/10 38±14 18±12 26±7 41 53 9,1±1,7 123,5±67,9 0,9±0,3 19
DM1 macroalbuminúricos 13 8/5 50±14 32±13 24±3 45 38 9,3±2,2 512,3±401,6 1,4±0,8 27
DM2
normoalbuminúricos 34 14/20 56±13 11±7 28±6 30 44 8,2±1,9 11,7±8,2 0,9±0,3 33
DM2 microalbuminúricos 35 19/16 59±13 14±11 30±5 38 38 8,4±2,5 128,5±82,0 1,5±0,9 45
DM2 macroalbuminúricos 28 11/17 62±11 19±7 29±4 72 78 8,2±2,1 928±1096 1,3±0,7 52
Nefrópatas no
diabéticos 22 9/13 44±14 - 29±5 63 26 - 3942±3634* 2,6±1,9 n.d.
Controles sanos 38 16/22 45±14 - 24±7 0 0 - 8,9±0,8 0,8±0,1 0
Resumen de las características clínicas y bioquímicas de los distintos grupos de pacientes y controles. *Este valor indica proteinuria en mg/l. n.d. = no determinado.
27
3.2. Detección de SNPs en el gen de nefrina
3.2.1. Análisis genético por SSCP-PCR
Al analizar mediante SSCP-PCR la región del gen de nefrina de interés en torno
al exón 24 (Región 2), se encontró perfiles de migración electroforéticos que permiten
identificar las muestras que presentan polimorfismos (Figura 4.B). En ninguna muestra
se detectó diferencias electroforéticas en la región de interés en torno al exón 2
(Región 1) (Figura 4.C).
Se encontraron polimorfismos mediante SSCP-PCR para la región 2 tanto en
pacientes DM1 como DM2, nefrópatas no diabéticos y controles sanos. La frecuencia
encontrada en pacientes con DM1 fue significativamente mayor que en el grupo control
(Tabla 4).
Tabla 4. Polimorfismo de la región 2 del gen NPHS1 en controles sanos, pacientes DM1, pacientes DM2 y nefrópatas no diabéticos.
Resumen del análisis de los resultados obtenidos por SSCP-PCR. Se muestran los % y las frecuencias del polimorfismo de la región 2 en los distintos grupos de pacientes. NS: no significativo
SSCP-PCR Grupos n n
(+) % Comparación grupos de pacientes
p
Controles sanos vs DM1 p< 0,05 Controles sanos 38 2 5,3 Controles sanos vs DM2 p< 0,05
DM1 65 18 27,7 DM1 vs DM2 NS
DM2 97 19 19,6Nefrópatas no DM vs controles sanos NS
Nefrópatas no DM vs DM1 NS Nefrópatas no DM 22 4 18,2
Nefrópatas no DM vs DM2 NS
28
Figura 4. Detección del polimorfismo del gen de nefrina mediante la técnica de SSCP-PCR en muestras de pacientes DM 1 y DM 2. A. Control técnica SSCP-PCR: Autorradiografía de un gel de poliacrilamida al 6%. En el
primer carril se muestra el patrón electroforético de una muestra que presentaba el polimorfismo (Mut), luego se muestra el patrón electroforético con sólo una de sus hebras marcada radiactivamente, la hebra Fw (2º Carril) y la hebra Rv (3º carril), comparados con una muestra que no presenta el polimorfismo (Ctrl, 4º carril), en las mismas condiciones de marcación radiactiva (Fw 5º carril y Rv 6º carril).
B. Detección polimorfismos Región 2 por SSCP-PCR: Autorradiografía de un gel de poliacrilamida al 6%. En el carril 1 se muestra un paciente DM1 negativo para el polimorfismo, seguido por dos pacientes DM1 que sí lo presentan (carriles 2 y 3). También se muestran las diferencias entre un paciente DM2 negativo para el polimorfismo (carril 4), seguido por dos pacientes DM2 que presentan el polimorfismo (carriles 5 y 6).
C. Detección polimorfismos Región 1 por SSCP-PCR: Autorradiografía de un gel de poliacrilamida al 6%. En los carriles 1-3 se muestran pacientes DM1, y en los carriles 4-6 se muestran pacientes DM2. Este mismo patrón electroforético se apreció en todas las muestras analizadas.
3.2.2. Análisis genético por secuenciación
Para confirmar la presencia del polimorfismo se analizó la secuencia
nucleotídica de los productos de las reacciones de SSCP-PCR de 16 muestras
tomadas al azar para la región 1 y 40 muestras tomadas al azar para la región 2.
29
16 Muestras SNP rs#3814995 al azar
Secuenciadas G ( - ) A ( + ) % ( + )
Controles sanos 4 * * 100%
1 * Normo
1 * DM
1
Macro 1 *
33,33%
1 * * 1 * Normo
2 * DM
2
Micro 1 *
40%
1 * * 1 * Nefrópatas ND
2 *
50%
3.2.2.1. Análisis genético por secuenciación para la región 1
Al no encontrarse patrones que mostraran un patrón electroforético
característico para la presencia de polimorfismos en la región 1, según el análisis
realizado mediante SSCP-PCR se escogieron 16 muestras al azar para un análisis
mediante secuenciación de ADN. Los resultados de la secuenciación se resumen en la
tabla 5.
Tabla 5. Resultados de la secuenciación de la región 1
Se escogieron 16 muestras al azar y se secuenciaron para el análisis del polimorfismo SNP rs#3814995. Se aprecian 6 casos heterocigotos G/A en la posición del SNP rs#3814995, 4 corresponden a controles sanos, 1 DM2 normo-albuminúrico y 1 nefrópata no diabético. 3 pacientes homocigotos para A (+ para el SNP), 1 DM1 normo-albuminúrico, 1 DM2 normo-albuminúrico y 1 nefrópata no diabético. 7 pacientes homocigotos para G (- para este SNP), 2 DM1 (1 normo-albuminúrico y 1 macro-albuminúrico), 3 DM2 (2 normo-albuminúricos y 1 micro-albuminúrico) y 2 nefrópatas no diabético. También se muestran los porcentajes para la presencia del SNP rs#3814995 en cada uno de los grupos de pacientes. Se encontró un 100% de presencia de este
polimorfismo en los controles sanos, un 33,33% para los DM1, un 40% para los DM2 y un 50% para los nefrópatas no diabéticos. * indica presencia del alelo G (G ( - ), negativo para la presencia del polimorfismo) y/o A (A ( + ), positivo para la presencia del polimorfismo) en la posición del polimorfismo SNP rs#3814995.
30
3.2.2.2. Análisis genético por secuenciación para la región 2
De las 43 muestras con SSCP-PCR positivo, se escogieron 26 al azar para un
análisis mediante secuenciación de ADN. Los resultados de la secuenciación se
resumen en la tabla 6 A.
De los individuos que mediante SSCP-PCR no presentaban el polimorfismo, se
escogieron al azar 13 casos y se secuenció su ADN. Los resultados obtenidos de la
secuenciación se resumen en la tabla 6 B.
