UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS...

UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS FÍSICAS Y MATEMÁTICAS

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA Y BIOTECNOLOGÍA

ESTUDIO DEL MECANISMO DE INTERNALIZACIÓN DE LOS PÉPTIDOS DE

PENETRACIÓN CELULAR TIRAP y TIRAPALA

EN CÉLULAS HELA.

MEMORIA PARA OPTAR AL TÍTULO DE INGENIERO CIVIL EN

BIOTECNOLOGÍA

KAREN ALEJANDRA FLORES OLAVE

PROFESOR GUÍA:

JOSÉ CRISTIÁN SALGADO HERRERA

MIEMBROS DE LA COMISIÓN:

MARCELA ALEJANDRA HERMOSO RAMELLO.

ZIOMARA PATRICIA. GERDTZEN HAKIM.

SANTIAGO DE CHILE

SEPTIEMBRE 2010

RESUMEN DE LA MEMORIA PARA OPTAR AL TITULO DE INGENIERO CIVIL EN BIOTECNOLOGÍA POR: KAREN ALEJANDRA FLORES OLAVE. FECHA: 18/10/2010 PROF. GUIA: Sr. J. CRISTIAN SALGADO H.

“ESTUDIO DEL MECA�ISMO DE I�TER�ALIZACIÓ� DE LOS PÉPTIDOS DE

PE�ETRACIÓ� CELULAR TIRAP Y TIRAPALA

E� CÉLULAS HELA”

Los Péptidos de Penetración Celular (o CPPs) poseen la habilidad de transportar moléculas a través de la membrana plasmática, sin pérdida de su integridad. Entre las secuencias más estudiadas se encuentran TAT, Antennapedia (Antp) y oligo-argininas, cuya característica en común es la presencia de grupos de aminoácidos catiónicos. La motivación del estudio de estos péptidos, es su potencial aplicación en el diseño de nuevos fármacos capaces de actuar localmente, ingresando directamente a la célula. El interés en la inmunología innata, radica en la posibilidad de bloquear la señalización rio abajo de receptores TLR, utilizando un segmento de la secuencia de TIRAP, el cual compite por la interacción de la proteína adaptadora TIR con TLR4. Esta secuencia posee ambas características deseables: grupos de aminoácidos catiónicos y efecto biológico.

Para desarrollar futuras aplicaciones terapéuticas, es indispensable caracterizar el mecanismo de ingreso, ya que de éste depende la estabilidad y accesibilidad del potencial fármaco al blanco; es por esto que el objetivo principal de este trabajo de tesis fue caracterizar el mecanismo de internalización del péptido TIRAP en células HeLa.

Se estudiaron las diferencias y similitudes estructurales que existen entre los péptidos TAT, TIRAP, y TIRAPALA. Se obtuvieron los modelos tridimensionales de las secuencias mencionadas realizando modelación comparativa, y se calculó el potencial electrostático sobre la superficie de los péptidos. Se encontró que los tres péptidos comparten grandes similitudes estructurales (estructura α-hélice ≥ 69%), sin embargo la gran diferencia radica en el campo de potencial electrostático que generan las cadenas laterales de los residuos, sugiriendo que este es el factor clave que le otorga la habilidad de traslocación a través de la membrana plasmática. Además, al estudiar la internalización de TIRAP y TIRAPALA en células HeLa, se encuentra evidencia experimental de la fuerte asociación de TIRAP a la membrana plasmática. Estudios sobre los posibles efectos tóxicos de TIRAP y TIRAPALA, arrojaron una disminución de la sobrevida celular producto de la internalización, por lo que se determina un límite concentración de incubación igual a 40 µM.

Se concluye que la diferencia de potencial generada por las interacciones entre TIRAP y moléculas de la superficie celular, proveen la primera etapa del mecanismo de internalización, denominado transducción. La diferencia de potencial inducido sobre la superficie celular es la que finalmente provoca el ingreso de los péptidos al citoplasma. Además, es importante considerar los resultados de viabilidad obtenidos para posibles futuras aplicaciones terapéuticas en el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas.

i

A mis padres Alejandro Flores y Roxana Olave, por todos estos años de amor, sacrificio, entrega

y dedicación. Por su incondicional apoyo durante mis momentos más difíciles, por el preciado

ejemplo de constancia, esfuerzo y compromiso que me inspiraron a ser la persona que hoy soy.

Por motivarme a soñar en grande, a volar con mis propias alas.

Gracias por creer en mí.

So keep the faith

Don't let nobody turn you 'round

You gotta know when it's good to go

To get your dreams up off the ground

So keep the faith, baby, yea

Because it's just a matter of time

Before your confidence will win out

Believe in yourself

No matter what it's gon' take

You can be a winner

But you got to keep the faith

Michael Jackson (Keep the Faith).

ii

AGRADECIMIENTOS

A Dios, por las maravillas de su creación que he podido observar a través de la ciencia.

A mis tutores de tesis; Dr J. Cristian Salgado, Dra Marcela Hermoso, Dra María Julieta

Venegas y Dr Gerald Zapata, por haberme guiado con gran interés y compromiso durante todo el

transcurso de este trabajo de tesis.

Al proyecto FONDECYT de iniciación 11080016 por el financiamiento de este trabajo de

tesis.

Al Laboratorio de Inmunología Innata, perteneciente a la Facultad de Medicina de la

Universidad de Chile, por haberme proporcionado los espacios y recursos necesarios para

desarrollar mi tesis.

A mis compañeros de laboratorio; Nancy, David, Patricia, Paulina, Marjorie, Loreto, Enzo

y Lucía por su permanente ayuda, especialmente al Sr. Frano Malinarich por dedicar tiempo y

paciencia en guiarme durante el desarrollo experimental.

A mis amigos Kirk y Marcos por su ayuda en la etapa de programación.

A toda mi familia, por mantener la fe en mí, especialmente a mis padres Alejandro y

Roxana, mi hermana Roxana, y mis amigos, que constantemente estuvieron animándome a

seguir.

iii

ÍNDICE DE CONTENIDO

1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................... 1

2. ANTECEDENTES GENERALES .......................................................................................... 4

2.1. Mecanismos de Ingreso de los Péptidos de Penetración Celular a las Células. ................. 5

2.2. Papel de los Proteoglicanos. ................................................................................................ 6

2.3. Alteración de la Viabilidad Celular en Función de la Concentración de Incubación. ........ 7

2.4. Zonas de Nucleación. ........................................................................................................... 8

2.5. Umbral de Transducción. ..................................................................................................... 9

2.6. Importancia de los Grupos de Aminoácidos Catiónicos en la Secuencia Primaria. ......... 10

3. OBJETIVOS........................................................................................................................... 12

4. METODOLOGÍA .................................................................................................................. 13

4.1. Modelamiento de las Estructuras Tridimensionales de TAT, TIRAP y TIRAPALA

. ............ 13

4.2. Cálculo del Campo de Potencial Electrostático sobre la Superficie de los Péptidos. ....... 14

4.3. Viabilidad de células HeLa en Función de la Concentración de Péptidos TIRAP y

TIRAPALA

........................................................................................................................................ 15

4.4. Medición de la Internalización de TIRAP y TIRAPALA

en Células HeLa Utilizando

Concentraciones Crecientes de Estreptavidina-R-Phycoerythrin. ................................................ 15

4.5. Cálculo del Porcentaje de Confluencia en Cultivos de Células HeLa. .............................. 16

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................................ 18

5.1. Mejores Alineamientos Obtenidos. ..................................................................................... 18

5.2. Tablas de Información General Entregadas por VADAR en la Revisión de las Estructuras

Obtenidas con MODELLER. ......................................................................................................... 19

5.3. Análisis Estructural de los Modelos Finales Obtenidos. ................................................... 23

5.4 Características de las Estructuras Tridimensionales de los Péptidos. .............................. 25

5.5. Campo de Potencial Electrostático en la Superficie del Péptido. ...................................... 27

5.6. Determinación del Umbral de Viabilidad. ......................................................................... 30

5.7. Ensayo de Internalización de TIRAP y TIRAPALA

. ............................................................. 36

6. CONCLUSIONES ................................................................................................................. 50

7. REFERENCIAS ..................................................................................................................... 52

iv

8. ANEXOS ................................................................................................................................ 60

A. Protocolo del Ensayo de Viabilidad de Células HeLa Incubadas con Concentraciones

Crecientes de Péptidos, con Yoduro de Propidio (IP) por Citometría de Flujo. .......................... 60

B. Protocolo de Internalización de TIRAP o TIRAPALA

en Células HeLa. ................................ 61

C. Analizador de Imágenes: Código Java de las Clases Programadas. .................................... 63

D. Resumen de la simbología JOY para la Representación de Alineamientos y Análisis de

Estructuras. ................................................................................................................................... 67

E. Alineamientos Restantes Utilizados para el modelamiento de TAT. ..................................... 67

F. Alineamientos Restantes Utilizados para el modelamiento de TIRAP. ................................. 69

G. Alineamientos Restantes Utilizados para el modelamiento de TIRAPALA

. ............................. 69

H. Breve Descripción de las Estructuras Utilizadas como Plantillas. ....................................... 69

I. Histogramas de Tamaño (FSC-H) y Granularidad (SSC-H) de Células HeLa Incubadas por

16 horas con diferentes concentraciones de TIRAP y TIRAPALA

. ................................................. 73

v

ÍNDICE

Figuras

Figura 1: Modelo de absorción celular y tráfico intracelular de los péptidos de penetración

celular.. ............................................................................................................................................ 7

Figura 2: Efecto de D-R9 sobre la viabilidad celular.. .................................................................... 8

Figura 3: Internalización de péptido R9 en células HeLa. .............................................................. 8

Figura 4: Heterogeneidad de internalización de diferentes CPPs en células HeLa.. ....................... 9

Figura 5: Análisis estructura-función de la secuencia TIRAP y TAT. .......................................... 10

Figura 6: Gráfico de Ramachandran entregado por MolProbity, de la estructura final obtenida

para la secuencia TAT. .................................................................................................................. 23

Figura 7: Gráfico de Ramachandran entregado por MolProbity, de la estructura final obtenida

para la secuencia TIRAP. .............................................................................................................. 24

Figura 8: Gráfico de Ramachandran entregado por MolProbity para la secuencia TIRAPALA

. .... 24

Figura 9: Dos vistas diferentes para los modelos 3D creados de los péptidos (A, B) TAT, (C, D)

TIRAP y (E, F) TIRAPALA

. ........................................................................................................... 26

Figura 10: Mapa del potencial electrostático sobre la superficie de (A) TAT, (B) TIRAP y (C)

TIRAPALA

. ..................................................................................................................................... 28

Figura 11: Isosuperficies del campo de potencial electrostático calculado sobre la superficie de

los péptidos TAT, TIRAP y TIRAPALA

, de valores -1, 0 y +1 kT. ............................................... 29

Figura 12: (A) Caracterización de la población en el gráfico de puntos SSC-H (granularidad)

versus FSC-H (tamaño). (B) Gráfico granularidad versus intensidad de fluorescencia (medido en

el canal FL2-H) para la determinación del umbral de intensidad de fluorescencia propia de la

población (autofluorescencia). (C) Tinción basal de células HeLa con IP. .................................. 30

Figura 13: Gráficos granularidad v/s intensidad de fluorescencia para células HeLa incubadas por

16 horas con 3 concentraciones diferentes de Stauroporine: (A) 0,5 µM, (B) 1 µM, (C) 2 µM. .. 31

Figura 14: Histogramas de tamaño (FSC-H) y granularidad (SSC-H), de células HeLa incubadas

por 16 horas con diferentes concentraciones de Estaurosporina: 0 (negro) 0,5 (rojo), 1 (amarillo)

y 2 (verde) µM. .............................................................................................................................. 31

vi

Figura 15: Gráficos de puntos granularidad vs intensidad de fluorescencia obtenidos para 1 de 2

ensayos realizados en forma independiente. Células HeLa incubadas por 16 horas con (A) 10 µM,

(B) 20 µM, (C) 40 µM, (D) 60 µM, (E) 80 µM y (F) 100 µM de TIRAP. ................................... 33

Figura 16: Gráficos de puntos granularidad vs intensidad de fluorescencia obtenidos para 1 de 2

ensayos realizados en forma independiente. Células HeLa fueron incubadas por 16 horas con (A)

10 µM, (B) 20 µM, (C) 40 µM, (D) 60 µM, (E) 80 µM y (F) 100 µM de TIRAPALA

. ................. 34

Figura 17: Curvas de viabilidad en función de la concentración de (A) Estaurosporina, (B)

TIRAP y TIRAPALA

. ...................................................................................................................... 35

Figura 18: Histogramas de (A) Granularidad y (B) Tamaño de células HeLa sin estímulos

(poblaciones control), tratadas con (rojo) y sin (azul) permeabilización-fijación. ........................ 36

Figura 19: Poblaciones Control para selección de la región de análisis: R1 para blancos (A) sin

tratamiento y R0 para blancos (C) con tratamiento de permeabilización-fijación. ....................... 36

Figura 20: Control blanco sin tratamiento (ST)............................................................................. 37

Figura 21: Control blanco con tratamiento (CT) de permeabilización-fijación. ........................... 38

Figura 22: Células HeLa incubadas por 2 horas con 40 µM de TIRAP, fueron luego incubadas

por 10 minutos a temperatura ambiente en oscuridad con (A) 2, (B) 10, (C) 20 y (D) 100 µg/ml

de Estreptavidina-R-PE. ................................................................................................................ 39

Figura 23: Células HeLa incubadas por 2 horas con 40 µM de TIRAP, fueron permeabilizadas y

fijadas, para luego ser incubadas por 10 minutos a temperatura ambiente en oscuridad con (A) 2,

(B) 10, (C) 20 y (D) 100 µg/ml de Estreptavidina-R-PE. ............................................................. 39

Figura 24: Unión de la Estreptavidina-R-PE a diferentes componentes en la célula, después del

tratamiento con Permeabilización-Fijación. .................................................................................. 40

Figura 25: Células HeLa incubadas por 2 horas con 40 µM de TIRAPALA

, fueron luego incubadas

por 10 minutos a temperatura ambiente en oscuridad con (A) 2, (B) 10, (C) 20 y (D) 100 µg/ml

de Estreptavidina-R-PE. ................................................................................................................ 41

Figura 26: Células HeLa incubadas por 2 horas con 40 µM de TIRAPALA

, fueron permeabilizadas

y fijadas, para luego ser incubadas por 10 minutos a temperatura ambiente en oscuridad con (A)

2, (B) 10, (C) 20 y (D) 100 µg/ml de Estreptavidina-R-PE. ......................................................... 41

Figura 27: Gráfico IFM vs Concentración Estreptavidina-R-PE, en donde se grafica la curva de

Unión Total Medida de los valores blanco con tratamiento (CT), en conjunto con los datos de

Unión Inespecífica con los valores de los blancos no tratados (ST). ............................................ 44

vii

Figura 28: Gráficos de datos experimentales de IFM. Se presentan además las curvas de mejor

ajuste al Modelo de Unión Específica y No Específica................................................................. 45

Figura 29: Intensidad de Fluorescencia Media máxima calculada diferenciando su localización,

ya sea por péptido internalizado o péptido asociado a la membrana plasmática. ......................... 47

Figura 30: Esquema del mecanismo de internalización propuesto. .............................................. 48

Tablas

Tabla 1: Secuencia Primeria de tres de los CPPs más estudiados. .................................................. 4

Tabla 2: Secuencia primaria de los péptidos TAT, TATALA

, TIRAP y TIRAPALA

....................... 11

Tabla 3: Mejores alineamientos encontrados para la secuencia TAT representados en formato

JOY. ............................................................................................................................................... 18

Tabla 4: Mejores alineamientos encontrados para la secuencia TIRAP representados en formato

JOY. ............................................................................................................................................... 18

Tabla 5: Mejores alineamientos encontrados para la secuencia TIRAPALA

representados en

formato JOY. ................................................................................................................................. 19

Tabla 6: Análisis estructural del primer modelo tridimensional obtenido para la secuencia TIRAP,

utilizando como plantillas las estructuras descritas en la Tabla 4. ................................................ 20

Tabla 7: Análisis estructural del primer modelo tridimensional obtenido para la secuencia

TIRAPALA

, utilizando como plantillas las estructuras descritas en la Tabla 5. ............................. 20

Tabla 8: Análisis estructural del modelo tridimensional refinado obtenido para la secuencia

TIRAP. ........................................................................................................................................... 22

Tabla 9: Análisis estructural del modelo tridimensional refinado obtenido para la secuencia

TIRAPALA

. ..................................................................................................................................... 22

Tabla 10: Cambio en los ángulos de cadenas laterales realizados para el mejoramiento de la

calidad de la estructura 3D. ........................................................................................................... 23

Tabla 11: Tabla resumen del análisis de calidad de la estructura realizada por MolProbity. ....... 25

Tabla 12: Resumen de las características estructurales de los péptidos modelados, describiéndose

el número de aminoácidos que participa en cada tipo de estructura secundaria y su respectivo

porcentaje....................................................................................................................................... 27

Tabla 13: Valores de p del análisis t-Student, no paramétrico, 1 y 2 colas. .................................. 35

viii

Tabla 14: Resultados del ajuste de parámetros del modelo de Unión Específica y No Específica,

para los datos de IFM obtenidos experimentalmente. (CT) Con tratamiento y (ST) sin tratamiento

de Fijación-Permeabilización ........................................................................................................ 43

Tabla 15: Valores Promedio de los parámetros de especificidad e inespecificidad del Modelo de

Unión Específica y No Específica. ................................................................................................ 44

Tabla 16: Valores calculados para los componentes individuales que aportan fluorescencia por

unión a Estreptavidina-R-PE. ........................................................................................................ 47

Ecuaciones

Ecuación 1: Modelo de saturación usado para analizar los datos de Intensidad de Fluorescencia

Media (IFM) para los datos obtenidos tanto para los controles blanco, como para los datos de

incubación con TIRAP y TIRAPALA

............................................................................................. 42

Ecuación 2: Modelo de Medición Total de Fluorescencia. ........................................................... 46

Ecuación 3: Ecuaciones del Modelo de Medición Total de Fluorescencia simplificadas para

cuando la recta de inespecificidad esta descrita, y concentraciones de ligando muy altas (x → ∞).

