UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

SISTEMA DE PREGRADO

TESIS FINAL

Previa a la obtención del grado en

Licenciatura en la Especialidad de Laboratorio Clínico

“Estudio de contaje de leucocitos en sistemas automatizados versus

método convencional en líquidos corporales (sinovial, pleural, peritoneal y

liquido Céfalo Raquídeo LFR) en el Laboratorio Clínico del Hospital Luis

Vernaza durante los meses de enero 2014 a mayo 2014”

Elaborado por:

José Ricardo Campos Cedeño

Tutor:

Segundo Pacherres, MSC

Guayaquil, Julio de 2014

i

AGRADECIMIENTO

A mi familia por todo el apoyo brindado.

Ricardo

1

ÍNDICE DE CONTENIDO

INTRODUCCIÓN ................................................................................................... 2 1. EL PROLEMA ................................................................................................ 3

1.1. Planteamiento del problema .................................................................... 3 1.2. Interrogantes de la investigación .............................................................. 3 1.3. Formulación del problema ........................................................................ 4 1.4. Variables .................................................................................................. 5 1.5. Objetivos .................................................................................................. 5 1.6. Justificación e importancia ....................................................................... 6

2. MARCO TEÓRICO ......................................................................................... 7 2.1. Líquido Sinovial ....................................................................................... 7

2.1.1. Obtención de la muestra ................................................................... 7 2.1.2. Recolección ...................................................................................... 7 2.1.3. Análisis del Líquido Sinovial sin Centrifugar ...................................... 8 2.1.4. Análisis del Líquido Sinovial Centrifugado Sedimento ..................... 10 2.1.5. Análisis del Líquido Sinovial Centrifugado Sobrenadante ............... 13 2.1.6. Bacteriología ................................................................................... 14

2.2. Fluidos Serosos ..................................................................................... 16 2.2.1. Formación ....................................................................................... 16 2.2.2. Obtención ....................................................................................... 17 2.2.3. Exudados y Trasudados ................................................................. 17 2.2.4. Examen Químico ............................................................................ 21 2.2.5. Examen Bacteriológico ................................................................... 21

2.3. Líquido Pleural ....................................................................................... 21 2.4. Líquido Pericárdico ................................................................................ 23 2.5. Líquido Peritoneal. ................................................................................. 24 2.6. Líquido Amniótico .................................................................................. 26

2.6.1. Obtención de la muestra ................................................................. 28 2.6.2. Madurez Dérmica Fetal ................................................................... 31 2.6.3. Defectos del Tubo Neural: Alfa Fero Proteína ................................. 33 2.6.4. Madurez Pulmonar Fetal ................................................................. 35 2.6.5. Madurez Renal Fetal: Creatinina..................................................... 38 2.6.6. Madurez Hepática Fetal: Bilirrubina ................................................ 39

2.7. Conteo Celular Manual .......................................................................... 41 2.8. Conteo Celular Automatizado ................................................................ 42

2.8.1. Equipo XT-4000i ............................................................................. 42 3. METODOLOGÍA .......................................................................................... 52

3.1. Diseño de la investigación ..................................................................... 52 3.2. Nivel de Estudio ..................................................................................... 53 3.3. Población ............................................................................................... 53 3.4. Muestra .................................................................................................. 53 3.5. Instrumentos de la investigación ............................................................ 54 3.6. Procedimiento de la investigación .......................................................... 54 3.7. Fuentes de información ......................................................................... 54 3.8. Procesamiento y análisis de datos ......................................................... 55 3.9. Análisis de los resultados....................................................................... 55

4. MARCO ADMINISTRATIVO ......................................................................... 59 4.1. Conclusiones ......................................................................................... 59 4.2. Recomendaciones ................................................................................. 61

BIBLIOGRAFIA .................................................................................................... 63 ANEXOS .............................................................................................................. 64 GLOSARIO DE TERMINOS ................................................................................. 69

2

INTRODUCCIÓN

El análisis de líquidos biológicos es una importante ayuda en el

diagnóstico y seguimiento de diversas patologías. La mayoría de

laboratorios utilizan métodos manuales para realizar el recuento celular,

pero es conocida la considerable imprecisión de que adolecen dichos

métodos, incluso si se con personal experimentado.

En el laboratorio se puede tener un fluido muy claro y decidir

procesarlo directamente o un fluido un poco turbio y decidir hacer una

dilución 1 a 10 y leerlo en la cámara, pero cuando se obtienen los

resultados se puede llegar a considerar que se debió diluirlo más, este

proceso manual depende mucho del criterio técnico del profesional, e

incluso se pueden llegar a cometer errores matemáticos de cálculo.

El Colegio Americano de Patólogos enfatiza queen el laboratorio se

debe tener un procedimiento, que basado en cuántas células se observan

en el cuadro de la cámara, especifique qué área de la cámara se debe

contar.