Tabla 6. Resultados secuenciación de la región 2
A B 26 Muestras SNP SNP 13 Muestras SNP SNP
( + ) rs#4806213 rs#466452 ( - ) rs#4806213 rs#466452 SSCP SSCP
Secuenciadas A ( - ) G ( + ) C ( - ) T ( + )
SecuenciadasA ( - ) G ( + ) C ( - ) T ( + )
20 * * 7 * * 4 * * 4 * * * 1 * * * 1 * * * * 1 * * * * 1 * *
A. Resultados de la secuenciación para muestras positivas para SSCP-PCR: Se secuenciaron 26 de los 43 casos que resultaron positivos para el análisis de polimorfismos por SSCP-PCR, se aprecian 20 casos homocigotos para A en la posición del SNP rs#4806213 (- para el SNP) y homocigotos T para el polimorfismo intrónico SNP #466452 (+ para este SNP), 4 individuos (1 control sano, 2 DM1 y 1 DM2) presentan una combinación G y T, respectivamente. Un individuo DM2 presenta A en el SNP rs#4806213 y es heterocigoto C/T en el SNP rs#466452 y finalmente un individuo DM1 es heterocigoto en ambos SNPs. No se encontró el genotipo G y C en los SNPs rs#4806213 y SNP rs#466452, respectivamente. B. Resultados de la secuenciación para muestras negativas para SSCP-PCR: Se secuenciaron 13 muestras al azar que resultaron negativas para el análisis de SSCP-PCR siendo 11 controles sanos y 2 pacientes DM1. De los 11 controles sanos 5 presentaban la variante A en la posición del SNP rs#4806213, y C en el SNP rs#4664352. 4 controles sanos presentaban A en el SNP rs#4806213 y resultaron ser heterocigotos C/T para el SNP rs#4664352. Un control sano resultó ser heterocigoto A/G para el SNP rs#4806213 y C/T para el SNP rs#4664352. Uno de los controles sanos presentó A en el SNP rs#4806213 y T para el SNP rs#4664352. Las dos muestras DM1 secuenciadas resultaron ser A para el SNP rs#4806213 y C para el SNP rs#4664352. * indica presencia del alelo A (A ( - )) y/o G (G ( + )) en la posición del polimorfismo SNP rs#4806213 y presencia del alelo C (C ( - )) y/o T (T ( + )) en la posición del polimorfismo SNP rs#4664352.
31
Mediante la secuenciación de las muestras que presentaban polimorfismos
según la técnica de SSCP-PCR, detectamos la presencia de un segundo polimorfismo
en la región 2, el cual correspondía al SNP rs#466452 que se encuentra en el intrón 24
y corresponde a un cambio de C por T.
Con el objeto de determinar si la presencia del polimorfismo encontrado en la
región 2 se relaciona con la severidad del daño renal, se analizó la frecuencia de éste
en ambos grupos de pacientes diabéticos según el nivel de albuminuria. No se
encontró diferencias significativas en la frecuencia del polimorfismo SNP rs#466452 del
gen NPHS1 en los DM1, ni DM2, según sean éstos normo-, micro- o
macroalbuminúricos (Tabla 7). Tampoco se encontró diferencias significativas entre
pacientes normo-, micro y macroalbuminúricos al comparar los grupos DM1 y DM2
entre sí.
Tabla 7. Frecuencia del polimorfismo del gen NPHS1 en la región 2 determinado mediante SSCP-PCR en pacientes DM1 y DM2, según niveles de albúmina en orina.
SSCP-PCR Grupos n
n (+) % p
DM1 normoalbuminúricos 31 10 32,2 normo vs macro NS
DM1 microalbuminúricos 21 5 23,8 normo vs micro NS
DM1 macroalbuminúricos 13 3 23,1 micro vs macro NS
DM2 normoalbuminúricos 34 5 14,7 normo vs macro NS
DM2 microalbuminúricos 35 10 28,6 normo vs micro NS
DM2 macroalbuminúricos 28 4 14,3 micro vs macro NS
32
3.3. Análisis Bioinformático
Los resultados de la secuenciación fueron analizados observando los distintos
electroferogramas. El análisis de los electroferogramas que arrojaban “N” en algunas
posiciones permitió resolver aquellas secuencias (Figura 5). Luego estas secuencias
fueron alineadas y comparadas con la secuencia consenso descrita para el gen
NPHS1 con las herramientas MegAlign y EditSeq del programa Lasergene 6.00 (Figura
6).
Figura 5. Ejemplo de visualización de los electroferogramas para los distintos resultados por secuenciación. A. Se aprecia un electroferograma correspondiente a una muestra homocigoto C para la posición del polimorfismo SNP rs#466452 (negativo para este polimorfismo). B. Se aprecia un electroferograma correspondiente a una muestra homocigoto T para la posición del polimorfismo SNP rs#466452 (positivo para este polimorfismo). C. Se aprecia un electroferograma correspondiente a una muestra heterocigoto C/T para la posición del polimorfismo SNP rs#466452. Se observa la sbreposición perfecta de ambas señales en la posición del polimorfismo.
33
Figura 6. Alineamiento de las distintas secuencias obtenidas por secuenciación. Consenso: Secuencia de consenso publicada para el gen NPHS1. 1: Secuencia sin polimorfismos en la posiciones del SNP rs#4806213 (A) y SNP rs#466452 (C). 2: Secuencia sin polimorfismo en la posición del SNP rs#4806213 (A) y presencia de polimorfismo en la posición del SNP rs#466452 (T). 3: Secuencia con presencia del polimorfismo en la posición del SNP rs#4806213 (G) y ausencia de polimorfismo en la posición del SNP rs#466452 (C). 4: Secuencia con presencia del polimorfismos en las posiciones del SNP rs#4806213 (G) y SNP rs#466452 (T).
Al analizar las secuencias que presentaban el polimorfismo SNP rs#466452 (T)
mediante los servidores RESCUE-ESE, se identificó una secuencia ESE que no se
presenta en las secuencias que presentan un C en esa posición según la predicción
del servidor RESCUE-ESE (Figura 7 A).
34
Figura 7. Análisis bioinformático de las secuencias obtenidas para el polimorfismo SNP rs#466452. A. Predicción de RESCUE-ESE para el SNP rs#466452 al compararlo con la secuencia consenso sin polimorfismo: El programa predice que para el cambio que estamos observando (C por T), aparece un sitio enhancer del splicing en el intrón 24. . B. Predicción de ESEfinder para el SNP rs#466452 al compararlo con la secuencia consenso sin polimorfismo:
B.1. Secuencias de unión a cada una de las proteínas SR descritas en la secuencia consenso sin el polimorfismo. Enmarcado en un recuadro se puede ver en la secuencia un sitio de unión a la proteína SF2/ASF, el cual desaparece en presencia del polimorfismo (B.2). B.2. Secuencias de unión a cada una de las proteínas SR descritas en las secuencias que presentan el polimorfismo. Enmarcadas en un recuadro se puede apreciar un nuevo sitio de unión a la proteína SRp40 y la desaparición del sitio de unión a la proteína SF2/ASF.