....................................................................................................................................................... 46

1

1. INTRODUCCIÓN

Los Péptidos de Penetración Celular (Cell Penetrating Peptides o CPPs) pueden

internalizar y transportar moléculas a través de la membrana plasmática, tales como drogas [1],

péptidos [2], proteínas [3], PNAs (peptide nucleic acid) [4] y nanopartículas [5], las cuales por sí

solas son incapaces de atravesar la membrana celular. Los CPPs, comprenden los factores de

transcripción pertenecientes a la familia de las proteínas de homodominio, tales como

Antennapedia de Drosophila melanogaster (Antp) [6], la proteína TAT de HIV-1 [7], factores de

crecimiento de fibroblastos 1 y 2 [8], y otras moléculas capaces de generar una respuesta

biológica, tales como la secuencia del receptor tipo Toll 4 (TLR4), la proteína adaptadora TIR

(TIRAP), entre otras [9].

El principal atractivo de estos péptidos en el área de la medicina es su habilidad de mediar

la importación de moléculas biológicamente activas, cuya principal aplicación es la

internalización de nuevas generaciones de fármacos [10].

La importancia del mecanismo de internalización para este uso radica en la eficiencia de

la respuesta biológica que se desea lograr. Para un propósito terapéutico, el desafío reside en

identificar y caracterizar un resultado asociado a una molécula específica [11]. Aun así, estos

péptidos pueden inducir efectos inespecíficos que podrían enmascarar la acción biológica de las

moléculas internalizadas.

El ingreso vía endocitosis, es un mecanismo que requiere de la liberación del péptido

desde el endosoma o lisosoma al citoplasma. La acidificación del endosoma o lisosoma, puede

alterar químicamente al fármaco mermando así la respuesta biológica [12]. Por este motivo, es

deseable que los péptidos ingresen directamente al citoplasma para que el fármaco tenga más

probabilidades de alcanzar su blanco, (tales como proteínas citosólicas o ligadas a la membrana

plasmática), y obtener así la respuesta biológica deseada. El mecanismo de transducción, el cual

no ha sido completamente estudiado, se ha descrito para la internalización de la oligo-arginina R9

en varios tipos celulares a 37 ºC, el cual comprende la formación de zonas de nucleación [13]. El

mecanismo de ingreso por transducción operaría cuando se utiliza una concentración entre 1 y 10

µM de incubación con CPPs, umbral que depende del tipo celular y tamaño de la molécula a ser

transportada [14].

2

Las respuestas inflamatorias, mediadas por la activación de receptores de tipo Toll (TLRs)

son de gran interés por lo que han sido intensamente estudiados [15]. Varios péptidos de bloqueo

han sido diseñados y empleados in vitro para alterar las vías de transducción río abajo de TLR2 y

TLR4 [16-17]. Los TLRs comparten un dominio citoplasmático o TIR (dominio del receptor

TLR e Interleuquina 1, IL-1R), y su activación induce el reclutamiento de proteínas adaptadoras,

tales como MyD88 [18] y la proteína adaptadora TIR (TIRAP) [17], las cuales acoplan al

dominio TIR. Estas moléculas son un blanco potencial para intervenciones terapéuticas, y por lo

tanto se predice que un antagonista de la vía de señalización de TLR4 pueda modular respuestas

inflamatorias perjudiciales o crónicas, como la observada en la septicemia severa.

TIRAP fue identificada por Horng y cols. (2001) [17] y su papel en la señalización de

TLR4 fue investigada usando Antp como péptido de penetración celular ligado covalentemente a

un dominio dominante negativo de TIRAP. Este dominio, llamado BB loop [19], es altamente

conservada entre los dominios TIR, por lo que se especuló que este péptido podría actuar como

un inhibidor específico de la proteína adaptadora TIR, compitiendo por su interacción con TLR4

[17]. Sin embargo, publicaciones posteriores mostraron resultados contradictorios [20],

generando la duda sobre el papel de los CPPs como medio de internalización, debido a las

posibles interferencias en la interacción del péptido de bloqueo con TLR4, motivando de esta

forma la búsqueda de nuevas secuencias de aminoácidos que posean ambas características

deseables: grupos de aminoácidos catiónicos (otorgándole así la habilidad de internalización) en

conjunto con la capacidad de bloquear señalizaciones intracelulares como la de TLR4.

El péptido TIRAP, rico en grupos de aminoácidos de arginina y lisina, transloca (o

atraviesa) directamente la membrana plasmática al citoplasma, manteniendo intacta su estructura

[9]. Por esta razón se plantea la hipótesis de que péptidos con grupos de aminoácidos catiónicos

comparten el mismo mecanismo de internalización, denominado transducción, el cual está

caracterizado por las zonas de nucleación.

Un análisis más detallado del mecanismo de transducción queda aún por realizar. Se

desconoce si éste es exclusivo para R9 [21], así como las condiciones de temperatura,

concentración, tipo de CPP y tipo celular, bajo las cuales la transducción ocurre. Por esta razón,

es importante determinar la máxima concentración de incubación de modo que no afecte la

sobrevida celular, así como estudiar las características de la internalización cercanas a la

concentración límite. La caracterización de la ruta de ingreso del potencial fármaco es

3

fundamental, de manera que sea efectivamente viable y producente de una respuesta biológica de

alto rendimiento.

La internalización de TIRAP en células Hela y Raw 264.7, disminuye considerablemente

cuando los aminoácidos catiónicos son sustituidos por residuos de alanina (alifático) [9]. Sin

embargo, aun no se han determinado las características estructurales claves que le otorgan la

habilidad de internalización los CPPs. Es por esto que se hace necesario estudiar los modelos

tridimensionales de ambas secuencias TIRAP y TIRAPALA

, compararlas entre sí, y además

obtener el modelo 3D para la secuencia TAT con el fin de comparar las estructuras y su habilidad

de cruzar la membrana plasmática. También se hace necesario calcular el campo de potencial

electrostático de la superficie de la proteína para analizar el efecto de éste sobre el mecanismo de

internalización.

4

2. ANTECEDENTES GENERALES

Los Péptidos de Penetración Celular o CPPs, - también mencionados como Dominio

Homólogo a Proteína de Transducción (Protein Transduction Domain o PTDs), o Péptidos Ricos

en Arginina (Arginine Rich Peptides o R-RPs) - son secuencias de no más de 30 residuos de

aminoácidos, derivados de proteínas naturales, no-naturales o secuencias quiméricas.

Los CPPs pueden ser clasificados según: aquellos que requieren un enlace químico con la

molécula a ser transportada, o los que forman complejos estables no-covalentes con la molécula.

Los CPPs también pueden ser distinguidos desde un punto de vista estructural: (i) poli-catiónicos

o péptidos ricos en arginina (R-RPs) los cuales presentan grupos de poli-arginina en su secuencia

primaria, tales como TAT (derivado de la proteína HIV-1 TAT), Antp (derivado de la proteína

Antennapedia de Drosophila melanogaster), y las quimeras de poli-arginina; (ii) péptidos de

modelo anfipático (Model Amphipathic Peptides o MAPs) desarrollado a partir de la separación

espacial de residuos de aminoácidos cargados positivamente e hidrofóbicos [22]. En la Tabla 1 se

muestran las secuencias primarias de tres de los CPPs más estudiados.

Tabla 1: Secuencia Primeria de tres de los CPPs más estudiados. Los aminoácidos en negrita corresponden a los residuos

catiónicos.

Nombre del Péptido Secuencia Primaria

TAT GRKKRRQRRRPPQ

R9 RRRRRRRRR

Antp RQIKIWFQNRRMKWKK

El transporte de moléculas al citoplasma, mediado por CPPs, puede darse por al menos

dos mecanismos independientes: endocitosis adsortiva y la subsiguiente liberación de los

componentes desde el endosoma o lisosoma al citoplasma [23], o el rápido cruce a través de la

membrana plasmática por un mecanismo aparentemente no dependiente de energía y aún

pobremente descrito, denominado transducción [13].

En cuanto al mecanismo de internalización de los CPPs, la translocación (o

internalización) de MAPs a través de la membrana plasmática, requiere que el péptido posea una

estructura con al menos cuatro vueltas helicoidales (α-hélice) pero no depende de la carga

positiva de los residuos de aminoácidos [22], mientras que la habilidad de internalización de los

5

R-RPs depende de un número mínimo de argininas [24]. Esto sugiere que el mecanismo de

entrada de ambos tipos de CPPs no está relacionado. Si bien resulta difícil establecer un

mecanismo general de internalización para los CPPs, existe un consenso en que la habilidad de

internalización de R-RPs reside en el grupo guanidina de la arginina [25] proveyendo el primer

paso para la entrada a la célula de los componentes a través de la membrana plasmática.

La internalización de los R-RPs acoplados a moléculas de alto peso molecular está

restringida a la endocitosis [26], los R-RPs por sí solos o enlazados a moléculas de bajo peso

molecular pueden ser internalizados por diversos mecanismos. Los R-RPs ingresan directamente

a través de la membrana plasmática al citoplasma cuando se utiliza una concentración entre 1 y

10 µM o umbral de transducción, el cual varía dependiendo del tipo celular y el tamaño de la

molécula a ser internalizada [14]. Se ha reportado que péptidos funcionalmente activos ligados a

R-RPs, producen un efecto biológico luego de su internalización en cultivos celulares [27]. Es

importante mencionar entonces que la transducción mediada por R-RPs, evita el lento mecanismo

de liberación de los péptidos desde las vesículas citoplasmáticas después del ingreso por

endocitosis.

2.1. Mecanismos de Ingreso de los Péptidos de Penetración Celular a las Células.

El estudio del mecanismo de ingreso de los CPPs a la célula es esencial para el desarrollo

y optimización de estrategias apropiadas para aplicaciones terapéuticas in vivo. Aunque la

internalización celular de los CPPs ha sido reportada en una amplia variedad de tipos celulares,

su mecanismo de ingreso permanece incierto.

El mecanismo de internalización de varios CPPs sería mediado por endocitosis [11, 28-

30], sin embargo, esta observación no es concluyente principalmente por el empleo de diferentes

métodos experimentales que no son comparables entre sí. Los resultados obtenidos de estos

estudios deben evaluarse cuidadosamente, puesto que en la mayoría de los casos, los CPPs están

ligados a fluoróforos, los que podrían alterar el mecanismo natural de ingreso, o provocar una

ruta de entrada inusual que no necesariamente se refleja en la fracción biológicamente activa de

los CPPs o de la molécula internalizada.

Se han identificado varias rutas de ingreso de los CPPs (como los que se mencionan en la

sección 2.2), algunas de ellas independientes de una ruta endosómica, translocando a través de la

membrana plasmática directamente al citoplasma [13, 31-33]. Para este último mecanismo,

6

denominado transducción, se ha detectado la formación de zonas de acumulación local del CPP

R9 en la membrana plasmática de varios tipos celulares antes que la internalización ocurra, lo que

se ha denominado como zonas de nucleación. Este proceso es aparentemente un requisito para el

rápido ingreso de los péptidos a la célula [13].

2.2. Papel de los Proteoglicanos.

Los proteoglicanos juegan un papel esencial en la regulación de los microdominios de la

superficie celular, tal como la organización del citoesqueleto y la activación de enzimas, entre

otros [34-35].

Los primeros contactos entre los CPPs y la superficie celular ocurren a través de uniones

electroestáticas con los glicosaminoglicanos (GAG) y la formación de pares iónicos lipofílicos

entre grupos sulfato, fosfato y carboxilo de los constituyentes de la membrana con los dos grupos

amino de la arginina. Estas interacciones proveen el primer paso de la translocación de los CPPs

a través de la membrana plasmática [36]. Posteriormente, la red de actina se reorganiza y

pequeñas GTPasas Rho A o Rac1 se activan [13, 37], las cuales modifican la fluidez de la

membrana, promoviendo la entrada de oligo-argininas, Antp y TAT por macropinocitosis [38] o

endocitosis dependiente de clatrina [29].

En la Figura 1 se muestra un diagrama que resume los diferentes mecanismos propuestos

en la literatura (modificado de Heitz y cols. [39]).

7

Figura 1: Modelo de absorción celular y tráfico intracelular de los péptidos de penetración celular. Absorción celular de

péptidos ligados covalentemente (CPP-C) y no covalentemente (CPP-NC) a una molécula. (1) Unión de los CPPs o

complejo CPP/molécula a la matriz extracelular a través de la plataforma de proteoglicanos. (2) La agrupación de

glicosaminolicanos provoca la activación selectiva de pequeñas GTPasas y la reorganización de la red de actina. (3) Un

incremento de la fluidez de la membrana promueve la entrada celular y la liberación al citosol de los CPP-NC y CPP-C

(en altas concentraciones) a través de la fusión de la membrana o la absorción celular de CPP-C o CPP-NC a través de la

(4) endocitosis (a): dependiente de caveolina, (b): dependiente de clatrina, (c): independiente de clatrina y caveolina o (5)

macropinocitosis. Posterior a la captación de los CPP-C o CPP-NC por endocitosis, estos pueden escapar de la

degradación lisosomal y translocar al citosol y al núcleo (6), permanecer en endosomas tempranos o tardíos (7), o ser

transportados al aparato de Golgi y retículo endoplasmático (8). Modificado de Heitz y cols (2009) [39].

2.3. Alteración de la Viabilidad Celular en Función de la Concentración de Incubación.

La viabilidad celular es un parámetro que puede ser modificado durante el tratamiento con

péptidos catiónicos [21]. La incubación con R9 afecta tanto la integridad de la membrana

plasmática, determinada mediante el ensayo con azul tripán, como la actividad enzimática,

utilizando el ensayo (3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5 difeniltetrazilio-bromuro (MTT), los cuales

disminuyen al aumentar la concentración de péptidos utilizada. La Figura 2 muestra el efecto de

la concentración sobre los parámetros mencionados anteriormente [21].

8

Figura 2: Efecto de D-R9 sobre la viabilidad celular. La viabilidad celular se determinó por ensayo de exclusión con azul

tripán (gris) y por medio de la actividad enzimática, utilizando de un ensayo MTT (púrpura), después de 2 horas de

incubación con diferentes concentraciones del péptido. Las barras señalan el error estándar correspondiente a dos

experimentos independientes. El número total de células contadas fueron 140 y 250 para cada experimento. Modificado de

Tunnemann y cols (2008) [21].

2.4. Zonas de Nucleación.

La rápida internalización celular a través del proceso de transducción, es dependiente de

la formación de zonas de nucleación, en los cuales los péptidos se encuentran agrupados

transientemente [13], tal como se observó en células HeLa incubadas con 20 µM de péptido R9.

En la Figura 3 se muestra la formación de zonas de nucleación (flechas blancas) y evolución

temporal del ingreso de R9 en las células HeLa.

Figura 3: Internalización de péptido R9 en células HeLa. Medio conteniendo una concentración de 20 µM de R9 ligado a

un fluoróforo, fue agregado a las células HeLa. La internalización de los péptidos fue visualizada por microscopia

confocal, en lapsos de tiempo de 30 segundos. Se muestran imágenes correspondientes al paso de 1, 5, 10 y 15 minutos,

después de la incubación. Las flechas blancas señalan la temprana formación de las zonas de nucleación. Modificado de

Duchardt y cols. (2007) [13].

9

2.5. Umbral de Transducción.

El umbral de transducción, corresponde a una concentración de péptidos a la cual ocurre

la transición entre el ingreso de los péptidos por endocitosis, y la internalización mediante zonas

de nucleación [13]. Este umbral es dependiente del tipo de célula y CPP.

Según lo reportado por Duchardt y cols. (2007), el umbral de transducción para R9 se

encuentra cercano a la concentración de 10 µM, puesto que se observan simultáneamente células

con péptido distribuido homogéneamente en el citoplasma (alta intensidad de fluorescencia) y

células con péptido confinado en vesículas (fluorescencia local, como puntos), lo que se

interpreta como dos mecanismos de translocación diferentes: transducción y endocitosis,

respectivamente [13].