La automatización del conteo da una mejor precisión, ya que si un

fluido corporal se procesa 10 veces, el mismo resultado se dará en esas 10

veces. Esto no sucede si el mismo fluido lo procesan 10 tecnólogos o

analistas diferentes. Otra ventaja de automatizar es la considerable

disminución del tiempo de entrega de los resultados.

El equipo automático hace un diferencial de dos partes, que es algo

nuevo en los fluidos corporales, separa las células mononucleares de las

polimorfonucleares. El diferencial del instrumento es un buen control de

calidad para el diferencial que se prepara en la cito centrífuga. Procesar los

fluidos de forma automática es mucho más seguro, rápido, fácil, eficiente,

exacto y preciso que hacerlo de forma manual.

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CAPITULO UNO

1. EL PROLEMA

1.1. Planteamiento del problema

El contaje de leucocitos en los líquidos biológicos, realizado de forma

tradicional ha sido un problema debido a la impresión y a las formas que tienen las

células ya que no están en su medio normal.

No existe un procedimiento estandarizado para el contaje, un tecnólogo podría

realizar diluciones y otros podrían no hacerlo, pero a pesar de hacer diluciones

podrían existir muchas células y por tal motivo se podría tomar la decisión de contar

solo los cuadrantes del área de los eritrocitos, sin tomarse la molestia de volver

hacer la dilución, debido al tiempo que toma repetir todo el proceso.

Las diluciones, el área en que se cuenta e incluso los cálculos matemáticos

cambian entre los diferentes analistas, esta variabilidad trae como consecuencias

errores que afectan a los resultados.

1.2. Interrogantes de la investigación

Para este trabajo se tesis se plantean las siguientes interrogantes:

¿Existe un método que pueda realizar el contaje de leucocitos en menor

tiempo?.

¿Existe un método que tenga mejor precisión?.

¿Cuál es la imprecisión en el método manual?.

¿Qué tan preciso es el método automatizado?.

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1.3. Formulación del problema

¿Qué tan eficaz es el método de citometría de flujo fluorescente en líquidos

biológicos?.

¿Cuál es la ventaja de realizar esta prueba en comparación con el método

tradicional?.

DELIMITACIÓN DEL PROBLEMA

Determinación de la relación que existe entre el método manual y el método

automatizado de la citometría de flujo fluorescente en líquidos biológicos analizados

en el Hospital Luis Vernaza.

Campo: Salud.

Área: Laboratorio Clínico

Método: Citometría de flujo fluorescente

Problema: Determinación la imprecisión del método manual y del

automatizado.

EVALUACIÓN DEL PROBLEMA

Delimitado: Este estudio investigativo se realizó en muestras que ingresaron

en el laboratorio del Hospital Luis Vernaza desde el mes de enero del 2014 hasta

mayo del mismo año.

Claridad: Las muestras analizadas son de pacientes mayores de edad que

estuvieron ingresados en el hospital.

Evidente: El estudio de líquido biológico automatizado permite disminuir los

tiempos de entrega de los resultados. Tiene mejor precisión y estandariza los

procedimientos.

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Relevante: A diferencia del conteo celular manual, la automatización dá una

mejor precisión.

Factible: Porque la institución cuenta con un equipo, talento humano,

profesional y con mucha experiencia, para realizar el estudio investigativo

permitiendo hacer posible la toma de la muestra y la realización del examen.

Producto Esperado: A través del estudio realizado lo que se espera

determinar cual es el mejor método para el contaje de células nucleadas en fluido

corporal.

1.4. Variables

Variable Independiente: Cantidad de exámenes por rangos de conteo.

1.5. Objetivos

OBJETIVO GENERAL

Investigar el rendimiento del método de contaje de células nucleadas en fluido

corporal en el Sysmex XT 4000, en el Hospital Luis Vernaza de Guayaquil.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Demostrar las ventajas del método automatizado frente al método manual.

Determinar el número de muestras con valores altos, bajos y normales de

células nucleadas en líquidos biológicos en el Hospital Luis Vernaza desde

enero hasta junio del 2014.

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1.6. Justificación e importancia

El análisis del conteo celular en líquidos corporales tradicionalmente se lleva a

cabo de manera manual, utilizando el método convencional, involucrando una serie

de pasos que contribuyen a la imprecisión y consumo excesivo de tiempo.

El XT-4000 es un analizador con el principio de citometría de flujo fluorescente,

que está aprobado por la Agencia de Alimentos y Medicamentos (FDA por sus siglas

en inglés), y contiene un programa diseñado para el conteo de células en líquidos

corporales que mejora la precisión y los tiempos de entrega de los resultados.

Al analizar dos grupos de muestras, uno con el método manual y otro con el

método automático, se obtienen datos que analizados estadísticamente permitirán

demostrar que el método de conteo automático es más preciso.