35
Al analizar las secuencias que presentaban el polimorfismo SNP rs#466452
mediante el servidor ESEfinder y compararlas con la secuencia consenso para esta
región, se predijo la desaparición de un sitio de unión a la proteína SF2/ASF y la
aparición de un nuevo sitio de unión para otra proteína de la familia SR, la SRP40
(Figuras 7 B.1 y B.2)
3.4. Análisis de Nefrinuria
No se logró identificar nefrina en la orina por medio de técnicas inmunológicas.
Al trabajar con los anticuerpos comerciales Nephrin (N-20) sc-1900 lote II G2004 y lote
II H0905, no se logró apreciar una banda atribuible a nefrina, ya que se identificaron
múltiples bandas en las muestras analizadas, sin encontrar banda alguna en las
muestras controles.
Por no poseer un control positivo de nefrina se utilizó como muestra control un
extracto de riñón de rata, extracto de riñón humano y el péptido que sirvió de antígeno.
Cuando se utilizó el anticuerpo diseñado contra el péptido CVSGDAKPAPDI,
cercano a la zona amino-terminal de la proteína nefrina, los ensayos de inmuno
western blot arrojaron como resultado múltiples bandas, sin embargo no se puede
atribuir ninguna de éstas a nefrina (Figura 8). Las bandas observadas tampoco eran
iguales al analizar distintas muestras (reproducibles), de modo de poder atribuirlas a
fragmentos proteolíticos de nefrina.
36
Debido a los resultados obtenidos por inmuno western blot, todos los
anticuerpos se analizaron mediante inmunohistoquímica en el Laboratorio de Fisiología
de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Pontificia Universidad Católica de Chile.
Los anticuerpos fueron probados usando diferentes fijaciones y condiciones, no
logrando detectar marca específica en los glomérulos en ninguna de las preparaciones.
Los anticuerpos fueron probados en riñón de rata, rata neonata, mono y riñón
humano. Como control negativo se usó secciones de testículo de rata. En el caso del
anticuerpo diseñado por nosotros se encontró una reacción positiva en secciones de
células tubulares y células intersticiales, pero no en podocitos ni glomérulos (resultados
no mostrados).
Figura 8. Western blot para nefrina en muestra de orina con el anticuerpo diseñado contra el péptido CVSGDAKPAPDI. Se cargaron 100 µg de proteína por carril. En el carril 1 se cargó una muestra perteneciente a un control sano, en el carril 2 una muestra perteneciente a un DM1 normo-albuminúrico; en el carril 3 se cargó una muestra perteneciente a un paciente DM1 macro-albuminúrico; en el carril 4 se cargó extracto de riñón, y en el carril 5 el péptido CVSGDAKPAPDI.
37
4. DISCUSIÒN En los últimos años se ha reconocido la importancia del poro de filtración de los
podocitos del glomérulo en las enfermedades que llevan a insuficiencia renal. Este
diafragma de filtración es responsable de impedir el paso de macromoléculas a través
de una sub-estructura que une la membrana plasmática de los podocitos (Figura 1 B).
Uno de los componentes fundamentales de esta barrera de filtración glomerular es la
nefrina, de manera que si se inhibe su acción mediante anticuerpos antinefrina, la
estructura persiste, pero se altera la filtración (18).
La nefrina participaría en la patogenia de enfermedades glomerulares
adquiridas que llevan a proteinuria (18). La expresión de la nefrina podría modificarse,
con alteración estructural de los podocitos, en las nefropatías potencialmente
reversibles y en la nefropatía progresiva (34). La hiperglicemia modificaría la expresión
de proteínas reguladoras de la apoptosis e induciría pérdida de podocitos, asociada a
proteinuria (34).
4.1. Presencia de polimorfismos en el gen de nefrina y su posible relación con Diabetes Mellitus y ND.
4.1.1. Validación de la técnica de SSCP-PCR Por medio de la técnica de SSCP-PCR se logró la detección de polimorfismos
del gen de nefrina en la región 2 que se estudió, no así en la región 1 donde no se
logró identificar diferencias en el patrón de migración de las distintas muestras. Sin
embargo, al efectuar secuenciación de los productos de PCR de estas muestras se
38
pudo demostrar la presencia del polimorfismo que no se logró detectar por SSCP-PCR
(Figura 4 C, Tabla 5).
La técnica de SSCP-PCR resultó ser sensible para la detección de
polimorfismos en el amplificado de la región 2, sin embargo arrojo una considerable
cantidad de falsos negativos. De las 13 muestras que por la técnica de SSCP-PCR
parecían no presentar polimorfismos en esta región, al ser secuenciadas resultaron
presentar algún tipo de cambio (Tabla 6B). Un ajuste en las condiciones de trabajo
podría disminuir este problema aumentando la sensibilidad del método para el análisis
de la región 2. Si se hiciera un trabajo similar de ajuste de condiciones se podría
mejorar la sensibilidad de la técnica de SSCP-PCR para utilizarla en el análisis de
polimorfismos de la región 1, ya que en las condiciones que trabajamos no fue posible
detectar polimorfismos mediante esta técnica en esta región.
Se encontró correlación entre una migración diferencial de la región 2 en la
electroforesis en geles de poliacrilamida y la presencia de un polimorfismo (Figura 4 A
y B, Tabla 6). El hallazgo de un nuevo polimorfismo en la región 2 estudiada, SNP
rs#466452, corrobora la importancia de verificar los resultados con un análisis exacto
mediante secuenciación de ADN.
4.1.2. Polimorfismos del gen de nefrina En el gen de nefrina se encuentran 3 polimorfismos no sinónimos, de los cuales
sólo analizamos dos de ellos. Se escogió analizar los polimorfismos correspondientes a
E117K y N1077S ya que por su ubicación y por los cambios aminoacídicos que
39
provocan, podrían alterar la interacción proteína-proteína y/o alterar cascadas
transduccionales que involucran a la nefrina (Figuras 1B y 2C).
En este trabajo se encontró que el polimorfismo SNP rs#3814995 está
presente en la población chilena, pese a no ser detectado por la técnica de SSCP-PCR
y sólo ser identificado mediante secuenciación. Al presentarse en todos los controles
sanos secuenciados, podemos concluir que dicho polimorfismo está presente en la
población chilena, pero que al parecer no tendría asociación con diabetes ni con ND
(Tabla 5).
El polimorfismo SNP rs#4806213 en la población estudiada es de baja
frecuencia y no tendría asociación con diabetes ni con ND (Tabla 6 A y B).