Figura 4: Heterogeneidad de internalización de diferentes CPPs en células HeLa. Las células HeLa fueron incubadas por

30 minutos con concentraciones crecientes del péptido indicado. Para el análisis por microscopia de fluorescencia, las

células fueron lavadas dos veces con medio y analizadas inmediatamente. Para el análisis por citometría de flujo, las

células fueron lavadas y tratadas con tripsina/EDTA. Modificado de Duchardt y cols. (2007) [13].

10

En la Figura 4 se muestra la internalización de tres péptidos: (A) Antp, (B) R9 y (C) TAT

en las células HeLa, luego de ser incubadas por 30 minutos a 37⁰C con concentraciones

crecientes de los péptidos mencionados [13]. La heterogeneidad de la internalización de los CPPs

en las células HeLa, se presenta a altas concentraciones dependiendo del tipo de péptido. Se

puede observar células con diferentes intensidades de fluorescencia, lo que indica diferentes

cantidades de péptido de internalizado.

2.6. Importancia de los Grupos de Aminoácidos Catiónicos en la Secuencia Primaria.

La habilidad de translocación a través de la membrana plasmática de los péptidos TIRAP

y TAT en células Hela y Raw 264.7, disminuye considerablemente cuando los aminoácidos de

arginina y lisina (catiónicos) presentes en la secuencia primaria, son sustituidos por residuos de

alanina (alifático) [9]. En la Figura 5, se muestran las diferencias en la cantidad de péptido

internalizado, la cual es proporcional a la intensidad de fluorescencia media medida, para las

secuencias de TAT, TATALA

, TIRAP y TIRAPALA

.

Figura 5: Análisis estructura-función de la secuencia TIRAP y TAT. Concentraciones crecientes de los péptidos TIRAP

(barras grises), TIRAPALA (barras gris claro), TAT (barras negras) y TATALA (barras blancas) marcados con NBD, fueron

incubadas en células HeLa y RAW por 2 horas. La cuantificación de la internalización se realizo añadiendo el apagador de

fluorescencia [quencher], ditionito de sodio. Los resultados mostrados corresponden al promedio de 3 experimentos

independientes. Modificado de Low y cols. (2007) [9].

11

En la Tabla 2 se muestran las secuencias de aminoácidos de los péptidos internalizados.

Tabla 2: Secuencia primaria de los péptidos TAT, TATALA, TIRAP y TIRAPALA. Los aminoácidos resaltados en negrita

son catiónicos, mientras que los marcados con rojo corresponden a las sustituciones de alanina.

Nombre del Péptido Secuencia Primaria

TIRAP GKMADWFRQTLLKKPKKRPNSPEST

TIRAPALA

GKMADWFRQTLLAAPAAAPNSPEST

TAT GRKKRRQRRRPPQ

TATALA

GRKKAAQAAAPPQ

12

3. OBJETIVOS

General.

Caracterizar el mecanismo de internalización del péptido TIRAP en células HeLa a

37ºC.

Específicos.

1. Determinar las características estructurales y electroestáticas de los péptidos TIRAP

y TIRAPALA

por métodos bioinformáticos.

2. Estudiar la viabilidad de células HeLa incubadas con el péptido TIRAP o TIRAPALA

.

3. Caracterizar uno de los posibles mecanismos de internalización de TIRAP o

TIRAPALA

en células HeLa.

13

4. METODOLOGÍA

4.1. Modelamiento de las Estructuras Tridimensionales de TAT, TIRAP y TIRAPALA

.

Alineamientos y Selección de las Plantillas.

Se realizó una búsqueda exhaustiva de secuencias conocidas, que presenten los mejores

alineamientos con las secuencias objetivo, con el propósito de utilizarlas como plantillas para el

modelamiento. Esta búsqueda se realizó en dos bases de datos: (1) El servidor en línea FUGUE

(Versión 2.0) [40], el cual utiliza la base de datos HOMSTRAD [41] y (2) búsqueda tipo Fasta1

[42] a en la base de datos PROTEIN DATA BANK (PDB) [43-44].

Ambas bases de datos y sus respectivos motores de búsqueda, se utilizaron para encontrar

los mejores alineamientos contra las tres secuencias objetivo. Las plantillas fueron seleccionadas

según los mejores valores para los parámetros estadísticos que arrojaron las búsquedas:

ZSCORE2 y E-Value

3 para FUGUE y PDB, respectivamente.

Las secuencias primarias de TAT, TIRAP y TIRAPALA

se muestran en la Tabla 2.

Obtención de los Modelos, Validación, Refinamiento y Modelo Final.

Para la obtención de las estructuras, se utilizó el software MODELLER, el cual es usado

para el modelamiento tridimensional de proteínas por homología o comparación [45-46],

satisfaciendo las restricciones espaciales impuestas por las plantillas [47-48]. Las plantillas

utilizadas para el modelamiento comparativo de cada secuencia fueron (identificación PDB):

1 El algoritmo Blast se usa con mayor frecuencia que Fasta. A pesar de que Fasta es más lento, entrega resultados con

mayor precisión. 2 Z-score normalizado por la divergencia de la secuencia.

ZSCORE Clasificación Confianza

≥ 6,0 Seguro 99%

≥ 4,0 Probable 95%

≥ 3,5 Menor 90%

≥ 2,0 Estimación Aproximada 50%

< 2,0 Incierto < 50%

3 Corresponde al número de alineamientos diferentes con puntuación equivalente o mejor, que el puntaje de

alineamiento en bruto que puede ocurrir en la base de datos por casualidad. Este valor provee un puntaje de

confianza para Bit Score, mientras más bajo, más significativo es el Bit Score.

14

TAT: 1JFW, 1K5K, 2W18, 1TAC, 1TVS1FW5, 2VCP, 2GRG, y 1H8B.

TIRAP y TIRAPALA

: 1SRA, 2DYO, y 1H8B.

El primer modelo obtenido con el software MODELLER, se seleccionó como el mejor de

100 estructuras diferentes generadas a partir de las plantillas correspondientes a cada secuencia.

Se utilizó el índice DOPE score (menor valor) como criterio de selección.

Para comprobar la validez y calidad de las estructuras terciarias obtenidas, se utilizó el

servidor en línea VADAR [49], con el fin de detectar errores en el modelo 3D e intentar

repararlos con las herramientas de refinamiento de estructuras de MODELLER.

Se generaron 100 refinamientos diferentes a partir de cada uno, y se seleccionó el mejor

modelo (menor DOPE score), para luego realizar nuevamente la verificación de la calidad de las

estructuras obtenidas.

La adición de átomos de hidrógeno, terminadores (extremo amino y carboxilo) y

corrección de errores en ángulos de cadenas laterales, se realizó con el servidor en red

MolProbity [50]. La validación final de las estructuras, luego de los cambios anteriores, se realizó

con el servidor VADAR para TIRAP y TIRAPALA

, y con el servidor MolProbity para la

secuencia TAT.

4.2. Cálculo del Campo de Potencial Electrostático sobre la Superficie de los Péptidos.

Antes del realizar el cálculo del campo de potencial electrostático sobre la superficie

(CPES) de los péptidos, fue necesario transformar el archivo de coordenadas .pdb, al formato

.pqr. Para ello se utilizó el servidor en línea PDB2PQR [51], empleando las condiciones estándar

para proteínas: campo de fuerza tipo PARSE y pH 7.

El cálculo del CPES de cada uno de los péptidos, se hizo utilizando el software APBS

[52] (a través de la interfaz gráfica del software PyMOL [53]), el cual usa FEtk [54-55] para

resolver la ecuación de Poisson-Boltzmann mediante integración por métodos numéricos. Los

parámetros que se establecieron para estos cálculos son: temperatura 310,15 ⁰K (37°C),

concentración de iones monovalentes 0,15 M (c/u), radio iónico 2,04.

4 Valores recomendados para la resolución de la ecuación de Poisson-Boltzmann en péptidos.[56] N.A. Baker, APBS

electrostatics in PyMOL - Software, in, 2001.

15

4.3. Viabilidad de células HeLa en Función de la Concentración de Péptidos TIRAP y

TIRAPALA

.

Células HeLa fueron incubadas a 37ºC, 5% CO2, en medio Dulbecco’s modified Eagle’s

high glucose (Gibco), conteniendo 10% de suero fetal bovino (Gibco), 100 U/ml de penicilina y

100 µg/ml de estreptomicina.

La determinación de la viabilidad celular se llevó a cabo mediante la tinción con yoduro

de propidio (IP), el cual es un indicador de células en apoptosis tardía. Las células fueron

sembradas en una placa de 48 pocillos (105 células/pocillo, confluencia del 40%

5) y tratadas con

péptido disuelto en medio de cultivo en un rango de 0 a 100 µM por 16 horas a 37ºC, 5% CO2.

Una vez finalizado el tratamiento, se recolectó el medio de incubación junto con las células

cosechadas con 25 mM de EDTA. Las células fueron centrifugadas a 1200 rpm por 5 minutos a

4⁰C y resuspendidas en buffer FACS para ser analizadas inmediatamente en el citómetro. Se

utilizó un Citómetro de Flujo de 4 colores (BECTON DICKINSON, modelo FACSCalibur

342976, serie: E97600098; incluye FACStation MACINTOSH modelo PowerMac G5 A1047,

EMC Nº 2061).

Como control positivo de muerte, se utilizaron células HeLa incubadas con

Estaurosporina en un rango de 0 a1 µM, bajo las mismas condiciones anteriormente descritas. La

medición de la muerte celular se realizó utilizando el mismo procedimiento anterior.

El protocolo detallado de la metodología descrita, se encuentra en el Anexo A.

4.4. Medición de la Internalización de TIRAP y TIRAPALA

en Células HeLa Utilizando

Concentraciones Crecientes de Estreptavidina-R-Phycoerythrin.

Células Hela fueron incubadas en medio Dulbecco’s modified Eagle’s high glucose

(Gibco), conteniendo 10% de suero fetal bovino (Gibco), 100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de

estreptomicina, a 37ºC, 5% CO2.

La cuantificación de la internalización de los péptidos unidos covalentemente a biotina, se

llevó a cabo utilizando concentraciones crecientes de Estreptavidina conjugado con el fluoróforo

R-Ficoeritrina (Estreptavidina-R-PE) (Molecular Probes). Las células fueron sembradas en placas

5 Porcentaje de confluencia calculado por análisis de imágenes mediante un software programado en Java

especialmente para este trabajo. Metodología descrita en la sección 4.5.

16

de 48 pocillos (105 células/pocillo, confluencia del 40%

6) y tratadas con péptido disuelto en

medio de cultivo 0 y 40 µM por 2 horas a 37ºC, 5% CO2. Posteriormente, se recolectó el medio

de incubación junto con las células que fueron cosechadas con EDTA 25 mM, para ser lavadas en

PBS (2000 rpm, 2 min, 4ºC) y distribuidas en una placa de 96 pocillos.

Para diferenciar la fluorescencia correspondiente a los péptidos internalizados de los

ligados a la superficie celular, las células fueron tratadas con Fixation/Permeabilization 1X (o

fijación-permeabilización) (eBioscience) por 30 minutos a 4ºC, y comparadas con las células

tratadas con PBS. Las células fueron lavadas en Permeabilization Buffer 1X (o buffer de

permeabilización) (eBioscience) o PBS según corresponda (2500 rpm, 2 min, 4ºC), para luego ser

incubadas con Estreptavidina-R-PE en un rango de 0 a 100 µg/ml (diluido en buffer de

permeabilización 1X o PBS según corresponda) durante 10 minutos a temperatura ambiente en

oscuridad.

Finalmente, las células fueron lavadas en buffer de permeabilización 1X o PBS según

corresponda (2500 rpm, 2 min, 4ºC) y resuspendidas en buffer FACS para ser analizadas por

citometría de flujo.

El protocolo detallado de la metodología anteriormente descrita, se encuentra en el Anexo

B.

4.5. Cálculo del Porcentaje de Confluencia en Cultivos de Células HeLa.

Para calcular el porcentaje de confluencia de un cultivo de células HeLa, se tomó una

fotografía digital a través de un microscopio invertido, la cual representa una muestra aleatoria

simple.

La fotografía es procesada utilizando el editor de imágenes Paint, de tal forma que quede

como un mapa de bits de 12 colores. Posteriormente, la imagen es analizada con el programa

GeneraColor, el cual cuenta el número de pixeles correspondiente a cada color y entrega una

planilla Excel con el código rgb del color y la frecuencia de aparición en la imagen.

Finalmente, se identifica el color que corresponde a las células adheridas, y se hace el

cálculo del porcentaje de aparición de dicho color de pixel sobre el total de pixeles en la imagen,

6 Porcentaje de confluencia calculado por análisis de imágenes mediante un software programado en Java, creado

especialmente para este trabajo de tesis. Metodología descrita en la sección 4.5.

17

el cual corresponde finalmente a la confluencia. Este cálculo es más certero que la comúnmente

utilizada estimación visual.

En el Anexo C se encuentran los códigos de las clases programadas, creados para este

trabajo de tesis.

Este programa fue diseñado personalmente y programado en conjunto con un Ingeniero

Civil en Computación.

18

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

5.1. Mejores Alineamientos Obtenidos.

En las Tablas 3, 4 y 5 se muestran los alineamientos seleccionados en formato JOY [57]

para las secuencias TAT, TIRAP y TIRAPALA

, respectivamente. Estas estructuras fueron

utilizadas como plantillas para el modelamiento de las estructuras. En el Anexo D se encuentra

una tabla con la simbología JOY.

Mejores Alineamientos para TAT.

Tabla 3: Mejores alineamientos para la secuencia TAT representados en formato JOY. Solo se muestran los 2

alineamientos con menor E-Value y mayor porcentaje de similitud. Los restantes 9 alineamientos se encuentran en el

Anexo E.

Alineamiento E-Value Similitud

10 20 30 40 50

1jfw ( 1) mePvdPrLepwkHPGsqpktacttcyckkccfhcqvcfttkaLGisygrk

TAT -----------------------------------------------GRK

ββ ββ

60 70 80

1jfw ( 51) krrqrrrPpqgsqtHqvslskqptsqprGDptgpke

TAT KRRQRRRPPQ--------------------------

0,0040 100%

10 20 30 40 50

1k5k ( 1) mDpvdPnlepwNHPGSqprtPcnkcyckkccyHcqmcfitkglgiSYGrk

TAT -----------------------------------------------GRK

60 70 80

1k5k ( 51) krrqrrrppqGnqAhqDPlpeqpssqhrgdHPtgpke

TAT KRRQRRRPPQ---------------------------

αααα

0,0041 100%

Mejores Alineamientos para TIRAP.

Tabla 4: Mejores alineamientos para la secuencia TIRAP representados en formato JOY. Solo se muestra el mejor

alineamiento (mayor ZSCORE). Los restantes 2 alineamientos se encuentran en el Anexo F.

Alineamiento ZSCORE Confianza

10 20 30 40 50

1sra (136) ppÇldselteFplrMrdwLKnvLvtlyerDednnlLtekqklrVkkihen

TIRAP ------------GKMADWFRQTLLKKPKKRPNSPEST-------------

ααααααααααααααααααααααααα αααααααααααα

60 70 80 90 100

1sra (186) ekrleagdhpvelLardfeknynMYifPVHwqFgqlDqhpidgyLshtEl

TIRAP --------------------------------------------------

αααααααααα 3333ααααααααααα ββ

110 120 130 140 150

1sra (236) apLraplIpmehÇTtrFFetÇdldndkyIaLdeWAgçFgIkqkdidkdlv

TIRAP --------------------------------------------------

3333 333αααααααα ββααααααα 333 333

1sra (286) i

TIRAP -

5,39 95%

19

Mejores Alineamientos para TIRAPALA

.

Tabla 5: Mejores alineamientos para la secuencia TIRAPALA representados en formato JOY. Solo se muestra el mejor

alineamiento (mayor ZSCORE). Los restantes 2 alineamientos se encuentran en el Anexo G.


10 20 30 40 50

1sra ( 136) ppÇldselteFplrMrdwLKnvLvtlyerDednnlLtekqklrVkkihen

TIRAPALA ------------GKMADWFRQTLLAAPAAAPNSPEST-------------

ααααααααααααααααααααααααα αααααααααααα

60 70 80 90

100

1sra ( 186) ekrleagdhpvelLardfeknynMYifPVHwqFgqlDqhpidgyLshtEl

TIRAPALA --------------------------------------------------

αααααααααα 3333ααααααααααα ββ

110 120 130 140

150

1sra ( 236) apLraplIpmehÇTtrFFetÇdldndkyIaLdeWAgçFgIkqkdidkdlv

TIRAPALA --------------------------------------------------

3333 333αααααααα ββααααααα 333 333

1sra ( 286) i

TIRAPALA -

4,93 95%

5.2. Tablas de Información General Entregadas por VADAR en la Revisión de las Estructuras

Obtenidas con MODELLER.