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CAPITULO DOS

2. MARCO TEÓRICO

2.1. Líquido Sinovial

El líquido sinovial es un filtrado del plasma secretado por las células sinoviales

en el cual se encuentra también ácido hialurónico y la glucosamina. Las células

sinoviales revisten las superficies de las articulaciones, y sin constituir una verdadera

membrana se disponen en un espesor de tres hileras de células en ausencia de una

membrana basal, y recibe el nombre de sinovium.

2.1.1. Obtención de la muestra

El procedimiento se lo llama artrocentesis, y la muestra es obtenida mediante

punción de la articulación afectada con una aguja previa la asepsia local de la piel.

Por ejemplo, la rodilla es una articulación de más fácil acceso, una vez confirmada la

presencia de líquido en la cavidad articular, se elige como sitio de punción la línea

media del espacio comprendido entre la rótula y el cóndilo femoral interno. Es

aconsejable anestesiar el sitio de la punción mediante infiltración con lidocaina al 1%

o 2%.

2.1.2. Recolección

La articulación de la rodilla en condiciones normales puede tener hasta 4 ml de

líquido. La muestra debe ser obtenida en un tubo con heparina (una gota de

Liquemine por cada 2.5 ml. de líquido), toda vez que su coagulación espontánea

invalida el contaje celular.

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No se recomienda el empleo del citrato cómo anticoagulante, porque puede

cristalizar e interferir en la observación de cristales. En igual forma no es

recomendable el uso de EDTA por su propiedad de capturar el Ca, y en

consecuencia se podría disolver los cristales que contenga el líquido. En todo caso

se debe de obtener una muestra con heparina y otra sin ella.

Es importante tener presente que al hacer la punción, la aguja al atravesar el

sinovium vascular va a traumatizar algunos capilares y por consiguiente se

producirá una micro hemorragia dentro de la luz articular.

2.1.3. Análisis del Líquido Sinovial sin Centrifugar

Características microscópicas. El líquido normalmente no coagula, porque

carece de fibrinógeno, de los factores V y VII, de antitrombina y de trombina tisular.

Pero en condiciones inflamatorias el líquido sinovial coagula, la velocidad de

coagulación y el tamaño del coagulo está en proporción directa a la intensidad de la

misma.

Según la característica macroscópica del líquido Ropes y Bauer lo agrupa en:

normal, no inflamatorio, inflamatorio y purulento.

En la Cuadro No.1 se da a conocer las características microscópicas del líquido

sinovialde acuerdo al volumen, color, transparencia, viscosidad, formación

espontáneo del coagulo de fibrina y la investigación de la formación del coagulo de

mucina.

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Cuadro No. 1

Características Microscópicas del Líquido Sinovial

CRITERIOS NORMAL NO

INFLAMATORIO INFLAMATORIO PURULENTO

VOLUMEN Menos 4 ml. Aprox. Más de 4 ml. Más de 4 ml. Más de 4 ml.

COLOR Pajizo Amarillo pálido Xantocrómico o blanco

Blanco

CLARIDAD Transparente Transparente Ligeramente turbio a turbio

Franco turbio

VISCOSIDAD Alta Alta Baja Muy baja

COAGULACIÓN DE MUCINA

Buena Regular a buena Regular a mala Mala

COÁGULO ESPONTÁNEO

Ausente Frecuente Frecuente Frecuente

También es posible encontrar líquidos hemorrágicos en los casos de haber una

injuria traumática o en pacientes con deficiencia de algún factor de coagulación

(hemofilia).

Viscosidad. Se la determina en forma muy aceptable visualmente observando

su filancia. Se deja caer una gota del líquido desde la aguja de punción o de una

pipeta, en condiciones normales se observa la formación de un filamento que se

corta cuando cede de los 6 cm.

En los caso de líquidos provenientes de procesos inflamatorios éste filamento

se va acortando de acuerdo al grado de inflamación, y en los casos extremos puede

llegar a gotear como agua.

La viscosidad del líquido sinovial se debe a la polimerización del ácido

hialurónico y es esencial para cumplir con su función de lubricar las superficies

articulares. En las artritis la viscosidad se ve afectada tanto en la producción del

ácido hialurónico como en su habilidad de polimerizar, y por consiguiente el líquido

se vuelve menos viscoso.

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Coagulo de mucina. La prueba se realiza dejando caer una gota de líquido

sobre 1 o 2 cm. de solución de ácido acético al 5%, normalmente se forma una

“bolilla” más o menos esférica y de bordes lisos.

En los estados inflamatorios esta “bolilla” se disgrega, pudiendo en algunos

casos disolverse, formar pequeños flóculos e incluso observarse una turbiedad

homogénea. El informe será: bueno, regular, malo o no se forma.

Recuento celular método manual. Se lo realiza en la cámara de Neubauer

siguiendo la misma técnica y criterio que la empleada en el recuento celular del

Líquido Céfalo Raquídeo. En los líquidos claros el recuento se hace sin diluir la

muestra, en los líquidos turbios se recomienda hacer diluciones en solución salina.

No se debe emplear para la dilución el líquido de recuento leucocitario que se usa en

sangre periférica, porque contiene ácido acético y puede coagular el líquido.