Estos resultados son concordantes con el estudio poblacional realizado por el
Finn-Dianne Study Group de Finlandia que examinó la frecuencia alélica de los 3
polimorfismos no sinónimos y su asociación con grados de daño renal en DM1 con ND
(14). Dicho estudio concluye que ninguno de estos polimorfismos está asociado a la
progresión de la enfermedad renal (14). Otros investigadores encontraron un menor
nivel de expresión de nefrina en biopsias renales de pacientes con ND y correlación
inversa entre los niveles de ARNm de nefrina y grado de proteinuria (19). Pese a que
este estudio fue realizado en pacientes escandinavos, las diferencias étnicas entre
chilenos y escandinavos sugieren que la frecuencia de estos polimorfismos podrían
afectar distintamente a estas dos poblaciones, como se ha visto en otros casos en los
que hay diferencias entre poblaciones en la frecuencia de un polimorfismo y su relación
con alguna patología. Por ejemplo, el polimorfismo C174G del promotor del gen de
40
interleukina 6 se ha relacionado con la sensibilidad a la insulina y el desarrollo de DM2
en pacientes caucásicos, pero no se ha visto ninguna relación entre este polimorfismo
y el desarrollo de DM2 en pacientes taiwaneses (35). Además se ha visto que en
pacientes españoles este polimorfismo jugaría un rol protector contra el desarrollo de
DM2, mientras que en pacientes finlandeses predispondría a desarrollar esta patología
(35).
El hallazgo más importante de esta tesis fue encontrar el polimorfismo SNP
rs#466452 del gen de nefrina asociado a DM1 y 2, que no se relaciona con la
severidad del daño renal (Tabla 4 y 7). Estos hallazgos sugieren que posiblemente el
daño renal sea gatillado por otros factores como la hiperglicemia. La secuenciación
indicó la presencia de una variante en pacientes DM1 y DM2 que no se ha estudiado
en diabetes ni en ND (Figura 7 B).
El polimorfismo SNP rs#466452 se localiza en un intrón, por lo que no debe
afectar la secuencia de la proteína. Sin embargo, es posible que influya en alguna de
las etapas de procesamiento del gen de nefrina, pudiendo afectar la estructura y con
ello la función de la nefrina (Figura 8).
Hace aproximadamente una década atrás, se lograron identificar los llamados
“Exon Splicing Enhancers” (ESEs), son secuencias cortas y especificas de ADN que al
encontrarse en los exones aumentan el reconocimiento de las secuencias o señales
por parte de los factores proteicos que conforman la maquinaria de splicing, y la
formación del spliceosoma, jugando un rol muy importante en el proceso de splicing
41
(39). Se ha logrado identificar secuencias con actividad ESE tanto en plantas como
animales, encontrándose frecuentemente en exones constitutivos que poseen exones
alternativos por splicing (22, 30, 39).
Una importante causa de enfermedades humanas son las alteraciones en el
splicing. Comúnmente se supone que solo las mutaciones puntuales en las regiones
codificantes de los genes ejercen sus efectos, alterando la secuencia primaria de las
proteínas codificadas (aminoácidos resultantes). Sin embargo, hay evidencia que
muchos genes humanos involucrados en enfermedades, tienen mutaciones puntuales
en exones que afectan la maquinaria de corte y empalme del ARNm (41). Se han
reportado casos en que un splicing alternativo característico del gen de nefrina
(NPHS1) causaría síndrome nefrótico congénito finlandés (27).
Los ESEs median su acción sobre la maquinaria del splicing a través de las
proteínas de la familia denominada SR (ricas en serina y arginina), las cuales se unen
a estas secuencias y reclutan componentes cercanos al sitio de splicing (30, 39).
Hoy en día se cuenta con sistemas de apoyo para la predicción de estos sitios
ESEs. De esta manera un servidor del MIT llamado RESCUE-ESE
(http://genes.mit.edu/burgelab/rescue-ese/), mediante algoritmos computacionales
identifica cerca de 238 hexámeros de oligonucleótidos, entre los posibles 4096
hexámeros existentes en intrones y exones, que están predichos para presentar
actividad ESE (22, 30). Por otro lado otro servidor, denominado ESEfinder
(http://rulai.cshl.edu/tools/ESE/) identificadas hasta el momento (31).
42
Gracias a estos servidores logramos identificar una nueva zona ESE, que
aparece cuando el polimorfismo SNP rs#466452 está presente (C por T) (Figura 6. A).
A su vez, se puede observar que cuando se presenta T en la posición de este
polimorfismo, desaparece un sitio de unión a una de las proteínas miembros de la
familia SR anteriormente predicho (Figuras 7 B y C).
Figura 9. Posibles productos resultantes del splicing alterado de la secuencia. En amarillo se ve el resultado si es que considera el primer "sitio dador" del splicing que corresponde a una GT (GU en el ARNm) en el extremo 5´, posterior a la GT correspondiente al exón 24 (enmarcado en morado), que daría como resultado una proteína más larga, ya que se incluiría parte del intrón 24 para empalmar con el exón 25. En rojo se indica lo que ocurre si se procesara el segundo GT posterior a la GT correspondiente al exón 24; en este caso aparecerían dos codones de término (se aprecian las secuencias de ARNm enmarcadas en celeste sobre la secuencia de ADN), y como resultado se obtendría una proteína truncada.
En base a los resultados obtenidos, es posible especular que el gen de la
nefrina humana en presencia del polimorfismo SNP rs#466452, podría estar sufriendo
del fenómeno de splicing alternativo, que originaría una proteína de menor tamaño
(proteína truncada) o una proteína de mayor tamaño (Figura 9). Una situación
semejante se ha visto en el caso del gen MLH1 relacionado con cáncer al colon, en el
cual ocurre un splicing aberrante en presencia de variantes intrónicas de una base,
43
produciendo la pérdida parcial o completa de un exón (41). Estas especulaciones
deben ser corroboradas por análisis de los mensajeros a través de RT-PCR.
4.2. Análisis de nefrinuria
No logramos identificar nefrina en forma consistente o confiable en orina de
pacientes con diabetes mellitus ni con nefropatía no diabética, pese a trabajar con dos
anticuerpos distintos antinefrina (Nephrin (N-20): sc-1900 Lote II G2004 y lote II H0905,
y anticuerpo diseñado contra el péptido CVSGDAKPAPDI). Se ensayó un amplio rango
de concentraciones, tanto para las proteínas cargadas en el análisis de inmuno
western blot, como de anticuerpos. Sólo logramos identificar una serie de bandas que
no coinciden con el patrón electroforético descrito para la nefrina o para sus
fragmentos proteolíticos (42).
Los problemas que tuvimos al identificar nefrinuria pueden deberse a los
anticuerpos que utilizamos, ya que éstos fueron probados por inmuno histoquímica y
no logramos identificar nefrina en cortes de riñón de rata, rata neonata y riñón humano.
Las células en que se vió reacción positiva fueron células tubulares e intersticiales,
pero no podocitos ni glomérulos (resultados no mostrados). Además no encontramos
reportes de que los anticuerpos que utilizamos para la detección de nefrinuria se hayan
utilizado satisfactoriamente con anterioridad. Los únicos reportes de identificación de
nefrina en orina con anticuerpos fueron descritos y sintetizados por el grupo de Anu
Patari y el FinnDiane Study Group (Universidad de Helsinki, Finlandia), sin embargo
estos anticuerpos no están disponibles.
44
Los mecanismos que conducen hacia las anormalidades estructurales de la
barrera de filtración y hacia la ND en particular, no se han dilucidado. Aún cuando la
nefrina es un componente esencial de dicha barrera, son necesarios múltiples
componentes estructurales y funcionales para mantener su integridad. Las variantes
genéticas tanto de la nefrina como de otras proteínas glomerulares probablemente
juegan un papel importante en las enfermedades asociadas con la disfunción del
podocito y con el desarrollo de proteinuria.