En las Tablas 6 y 7, se muestra el análisis de la calidad de las primeras estructuras

obtenidas con MODELLER a partir de las plantillas seleccionadas para TIRAP y TIRAPALA7

.

Estas Tablas de información general fueron entregadas por el servidor web VADAR [49].

Los resultados arrojados por los análisis fueron claves para identificar los residuos con

problemas espaciales, es decir, que no satisfacen las restricciones impuestas. Para TIRAP, se

identifican problemas en los residuos 6 y 24, mientras que para TIRAPALA

los problemas están en

los residuos 11, 20 y 25.

La columna PRBLM señala los tipos de errores que puede presentar el residuo:

A: indica posible problema con ASA (área superficial accesible) fraccional (fASA > 1.0).

V: indica posible problema con volumen fraccional (fV < 0.8 o fV > 1.2).

P: indica posible problema con ángulos Phi y Psi [58].

O: indica posible problema con ángulo Omega (omega > 170 o omega < -170).

C: indica enlace peptídico cis (-20 < omega < 20).

7 Para la secuencia de TAT no se realizó el análisis estructural con VADAR, puesto que posee menos de 15

aminoácidos.

20

TIRAP.

Tabla 6: Análisis estructural del primer modelo tridimensional obtenido para la secuencia TIRAP, utilizando como

plantillas las estructuras descritas en la Tabla 4. Los valores resaltados en rojo indican los parámetros con problemas.

RES. RES. SCND HBOND BTURN RES. FRAC. RES. FRAC. PHI PSI OMEGA PRBLM

NUM. NAME STRUC HBOND BTURN ASA ASA VOL. VOL. PHI PSI OMEGA PRBLM

---------------------------------------------------------------------------------------

1 GLY CCC C 4,5 64.5 0.71 57.6 0.91 360.0 168.5 179.7

2 LYS HHH H 5,6 182.9 0.85 157.1 1.02 -62.6 -43.7 -177.7

3 MET HHH H 6,7 145.3 0.67 142.0 0.87 -64.3 -40.1 -177.1

4 ALA HHH H 8,7 55.3 0.45 73.3 0.84 -61.4 -42.9 -179.0

5 ASP HHH H 1,9 88.1 0.56 120.7 1.06 -64.5 -34.5 -177.2

6 TRP HHH H 2,10 152.8 0.57 179.2 0.78 -60.6 -45.6 -177.6 V

7 PHE HHH H 3,11 114.9 0.51 169.0 0.86 -61.5 -46.8 -176.1

8 ARG HHH H 4,11 177.1 0.73 159.8 0.91 -60.8 -47.7 -176.3

9 GLN HHH H 5,13 80.1 0.42 118.2 0.85 -65.2 -44.0 -176.7

10 THR HHH H 6,13 27.2 0.18 98.4 0.84 -64.3 -44.2 -175.5

11 LEU HHH H 7,13 69.0 0.33 132.4 0.81 -63.3 -40.9 -177.7

11 LEU HHH H 8,16 123.1 0.59 135.7 0.83 -61.8 -39.8 -177.8

13 LYS HHH H 9,16 114.9 0.54 151.1 0.98 -62.3 -36.1 -175.0

13 LYS HHH H 10,18 119.4 0.56 138.1 0.90 -59.4 -51.9 176.4

15 PRO HHH H 11,19 77.6 0.50 113.2 0.98 -65.6 -27.7 178.4

16 LYS HHH H 11,13 142.6 0.67 142.1 0.92 -63.9 -44.2 -174.5

16 LYS HHH H 13,21 133.4 0.62 153.7 1.00 -64.8 -44.2 -172.2

18 ARG HHH H 13,21 III 185.9 0.76 159.0 0.91 -64.3 -48.8 -179.6

19 PRO HHH H 15 III 96.1 0.62 104.0 0.90 -68.1 -24.2 -176.7

20 ASN HHH H 16,16 III 93.2 0.56 98.3 0.84 -65.5 -36.6 -176.1

21 SER CCC C 16,18 III 29.2 0.22 78.8 0.87 -59.8 137.5 174.7

22 PRO CCC C 25 III 79.5 0.51 94.0 0.82 -68.5 152.7 -177.8

23 GLU CCC C III 166.9 0.88 110.7 0.83 -64.0 -39.7 -177.3

24 SER CCC C III 112.4 0.85 72.0 0.80 -61.5 -53.0 -179.7 V

25 THR CCC C 22 III 129.5 0.86 101.3 0.87 -94.9 360.0 360.0

TIRAPALA

.

Tabla 7: Análisis estructural del primer modelo tridimensional obtenido para la secuencia TIRAPALA, utilizando como

plantillas las estructuras descritas en la Tabla 5. Los valores resaltados en rojo indican los parámetros con problemas.



---------------------------------------------------------------------------------------

1 GLY CCH C 4,5 85.9 0.95 53.6 0.85 360.0 -66.1 180.0

2 LYS HHH H 5,6 181.9 0.85 138.2 0.90 -63.1 -40.9 -178.2

3 MET HHH H 6,7 126.1 0.58 153.3 0.94 -64.5 -45.8 -173.9

4 ALA HHH H 8,7 69.4 0.56 73.3 0.84 -64.5 -48.3 -176.9

5 ASP HHH H 1,9 85.3 0.54 95.5 0.84 -69.8 -29.8 178.9

6 TRP HHH H 2,10 147.5 0.55 203.2 0.88 -63.4 -37.4 -178.9

7 PHE HHH H 3,11 105.2 0.46 158.5 0.81 -60.1 -44.3 -179.6

8 ARG HHH H 4,11 149.4 0.61 154.2 0.88 -61.9 -38.1 -177.1

9 GLN HHH H 5,13 88.3 0.47 121.4 0.87 -62.0 -41.8 -179.3

10 THR HHH H 6,13 36.6 0.24 117.3 1.00 -65.9 -36.7 -179.8

11 LEU HHH H 7,8 61.8 0.30 125.1 0.77 -61.6 -45.2 -176.3 V

11 LEU HHH H 8,16 96.1 0.46 144.9 0.89 -63.3 -41.8 -175.5

13 LYS HHH H 9,16 123.3 0.58 138.7 0.90 -63.4 -37.0 -178.4

13 LYS HHH H 10,18 80.4 0.38 150.8 0.98 -60.7 -46.0 173.4

15 PRO HHH H 11,18 65.6 0.42 101.4 0.88 -62.6 -28.3 177.3

16 LYS HHH H 11,13 161.1 0.75 139.5 0.91 -64.3 -40.7 178.5

16 LYS HHH H 13,13 108.1 0.50 144.1 0.94 -62.1 -26.0 -173.9

18 ARG HHH H 13,15 140.7 0.58 171.9 0.98 -55.9 -41.2 172.8

19 PRO CCC C 16 111.0 0.72 97.5 0.85 -64.1 107.0 -176.8

20 ASN CCC C 118.9 0.72 95.0 0.81 151.5 -146.4 178.5 P

21 SER CBC C 61.2 0.46 85.0 0.94 -66.5 156.3 -178.0

22 PRO CBC C 120.6 0.78 110.9 0.96 -51.8 124.2 -177.6

23 GLU CBC C 45.5 0.24 136.0 1.02 -141.3 139.0 179.5

24 SER CCC C 63.5 0.48 85.5 0.94 48.3 55.4 -178.0

25 THR CCC C 178.5 1.18 107.6 0.92 -47.4 360.0 360.0 A

21

A partir de lo indicado en las Tablas 6 y 7, el problema más común que se presenta en las

estructuras corresponde al volumen fraccional, el cual está calculado como el volumen ocupado

por un residuo definido por su radio atómico y sus vecinos más cercanos. Cuando este valor es

menor a 0.8 (como en el caso de los residuos 6 y 24 en TIRAP, 11 en TIRAPALA

), quiere decir

que el residuo se encuentra en una región comprimida.

Luego del refinamiento con MODELLER y selección del mejor modelo obtenido

utilizando el índice Dope score (menor valor), se realizó nuevamente la verificación de la calidad

de las estructuras con VADAR. El análisis estructural posterior al refinamiento se muestra en las

Tablas 8 y 9.

Como se puede observar en las Tablas 8 y 9, el análisis arrojado indica mejoras en la

calidad de las estructuras. Los problemas detectados en TIRAP se mantuvieron a pesar de los

refinamientos realizados. Es posible que estos residuos estén forzados a permanecer en estos

valores de volumen fraccional por acción de los residuos vecinos, de tal forma que si se

modifican la estructura completa pierde calidad. Aún así, 2 de los 3 residuos con problemas

detectados en la estructura de TIRAPALA

si fueron corregidos completamente (residuos 11 y 20),

mientras que el residuo 25, sin bien permanece con problemas de área superficial accesible, su

valor se corrigió levemente disminuyendo en 0,02 grados.

22

TIRAP.

Tabla 8: Análisis estructural del modelo tridimensional refinado obtenido para la secuencia TIRAP. Los valores

resaltados en rojo indican los parámetros con problemas.



---------------------------------------------------------------------------------------

1 GLY CCC C 4,5 64.5 0.71 57.6 0.91 360.0 168.5 179.7

2 LYS HHH H 5,6 182.9 0.85 157.1 1.02 -62.6 -43.7 -177.7

3 MET HHH H 6,7 147.5 0.68 142.5 0.87 -64.3 -40.1 -177.1

4 ALA HHH H 1,8 55.3 0.45 73.3 0.84 -61.4 -42.9 -179.0

5 ASP HHH H 1,9 88.1 0.56 120.5 1.06 -64.5 -36.7 -176.6

6 TRP HHH H 2,10 167.9 0.63 180.0 0.78 -62.8 -41.9 -178.9 V

7 PHE HHH H 3,11 125.7 0.55 172.5 0.88 -60.1 -46.8 -176.1

8 ARG HHH H 4,11 177.1 0.73 159.8 0.91 -60.8 -47.7 -176.3

9 GLN HHH H 5,13 73.5 0.39 116.3 0.84 -65.2 -44.0 -176.7

10 THR HHH H 6,13 28.6 0.19 99.3 0.85 -64.3 -44.2 -175.5

11 LEU HHH H 7,13 69.0 0.33 132.4 0.81 -63.3 -40.9 -177.7

11 LEU HHH H 8,16 123.1 0.59 135.7 0.83 -61.8 -39.8 -177.8

13 LYS HHH H 9,16 114.9 0.54 151.1 0.98 -62.3 -36.1 -175.0

13 LYS HHH H 10,18 119.4 0.56 138.1 0.90 -59.4 -51.9 176.4

15 PRO HHH H 11,19 77.6 0.50 113.2 0.98 -65.6 -27.7 178.4

16 LYS HHH H 11,13 142.6 0.67 142.1 0.92 -63.9 -44.2 -174.5

16 LYS HHH H 13,21 133.4 0.62 153.7 1.00 -64.8 -44.2 -172.2

18 ARG HHH H 13,21 III 185.9 0.76 159.0 0.91 -64.3 -48.8 -179.6

19 PRO HHH H 15 III 96.1 0.62 104.0 0.90 -68.1 -24.2 -176.7

20 ASN HHH H 16,16 III 93.2 0.56 98.3 0.84 -65.5 -36.6 -176.1

21 SER CCC C 16,18 III 29.2 0.22 78.8 0.87 -59.8 137.5 174.7

22 PRO CCC C 25 III 77.6 0.50 94.5 0.82 -68.5 152.7 -177.8

23 GLU CCC C III 167.9 0.88 111.2 0.83 -64.0 -40.6 -177.7

24 SER CCC C III 113.6 0.86 72.1 0.80 -61.1 -46.0 177.1 V

25 THR CCC C 22 III 129.9 0.86 102.7 0.88 -103.4 360.0 360.0

TIRAPALA

Tabla 9: Análisis estructural del modelo tridimensional refinado obtenido para la secuencia TIRAPALA. Los valores

resaltados en rojo indican los parámetros con problemas.



---------------------------------------------------------------------------------------

1 GLY CCH C 4,5 89.4 0.98 55.6 0.88 360.0 74.2 -180.0

2 LYS HHH H 5,6 180.9 0.84 140.0 0.91 -62.6 -41.3 179.5

3 MET HHH H 6,7 136.0 0.62 148.3 0.91 -63.1 -39.8 -178.0

4 ALA HHH H 1,7 56.1 0.45 80.7 0.93 -62.3 -38.7 -177.7

5 ASP HHH H 1,9 72.2 0.46 106.6 0.94 -61.0 -39.0 180.0

6 TRP HHH H 2,10 139.7 0.52 191.7 0.83 -62.7 -38.7 -176.4

7 PHE HHH H 3,11 98.6 0.43 157.8 0.81 -60.7 -43.9 -179.3

8 ARG HHH H 5,11 172.8 0.71 150.1 0.86 -60.9 -42.0 -176.2

9 GLN HHH H 5,13 120.2 0.64 120.0 0.86 -62.0 -45.2 -178.8

10 THR HHH H 6,13 37.9 0.25 95.5 0.82 -66.0 -42.3 -175.3

11 LEU HHH H 7,13 102.3 0.49 135.5 0.83 -62.6 -40.7 -178.9

11 LEU HHH H 8,16 150.3 0.72 161.8 0.99 -63.4 -41.6 -176.7

13 ALA HHH H 16,16 54.7 0.44 87.8 1.01 -62.9 -39.4 -173.0

13 ALA HHH H 10,16 53.5 0.43 73.6 0.84 -61.0 -48.6 176.6

15 PRO HHH H 11,19 80.6 0.52 101.8 0.88 -66.3 -23.9 178.3

16 ALA HHH H 11,13 64.5 0.52 79.4 0.91 -64.8 -45.3 -175.3

16 ALA HHH H 13,20 65.7 0.53 72.9 0.84 -65.9 -43.8 -170.5

16 ALA HHH H 13,21 68.2 0.55 69.9 0.80 -62.5 -48.0 -179.6

19 PRO HHH H 15,22 III 88.8 0.57 107.6 0.93 -69.3 -18.3 -178.0

20 ASN CHH H 23,16 III 91.1 0.55 94.4 0.81 -67.0 -28.3 -177.7

21 SER CHH H 16,24 III 88.9 0.67 72.6 0.80 -61.9 -36.8 -174.3

22 PRO CHH H 19 III 106.6 0.69 95.2 0.83 -65.4 -18.7 -178.0

23 GLU CHH H 20,21 95.6 0.50 119.3 0.90 -63.8 -37.6 -176.0

24 SER CCC C 21 105.8 0.80 75.1 0.83 66.8 25.9 178.6

25 THR CCC C 175.4 1.16 112.0 0.96 -114.7 360.0 360.0 A

23

Luego de la adición de átomos de hidrógeno y terminadores (extremo amino y

carboxilo), se corrigieron errores en ángulos de cadenas laterales, los cuales fueron detectados a

través del servidor en red MolProbity. Los cambios que se realizaron se muestran en la Tabla 10.

Tabla 10: Cambio en los ángulos de cadenas laterales realizados para el mejoramiento de la calidad de la estructura 3D.

Péptido # Residuo ID Residuo Origen Flip Flip-Origen

TAT 13 GLN -1,90 -0,54000 1,36000

TIRAP 20 ASN -3,70 -2,00000 1,70000

TIRAPALA

09 GLN -0,19 -0,00041 0,18959

20 ASN 0,19 -0,25000 -0,44000

5.3. Análisis Estructural de los Modelos Finales Obtenidos.

La validación final de las estructuras obtenidas luego de los cambios anteriores, se realizó

con MolProbity. En las Figuras 6, 7 y 8 se muestran los gráficos de Ramachandran para las

secuencias de TAT, TIRAP y TIRAPALA

, respectivamente.

Gráficos de Ramachandran de las Estructuras Finales.

TAT.

Figura 6: Gráfico de Ramachandran de la estructura final de la secuencia TAT. Las regiones delimitadas por una línea

celeste corresponden las zonas óptimas, aquellas delimitadas con una línea azul son zonas permitidas, las regiones sin

delimitación corresponden a zonas no permitidas. Gráfico obtenido con MolProbity.

24

TIRAP.

Figura 7: Gráfico de Ramachandran de la estructura final de la secuencia TIRAP. Las regiones delimitadas por una línea

celeste corresponden las zonas óptimas, aquellas delimitadas con una línea azul son zonas permitidas, las regiones sin


TIRAPALA

.

Figura 8: Gráfico de Ramachandran de la estructura final de la secuencia TIRAPALA. Las regiones delimitadas por una

línea celeste corresponden las zonas óptimas, aquellas delimitadas con una línea azul son zonas permitidas, las regiones sin


25

La Tabla 11 muestra el resumen del análisis de calidad para las estructuras finales de

TAT, TIRAP y TIRAPALA

.

Si bien, el porcentaje de rotámetros pobres excede la meta impuesta (la cual está

configurada por el servidor utilizado), se considera aceptable puesto que sólo un residuo de cada

modelo presenta este problema.