El líquido sinovial normal tiene aproximadamente unas 200 células por ml., y de

acuerdo a la severidad de los procesos patológicos este recuento irá en aumento.

Es preferible que el recuento celular se lo haga dentro de las 24 horas de aspirado el

líquido, porque existe una rápida y progresiva disolución de las células, en especial

los neutrófilos.

2.1.4. Análisis del Líquido Sinovial Centrifugado Sedimento

Morfología celular. Células mononucleadas, cómo linfocitos, monocitos,

macrófagos y células tisulares sinoviales son las encontradas primariamente en el

líquido sinovial, conjuntamente con los neutrófilos.

Se hace un extendido en una lámina portaobjeto con el sedimento

homogenizado y se lo colorea con Wright o con Giemsa, luego se cuentan los

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elementos figurados en igual forma como se hace en el diferencial de sangre

periférica.

Neutrófilos. Tienen una morfología semejante a los observados en la sangre,

se encuentran aumentados en los procesos infecciosos, y también en los

inflamatorios “gotosos” o “pseudogotosos” inducidos por cristales. En condiciones

normales su porcentaje es inferior al 25%.

Linfocitos. Son los leucocitos mononucleados con características similares a

los de la sangre periférico, y su incremento indica un proceso inflamatorio no séptico.

Normalmente se encuentran en un porcentaje de alrededor del 25%.

Macrófagos. Con una morfología similar a los monocitos que circulan en la

sangre periférica, pero, pueden ser multinucleados y con citoplasma vacuolado.

Están presentes en una proporción del 48% aproximadamente. Su número aumenta

en los casos de infección viral.

Sinoviocitos. Con una estructura que recuerda a las células mesoteliales, pero

en ocasiones pueden semejar a los macrófagos y ser multinucleadas. Están

presentes entre el 2% y el 5%.

Anormalmente es factible encontrar otros tipos de células, cómo:

Células LE. Son neutrófilos con cuerpos de inclusión ingeridos. Están

presentes en el lupus eritematoso.

Células de Reiter. Son las células macrófagas vacuoladas en cuyo interior se

encuentran restos de neutrófilos. Están presentes en condiciones inflamatorias no

específicas y en el síndrome de Reiter.

Ragocitos (células RA). Denominadas originalmente células de artritis

reumatoide. Son los neutrófilos con granulaciones citoplasmáticas obscuras que

contienen complejos inmune.

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En caso de trauma es posible encontrar intra o extracelularmente “gotitas de

grasa” que pueden ser observadas mediante la tinción con Sudan.

Identificación de cristales. Se debe hacer observación microscópica con luz

directa y con luz polarizada de una preparación húmeda para visualizar cristales.

Esta investigación tiene interés para poder diagnosticar las artritis inducidas por

cristales. Se recomienda que la investigación de cristales sea realizada tan pronto

como se obtiene la muestra del líquido, pues, el cambio en la temperatura y el pH

del líquido pueden afectar la solubilidad de los cristales, y en consecuencia obtener

datos errados. La refrigeración de la muestra disminuye la solubilidad del ácido

úrico, lo que determina un aumento de los cristales de urato monosódico.

Cristales de urato monosódico. Se observan como agujas alargadas de 5 a

20 micras de longitud, birrefringentes, es clásico observar los extremos del cristal

fuera del leucocito que al fagocitarlo lo atraviesa. Estos cristales son de ácido úrico

que se forman en las manifestaciones de “gota”.

Cristales de pirofosfato de calcio. Son más pequeños, rectangulares, y no

perforan la pared del leucocito cuando son fagocitados. Estos cristales están

asociados con los casos de “pseudogotas”.

Otros cristales. En derrames articulares de larga data se pueden observar

cristales de colesterol, que tienen la forma de placas romboidales planas con

ángulos recortados, tienen gran tamaño (100 micras) y son muy birrefringentes.

Estos cristales nunca son fagocitados y pueden ser lo suficientemente numerosos

para dar el aspecto lechoso al líquido.

Los cristales de ésteres de corticoides son fuertemente birrefringentes, miden

de 1 a 20 micras, son fagocitados por los leucocitos del líquido articular, y están

presentes en la articulación hasta un mes después de una infiltración.

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Los cristales de hidroxiapatita miden de 0,1 a 1 micra tienen la forma de aguja,

con tendencia a formar agregados y por cuya razón pueden quedar atrapados en

una matriz orgánica formando partículas numulares. Se los puede identificar

químicamente mediante la reacción con Alizarin S. Se agrega a una gota del

sedimento recientemente centrifugado una gota de una solución al 0,5% del

colorante en solución salina, la hidroxiapatita toma una coloración rosada. Debemos

tener presente que esta reacción se presenta en todas las sustancias que tienen en

su constitución Ca, por lo tanto, puede colorear también los cristales de oxalatos y

fosfatos, pero las características cristalinas de estos difieren de la amorfa que

presenta la hidroxiapatita.