Se ha visto que mutaciones en los genes de nefrina (NPHS1) y podocina
(NPHS2) causan síndrome nefrótico congénito finlandés (36) y ciertos polimorfismos de
estos dos genes estarían relacionados con un aumento de proteinúria y síndrome
nefrótico congénito (36 - 38).
Los avances en el conocimiento de la biología del podocito posibilitarán
nuevas estrategias preventivas y terapéuticas para evitar el daño renal en pacientes
diabéticos.
45
5. CONCLUSIONES Y PROYECCIONES
• La técnica de SSCP-PCR es un método sensible, reproducible y bajo costo, que
permite detectar variaciones de una sola base en fragmentos aislados y
amplificados de la región 2 del gen NPHS1 humano.
• No existe asociación entre los polimorfismos SNP rs#3814995 y SNP
rs#4806213 del gen NPHS1 humano con la presencia de diabetes mellitus y
nefropatías no diabéticas.
• Existe asociación entre el polimorfismo intrónico SNP rs#466352 encontrado
en la región 2, amplificada del gen de nefrina, y la presencia de Diabetes
Mellitus tipo 1 y Diabetes Mellitus tipo 2, no así con nefropatías no diabéticas.
• Esta mayor presencia del polimorfismo SNP rs#466352 del gen de nefrina en
pacientes con Diabetes Mellitus tipo 1 y 2 que en controles sanos, podría
sugerir una relación con el desarrollo de nefropatía diabética.
• Es necesario analizar mediante RT-PCR la posibilidad de que el gen NPHS1
esté sufriendo de splicing alternativo a causa del polimorfismo SNP rs#466452
y del nuevo sitio ESE formado.
46
6. REFERENCIAS
1. American Diabetes Association (2006). Diagnosis and Classification of
Diabetes Mellitus. Diabetes. 29: 43-48.
2. García de los Ríos M, Durruty P. (2002). Diabetes Mellitus. Fundación de
Investigación y Perfeccionamiento Médico.
3. Mella I, García de los Ríos M, Parker M, Covarrubias A. (1981). Prevalencia
de la diabetes en el Gran Santiago, Chile. Rev Med Chile. 109: 869-75.
4. Larenas G, Montecinos A, Manosalva A, Barthou M, Vidal T. (1996).
Incidence of insulin-dependent diabetes mellitus in the IX region of Chile: ethnic
differences. Diab Res Clin Pract. 34: 147-51.
5. Berg JP, Bjerknes R. (2005). Molecular diagnostics in endocrine diseases.
Tidsskr Nor Laegeforen. 125(21):2959-2963.
6. Hoppner W. (2002). Clinical impact of molecular diagnostics in endocrinology.
Polymorphisms, mutations and DNA technologies. Horm Res. 58(3):7-15.
7. Rossing, P. (2006). Prediction, progression and prevention of diabetic
nephropathy. Diabetologia. 49: 11-19.
8. American Diabetes Association. (2004) Nephropathy in Diabetes. Diabetes
Care. 27: S79-S83.
9. Mogensen C, Schmitz O. (1988). The diabetic kidney: from hiperfiltration and
albuminuria to end stage renal failure. Med Clin of North Am. 72: 1465-1489.
10. Rich SS, Freedman BI, Bowden DW. (1997). Genetic epidemiology of diabetic
complications. Diabetes Rev. 5:165-173.
11. Marre M. (1999). Genetics and prediction of complications in type 1 diabetes.
Diabetes Care. 22 (2): B53-58.
47
12. Routsalainen V, Ljundberg P Wartiovaara J, Kestilä M, Jalanko H, Holmberg C, et al. (1996). Nephrin is specifically located at the slit diaphragm
of glomerular podocytes. Proc Natl Acad Sci USA. 96: 7962-7967.
13. Kestilä M, Lenkkeri U, Männikkö M, Lamerdin J, Mccready P, Putaala H, et
al. (1998). Positionally cloned gene for a novel glomerular protein – nephrin – is
mutated in congenital nephrotic syndrome. Mol Cell. 1: 575-582.
14. Petterson-Fernholm K, Forsblom C, Perola M, Groop PH. (2003).
Polymorphisms in the nephrin gene and diabetic nephropathy in type 1 diabetic
patients. Kidney Int. 63:1205-1210.
15. Huber Tb, Hartleben B, Kim J, Schmidts M, Schermer B, Keil A, et al.
(2003). Nephrin and CD2AP associate with phosphoinositide 3-OH kinase and
stimulate Akt-dependent signaling. Mol Cell Biol. 23: 4917-4928.
16. Lenkkeri U, Männikkö M, Mccready P, Lamerdin J, Gribouval O, Niaudet et
al. (1999). Structure of the gene for congenital nephrotic syndrome of the finnish
type (NPHS1) and characterization of mutations. Am J Hum Genet. 64: 51-61.
17. Koop K, Eikmans M, Baelde Hj, Karachi H, De Heer E, Paul LC, et al. (2003).
Expression of podocyte – associated molecules in acquired human kidney
diseases. J Am Soc Nephrol. 14: 2063-2071.
18. Doublier S, Ruotsalainen V, Salvidio G, Lupia E, Biancone L, Conaldi PG,
et al. (2001). Nephrin redistribution on podocytes is a potential mechanism for
proteinuria in patients with primary acquired nephrotic syndrome. Am J Pathol.
158: 1723-1731.
19. Toyoda M, Suzuki D, Tomota U, Goro U, Maruyama M, Honma M, et al.
(2004). Expression of human nephrin ARNm in diabetic nephropathy. Nephrol
Dial Transplant. 19: 380-385.
20. Lenkkeri U, Mannikko M, Mccready P, Lamerdin J, Gribouval O, Niaudet
Pm, Antignac CK, Kashtan CE, Homberg C, Olsen A, Kestila M,
48
Tryggvason K. (1999). Structure of the gene for congenital nephrotic syndrome
of the finnish type (NPHS1) and characterization of mutations. Am J Hum Genet.
64(1):51-61.
21. Beltcheva O, Martin P, Lenkkeri U, Tryggvason K. (2001). Mutation spectrum
in the nephrin gene (NPHS1) in congenital nephrotic syndrome. Hum Mutation.
17: 368-373.
22. Fairbrother WG, Holste D, Burge CB, Sharp PA. (2004). Single nucleotide
polymorphism-based validation of exonic splicing enhancers. Plos Biol.
2(9):E268.
23. Von Ahsen N, Oellerich M. (2004). The intronic prothrombin 19911A>G
polymorphism influences splicing efficiency and modulates effects of the
20210G>A polymorphism on ARNm amount and expression in a stable reporter
gene assay system. Blood. 103(2):586-593.
24. Mccullough AJ, Berget SM. (1997). G triplets located throughout a class of
small vertebrate introns enforce intron borders and regulate splice site selection.
Mol Cell Biol. 17(8):4562-4571.
25. Luimula P, Aaltonen P, Ahola H, Palmen T, Holthofer H. (2000). Alternatively
spliced nephrin in experimental glomerular disease of the rat. Pediatr Res.