Tabla 11: Tabla resumen del análisis de calidad de la estructura realizada con MolProbity. Se comparan los resultados de

las secuencias TAT, TIRAP y TIRAPALA.

Parámetro TAT TIRAP TIRAPALA

Meta

Rotámetros Pobres 8.33% (01/12) 4.35% (01/13) 5.56% (01/18) < 1.0%

Ramachandran outliers 0.00% (00/11) 0.00% (00/23) 0.00% (00/23) < 0.2%

Ramachandran favorecidos 100% (11/11) 100% (23/23) 100% (23/23) > 98.0%

Desviaciones Cβ > 0.25 Å 0 0 1 0

Residuos con malos enlaces 0.00% 0.00% 0.00% 0.0%

Residuos con malos ángulos 0.00% 0.00% 0.00% < 0.1%

5.4 Características de las Estructuras Tridimensionales de los Péptidos.

Se puede observar de la Figura 9, que al reemplazar lisina (LYS, K) y arginina (ARG, R)

por alanina (ALA, A) en el péptido TIRAP para formar TIRAPALA

(Figura 9C y 9E), la estructura

secundaria varía aumentado levemente el porcentaje de α-hélice en la estructura de TIRAPALA

con respecto a la estructura de TIRAP.

26

(A) TAT: Vista simple más cadenas laterales (B) TAT: Vista de la superficie

(C) TIRAP: Vista simple más cadenas laterales (D) TIRAP: Vista de la superficie

(E) TIRAPALA

: Vista simple más cadenas

laterales (F) TIRAP

ALA: Vista de la superficie

Figura 9: Dos vistas diferentes para los modelos 3D creados de los péptidos (A, B) TAT, (C, D) TIRAP y (E, F) TIRAPALA.

Los puntos rosados corresponden a los átomos de las cadenas laterales pertenecientes a los aminoácidos de interés. En la

vista simple más cadenas laterales, el color azul indica el extremo amino, y el color rojo el extremo carboxilo. En la vista

de superficie, los colores representan: verde = C, blanco = H, rojo = O, azul = N. Imágenes generadas con PyMol [53].

Este cambio no es atribuible a las plantillas utilizadas, puesto que se usaron las mismas

para ambas secuencias, más bien podría explicarse dado el menor tamaño del residuo de alanina

(89,09 g/mol) en comparación al de lisina (146,19 g/mol) y arginina (174,2 g/mol). Es posible

que el residuo de arginina esté interactuando con las cadenas laterales de los residuos vecinos

(interacción estérica), interfiriendo de esta forma con la formación de vueltas helicoidales en la

última sección de la estructura. Así, al reemplazarse con un aminoácido de cadena lateral más

pequeña, esta interacción disminuye permitiendo la estructura α-hélice en los residuos cercanos al

extremo carboxilo.

27

Las estructuras obtenidas presentan grandes similitudes estructurales (Tabla 12),

predominando fuertemente la estructura secundaria tipo α-hélice, siendo su composición mayor al

69% en los tres modelos obtenidos.

Tabla 12: Resumen de las características estructurales de los péptidos modelados. Se describe el número de aminoácidos

que participa en cada tipo de estructura secundaria y su respectivo porcentaje.

Observado

Parámetro TAT TIRAP TIRAPALA

# α-Hélice 09 (69%) 19 (76%) 22 (88%)

# Hoja-β 00 (00%) 00 (00%) 00 (00%)

# Coil 04 (31%) 06 (24%) 03 (12%)

Con respecto a las plantillas utilizadas para el modelamiento de las estructuras, se puede

notar en el caso de la secuencia TAT, que a pesar de que las dos estructuras con mejor

alineamiento según PDB (1K5K y 1JFW) presentan efectivamente 100% de similitud, las

estructuras secundarias de las plantillas (ver Anexo H) son muy diferentes al modelo final

obtenido, siendo 1K5K y 1JFW principalmente tipo coil versus la predominancia de α-hélice en

TAT. Esto da una idea que, para la obtención de un modelo aceptable, no sólo es necesario la

utilización de buenas plantillas, sino que también del refinamiento posterior y las condiciones de

borde que se le den al modelo. En el caso particular de TAT, las condiciones de borde fueron

entregadas por las plantillas con secuencias más cortas.

A pesar de la buena evaluación de las estructuras obtenidas (#Outliers 0, en Tabla 11)

mostrados en las los gráficos de Ramachandran de las Figuras 6, 7 y 8, aún existen problemas en

los modelos obtenidos. Estos defectos se deben principalmente a superposiciones estéricas entre

algunos átomos de cadenas laterales vecinas, mostrados por los índices entregados por VADAR

(Tablas 8 y 9) y MolProbity (Tabla 11), los cuales deben ser corregidos en el futuro utilizando,

por ejemplo, técnicas de refinación basadas en simulaciones de dinámica molecular.

5.5. Campo de Potencial Electrostático en la Superficie del Péptido.

Los cálculos obtenidos fueron determinados en condiciones estándar, es decir, a pH 7,

temperatura 37⁰C y 0,15 M de iones monovalentes. Estos parámetros son muy similares a las

condiciones experimentales (pH 7,3 y salinidad fisiológica), por lo que las variaciones deberían

ser despreciables. Así, los resultados obtenidos se asumen válidos para los análisis posteriores.

28

Los modelos indican que las sustituciones en la secuencia primaria de TIRAP, no provoca

un cambio importante en la estructura secundaria, sin embargo, el potencial electrostático varía

fuertemente. Esto sugiere que el campo electrostático puede ser una de las características

importantes que le otorga a los CPPs la permeabilidad a la membrana plasmática, y por lo tanto,

jugar un papel importante en el mecanismo de internalización de los péptidos.

(A) TAT

(B) TIRAP

(C) TIRAPALA

Figura 10: Mapa del potencial electrostático en la superficie de (A) TAT, (B) TIRAP y (C) TIRAPALA. Las regiones azules

corresponden al sector del campo que tiene valor +1, las blancas con valor neutro y las de color rojo con valor -1. Los

puntos rosados corresponden a los átomos de las cadenas laterales pertenecientes a los aminoácidos de interés. Imágenes

generadas con PyMol [53].

Como se puede observar en la Figura 10, el CPES positivo predomina considerablemente

por sobre negativo, tanto para TAT como para TIRAP. La estructura de TIRAPALA

presenta un

mapa superficial mas homogéneamente distribuido.

29

En la Figura 11 se comparan las isosuperficies de módulo 0 y 1 para las 3 estructuras. En

TIRAP al igual que en TAT, la isosuperficie electrostática positiva es la que domina el campo

superficial, con un área claramente mayor al de la isosuperficie negativa.

En el caso de la secuencia de TIRAPALA

, el reemplazo de los aminoácidos catiónicos por

alaninas genera disminución de área de la isosuperficie electrostática positiva, balanceando en

cierto modo el campo sobre la superficie. Es más, en TIRAPALA

, la isosuperficie electrostática

neutra, muestra que se podría definir un dipolo sobre la superficie del péptido.

Isosuperficie -1 kT Isosuperficie 0 kT Isosuperficie +1 kT

TAT

TIRAP

TIRAPALA

Figura 11: Isosuperficies del campo de potencial electrostático calculado sobre la superficie de los péptidos TAT, TIRAP y

TIRAPALA, de valores -1, 0 y +1 kT. Los puntos rosados corresponden a los átomos de las cadenas laterales pertenecientes

a los aminoácidos de interés. Imágenes generadas con PyMol [53].

Debido a lo anteriormente expuesto, se plantea que las diferencias en el grado de

internalización de TIRAP y TIRAPALA

reportados por Low y cols. (Figura 5) [9], se deben a la

interacción del campo electrostático entre la superficie de éstos y las moléculas de la membrana

celular, y no a la conformación de la estructura secundaria de los péptidos. Esta observación se

discutirá con los resultados presentados más adelante.

30

5.6. Determinación del Umbral de Viabilidad.

Control Blanco: Células HeLa sin estímulo.

En la Figura 12 se pueden ver los gráficos de puntos (o Dot Plots) representativos (n = 3),

obtenidos mediante citometría de flujo de células HeLa. Cada punto representa un evento (una

célula), y la diferencia de colores determina la densidad de, siendo las zonas azules las de mayor

densidad, seguido por las zonas de color verde, amarillo y rojo. El parámetro SSC-H (Side

Scatter) caracteriza la granularidad de las células, mientras que FSC-H (Forward Scatter)

caracteriza el tamaño celular. El canal FL2-H detecta la emisión de yoduro de propidio o IP (562-

588 nm), el cual se intercala en el ADN otorgándole fluorescencia a las células en apoptosis

tardía, por lo que esta tinción se utiliza como indicador de muerte celular. El umbral de

autofluorescencia de las células se fijó de tal modo que cerca del 99,5% de las células control

queden por debajo de éste. El número señalado en la esquina inferior derecha, indica el

porcentaje de células que sobrepasan el umbral de autofluorescencia, es decir, que han sido

marcadas o teñidas con el fluoróforo.

Figura 12: (A) Caracterización de la población de células HeLa en el gráfico de puntos SSC-H (granularidad) versus FSC-

H (tamaño). (B) Gráfico de granularidad versus intensidad de fluorescencia (medido en el canal FL2-H) para la

determinación del umbral de intensidad de fluorescencia propia de la población (autofluorescencia). (C) Tinción basal de

células HeLa con yoduro de propidio. La línea vertical indica el umbral de autofluorescencia. El porcentaje en el

cuadrante derecho, indica el número de células que incorporan el fluoróforo (IP). Los colores indican la densidad de

puntos, siendo las zonas azules las de mayor densidad, seguido por las zonas de color verde, amarillo y rojo.

En la Figura 12C muestra que existe muerte celular no despreciable asociada a la técnica

de cosechado de células adherentes con EDTA, puesto que cerca del 10% de las células

sobrepasan el umbral de autofluorescencia, es decir, se encuentran en apoptosis tardía. Es por

esto que fue necesario realizar varios ensayos (3 en total) para lograr caracterizar la muerte basal,

31

con el fin de identificar posteriormente la muerte inducida por la incubación con los diferentes

estímulos.

Control de Muerte: Células HeLa estimuladas con concentraciones crecientes de

Estaurosporina.

En la Figura 13 se puede apreciar un aumento en la intensidad de fluorescencia de IP en

las células incubadas con el inductor de apoptosis Estaurosporina. También se observa un cambio

en las características de la población, tales como el aumento de la heterogeneidad y disminución

del tamaño y granularidad (Figura 14). Para las tres concentraciones de Estaurosporina

empleadas, se observa una segunda población de células con alta intensidad de fluorescencia, las

cuales se asocian al proceso de apoptosis tardía [59].

Figura 13: Gráficos granularidad v/s intensidad de fluorescencia para células HeLa incubadas por 16 horas

Estaurosporina: (A) 0,5 µM, (B) 1 µM, (C) 2 µM. Gráficos de puntos representativos de 4 ensayos realizados en forma

independiente.

Figura 14: Histogramas de tamaño (FSC-H) y granularidad (SSC-H), de células HeLa incubadas por 16 horas con

Estaurosporina: 0 (negro) 0,5 (rojo), 1 (amarillo) y 2 (verde) µM.

32

Estimulación con TIRAP: Porcentaje de células marcadas con IP.

Para los ensayos de viabilidad de células HeLa estimuladas con TIRAP por 16 horas

(Figura 15), se puede apreciar claramente una población con aumento de la fluorescencia de IP

medido por citometría de flujo. A partir de 40 µM, se muestra un abrupto aumento de la

fluorescencia (de 13,7% a 31,5% de células muertas o IP+), tendencia que se mantiene para las

concentraciones mayores o iguales a 40 µM, con un promedio de muerte celular cercano al 29%.

Lo anterior, sugiere que el aumento de la concentración de TIRAP, induce la muerte de células

HeLa.

Con respecto a las características morfológicas de las poblaciones celulares, no se

observan cambios notorios ni en la granularidad, ni en el tamaño celular con respecto a las células

control (Anexo I). Se descarta que el IP se una inespecíficamente a la membrana, puesto que los

controles blancos no presentan tal incremento abrupto en la fluorescencia. Así también se

descarta que el IP se esté uniendo inespecíficamente al péptido asociado a la membrana puesto

que el ión propidio es un catión impermeable, el cual sería repelido por la superficie catiónica de

TIRAP. No queda claro cuál es el o los tipos de muerte inducidos por TIRAP ni su mecanismo.

Hasta la fecha no se cuenta con un modelo claro del mecanismo de inducción de muerte

producido por diferentes CPPs, sin embargo su determinación no es objetivo de ésta tesis.

33

Figura 15: Gráficos de puntos granularidad vs intensidad de fluorescencia representativo (n = 2). Células HeLa fueron

incubadas con TIRAP (A) 10 µM, (B) 20 µM, (C) 40 µM, (D) 60 µM, (E) 80 µM y (F) 100 µM, durante 16 horas.

Estimulación con TIRAPALA

: Porcentaje de células marcadas con IP

La viabilidad de células HeLa incubadas con TIRAPALA

por 16 horas no se ve

mayormente afectada. Se observa claramente en la Figura 16 que no hay aumento de la

fluorescencia, con respecto al control (Figura 12C) producto de la incubación con el péptido.

Las diferencias en los datos obtenidos se atribuyen principalmente a eventos aleatorios

producidos por el error asociado a la técnica de extracción y medición. Un análisis estadístico8 de

los datos obtenidos, señalan que no existen diferencias significativas (p > 0,05) entre los datos

obtenidos de la incubación con TIRAPALA

y los controles. Esto demuestra que no hay inducción

de muerte producto de la incubación con TIRAPALA

, sugiriendo además que éste péptido no

ingresa a la célula. Este último comentario discutirá más adelante.

8 Análisis t-Student, no paramétrico, 1 y 2 colas.

34

Figura 16: Gráficos de puntos de granularidad vs intensidad de fluorescencia representativo (n = 2). Células HeLa fueron

incubadas con TIRAPALA (A) 10 µM, (B) 20 µM, (C) 40 µM, (D) 60 µM, (E) 80 µM y (F) 100 µM de, por 16 horas.

Curvas de Porcentaje de Viabilidad en Función de la Concentración de Incubación.

Para poder entender todos los datos reportados anteriormente, se construyeron curvas de

porcentaje de viabilidad en función de la concentración de incubación de Estaurosporina, TIRAP

y TIRAPALA

. En la Figura 17 se muestran dos gráficos de los datos obtenidos. Los puntos

graficados corresponden al promedio de los datos obtenidos para (A) 4 y (B) 2 experimentos

independientes, y las barras muestran el error estándar.

Los datos obtenidos de los ensayos de viabilidad en células HeLa incubadas con

concentraciones crecientes de péptidos, muestran que TIRAP efectivamente induce muerte

celular, reduciendo la viabilidad en un 23,5%9 con respecto a la condición basal, mientras que la

incubación con Estaurosporina redujo la viabilidad en un 12,71%10

con respecto al control.

9 Cálculo realizado comparando los datos de viabilidad para 40, 60, 80 y 100 µM de TIRAP con las muestras control.

10 Cálculo realizado comparando los datos de viabilidad para 1,0 y 2,0 µM de Estaurosporina con las muestras

control.

35

(A) HeLa (16 Hrs)

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.570

75

80

85

90

95

n = 4

Estaurosporina

Concentración [M]

% V

iab

ilid

ad

(B) HeLa (16 Hrs)

0 50 100 15050

60

70

80

90

100

n = 2

TIRAPALA

TIRAP

* * * *

Concentración [uM]

% V

iab

ilid

ad

Figura 17: Curvas de viabilidad celular en función de la concentración de (A) Estaurosporina, (B) TIRAP y TIRAPALA.

Los puntos graficados son los valores promedio de (A) 4, y (B) 2 experimentos independientes. Células HeLa fueron

estimuladas por 16 horas, para luego medir viabilidad por tinción con IP por citometría de flujo. Las barras representan

el error estándar. (B) Los asteriscos muestran los datos que presentan diferencias significativas con respecto a los

controles blanco.

En la Figura 17B, los datos marcados con asterisco son aquellos que mostraron

diferencias significativas con respecto a los controles blanco, según un análisis t-Student no

paramétrico de 1 y 2 colas. En la Tabla 13 se muestran los valores de p (p ≤ 0,05 para que sea

significativo).

Tabla 13: Valores de p del análisis t-Student, no paramétrico, 1 y 2 colas. Se muestran solo los valores con p ≤ 0,05; así

como el porcentaje de viabilidad promedio de dos experimentos independientes, correspondiente a cada dosis de

incubación.

Concentración TIRAP T(1 cola, no paramétrico) T(2 colas, no paramétrico) % Viabilidad

40 µM 0,0008 0,0016 68,00 %

60 µM 0,0133 0,0266 66,30 %

80 µM 0,0086 0,0172 69,85 %

100 µM 0,0056 0,0112 64,95 %

En base a los datos encontrados, se tiene que el promedio de viabilidad basal es de

87,91%, por lo que el límite de viabilidad impuesto es de 77,91% (cercano al 80%). Para

concentraciones mayores o iguales a 40 µM este límite es superado (la viabilidad disminuye más

de un 10% con respecto a la viabilidad basal). Es importante tener este resultado en consideración

para posibles futuras aplicaciones terapéuticas, por lo que no se recomienda usar concentraciones

mayores a 40 µM debido al daño celular que se puede generar.