2.1.5. Análisis del Líquido Sinovial Centrifugado Sobrenadante

Como el líquido sinovial es un ultrafiltrado del plasma, los valores de los

parámetros son muy similares a los del suero, en realidad son muy pocas las

pruebas bioquímicas que tienen valor diagnóstico.

Glucosa. Es el parámetro de mayor utilidad para diagnostico, pues, un valor

marcadamente bajo revela un proceso inflamatorio o una sepsis articular. La

determinación es igual que la técnica que se emplea en la sangre. Se recomienda

que la determinación de la glucosa en el líquido sea paralela a la determinación en la

sangre, en estas condiciones la glucosa en el líquido sinovial normalmente no debe

ser más de 10 mg. por ciento menor que el valor en la sangre.

Proteínas. La cuantificación de proteína total en el líquido sinovial no

contribuye grandemente para el diagnóstico de las patologías articulares, cuando se

la mide se procede a realizar la prueba en la misma forma que si fuera suero. Un

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aumento de los valores de proteína total se ha encontrado en los procesos

inflamatorios y hemorrágicos.

Ácido úrico. Es bien conocido que la “gota” se manifiesta por un aumento de

los niveles sérico de ácido úrico. Se puede confirmar el diagnóstico si se demuestra

niveles de ácido úrico elevado en el líquido sinovial, y no pueden ser observados los

cristales al microscopio.

Pruebas inmunológicas. La mayoría de las pruebas inmunológicas que se

realizan en el suero son también empleadas para fines de diagnóstico en el líquido

sinovial.

Factor reumatoide. Se lo encuentra presente en los enfermos con artritis

reumatoide. Se han reportado valores más altos que en el suero, se piensa que sea

sintetizado en el sitio.

Complemento. Los títulos son similares a los del suero. En los enfermos con

artritis rematoidea, con lupus o con sinovitis bacteriana, encontramos niveles bajos

de complemento en el líquido asociado con niveles séricos normales, posiblemente

por haber un consumo in situ de los inmunocomplejos formados dentro de la

articulación.

En igual forma se puede encontrar niveles altos de complemento en el líquido

en la enfermedad de Reiter.

Anticuerpos antinucleares. Se la realiza por la técnica de

inmunofluorescencia de la misma manera que en suero.

2.1.6. Bacteriología

Todo examen de líquido sinovial debe de ir con una cuidadosa investigación

bacteriológica. La tinción de Gram es sin duda la mejor prueba que puede orientar al

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médico a una terapia antimicrobiana precoz en una artritis supurada, hasta que sea

reportado el cultivo y la prueba de sensibilidad.

Así mismo, hay que tener presente que existen microorganismos más

frecuentes de infección según las edades, así la incidencia de artritis por gonococos

son más frecuentes en los adultos jóvenes; las infecciones por estafilococos dorados

se presentan más frecuentes en los dos extremos de la vida. Cuando se sospeche

una infección bacteriana es necesario emplear un medio de cultivo enriquecido para

el aislamiento de bacterias aerobias en general. Si se sospecha infección

tuberculosa por hongos o por bacterias anaerobias, entonces se emplean medios de

cultivos selectivos.

Las pruebas serológicas para cuantificar inmunoglobulinas de la clase IgG o

IgM frente al gonococo o a la Chlamidia son de utilidad diagnóstica en la

investigación del líquido sinovial.

La enfermedad de Lyme es una patología infecciosa, progresiva y crónica, que

compromete múltiples órganos que incluye la piel (eritema migrans), corazón,

sistema nervioso central y periférico, hígado y articulaciones.

Aproximadamente la mitad de los pacientes con enfermedad de Lyme sin

tratar, desarrollan artritis en el curso de 2 años. La artritis primaria de Lyme afecta

especialmente a las articulaciones grandes como la rodilla.

El diagnóstico de borreliosis de Lyme es difícil, los cultivos suelen demorar

semanas para poder observar crecimiento. Lo aconsejables es investigar

anticuerpos de la clase IgG e IgM específico frente a la Borrelia burgdorferi en el

suero del paciente que se sospecha la enfermedad articular. El pico de la IgM se

manifiesta dentro de las 3 a 6 semanas de presentar el paciente los síntomas. En el

Cuadro 2 se presenta la clasificación de las artritis.