48(6):759-762.
26. Padgget, R.A., Konarska, M.M., Grabowski, P.J., Hardy, S.F., Sharp, P.A.
(1989). Lariat RNA as intermediates and products in the splicing of messenger
RNA precursors. Science. 225, 898-903.
27. Holthofer H, Ahola H, Solin Ml, Wang S, Palmen T, Luimula P, Miettinen A,
Kerjaschki D. (1999). Nephrin localizes at the podocyte filtration slit area and is
characteristically spliced in the human kidney. Am J Pathol. 155(5):1681-1687.
49
28. Orita NY, Iwahana H., Kanazawa H., Hayashi K, Sekiya T. (1989). Detection
of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as single-strand
conformation polymorphisms. Proc Nat Acad Sci USA. 86: 2766-2770.
29. Mehta P, Robson CN, Neal DE, Leung HY. (2000). Fibroblast growth factor
receptor -2 mutation analysis in human prostate cancer. BJU Int. 86: 681-685.
30. Fairbrother WG, Yeo GW, Yeh R, Goldstein P, Mawson M, Sharp PA, Burge
CB. (2004). RESCUE-ESE identifies candidate exonic splicing enhancers in
vertebrate exons. Nucleic Acids Res. 32:W187-190.
31. Wang J, Smith PJ, Krainer AR, Zhang MG. (2005). Distribution of SR protein
exonic splicing enhancer motifs in human protein-coding genes. Nucleic Acids
Res. 33(16):5053-5062.
32. Becker M I, Carrasco, I., Beltrán C., Torres M., Jaureguiberry B., De
Ioannes A. E. (1998). Development of monoclonal antibodies to Gizerozzine a
toxic component present in fish meals. Hybridoma. 17: 373-381.
33. De Ioannes P, Moltedo B, Oliva H, Pacheco R, De Ioannes A. E., Mecker MI.
(2004). Hemocyanin of the Molluskan Concholepas concholepas Exhibits an
Unusual Heterodecameric Array of Subunits. J Biol Chem. 279: 26134-26142.
34. Wolf G, Chen S, Ziyadeh FN. (2005). From the periphery of the glomerular
capillary wall toward the center of disease: podocyte injury comes of age in
diabetic nephropathy. Diabetes. 54:1626-1634.
35. Chang YH, Huang CN, Shiau MY (2004). The C-174G promoter polymorphism
of the interleukin-6 (IL-6) gene that affects insulin sensitivity in Caucasians is not
involved in the pathogenesis of Taiwanese type 2 diabetes mellitus. Eur
Cytokine Netw. 15(2):117-119.
36. Koziell A, Grech V, Hussain S, Lee G, Lenkkeri U, Tryggvason K, Scambler
P (2002). Genotype/phenotype correlations of NPHS1 and NPHS2 mutations in
50
nephrotic syndrome advocate a functional inter-relationship in glomerular
filtration. Hum Mol Genet. 15;11(4):379-388.
37. Caridi G, Perfumo F, Ghiggeri GM (2005). NPHS2 (Podocin) mutations in
nephrotic syndrome. Clinical spectrum and fine mechanisms. Pediatr Res. 57(5
Pt 2):54R-61R.
38. Caridi G, Bertelli R, Di Duca M, Dagnino M, Emma F, Onetti Muda A, Scolari
F, Miglietti N, Mazzucco G, Murer L, Carrea A, Massella L, Rizzoni G, Perfumo F, Ghiggeri GM (2003). Broadening the spectrum of diseases related
to podocin mutations. J Am Soc Nephrol. 14(5):1278-1286.
39. Yeo G, Holste D, Kreiman G, Burge CB. (2004). Variation in alternative
splicing across human tissues. Genome Biol. 5(10):R74.
40. Cartegni L, Chew SL, Krainer AR (2002). Listening to silence and
understanding nonsense: exonic mutations that affect splicing. Nat Rev Genet.
3(4):285-298.
41. Pagenstecher C, Wehner M, Friedl W, Rahner N, Aretz S, Friedrichs N,
Sengteller M, Henn W, Buettner R, Propping P, Mangold E (2006). Aberrant
splicing in MLH1 and MSH2 due to exonic and intronic variants. Hum Genet.
119(1-2):9-22.
42. Patari A, Forsblom C, Havana M, Taipale H, Per-Henrik Groop. Holthofer H,
and the FinnDiane Study Group (2003). Nephrinuria in Diabetic Nephropathy
of Type 1 Diabetes. Diabetes. 52:2969-2974.
51
Anexo1. Detalle datos pacientes Grupo Control
Nº Sec SSCP-PCR Sec Sec
IngresoEdad
SNP 38 SNP 48 SNP 48 SNP 46
Albuminuria(mg/día) Sexo IMC Crea
(g)
8 - A/G C/T Fem. 9 G/A - A C Fem. 10 64 - A 7 Fem. 11 63 - 14 Fem. 0,8 12 58 G/A - 6 Fem. 0,9
13 y 33 57 - 7 Fem. 29 37 - A T 5 Fem. 26,7 30 - 10 Masc. 31 60 - 8 Masc. 24,2 38 48 - 5 Fem. 39 42 - 13 Fem. 0,8 44 55 - 7 Masc. 0,8 52 28 - 9 Fem. 0,7
61 y 72 40 - 6 Fem. 25,1 0,7 68 43 - 26 Fem. 0,7 69 35 - A 5 Fem. 70 40 - A C 8 Fem. 71 43 - Fem. 23,3 0,9 91 - 10 Masc. 127 22 - 4 Masc. 25,1 136 23 - 3 Masc. 25 137 63 G/A - 9 Masc. 21,5 0,7 138 22 G/A - 10 Fem. 20 0,8 139 45 - 5 Fem. 27,3 140 50 - 5 Fem. 24,5 0,9 142 60 - A C 24 Fem. 27 143 - A C 7 Masc. 1 144 22 - 5 Masc. 18,7 1 145 44 - 9 Masc. 146 26 - A C 5 Masc. 21,6 180 33 - 24 Masc. 1 193 - A C/T Fem. 196 22 - A T 5 Masc. 21,8 0,8 200 22 - Fem.
241 y 27 58 + G T 9 Masc. 242 y 66 49 + A T 10 Fem. 23 0,8
260 - Masc.