36

5.7. Ensayo de Internalización de TIRAP y TIRAPALA

.

Controles Blanco: Células HeLa sin (ST) y con tratamiento (CT) de Permeabilización-Fijación.

Poblaciones Control.

En la Figura 19, se muestra la selección de la población, excluyendo de esta forma restos

celulares que puedan interferir en la fluorescencia. Debido a que la morfología de las células

cambia levemente con el tratamiento de permeabilización-fijación (Figura 18), en los gráficos de

granularidad (SSC-H) versus tamaño (FSC-H) se seleccionaron las regiones para cada población,

R1 para las células control sin tratamiento de fijación-permeabilización (Figura 19A), y R0 para

la población control con tratamiento de fijación-permeabilización (Figura 19C).

Figura 18: Histogramas de (A) Granularidad y (B) Tamaño de células HeLa sin estímulos (poblaciones control), tratadas

con (rojo) y sin (azul) permeabilización-fijación. Se observa un ligero aumento del tamaño y disminución de la

granularidad de la población, cuando las células son tratadas con Permeabilización-Fijación.

Luego, los datos de la Figura 19A y 19C se grafican en granularidad versus fluorescencia

(FL2-H) para determinar el umbral de autofluorescencia correspondiente a cada tratamiento

empleado (Figuras 19B y 19D respectivamente).

Figura 19: Poblaciones Control para selección de la región de análisis: R1 para blancos (A) sin tratamiento y R0 para

blancos (C) con tratamiento de permeabilización-fijación. Así mismo se definió el umbral de autofluorescencia para las

regiones seleccionadas para las células (B) sin tratamiento y (D) con tratamiento.

37

Blancos Sin Tratamiento.

Los resultados presentados en la Figura 20, corresponden a células HeLa control

incubadas por 10 minutos a temperatura ambiente en oscuridad, con concentraciones crecientes

de Estreptavidina-R-PE. Se puede observar que existe un leve incremento en la fluorescencia de

las células a medida que aumenta la concentración de incubación con Estreptavidina-R-PE. Como

se muestra en la Figura 20, el porcentaje de células marcadas con el fluoróforo aumenta desde

1,5% a 4,41% cuando la concentración de incubación aumenta 50 veces.

Se ha reportado que Estreptavidina posee el triplete Arg-Tyr-Asp (RYD) que

aparentemente imita al triplete Arg-Gly-Asp (RGD), secuencia de unión a fibronectina, un

componente de la matriz extracelular que específicamente promueve la adhesión celular [60].

Esta secuencia de reconocimiento universal se une a integrinas y otras moléculas relacionadas

con la superficie celular [61-62], por lo que problemas asociados a ruido en la medición de los

datos puede atribuírsele a este triplete. Es por esto, que la caracterización y cuantificación de la

inespecificidad de Estreptavidina, por componentes de la matriz extracelular, fue muy importante

para los análisis posteriores de los datos de Intensidad de Fluorescencia Media (IFM) obtenidos

para los ensayos de internalización de TIRAP y TIRAPALA

, en donde esta interacción se modela

como inespecificidad proporcional a la concentración de incubación.

Figura 20: Control blanco sin tratamiento (ST). Células HeLa fueron incubadas por 10 minutos a temperatura ambiente

en oscuridad, con (A) 2, (B) 10, (C) 20 y (D) 100 µg/ml de Estreptavidina-R-PE.

Blancos Con Tratamiento.

Las imágenes mostradas en la Figura 21, muestran un desplazamiento completo de la

población, aumentando su florescencia en la medida que aumenta la concentración de

Estreptavidina-R-Pe. Esto se debe a que la Estreptavidina se une específicamente tanto a la

biotina endógena, como a los componentes biotinilados de las células HeLa.

38

Figura 21: Control blanco con tratamiento (CT) de permeabilización-fijación. Células HeLa fueron incubadas por 10

minutos a temperatura ambiente en oscuridad con (A) 2, (B) 10, (C) 20 y (D) 100 µg/ml de Estreptavidina-R-PE.

Lo anterior concuerda con lo reportado por Rodriguez Melendez (2000), en donde se

indica que en humanos, la biotina está involucrada en importantes rutas metabólicas tales como

glucogénesis, síntesis de ácidos grasos, y catabolismo de aminoácidos, actuando como un grupo

prostético para la piruvato carboxilasa, propionil-CoA carboxilasa, beta-metilcrotinil-CoA

carboxilasa y acetil-CoA carboxilasa [63]. Además, se ha reportado que conjugados de

Estreptavidina y anticuerpos Anti-biotina se unen a la mitocondria de algunos tipos celulares

[64]. Es por esto, que la cuantificación de la biotina endógena en células HeLa, por medio de la

Intensidad de Fluorescencia Media (IFM) obtenida de los datos experimentales, fue fundamental

para analizar los datos de internalización de TIRAP y TIRAPALA

.

Internalización de TIRAP: Sin Tratamiento.

Luego de que células HeLa fuesen incubadas por 2 horas con 40 µM de TIRAP, el

resultado de la incubación con diferentes concentraciones de Estreptavidina-R-PE para la

detección de péptido asociado a la membrana plasmática, se muestra en la Figura 22.

Nuevamente se aprecia un notable incremento en la fluorescencia como consecuencia del

aumento de la concentración de incubación con Estreptavidina-R-PE. Gracias a que las células no

fueron tratadas con permeabilización-fijación, la fluorescencia medida se interpreta como la

unión inespecífica de Estreptavidina a componentes de la matriz extracelular, más la unión

específica de Estreptavidina a biotina ligada covalentemente a TIRAP.

Cabe destacar que la población no se desplaza completamente, consecuente con lo

presentado para células sin incubación con péptido (Figura 20), por lo que la interpretación de los

datos es válida.

39

Figura 22: Células HeLa incubadas por 2 horas con 40 µM de TIRAP, fueron luego incubadas por 10 minutos a

temperatura ambiente en oscuridad con (A) 2, (B) 10, (C) 20 y (D) 100 µg/ml de Estreptavidina-R-PE.

Internalización de TIRAP: Con Tratamiento.

Los resultados de las mediciones de fluorescencia obtenidos para células HeLa incubadas

por 2 horas con 40 µM de TIRAP (Figura 23), muestran un desplazamiento completo de la

población a medida que aumenta la concentración de incubación con Estreptavidina-R-PE, con

respecto al respectivo control (Figura 19D), producto de la detección de la internalización de

TIRAP.

Figura 23: Células HeLa incubadas por 2 horas con 40 µM de TIRAP, fueron permeabilizadas y fijadas, para luego ser

incubadas por 10 minutos a temperatura ambiente en oscuridad con (A) 2, (B) 10, (C) 20 y (D) 100 µg/ml de

Estreptavidina-R-PE.

En los gráficos de la Figura 23, especialmente en la Figura 23D, se observa un conjunto

de eventos de intensidad de fluorescencia heterogénea, abarcando un amplio rango fluorescencia

(entre 101 y 10

4 u.a.). Esto concuerda con la heterogeneidad en la internalización de los péptidos

catiónicos Antp, TAT y R9 ligados a un fluoróforo, observado a través de microscopía confocal

[13].

Los datos de fluorescencia medidos por citometría de flujo, son interpretados como la

suma de la unión específica de Estreptavidina a biotina endógena, la unión específica a biotina

40

ligada covalentemente a TIRAP internalizado, la unión inespecífica a componentes

extracelulares, y la unión específica a TIRAP biotinilado en la superficie de la membrana (Figura

24).

Figura 24: Unión de la Estreptavidina-R-PE a diferentes componentes en la célula, después del tratamiento con

Permeabilización-Fijación. La Intensidad de fluorescencia medida (estrella roja) corresponde a la unión de Estreptavidina

a (A) componentes biotinilados y biotina endógena, (B) TIRAP biotinilado internalizado, (C) componentes de la matriz

extracelular y (D) TIRAP asociado a componentes de la membrana plasmática.

Internalización de TIRAPALA

: Sin Tratamiento.

Al observar los datos de porcentaje de células con fluorescencia superior al umbral

(Figura 25), estos presentan solo un leve aumento en la fluorescencia en comparación con los

datos de los controles blanco (Figura 20). El dato para células HeLa incubadas con 40 µM de

TIRAPALA

y luego teñidas con 100 µg/ml de Estreptavidina-R-PE (Figura 25D) es casi 1,4

puntos porcentuales superior al correspondiente control (Figura 20D).

41

Figura 25: Células HeLa incubadas por 2 horas con 40 µM de TIRAPALA, fueron luego incubadas por 10 minutos a

temperatura ambiente en oscuridad con (A) 2, (B) 10, (C) 20 y (D) 100 µg/ml de Estreptavidina-R-PE.

Este resultado sugiere que existe baja asociación de TIRAPALA

a la membrana plasmática,

en comparación a los datos obtenidos para TIRAP (Figura 22), en donde el porcentaje de células

fluorescentes alcanza el 18,6%, para la misma concentración de Estreptavidina-R-PE.

Internalización de TIRAPALA

: Con Tratamiento.

En la Figura 26 se encuentras los gráficos de puntos obtenidos de las mediciones por

citometría de flujo de células HeLa incubadas por 2 horas con 40 µM de TIRAPALA

, y luego

tratadas con fijación-permeabilización.

Para todas las concentraciones de Estreptavidina-R-PE empleadas, no se observan

mayores diferencias en la población de células, con respecto a los controles blancos con el mismo

tratamiento (Figura 21). No fue posible realizar un análisis estadístico, de tipo ANOVA, para

determinar si existen o no diferencias significativas entre los dos grupos de datos, ya que por falta

de tiempo no se pudieron hacer repeticiones. Como se verá más adelante, se discutirá una

interpretación para estos datos.

Figura 26: Células HeLa incubadas por 2 horas con 40 µM de TIRAPALA, fueron permeabilizadas y fijadas, para luego ser

incubadas por 10 minutos a temperatura ambiente en oscuridad con (A) 2, (B) 10, (C) 20 y (D) 100 µg/ml de

Estreptavidina-R-PE.

42

Análisis de Datos de Intensidad de Fluorescencia Media (IFM): Modelo de Unión Específica y

No Específica.

Para poder analizar los datos de IFM obtenidos anteriormente, tanto para los controles

blanco como para las muestras de células HeLa incubadas con 40 µM de TIRAP y TIRAPALA

, se

utilizó el Modelo de Unión Específica y No Específica (o MUENE) [65] descrito en la Ecuación

1, la cual es matemáticamente equivalente a la ecuación de Michaelis-Menten para la velocidad

de una reacción catalizada por una enzima [66]. Esta ecuación ha sido adaptada para interpretar

los datos de intensidad de fluorescencia. Se utiliza la hipótesis de que la IFM medida por

citometría de flujo, es directamente proporcional a la cantidad de Estreptavidina unida.

Se asume que los datos obtenidos, son el resultado de la unión específica e inespecífica de

la Estreptavidina a la biotina y componentes de la matriz extracelular, respectivamente.

En las ecuaciones, y representa IFM medida en unidades arbitrarias [u.a.] como función

de la concentración de incubación con Estreptavidina-R-PE x en unidades de [µg/ml]. Kd

representa la concentración de ligando a la cual se alcanza la mitad de la fluorescencia máxima

βmax, este valor representa la afinidad de Estreptavidina por su ligando específico biotina.

Cuando la concentración de incubación es muy alta (x → ∞), la IFM llega al límite βmax. Los

valores de Background y NS se interpretan como la fluorescencia basal (autofluorescencia de las

células) y constante de inespecificidad de unión respectivamente.

Ecuación 1: Modelo de saturación usado para analizar los datos de Intensidad de Fluorescencia Media (IFM) para los

datos obtenidos tanto para los controles blanco, como para los datos de incubación con TIRAP y TIRAPALA

Se procedió a realizar el ajuste de parámetros a la curva del Modelo de Unión Específica y

No Específica (MUENE) para todos los datos obtenidos experimentalmente. Los cálculos fueron

realizados utilizando el software GraphPad Prism [67], el cual obtiene los valores de los

parámetros asociados con la mejor curva de ajuste por regresión no lineal, utilizando el método

de mínimos cuadrados [68-71].

43

En la Tabla 14 se muestran los valores de los parámetros del MUENE ajustados por

regresión no lineal, para los datos de IFM obtenidos experimentalmente. Se presentan los valores

de los parámetros que mejor se ajustan al modelo, error estándar asociado a cada parámetro,

intervalo de confianza del 95% y los parámetros de la indican la calidad del ajuste. La última

sección de la tabla indica que los parámetros de unión total y no específica son compartidos, es

decir, ambos grupos de datos se ajustan al modelo.

Tabla 14: Resultados del ajuste de parámetros del modelo de Unión Específica y No Específica, para los datos de IFM

obtenidos experimentalmente. (CT) Con tratamiento y (ST) sin tratamiento de Fijación-Permeabilización

Unión Total: Específica y No Específica

Unión No

Específica

Blanco (CT) TIRAP (CT) TIRAP

ALA (CT) TIRAP (ST) TIRAP

ALA (ST) Blanco (ST)

Valores de Mejor Ajuste

βmax 35,940 221,600 29,980 60,440 1,070 (no usado)

Kd 29,870 28,280 34,070 21,390 29,390 (no usado)

NS 0,031 0,048 0,029 0,031 0,028 0,033

Background 5,312 3,301 5,350 4,752 5,365 4,816

Error Estándar

βmax 4,363 17,210 3,919 7,739 1,613 (no usado)

Kd 8,423 5,158 10,070 6,834 103,200 (no usado)

NS 0,016 0,067 0,014 0,035 0,006 0,028

Background 0,660 2,699 0,541 1,424 0,247 1,114

Intervalo de Confianza 95%

βmax 25,260 a

46,610

179,500 a

263,700 20,390 a 39,570

41,500 a

79,370 -2,877 a 5,018 (no usado)

Kd 9,264 a

50,480

15,650 a

40,900 9,417 a 58,720

4,667 a

38,110

-223,200 a

282,000 (no usado)

NS -0,010 a

0,071

-0,117 a

0,212 -0,004 a 0,063

-0,055 a

0,117 0,013 a 0,043 -0,117 a 0,212

Background 3,697 a

6,928

-3,304 a

9,907 4,025 a 6,674 1,268 a 8,236 4,761 a 5,968 -3,304 a 9,907

Calidad del Ajuste

Grados de Libertad 6 6 6 6 6 6

R² 0,981 0,991 0,981 0,972 0,880 0,844

Suma de Cuadrados 12,050 194,700 8,012 55,200 1,225 0,965

Restricciones

NS compartido compartido compartido compartido compartido compartido

Background compartido compartido compartido compartido compartido compartido

Puntos Analizados 5 5 5 5 5 5

Se puede comprobar que los valores de Kd encontrados, el cual representa la especificidad

de unión de la Estreptavidina a la biotina, se encuentran dentro del mismo rango para los 5

cálculos realizados. Así también, los valores de NS y Background comparten el mismo rango

44

entre las diferentes mediciones, indicando concordancia entre los datos medidos. En la Tabla 15

se muestran los valores promedio, desviación estándar y error estándar para los parámetros de Kd,

NS y Background.

Tabla 15: Valores Promedio de los parámetros de especificidad e inespecificidad del Modelo de Unión Específica y No

Específica.

Parámetro Promedio Desviación Estándar Error Estándar

Kd 28,600 4,105 0,906

NS 0,033 0,007 0,038

Background 4,816 0,791 0,398

Los datos anteriormente expuestos, corresponden a solo un experimento realizado. Por

falta de tiempo y recursos no fue posible repetir el ensayo, sin embargo se encuentra

concordancia experimental con los datos reportados en la literatura para ensayos de

internalización en células HeLa incubadas con 40 µM de TIRAP y TIRAPALA

, en donde la

cantidad de fluorescencia asociada a la internalización de TIRAP supera casi 3 veces la

presentada por TIRAPALA

[9], por lo que se espera encontrar la misma tendencia al realizar

futuros experimentos independientes.

En las Figuras 27 y 28 se grafican los datos experimentales de IFM, de unión total y unión

no específica. Adicionalmente, se grafican las curvas de mejor ajuste al modelo.

Unión Total Blancos (+ Inesp)

0 50 100 1500

10

20

30

40Blanco (CT)

Blanco (ST)

Concentración Streptavidine-R-PE [g/ml]

IFM

Figura 27: Gráfico IFM vs Concentración Estreptavidina-R-PE, en donde se grafica la curva de Unión Total Medida de

los valores blanco con tratamiento (CT), en conjunto con los datos de Unión Inespecífica con los valores de los blancos no

tratados (ST).