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Cuadro No. 2

Clasificación de las Artritis

Grupo I (No infecciosas) Grupo II (Inflamatorias) Grupo III (Infecciosa)

Osteoartritis Artritis truamática Osteocondritis disecante Enfermedad de Paget Hiperparatiroidismo Osteoartropatía neuropática

Artritis reumatoidea Lupus eritematoso Sindrome de Reiter Fiebre reumática Espondilitis anquilosante Sarcoidosis

Bacteriana Tuberculosa Micótico Viral Espiroquetas

Grupo IV (Inducida por cristales)

Grupo V (Hemorrágicas)

Gota por Urato Artropatía asociada con Apatito Depósito de Pirofostato de calcio Gota por Oxalato

Artritis traumática Hemangioma sinovial Uso de Anticoagulantes

2.2. Fluidos Serosos

Las cavidades cerradas del cuerpo, que se denominan: pleural, pericárdica y

peritoneal, están limitadas por dos membranas serosas. La una membrana cubre la

pared de la cavidad (membrana parietal), y la otra recubre el órgano que se

encuentra dentro de la cavidad (membrana visceral). El líquido localizado entre las

dos membranas se lo denomina fluido seroso, y tiene la función de lubricar las

superficies de las membranas para que se deslicen la una sobre la otra.

Normalmente sólo una pequeña cantidad de líquido está presente porque su

producción y reabsorción depende del equilibrio entre la presión hidrostática y la

coloidal.

2.2.1. Formación

El líquido seroso es un ultrafiltrado del plasma, normalmente es producido por

la serosa parietal y absorbido por la serosa visceral. Se forma por filtración del

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plasma a través del endotelio capilar, su presencia depende de la presión

hidrostática en los capilares, de la presión osmótica del plasma, de la reabsorción

linfática y de la permeabilidad de los capilares.

2.2.2. Obtención

Los fluidos serosos para su estudio se los obtiene por aspiración mediante

punción de la cavidad afectada, bajo condiciones de estricta asepsia. El

procedimiento de aspiración se lo denomina toracentesis si la toma es de la pleura,

pericardiocentesis si es del pericardio y paracentesis si es de la cavidad peritoneal.

La muestra debe ser recogida en tres tubos, uno con anticoagulante para

proceder al recuento celular y estudio de la morfología de las células, otro tubo sin

anticoagulante para observar si se produce coagulación espontánea, y un tercer

tubo estéril para el estudio bacteriológico.

2.2.3. Exudados y Trasudados

Son muchas las condiciones patológicas que pueden determinar la presencia

del fluido seroso en la cavidad, clásicamente se pueden separar los líquidos serosos

en dos categorías: trasudados y exudados.

Trasudados son las efusiones que se forman debido a desordenes que

interrumpe el balance que regula la filtración y reabsorción, por ejemplo los cambios

que se producen en la presión hidrostática por insuficiencia cardiaca congestiva.

Exudados son los producidos por condiciones que directamente comprometen

las membranas de la cavidad, por ejemplo los formados durante en un proceso

maligno o infeccioso.

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Es importante establecer cuando un fluido seroso es exudado o un trasudado y

en esta forma establecer la causa de su producción excesiva. Se han establecido

parámetros de laboratorio para diferenciarlos los cuales se describen en el Cuadro

No.3.

Cuadro No. 3

Parámetros de laboratorio para Fluidos Serosos

PARÁMETRO TRASUDADOS EXUDADOS

ASPECTO Generalmente límpido Seroso, purulento o hemorrágico

DENSIDAD Menos de 1.018 Mayor de 1.018

PROTEÍNA TOTAL Menos de 3.0 g/dl. Mayor de 3.0 g/dl

DEHIDROGENASA LÁCTICA Menos 200 UI. Mayor de 200 UI.

REACCIÓN DE RIVALTA Negativa Positiva

CONTAJE CELULAR Menos de 1000/ul. Mayor de 1000/ul.

BACTERIOLÓGICO Negativo Diversidad de gérmenes

COAGULACIÓN ESPONTÁNEA

Ausente Posible

CARACTERES FÍSICOS Y ORGANOLÉPTICOS

Aspecto. Los trasudados tienen en general color amarillo claro, son límpidos

aunque a veces pueden ser opalescentes. La presencia de sangre le confiere su

color característico.

Los exudados son serosos de color amarillo pajizo, serofibrinoso, con

coagulación espontánea por su riqueza en fibrinógeno; en ocasiones pueden ser de

carácter purulento, o también tener un aspecto lechoso por la presencia de glóbulos

de grasa.

Densidad. Se puede medir con los densímetros que son empleados en orina.

En general la densidad es mayor en los exudados.

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Coagulación. Se presenta espontáneamente en los exudados mientras que los

trasudados no coagulan, y si lo hacen sólo exhiben una película fina.

Examen citológico. El material extendido es teñido por la técnica de Giemsa o

de Wright. En los procesos crónicos como tuberculosis, sífilis, tumores y pleuresías,

se observan predominio de linfocitos. En los procesos infecciosos agudos se

observarán gran número de polimorfonucleados.

Los eosinófilos sugieren un proceso alérgico o parasitario. En ocasiones se

pueden encontrar células tumorales de gran tamaño, en ocasiones con vacuolas,

que pueden ser confundidas con macrófagos.

Recuento celular. Se emplea la cámara de Neubauer estándar. Cuando el

líquido es claro el contaje células se lo hace directamente, si el líquido es turbio es

necesario previamente hacer una dilución en solución salina (ver Cuadro No.4).