52
Anexo2. Detalle datos pacientes Grupo DM1 Normoalbuminúricos
Nº Sec SSCP-PCR Sec Sec Edad Años
Ingreso Edad SNP
38 SNP 48
SNP 48
SNP 46 debut DM
Albuminuria(mg/día) Sexo IMC Crea
(g) IECA HTA DIS
16 24 - 13 11 10 Fem. 23,8 0,6 Si No No 18 48 + C T 20 28 6 Fem. 24 0,9 No No No 20 61 - 40 21 6 Fem. 31,2 0,7 Si Si No 26 39 - 29 10 5,5 Fem. 0,8 No No No 42 59 + G T 39 20 19 Fem. 0,7 No Si Si 50 33 + A C 14 19 24 Fem. 24,8 0,8 Si No No 55 46 - 9 37 7 Fem. No No No 56 82 - A C 45 37 9 Masc. 27,4 0,8 No No No 57 59 A + G ? C ? 25 34 12 Fem. 24 0,7 No No No 58 36 + A T 10 26 18,3 Fem. 28,6 0,7 No No No 77 25 G + A T 13 12 Fem. 26,9 0,7 No No No 80 26 - 2 24 9 Fem. 25 0,6 No No No 82 31 - 23 8 6 Masc. 20,2 0,8 No No No 84 32 - 31 1 26 Fem. 17,4 0,6 No No No 110 34 + G ? T ? 23 11 8 Fem. 0,8 No No No 114 27 - 15 12 Fem. 20,9 0,7 No No No 116 38 - 20 18 10 Fem. 25 Si No No 117 20 - 4,4 Masc. 26 0,8 No No Si 159 25 - 5 20 24 Fem. 21,8 0,8 No No No 172 25 - 14 11 24 Fem. 25,1 0,8 No No No 183 46 + A T 27 19 4 Masc. 24,2 0,7 Si Si No 218 31 - 14 17 16 Fem. 24 Si No No 224 50 - 34 16 26 Masc. 23,8 0,9 No No No 229 38 + C C 10 28 4 Masc. 30,3 0,9 Si No No 230 70 - 26 44 29 Masc. 1,7 Si Si No 236 27 - 24 3 9 Fem. 22 No No No 237 34 - 21 13 9 Fem. 22,7 1 No No No 238 20 + C T 8 12 12 Masc. 23,2 1,3 No No No 239 60 - 38 22 15 Fem. 1,3 Si No No 245 32 - 24 8 10 Fem. 27,9 252 65 - 40 25 13 Masc. 18,6 No Si No 254 39 - 11 28 14 Masc. 26,4 1 Si Si Si
53
Anexo 3. Detalle datos pacientes Grupo DM1 Microalbuminúricos
Nº SSCP-PCR Sec Sec Edad Años
Ingreso Edad
SNP 48 SNP 48 SNP 46 debut DM
Albuminuria(mg/día) Sexo IMC Crea
(g) IECA HTA DIS
15 26 - 5 21 54 Fem. 23,1 0,9 No No No 21 22 - 21 2 98 Fem. 26,6 0,7 No No No 22 36 + C T 17 19 140 Fem. 25,5 0,9 Si No No 41 - 109 Masc. 0,9 Si No No 65 72 - 60 5 252 Fem. 28 0,6 Si Si No 76 - Masc. 0,7 No No No 103 53 - Fem. 38,3 113 23 + A T 15 8 33 Masc. 22 0,9 No No No 164 43 - 23 20 217 Masc. 29 1,7 Si Si 176 33 - 8 25 87 Masc. 26,6 1,9 Si 178 31 + C ? T 19 12 275 Fem. 24,2 9,8 No No No 206 43 - A C 35 8 99 Masc. 31,7 Si Si No 216 38 - 88 Fem. 24,7 Si No Si 217 41 - 61 Fem. 19 Si Si 225 28 - 70 Masc. 0,9 Si Si No 228 35 + C T 165 Fem. 22,3 2,3 No Si No 234 43 - 37 Fem. 243 38 - 13 25 138 Masc. 24,2 246 61 + A T 19 42 197 Masc. 26,6 247 36 - 11 25 153 Masc. 25,1 0,7 Si No No 250 58 - 8 50 97 Fem. 24,6 Si No 253 21 - 5 16 Masc. 22,4 No No
54
Anexo 4. Detalle datos pacientes Grupo DM1 Macroalbuminúricos
Nº Sec SSCP-PCR Sec Sec Edad Años
Ingreso Edad
SNP 38 SNP 48 SNP 48 SNP 46 debut DM
Albuminuria(mg/día) Sexo IMC Crea
(g) IECA HTA DIS
43 - 123 Masc. 0,7 Si Si No 87 69 - 531 Fem. 31 0,9 No Si No
120 49 + A T 37 12 164 Masc. 21,5 0,9 No No Si 126 75 G - Masc. No No No 161 49 - 338 Masc. 0,9 No No No 222 36 - 402 Masc. 24,2 No No No 233 47 - Masc. 2,9 Si Si Si 235 40 - A C Fem. Si Si No 244 - Fem. 1,9 No Si No 249 - Fem. No 251 + Masc. 257 + Masc. Si 270 - Fem. 0,9 No No No
55
Anexo 5. Detalle datos pacientes Grupo DM2 Normoalbuminúricos
Nº Sec SSCP-PCR Sec Sec
Ingreso Edad
SNP 38 SNP 48 SNP 48 SNP 46
Albuminuria(mg/día) Sexo IMC Crea
(g) IECA HTA DIS
14 26 - 5,9 Fem. 33,8 0,6 Si Si Si 19 57 + A T 3 Masc. 1,3 Si No No 24 76 - 16 Masc. 24,4 0,9 No No No 32 56 + A T Fem. 27,9 0,9 Si Si No 36 - 5 Fem. 0,8 No No No 37 63 - 8 Fem. 0,8 Si Si Si 45 65 - Fem. 47 Si No Si 47 29 - Fem. No No 54 66 - Fem. 0,9 No No Si 62 56 - 9 Fem. 31,2 0,8 Si Si Si 63 61 - 19,4 Masc. 25,8 0,9 No No No 64 58 - 10,6 Fem. 30,8 0,7 Si Si Si
73 y 94 + 3 Fem. No No No 78 y 129 57 A 24 Masc. 22,9 No No No
81 40 - 8 Masc. 0,9 85 - Fem. No No No 86 67 - Fem. 0,9 Si Si Si 89 62 G - 17 Masc. 23,5 0,8 No Si No 95 62 - 10 Fem. Si Si 96 52 - 5 Fem. 35,4 Si Si 98 67 - 11 Fem. 31,6 No No No 99 56 - 18 Si Si No 100 18 - 6 Fem. 23,8 No No 101 62 + 20 Fem. 24,2 Si Si No 105 54 G/A - 6 Fem. 29,9 0,8 No No No 106 66 - 20 27,7 Si No Si 107 54 - 18 Fem. No No 111 54 - 7 Fem. 28,6 0,8 No No Si 112 53 G + A T 16 Fem. 31,6 0,8 No No No 115 51 - Masc. 29 1,8 Si Si 124 73 - 26 Masc. 29,4 0,5 No 135 39 - 8 Masc. 22,7 0,9 No No No 185 55 - 24 Fem. No No No 186 65 - 27 Masc. 24,5 Si Si 208 58 - 28 Fem.