45

En la Figura 27 se presentan los datos experimentales de IFM para los blancos con

tratamiento de fijación-permeabilización (CT) (o datos de unión total), en conjunto con los datos

experimentales de IFM para los blancos sin tratamiento (ST) (o datos de unión inespecífica).

Utilizando los datos anteriormente mencionados, se pudo cuantificar (en fluorescencia) la biotina

endógena de las células HeLa, con el objetivo de analizar de forma independiente la fluorescencia

correspondiente a péptido internalizado y no internalizado.

(A) Unión Total TIRAP (CT) (+ Inesp)

0 50 100 1500

50

100

150

200TIRAP (CT)

Blanco (ST)

Concentración Streptavidine-R-PE [ g/ml]

IFM

(B) Unión Total TIRAPALA

(CT) (+ Inesp)

0 50 100 1500

10

20

30

40TIRAPALA (CT)Blanco (ST)

Concentración Streptavidine-R-PE [g/ml]

IFM

(C) Unión Total TIRAP (ST) (+ Inesp)

0 50 100 1500

20

40

60

80TIRAP (ST)

Blanco (ST)


IFM

(D) Unión Total TIRAPALA

(+ Inesp)

0 50 100 1500

2

4

6

8

10TIRAPALA (ST)Blanco (ST)


IFM

Figura 28: Gráficos de datos experimentales de IFM. Se presentan además las curvas de mejor ajuste al Modelo de Unión

Específica y No Específica. IFM de células HeLa incubadas por 2 horas con 40 µM de (A, C) TIRAP, (B, D) TIRAPALA.

Los péptidos biotinilados fueron detectados con Estreptavidina-R-PE y posteriormente medición por citometría de flujo.

Se diferencian células con tratamiento (CT) y sin tratamiento (ST) de fijación-permeabilización.

En la Figura 28, se muestran las curvas del modelo de MUENE que mejor se ajustan a los

datos de IFM medidos en células HeLa incubadas con 40 µM de TIRAP (azul) y TIRAPALA

(verde), además de los datos medidos del control blanco sin péptidos (negro), el cual no fue

tratado con fijación-permeabilización (Blanco (ST)), de tal modo que se interpreta como la unión

46

inespecífica de Estreptavidina a componentes de la matriz extracelular. Las muestras con

tratamiento (CT) presentan mayor intensidad media de fluorescencia que aquellas que no fueron

tratadas (ST), indicando no solo la efectividad de la técnica de fijación-permeabilización, sino

que también el aumento de la fluorescencia producto de la internalización de los péptidos.

Se propone entonces que los datos de IFM medidos experimentalmente se pueden

expresar como la suma de IFM aportada por diferentes componentes (Ecuación 2), en donde cada

uno de estos aportes individuales es una función de Unión Específica descrita por la Ecuación

1A, más la Unión Inespecífica (Ecuación 1B) la cual es representada por las mediciones del

control blanco sin tratamiento (Ecuación 2A).

Ecuación 2: Modelo de Medición Total de Fluorescencia. Se describen las ecuaciones para cada situación de incubación

(blanco/pept.) y post-tratamiento (CT/ST). IFM corresponde a Intensidad de Fluorescencia Medida detectada.

Una vez calculados los valores parámetros de la unión inespecífica (Background y NS), se

pueden suprimir, para trabajar solo con los valores de βmax (o IFMmax) cuando x → ∞. La

simplificación de la Ecuación 2 con los supuestos anteriores se presenta en la Ecuación 3.

Ecuación 3: Ecuaciones del Modelo de Medición Total de Fluorescencia simplificadas para cuando la recta de

inespecificidad esta descrita, y concentraciones de ligando muy altas (x → ∞).

Con los valores calculados mostrados en la Tabla 14, y las ecuaciones desplegadas en

Ecuación 3, se obtienen los resultados mostrados en la Tabla 16. Para el valor de IFMmax

correspondiente a TIRAPALA

internalizado, se obtiene un valor negativo dado que los valores

IFM para cada concentración de Estreptavidina-R-PE en las muestras con tratamiento (Figura

47

28B) son levemente menores que los obtenidos para los valores de IFM en las muestras blanco

con tratamiento (Figura 27). Estas diferencias son atribuibles principalmente al error asociado a

la técnica utilizada y no a diferencias significativas. El este resultado se interpreta como que no

existe internalización de TIRAPALA

, por lo que se le asigna el valor 0.

Tabla 16: Valores calculados para los componentes individuales que aportan fluorescencia por unión a Estreptavidina-R-

PE. Los valores de la tabla fueron obtenidos usando los resultados de los cálculos mostrados en el Gráfico 7, en conjunto

con la Ecuación 3.

Componente [u.a.]

35,94

60,44

125,22

1,07

-7,03

0

En la Figura 29, se comparan las fluorescencias máximas asociadas a cada componente

descrito en la Ecuación 3 utilizando los valores de la Tabla 9. Se puede apreciar que TIRAP

internaliza fuertemente en células HeLa al cabo de 2 horas de incubación, en contraste con

TIRAPALA

que sencillamente no fue capaz de atravesar la membrana plasmática. Adicionalmente,

la diferencia encontrada en la fluorescencia asociada a péptido ligado a la membrana plasmática

entre TIRAP y TIRAPALA

es notable, siendo la de TIRAP casi 60 veces superior a la encontrada

en TIRAPALA

y caso la mitad con respecto a la fluorescencia de TIRAP internalizado.

HeLa (40 µM, 2 Hrs)

Internalizado Ligado a Membrana0.1

1

10

100

1000TIRAP

TIRAPALA

Localización

IFM

max

Figura 29: Intensidad de Fluorescencia Media máxima calculada diferenciando su localización, ya sea por péptido

internalizado o péptido asociado a la membrana plasmática. Los datos se presentan es escala logarítmica.

48

Se evidencia por primera vez experimentalmente, una fuerte asociación de TIRAP a la

membrana plasmática, lo que sugiere un mecanismo dependiente de la diferencia de potencial

inducida en la superficie de la membrana celular, la cual sería dependiente de la concentración [9,

13] y campo de potencial electrostático de la superficie del péptido, en donde existe interacción

con moléculas de la membrana celular, tales como las cabezas de los fosfolípidos de la membrana

plasmática y proteoglicanos [23, 36], concordante con la literatura publicada para otros CPPs. Es

posible relacionar este resultado con la formación de zonas de nucleación, característica principal

del mecanismo de transducción en estudio.

En la Figura 30 se muestra un diagrama del mecanismo de internalización propuesto. Las

fuertes interacciones del péptido de penetración celular TIRAP, con proteoglicanos y moléculas

de la superficie de la membrana plasmática a altas concentraciones, produce una acumulación

local de TIRAP, induciendo una diferencia de potencial en la superficie de la membrana. La

reorganización de la red de actina del citoesqueleto conduce finalmente a un cambio en la fluidez

de la membrana, para dar lugar a la internalización del péptido TIRAP. Debido a que TIRAPALA

interactúa en menor medida con moléculas de la superficie (producto del bajo potencial

electrostático positivo), no se genera una diferencia de potencial sobre la membrana, impidiendo

de esta forma la internalización del péptido.

Figura 30: Esquema del mecanismo de internalización propuesto. (A) Las interacciones de TIRAP con proteoglicanos y

moléculas de la membrana plasmática a altas concentraciones, produce una acumulación local de TIRAP, generando una

diferencia de potencial en la superficie de la membrana, seguido de la reorganización de la red de actina del citoesqueleto,

conduciendo finalmente a un cambio en la fluidez de la membrana y posterior internalización de TIRAP. (B) Debido a que

TIRAPALA interactúa en menor manera con moléculas de la superficie (producto de su bajo potencial electrostático

positivo), no es capaz de generan una diferencia de potencial sobre la membrana, impidiendo de esta forma la

internalización del péptido.

49

En base a los resultados obtenidos en este trabajo, se propone que para que la

internalización se produzca, es indispensable la inducción de la diferencia de potencial producto

del campo de potencial electrostático de los CPPs, puesto que esta fuerte asociación a la

membrana sería la primera etapa de la internalización.

50

6. CONCLUSIONES

El objetivo fundamental de este trabajo de investigación, fue determinar las características

estructurales de los de péptidos de penetración celular (o CPPs) que son requisito para la

internalización de éstos en la célula, y usar ésta información para desarrollar las bases de un

modelo que explique uno de los mecanismos de ingreso a la célula utilizado por los CPPs

estudiados.

La importancia de los grupos de aminoácidos catiónicos en la secuencia del péptido ya

había sido reportada, por lo que se estudió el efecto de estos aminoácidos sobre la estructura

terciaria del péptido. Por medio de técnicas de modelación molecular (modelamiento por

comparación en adición a sucesivos procesos de refinamiento y validación), se obtuvieron los

modelos tridimensionales de los péptidos TAT, TIRAP y TIRAPALA

. Se observan similitudes

tridimensionales importantes entre los modelos, predominando fuertemente la estructura terciaria

tipo α-hélice con un porcentaje superior al 69% en las tres estructuras. Esta característica le da

una forma alargada y cónica a los péptidos, permitiendo que los residuos catiónicos estén

expuestos al solvente y por ende puedan interactuar con las moléculas de la superficie de la

membrana celular. Cuando los residuos de arginina y lisina del péptido TIRAP son reemplazados

por alanina para formar TIRAPALA

, la conformación espacial varía aumentando levemente el

porcentaje de α-hélice en el modelo. Aunque la sustitución de los residuos no afecta mayormente

la estructura central del péptido, la taza de internalización es reducida notablemente [9]. Esto

sugiere que la conformación α-hélice no es requisito suficiente para lograr la internalización de

los péptidos, sino que es más importante la carga superficial, siendo ésta una de las características

esenciales que le otorgan la habilidad de internalización.

En la estructura de TIRAP, se observan dos subgrupos de residuos de arginina y lisina que

están orientados en diferentes direcciones; los residuos 2, 13 y 16 se encuentran en oposición a

los residuos 14 y 18, el residuo de arginina en la posición 17 se encuentra en una dirección

intermedia a las anteriores. Esta característica sugiere que no todos los residuos catiónicos

interactúan simultáneamente con las moléculas de la superficie celular, por lo que sólo un

subgrupo de ellos participa directamente en la primera etapa del mecanismo de internalización

(interacción con las moléculas de la superficie). Además, la orientación de los residuos está

51

determinada por el número de aminoácidos consecutivos no catiónicos entre cada residuo de

arginina y/o lisina, lo que sugiere que el espaciamiento entre los residuos catiónicos puede influir

en la eficiencia de la internalización.

La diferencia más importante entre los péptidos estudiados, se detecta al calcular el campo

de potencial electrostático sobre la superficie. En TAT y TIRAP, el campo positivo presenta un

área superficial mucho mayor que el negativo cuando se comparan las isosuperficies de módulo

1; sin embargo, el campo electrostático se balancea al sustituir arginina y lisina por alanina,

estableciéndose un dipolo sobre la superficie de TIRAPALA

. Este resultado lleva a concluir que la

habilidad de internalización de los péptidos catiónicos depende, entre otras variables, de la

diferencia de potencial inducida por los péptidos sobre la superficie de la célula. Esta observación

se comprueba experimentalmente en los ensayos de internalización realizados en células HeLa.

Se encuentra evidencia experimental de la importancia del campo electrostático sobre la

superficie del péptido, para lograr una fuerte asociación a la membrana plasmática. Esto sugiere

un mecanismo dependiente de la diferencia de potencial inducida en la superficie de la

membrana, en el cual la concentración de péptido en el medio y el campo de potencial

electrostático sobre la superficie del péptido juegan un papel importante. Esta asociación sería

una etapa importante en el mecanismo de transducción. Además, la fuerte interacción de los

péptidos con moléculas de la membrana plasmática (tales como cabezas de fosfolípidos y

proteoglicanos), podría ser el resultado de la azarosa formación de zonas de nucleación sobre la

superficie celular, el cual es requisito para el rápido ingreso de los péptidos por medio del

mecanismo de transducción.

Estudios toxicológicos en células incubadas con diferentes concentraciones de quimeras

de arginina, indican que altas concentraciones provocan muerte celular no deseada producto de la

internalización. Con el fin de determinar los efectos tóxicos de TIRAP, se realizó un estudio de la

viabilidad de células HeLa como función de la concentración de incubación, el cual varió en el

rango 0 – 100 µM. Se detectó una clara inducción de muerte producto de la internalización de los

péptidos. Para concentraciones mayores a 40 µM, la viabilidad de células HeLa disminuyó más

de un 10% en comparación a la sobrevida basal de referencia, por lo que en futuras aplicaciones

terapéuticas, debe trabajarse a concentraciones menores o iguales a este límite.

52

7. REFERENCIAS

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60

8. ANEXOS

A. Protocolo del Ensayo de Viabilidad de Células HeLa Incubadas con Concentraciones

Crecientes de Péptidos, con Yoduro de Propidio (IP) por Citometría de Flujo.

Materiales.

1. Solución EDTA-PBS 25 mM.

2. Stock de Yoduro de Propidio (IP).

3. Solución Buffer FACS.

4. Tubos Falcon.

5. Tubos para citometría.

Métodos.

1. En una placa de 48 pocillos se siembran 17 pocillos con 100.000 células cada uno y se

afora hasta 1 ml de medio de cultivo. Se deja reposar 4 horas a 37⁰C para que se adhieran

las células al fondo de la placa.

2. Se extrae el medio de cultivo y se lava 1 vez con PBS para retirar las células muertes o no

adheridas.

3. Se agrega medio de cultivo fresco que contenga las siguientes condiciones:

#1

Blanco 1 ml de medio

#2

Control IP 1 ml de medio

#3

Staurosp. 0,5 µM 500 µl de 1 µM + 500

µl de medio

#4

Staurosp. 1 µM 1 µl de 1 mM + 999 µl

de medio

#5

Staurosp. 2 µM 2 µl de 1 mM + 998 µl

de medio

#6

TIRAP 10 µM

25 µl de 1 mM + 225 µl de medio

#7

TIRAP 20 µM


#8

TIRAP 40 µM


#9

TIRAP 60 µM


#10

TIRAP 80 µM


#11

TIRAP 100 µM

2,5 µl de 1 mM + 247,5 µl de medio

#12

TIRAPALA 10 µM

25 µl de 1 mM + 225

µl de medio

#13

TIRAPALA 20 µM

20 µl de 1 mM + 230

µl de medio

#14

TIRAPALA 40 µM

15 µl de 1 mM + 235

µl de medio

#15

TIRAPALA 60 µM

10 µl de 1 mM + 240

µl de medio

#16

TIRAPALA 80 µM

5 µl de 1 mM + 245 µl

de medio

#17

TIRAPALA 100 µM

2,5 µl de 1 mM +

247,5 µl de medio

4. Se deja incubando por 16 horas a 37⁰C, 5% CO2.

5. Se extrae el medio celular de las placas y se guarda en tubos falcon rotulados, en hielo.

6. Se agregan 250 µl de EDTA-PBS a cada pocillo.

7. Se incuba en la estufa de la sala de cultivo a 37 ⁰C por 5 min.

61

8. Se sueltan las células adheridas restantes con un suave pipeteo. Se ponen las células ya

sueltas en los tubos falcon correspondiente a su medio de cultivo, previamente rotulados.

9. Centrifugar a 1200 rpm por 5 min a 4⁰C.

10. Se elimina el sobrenadante y solo se deja el pellet.

11. Se resuspende el pellet en 200 µl de Buffer FACS 1%.

12. Se mantienen las muestras en hielo hasta que se realice la tinción con IP.

13. Se agrega 1 µl de IP a cada muestra, se homogeniza suavemente y traspasan las células a

tubos de citometría. Se mantienen los tubos en hielo.

14. Se miden las muestras en el citómetro.

Nota: Se pasaron primero las muestras sin IP y luego las muestra con IP, ya que el citómetro

puede contaminarse, alterando así las mediciones de las muestras siguientes sin IP.

B. Protocolo de Internalización de TIRAP o TIRAPALA

en Células HeLa.

Métodos.

1. En una placa de 48 pocillos, se sembraron 13 pocillos con 100.000 células por pocillo en

una placa de 48 pocillos. Se dejaron a 37⁰C, 5% CO2 por 2 horas para que se completara

la adherencia de las células.

2. Se retiró el medio de cultivo y se lavó con PBS.

3. Posteriormente 5 pocillos se dejaron con 100 µl de medio de cultivo (sin tratamiento), 4

pocillos con 100 µl de medio conteniendo 40 µM de TIRAP y 4 pocillos con 100 µl de

medio conteniendo 40 µM de TIRAPALA

.

4. Se dejó incubando por 2 horas a 37⁰C, 5% CO2.

5. Se retira el medio de cultivo y se guarda en tubos eppendorff previamente rotulados.

6. Se agregan 500 µl de EDTA 25 mM para cosechar las células. Se deja a la estufa por 5-10

min.

7. Se sueltan las células con un suave pipeteo y se colocan en los tubos rotulados

correspondiente a su medio de cultivo previamente retirado.