Cuadro No. 4

Parámetros de laboratorio para Fluidos Serosos

CLARIDAD DILUCIÓN CANTIDAD DE MUESTRA CANTIDAD DE DILUYENTE

Opalescente 1:10 30 ul 270 ul

Lig. turbio 1:100 30 ul 2970 ul

Turbio 1:200 30 ul 5970 ul

Criterios para realiza el contaje. El número de células presentes en el área

de los 9 reticulados de la cámara (9 mm2) nos orientará sobre el criterio que

debemos tomar para realizar el contaje:

a) Si más de 200 células están presentes en cada retículo de 1 mm2, se

cuentan células que están en los 5 cuadriculado del área de los hematíes

(las cuatro esquinas y el del centro).

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b) Si más de 200 células están presentes en los 9 mm2 de la cámara, se

procederá a contar los 4 retículos de las esquinas (área de los leucocitos).

Identificación de los elementos celulares. Las células en la cámara se

identifican de la siguiente forma:

a) Los hematíes por su característica de tener un centro más claro. Si son

crenados ellos tendrán unas proyecciones puntiformes.

b) Los leucocitos son células granulares o mononucleados.

c) Las células de origen tisular son grandes y de bordes citoplasmáticos

irregulares. Las células lisadas o tisulares no se toman en cuenta en el

contaje.

Cálculos. Los cálculos del total de células se basan en la siguiente fórmula:

Total de células / mm3 =𝑁𝑜.𝑑𝑒𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠𝑥𝐷𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛

𝐶𝑢𝑎𝑑𝑟í𝑐𝑢𝑙𝑎𝑠𝑐𝑜𝑛𝑡𝑎𝑑𝑜𝑠𝑥𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛𝑐/𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟í𝑐𝑢𝑙𝑜

Ejemplos para aplicar la fórmula:

a) Volumen del cuadriculado del área de los hematíes = 0,004 mm3 (Si

contamos 30 células en los 5 cuadriculados en fluido diluido 1:10)

30 x 10 = 15.000 células /mm3

5 x 0,004

b) Volumen del cuadriculado de leucocitos = 0,1 mm3 (Si contamos 120 células

en los 4 cuadriculares de las esquinas en fluido sin diluir

120 x 1 = 300 células /mm3

4 x 0,1

c) Volumen de cada cuadriculado = 0,1 mm3 (Si contamos 25 células en los 9

mm2.en fluido sin diluir)

25 x 1 = 28 células/mm3

9 x 0,1

21

2.2.4. Examen Químico

Proteínas. En general los trasudados contienen una concentración de

proteínas inferior a 3,0 g/100; los exudados poseen una concentración mayor de 3,0

g/100. La cuantificación se lo puede hacer por técnica química empleada en química

sanguínea o por densimetría.

Reacción de Rivalta. En una probeta de 100 ml. se coloca 0,1 ml. de ácido

acético glacial y se completa con agua el volumen. A esta solución se deja caer una

gota del fluido seroso. Si el líquido es un exudado se forma una nubécula parecida al

humo de cigarrillo, cuya intensidad se mide por cruces, en los trasudados no

aparece esta nubécula.

Dehidrogenasa láctica. Puede ser de gran utilidad para el diagnóstico de

tumores metastáticos de pleura en el caso de líquidos pleurales.

2.2.5. Examen Bacteriológico

Es necesario realizar observaciones de las preparaciones teñidas con Gram y

Zielh Neelsen. Es conveniente realizar cultivos.

2.3. Líquido Pleural

En condiciones normales el líquido pleural es claro y de color amarillo pálido.

La turbidez está dada por la cantidad de leucocitos que están presentes y

generalmente indica infección bacteriana, tuberculosis, o un desorden inmunológico

como artritis reumatoide.

La presencia de sangre es debido a un hemotórax (lesión traumática), daño en

las membranas como es el caso de malignidad o también debido a la punción de

22

algún capilar al momento de efectuar la punción. Una forma de diferenciar entre un

hemotórax y un líquido hemorrágico por accidente de punción es haciendo un

hematocrito del líquido, si la sangre es por un hemotórax el hematocrito del líquido

será igual al hematocrito de la sangre total venoso.

La presencia de un líquido de aspecto lechoso se debe a la presencia de

quilomicrones por el paso a través del ducto torácico o a la presencia de material

pseudoquilosos producidos en procesos inflamatorios crónicos. Se puede distinguir

la naturaleza de estas dos sustancias si se mezcla el líquido con éter, en el caso de

ser quilomicrones el fluido se aclara.

Los valores de los parámetros químicos del líquido pleural son iguales a los del

plasma porque el fluido pleural es un ultrafiltrado. Son de mejor utilidad clínica si

simultáneamente se cuantifica en el líquido pleural y en el suero las proteínas

totales, la dehidrogenasa láctica y el colesterol, para establecer si el fluido en estudio

es exudado o trasudado. En el Cuadro No. 5se muestras algunos parámetros con

sus respectivos valores.