56
Anexo 6. Detalle datos pacientes Grupo DM2 Microalbuminúricos
Nº Sec SSCP-PCR Sec Sec
Ingreso Edad
SNP 38 SNP 48 SNP 48 SNP 46
Albuminuria(mg/día) Sexo IMC Crea
(g) IECA HTA DIS
17 19 G + A T 77 33,2 Si Si 28 19 - 113 Fem. 29,4 Si Si Si 35 75 - 95,6 Masc. 1 No Si No 40 - 270 Masc. 1,3 Si Si
46 y 207 + Masc. No No No 48 - Fem. Si 67 54 - 32 Masc. 24,9 No No 75 58 - Masc. 28,7 0,8 No Si 88 61 + 44 Masc. 26,5 Si No 90 46 - 144 Masc. 28 Si No Si 97 - 209 Fem. No Si 102 62 - 82 Fem. 23,8 Si 104 49 - 222 Fem. 22,9 No 109 60 + A T 38 Masc. No 121 67 - 56 Masc. 31,3 No 122 60 + G T 49 Masc. 33,6 No 123 61 - 30 Masc. 23,8 No Si 155 - Masc. No 158 + Masc. Si 162 69 - 245 Masc. 4,3 No 163 69 - 268 Masc. 27,4 2,1 No No No 174 74 - 55 Fem. 33,8 0,8 No No No 177 - Fem. 1,2 Si 179 74 + A T 92 Masc. 26,4 1,2 No Si 199 74 - Masc. 1,6 Si 210 - Fem. 211 + A T Masc. 215 - Fem. 219 - Masc. 1,3 Si Si 220 - Fem. 223 - Masc. 231 + A C Masc. Si 232 - Masc. 255 82 - 109 Fem. No 261 + Fem. 1,4 Si No
57
Anexo 7. Detalle datos pacientes Grupo DM2 Macroalbuminúricos
Nº Sec SSCP-PCR Sec Sec
Ingreso Edad
SNP 38 SNP 48 SNP 48 SNP 46
Albuminuria(mg/día) Sexo IMC Crea
(g) IECA HTA DIS
23 79 - 329 Fem. 1,9 Si Si Si 25 54 - 522 Fem. 34,5 1 Si Si Si 74 - Fem. 1,6 79 70 - 327 Masc. 24,4 1,4 Si No Si 128 69 - 448 Masc. 30,4 1 Si Si 133 - Fem. 1,2 153 74 - 317 Masc. 30,4 Si 156 62 - 833 Fem. 27,8 Si No Si 157 60 + C T 754 Fem. 30,8 1,4 No 160 71 - 861 Fem. 0,7 Si Si Si 165 56 - 433 Masc. 33,7 1,2 Si Si Si 166 66 - 1440 Fem. 1,3 No Si No 167 72 - 468 25,5 0,9 Si Si Si 170 56 - 715 Fem. 26,5 0,8 Si Si No 173 - Fem. 0,6 Si Si No 184 - Fem. 0,9 Si Si Si 190 - Masc. 1 Si Si No 191 - Fem. 0,8 Si Si Si 205 - Fem. No No No 202 + G C Fem. 203 + A T Masc. No No No 204 - 209 65 + A T 686 Fem. 1,5 Si Si Si 221 - Masc. 1,3 Si No 226 - Fem. 0,8 Si No 227 - Masc. 3,3 256 63 - 553 Masc. 25,2 3,2 Si Si No 269 - Masc.
58
Anexo 8. Detalle datos pacientes Nefrópatas no diabéticos
Nº Sec SSCP-PCR Sec Sec
Ingreso Edad SNP
38 SNP 48
SNP 48
SNP 46
Albuminuria(mg/día) Sexo IMC Crea
(g)
125 - Fem. 130 51 G - Fem. 29,7 4,4 131 - Fem. 31,8 1,6 132 49 - Fem. 30,8 0,9 134 36 - Fem. 1,4 147 39 - Masc. 28,8 2,2 149 18 - Fem. 20,7 2,7 150 41 - Masc. 28,7 7 151 28 - Fem. 39 152 71 + A T Masc. 1,3 168 G - Fem. 169 30 - Masc. 28,4 5 171 42 - Fem. 26,6 1,3 182 57 - Masc. 24,5 1 187 46 + C T 150 Masc. 27,2 1,2 188 58 A - Fem. 27,3 3,6 189 37 + A T Fem. 27,3 212 G/A + A T Fem. 213 - Masc. 258 - Fem.
59
Anexo 9. PROCEDIMIENTO DE ELISA
ANTIGENO Péptido ANTICUERPOS Sueros de conejo de la cepa New Zealand o ratones BALB/c
inmunizados con el péptido o hapteno acoplado con Glutardialdehído a Hemocianina de C. Concholepas (Blue Carrier de Biosonda S.A.).1, 2, 3
ACTIVACION Placas de poliestireno de 96 pozos, tratadas con anhídrido maleico
(Pierce), fueron incubadas con 100 µl/ pozo de una solución 10 µg/ml de péptido, en tampón fosfato salino (PBS) pH 7,2, toda la noche a 4ºC.
LAVADO 1 Tres veces en un período de 5 min. Con 200 µl/pozo de PBS-0,02% Tween 20, pH 7,2 (Pierce).
BLOQUEO 200 µl/pozo PBS-BSA 1% durante 3 h a 4º C. LAVADO 2 Similar al lavado 1. ANTICUERPO 1 (específico)
Suero inmune de conejo diluido en base 2 en PBS-BSA 1%. 100 µl/pozo. Incubación durante, toda la noche a 4ºC ó 3 h a 25ºC. Control: Suero pre-inmune del mismo conejo.
LAVADO 3 Similar al lavado 1 ANTICUERPO 2 (conjugado)
Suero de cabra anti-conejo conjugado con Fosfatasa Alcalina (FAL, Pierce) 1:1000 en PBS-BSA 1%, 100 µl /pozo, incubación 30 min a 1 h. a 37ºC.
LAVADO 4 Similar al lavado 1 REVELADO 100 µl/pozo solución 1mg/ml de para-nitrofenilfosfato (Merk) en
tampón FAL (Tris 0,1 M, NaCl 0,1 M y MgCl2 5mM, pH 9.5). Incubación 30 min 37º C.
DETENCION 100 µl /pozo NaOH 3N LECTURA 405 nm
1. Becker M I, Carrasco, I., Beltrán C., Torres M., Jaureguiberry B., De Ioannes A. E. Development of monoclonal antibodies to Gizerozzine a toxic component present in fish meals. Hybridoma 17: 373-381 (1998).
2. Mura C.V, Becker M. I, Orellana A, Wolf D..Immunopurification of Golgi vesicles by magnetic sorting. J Immunol Methods. 260: 263-71 (2002).
3. De Ioannes P, Moltedo B, Oliva H, Pacheco R, De Ioannes A. E., Becker M.I Hemocyanin of the Molluskan Concholepas concholepas Exhibits an Unusual Heterodecameric Array of Subunits. J. Biological Chemistry 279: 26134-26142 (2004)
EDUARDO CASTILLO VELASCO 2902, FONO (56-2) 209 6770 FAX (56 2) 274 5462 Email [email protected] SANTIAGO CHILE
![Clase 2 Etiopatogenia Dm1 - Mariano Taverna - Salta 2012 [Modo de Compatibilidad]](https://static.fdocuments.ec/doc/165x107/577c77b71a28abe0548d354c/clase-2-etiopatogenia-dm1-mariano-taverna-salta-2012-modo-de-compatibilidad.jpg)