8. Se centrifugan las muestras a 1200 rpm por 5 min, 4⁰C.

9. Se resuspenden las células en 100 µl de PBS y se distribuyen en una placa de 96 pocillos

según el siguiente diagrama. Los 5 pocillos sin tratamientos se distribuyen en volúmenes

iguales para las 10 muestras de autofluorescencia y blancos, los 4 pocillos con TIRAP se

62

distribuyen en las 8 muestras de TIRAP y los 4 pocillos con TIRAPALA

se distribuyen en

los 8 muestras de TIRAPALA

.

Autofluorescencia Sin Permeabilizar/Fijar

Con Permeabilizar/Fijar

Dilución Streptavidina-R-PE

1/10 1/50 1/100 1/500

0 µM Blancos

Sin Permeabilizar/Fijar

Con Permeabilizar/Fijar

1/10 1/50 1/100 1/500

TIRAP Sin Permeabilizar/Fijar

40 µM Con Permeabilizar/Fijar

1/10 1/50 1/100 1/500

TIRAPALA

Sin Permeabilizar/Fijar

40 µM Con Permeabilizar/Fijar

10. Se centrifuga la placa a 2000 rpm 2 min, 4⁰C y se elimina el sobrenadante.

11. Permeabilización y fijación de células agregando 50 µl/pocillo de solución

Fixation/Permeabilization 1X (o PBS para las muestras sin permeabilización). Se incuba

por 30 min a 4⁰C.

12. Centrifugación 2500 rpm, 2 min, 4⁰C.

13. 1 lavado en 150 µl de PermBuffer/PBS según corresponda.

14. Incubación con 10 µl de Streptavidin-R-Pe, diluciones 0, 1/10, 1/50, 1/100, 1/500 (en

PermBuffer o PBS según corresponda) por 10 min a 20⁰C en oscuridad (temperatura

ambiente).

Dilución 0 1/10 1/50 1/100 1/500

Formula = 50 µl

PermBuffer/PBS

05 µl stock

45 µl

PermBuffer/PBS = 50 µl

10 µl 1/10

40 µl


20 µl 1/50

20 µl


10 µl 1/100

40 µl


Concentración 0 µg/ml 100 µg/ml 20 µg/ml 10 µg/ml 2 µg/ml

Vol. Disponible 50 µl 40 µl 30 µl 30 µl 50 µl

15. Centrifugación 2500 rpm 2 min 4⁰C.

16. 1 Lavado en 150 µl de PermBuffer/PBS según corresponda (2500 rpm 2 min 4⁰C).

63

17. Resuspensión en 100 µl de buffer FACS.

18. Se marcan los tubos de citometría y se agregan 100 µl de buffer FACS a cada uno, se

traspasan las muestras a los tubos correspondientes y se analizan por citometría.

C. Analizador de Imágenes: Código Java de las Clases Programadas.

Clase ColorCount

import java.awt.*;

import java.awt.image.BufferedImage;

import java.io.*;

import javax.imageio.ImageIO;

public class ColorCount {

public static void main(String[] args) throws IOException {

String path = args[0];

BufferedImage image = ImageIO.read(new File(path));

int redCount = 0, greenCount = 0, blueCount = 0;

int red = Color.red.getRGB();

int green = Color.green.getRGB();

int blue = Color.blue.getBlue();

System.out.printf("red = %d green = %d blue = %d%n",red,

green,blue);

int w = image.getWidth();

int h = image.getHeight();

Histo histograma = new Histo();

int cont = 0;

for(int y = 0;y < h;y++) {

for(int x = 0;x < w;x++) {

System.out.println(cont);

int pixel = image.getRGB(x,y);

HistoElem e = new HistoElem(pixel,1);

histograma.add(e);

cont++;

}

}

histograma.display();

64

}

}

Clase GeneraColor.

import java.awt.*;

import java.awt.image.BufferedImage;

import java.io.*;

import javax.imageio.ImageIO;

import java.lang.*;

public class GeneraColor {

public static void main(String[] arg) {

int numEntero = Integer.parseInt(arg[0]);

try {

BufferedImage bi = getMyImage(numEntero);

File outputfile = new File(arg[0]+".png");

ImageIO.write(bi,"png",outputfile);

}

catch(IOException e){

}

}

public static BufferedImage getMyImage(int rgba) {

BufferedImage image = new BufferedImage (100,100,

BufferedImage.TYPE_INT_ARGB);

int w = image.getWidth();

int h = image.getHeight();

int cont=0;

for(int y = 0;y < h;y++) {

for(int x = 0;x < w;x++) {

System.out.print(".");

image.setRGB(x,y,rgba);

cont++;

}

65

}

System.out.println("done");

return image;

}

}

Clase Histo.

import java.util.*;

import java.io.*;

public class Histo {

Vector <HistoElem> vect = new Vector <HistoElem>();

public void SortByColor() {

}

public void add(HistoElem he) {

if (colorWasAlreadyAdded(he)) {

}

else {

vect.addElement(he);

}

}

public void display() {

try {

FileWriter outFile = new FileWriter

("outCCFile.xls");

PrintWriter out = new PrintWriter(outFile);

for(int i = 0;i < vect.size();i++) {

HistoElem aux = (HistoElem)vect.elementAt(i);

out.println(aux.getRecord());

}

out.close();

}

catch (IOException e) {

66

}

}

public boolean colorWasAlreadyAdded(HistoElem he) {

boolean retorno = false;

for(int i = 0;i < vect.size();i++) {

HistoElem aux = (HistoElem)vect.elementAt(i);

if(aux.getColor() == he.getColor()) {

retorno = true;

HistoElem reemplazo = new HistoElem

(aux.getColor(),aux.getFrec()+1);

vect.remove(i);

vect.add(i,reemplazo);

break;

}

}

return retorno;

}

}

Clase HistoElem.

public class HistoElem {

public int color;

public int frec;

public HistoElem(int c, int f) {

color = c;

frec = f;

}

public int getColor() {

return color;

}

public int getFrec() {

return frec;

}

67

public void frecPlus() {

frec ++;

}

public void display() {

System.out.printf("%d | %d %n",this.color,this.frec);

}

public String getRecord () {

String retorno = this.color+";"+this.frec;

return retorno;

}

}

D. Resumen de la simbología JOY para la Representación de Alineamientos y Análisis de

Estructuras.

Característica Símbolo Ejemplo

inaccesible al solvente MAYÚSCULA X

accesible al solvente minúscula x

Φ positivo itálica x

péptido-cis breve x

puente de hidrógeno a otra cadena lateral tilde x

puente de hidrógeno a amino cadena principal ennegrecido x

puente de hidrógeno a carboxilo cadena principal subrayado x

enlace disulfuro cedilla ç

α-hélice rojo x

hoja-β azul x

helice-310 granate x

E. Alineamientos Restantes Utilizados para el modelamiento de TAT.


10 20 30 40 50

2w18 ( 854) nLqlvseLknpsgscSvDVsAmfwekepCIITACedvVSLwkaldawqWe

TAT --------------------------------------------------

βββββββ βββββββββ ββββββββ βββββββ ββ

60 70 80 90 100

2w18 ( 908) klytWhFaevpVlqIVpVpdVynLVCVALGnleireIrALfcekqvllks

TAT --------------------------------------------------

ββββββ ββββ βββββ βββββββ ββββββ

110 120 130 140 150

2w18 ( 964) gnIkaVlGLtkrrLVSSsgtlsdQqVeVmtFaedGggkenqfLmpPeetI

TAT ----------------------------------GRKKRRQRRRPPQ---

βββββββββ ββββββ βββββββ βββββββ β

160 170 180 190 200

2w18 (1014) ltFaeVqgmqeALLGTTimnnIVIWnLktGqllkkMhIddasvChkAYse

TAT --------------------------------------------------

βββββββ ββββββ ββββββ ββββββ ββββββββ

3,11 50%

68

210 220 230 240 250

2w18 (1067) mglLfIVLSpVFqlIvInpkttlSvgvmlYcLppgqagrfleGdVkdhcA

TAT --------------------------------------------------

βββββββ βββββββ ββββββββ βββββββ ββ

260 270 280 290 300

2w18 (1129) AAILtsgtIAIWdLllgqCtallppvqhWsFVkWSgTdshLLAGQkdGnI

TAT --------------------------------------------------

ββββ βββββ βββββ ββββ βββββ β

2w18 (1181) fVYhys

TAT ------

βββββ

10 20 30 40 50

1tac ( 1 ) ldpvdPniepWnhpGsqPktasnrahakksayhsQvaFItkglGisygrk

TAT -----------------------------------------------GRK

60 70 80

1tac ( 51 ) krRqrrrpsqgGqTHqdPIpkqpssQprgdpTgpke

TAT KRRQRRRPPQ--------------------------

333

2,67 50%

10 20 30 40 50

1tvs ( 1) ledrripgtaeenlqkssggvpgqntggqearpnyhçqlçflrslgidyl

TAT --------------------------------------------------

αααα αααααα ααα

60 70

1tvs ( 51) daslrkknkqrlkaiqqgrqpqyll

TAT ---------GRKKRRQRRRPPQ---

ααα αααααααααα

2,51 50%

10 20

1fw5 ( 1) gstlytesrkllrswhlpsv

TAT -------GRKKRRQRRRPPQ

αααααααααααααα

2,48 50%

10

2vcp ( 433) grdalldqirqgiqlksva

TAT GRKKRRQRRRPPQ------

ααααααααα

2,23 50%

10 20 30 40 50

2grg ( 1) mkssipiteVlprAvGsLtFdenynlldtsgvAkvIekspIaeiIrkSna

TAT --------------------------------------------------

ββααααααα βββββ ββββββ333 αααααααααα

60 70 80 90

2grg ( 51) eLgrlGysVyedaqyiGhAFkkaghfiVyFTpknknregvvppvgitn

TAT -------------------------------GRKKRRQRRRPPQ----

α βββββββ βββββββ βββββββ

2,23 50%

10 20

1h8b ( 7) gkkaeavatvvaavdqarvrepr

TAT ----------GRKKRRQRRRPPQ

ααααααααααααααααα

2,18 50%

10 20 30 40 50

1lki ( 9) natçairhpçhgnlmnqIknqLaqLngsAnaLfisYytaQgepFpnnvek

TAT --------------------------------------------------

ββ333 ααααααααααααααααααααααααααα 333ααα

60 70 80 90 100

1lki ( 59 ) lÇapnmtdFpsFhgngtektkLveLyrMVaYLsasLtnitrdQkvlnpta

TAT ------------------------------------GRKKRRQRRRPPQ-

α ααααααααααααααααααααααααααααα

110 120 130 140 150

1lki ( 109 ) vsLqvkLnaTIdvMrgLlsnVlÇrLÇnkyrvghVdvppvpdhsdkeafqr

TAT --------------------------------------------------

ααααααααααααααααααααααααααα ββ αααα

160 170

1lki ( 159 ) kklGÇqlLGTYkqvIsvVvqaf

TAT ----------------------

ααααααααααααααααααα

2,14 50%

10 20 30

1ery ( 1 ) deçanAaaqçSitlÇnlyÇgplieiÇeltVmqnçeppf

TAT -------------------------GRKKRRQRRRPPQ

ααααααα ααααααα 333ααααααααααα

2,03 50%

69

F. Alineamientos Restantes Utilizados para el modelamiento de TIRAP.


10 20 30

2dyo ( 22) dsmddllirrltdrndkeahlnelfqdnsgaiggni

TIRAP GKMADWFRQTLLKKPKKRPNSPEST-----------

αααααααααααααααααα 333

4,78 95%

10 20


TIRAP GKMADWFRQTLLKKPKKRPNSPEST

Ααααααααααααααααα

4,03 95%

G. Alineamientos Restantes Utilizados para el modelamiento de TIRAPALA

.


10 20 30

2dyo ( 22) dsmddllirrltdrndkeahlnelfqdnsgaiggni

TIRAPALA GKMADWFRQTLLAAPAAAPNSPEST-----------

αααααααααααααααααα 333

4,70 95%

10 20


TIRAPALA GKMADWFRQTLLAAPAAAPNSPEST

Ααααααααααααααααα

3,89 90%

H. Breve Descripción de las Estructuras Utilizadas como Plantillas.

TIRAP y TIRAPALA

.

PDB ID: 1SRA

Hohenester, E.; Maurer, P.; Hohenadl, C.; Timpl, R.; Jansonius,

J.N.; Engel, J.

Structure of a novel extracelular Ca2+

-binding module in BM-40.

Nature Structure Biology 3: 67-73 (1996).

PDB ID: 2DYO

Matsushita, M.; Suzuki, N.N.; Obara, K.; Fujioka, Y.; Ohsumi, Y.;

Inagaki, F.

Structure of Atg5.Atg16, a complex essential for autophagy.

J. Biol. Chem. 282: 6763-6772 (2007).

70

PDB ID: 1H8B

Atkinson, R.A.; Joseph, C.; Kelly, G.; Muskett, F.W.; Frenkiel,

T.A.; Nietlispach, D.; Pastore, A.

Ca2+

-independent binding of an EF-hand domain to a novel motif in

the alpha-actinin-titin complex.

Nature Structure Biology 8: 853 (2001).

TAT.

PDB ID: 1JFW

Péloponèse, J.M. Jr.; Grégoire, C.; Opi, S.; Esquieu, D.; Sturgis,

J.; Lebrun, E.; Meurs, E.; Collette, Y.;Olive, D.; Aubertin, A.M.;

Witvrow, M.; Pannecouque, C.; De Clercq, E.; Bailly, C.;

Lebreton, J.; Loret, E.P.

1H-13C nuclear magnetic resonance assignment and structural

characterization of HIV-1 Tat protein.

C. R. Academic Science III 323: 883-894 (2000).

PDB ID: 1K5K

Grégoire, C.; Péloponèse, J.M. Jr.; Esquieu, D.; Opi,

S.; Campbell, G.; Solomiac, M.; Lebrun, E.; Lebreton, J.; Loret,

E.P.

Homonuclear (1) H-NMR assignment and structural

characterization of human immunodeficiency virus type 1 Tat

Mal protein.

Biopolymers 62: 324-335 (2001).

PDB ID: 2W18

Oliver, A.W.; Swift, S.; Lord C.J.; Ashworth, A.; Pearl, L.H.

Structural basis for recruitment of BRCA2 by PALB2.

Embo Rep. 10: 990-996 (2009).

71

PDB ID: 1TAC

Boehm, M.; Sticht, H.; Seidel, G.; Roesch, P.

HIV-1 TAT CYS-, NMR, 10 Structures.

To be Published.

PDB ID: 1TVS

Sticht, H.; Willbold, D.; Ejchart, A.; Rosin-Arbesfeld, R.; Yaniv,

A.; Gazit, A.; Rösch, P.

Trifluoroethanol stabilizes a heliz-turn-heliz motif in equine

infectious-anemia-virus transactivator protein.

European Journal of Biochemistry 225: 855-861 (1994).

PDB ID: 1FW5

Lampio, A.; Kilpeläinem, I.; Pesonen, S.; Karhi, K.; Auvinen, P.;

Somerharju, P.; Kääriäinen, L.

Membrane binding mechanism of an RNA virus-capping enzyme.

Journal of Biological Chemistry 275: 37853-37859 (2001).

PDB ID: 2VCP

Faucher, J.F.; Didry, D.; Carlier, M.F.

Crystal structure of N-Wasp Wh2 domain in complex with

skeletal actin.

To be Published.

72

PDB ID: 2GRG

Wu, B.; Yee, A.; Ramelot, T.; Lemak, A.; Semesi, A.; Kennedy,

M.; Edward, A.; Arrowsmith, C.H.

Solution NMR Structure of Protein YNR034W-A from

Saccharomyces cerevisiae. Northeast Structural Genomics

Consortium Target YT727; Ontario Center for Structural

Proteomics Target yst6499.

To be Published.

PDB ID: 1H8B

Atkinson, R.A.; Joseph, C.; Kelly, G.; Muskett, F.W.; Frenkiel,

T.A.; Nietlispach, D.; Pastore, A.

Ca2+

-independent binding of an EF-hand domain to a novel motif

in the alpha-actinin-titin complex.

Nature Structure Biology 8: 853 (2001).

PDB ID: 1LKI

Robinson, R.C.; Grey, L.M.; Staunton, D.; Vankelecom, H.;

Vernallis, A.B.; Moreau, J.F.; Stuart, D.I.; Heath, J.K.; Jones,

E.Y.

The crystal structure and biological function of leukemia

inhibitory factor: implications for receptor binding.

Cell (Cambridge, Mass.) 77: 1101-1106 (1994).

PDB ID: 1ERY

Luginbühl, P.; Wu, J.; Zerbe, O.; Ortenzi, C.; Luporini, P.;

Wüthrich, K.

The NMR solution structure of the pheromone Er-11 from the

ciliated protozoan Euplotes raikovi.

Protein Science 5: 1512-1522 (1996).

73

I. Histogramas de Tamaño (FSC-H) y Granularidad (SSC-H) de Células HeLa Incubadas

por 16 horas con diferentes concentraciones de TIRAP y TIRAPALA

.

TIRAP.

TIRAPALA

.

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