Cuadro No. 5

Valores para Líquido Pleural exudado y trasudado

PARÁMETROS

TRASUDADO

EXUDADO

Proteína Total Relación Liq.Pleural/ suero

< 0,5 >0,5

Deshidrogenasa Láctica Relación Liq. Pleural/ suero

< 0,6 > 0,6

Colesterol Total Liq. Pleural < 60 mg/dl > 60 mg/dl

Colesterol Relación Liq. Pleural/ suero

< 0,3 0,3

A pesar que el estudio citológico es el más específico para detectar malignidad

en los fluidos pleurales, de gran ayuda es también determinar los niveles de ciertos

marcadores tumoral para establecer si el líquido es carácter maligno o inflamatorio.

23

Un aumento de los niveles de CEA es la mejor información diagnóstica de

malignidad. No existe un rango de normalidad porque hay muchos factores que

intervienen y hacen que los resultados sean variables entre laboratorios, algunos de

ellos son la diversificación de técnicas, y quizás la más importante el valor de corte

(Cut off values). Se ha reportado que valores tan altos como 12 ng/ml son

compatibles con líquidos de naturaleza maligna.

La investigación de otros marcadores tumorales como el CA 125, CA 191 y el

CA153 también son de ayuda para el diagnóstico de neoplasia.

Las investigaciones inmunológicas también tienen su valor diagnóstico. La

presencia de células LE en el líquido pleural confirma el diagnóstico de pleuritis

lúpica, y títulos altos de anticuerpos ANA (1:160 o más) y/o una relación líquido

pleural / suero de 1.0 o mayor confirma el diagnóstico.

2.4. Líquido Pericárdico

Normalmente una pequeña cantidad, de aproximadamente 10 ml. de un líquido

claro y de color amarillo pálido se encuentra en el espacio pericárdico.

El aumento de líquido se sospecha cuando al examen clínico se determina que

hay una compresión cardiaca y está determinada por un trastorno en la

permeabilidad de las membranas pericárdicas causada por una infección

(pericarditis), a cambios metabólicos o neoplásicos.

Un líquido turbio nos indica que existe una infección o neoplasia. Un líquido

lechoso indica que existe un daño a nivel del sistema linfático. En las tuberculosis y

en ciertos tipos de tumores el líquido es ligeramente hemorrágico, este último

también puede ser causado accidentalmente al momento de hacer la punción.

24

Un aumento de contaje de leucocitos mayor de 1000 células por mm3 con

predominio de polimorfonucleados sugiere una pericarditis bacteriana. En igual

forma el estudio citológico tiene valor diagnóstico en los procesos malignos.

Una disminución de los niveles de glucosa se encuentra en los procesos

infecciosos y en los malignos.

La tinción de Gram de los frotis preparados del sedimento del líquido

centrifugado es importante para establecer la presencia de bacterias, y los cultivos

sólo se realizarán en caso de sospecharse una endocarditis bacteriana.

2.5. Líquido Peritoneal.

La acumulación de líquido en la cavidad peritoneal se denomina ascitis. En

ocasiones se suele introducir solución salina en la cavidad peritoneal para hacer un

lavado y detectar algún daño abdominal, esta maniobra es muy sensible para

detectar hemorragia intraabdominal.

El líquido peritoneal es claro y de color amarillo pálido. Los exudados son

turbios en infecciones bacterianas o micóticas, de color verdoso cuando está

presente la bilirrubina, la misma puede ser reconocida mediante el empleo de las

tirillas que se usan en el examen de orina en el área destinada para esta prueba.

Un contaje leucocitario mayor de 300 x mm3 con predominio de granulocitos

indica una peritonitis bacteriana o una cirrosis. Los tipos de células que se pueden

encontrar en una observación microscópica son variables.

Los mononucleados fagocítos (monocitos, histiocitos y macrófagos) son

observados en número variable dependiendo de la etiología del líquido.

Los linfocitos en número variable exhiben modificaciones en su estructura

celular de acuerdo a los estímulos. Existe predominio de linfocitos en las peritonitis

25

tuberculosas, en las insuficiencias cardiacas congestivas, en las cirrosis y en el

síndrome nefrótico. En los linfomas malignos con líquido ricos en linfocitos se

recomienda utilizar la citometría de flujo para diferenciar las diversas variedades de

linfocitos.

Los neutrófilos se presentan con el número de granulaciones citoplasmáticas

disminuido y con núcleo densamente teñido. En las peritonitis se observan

polimorfonucleados degenerados vacuolados y con núcleos borrosos.

Los eosinófilos están asociados con insuficiencia cardiaca congestiva,

vasculitis, ruptura de quiste hidatídico y en diálisis peritoneal crónico. Las células

mesoteliales son de morfología muy variable, al igual que las de las cavidades

pericárdica y pleural. Hay que tener buena experiencia para poder reconocerlas y

diferenciarlas microscópicamente las formas benignas de las células malignas.

Durante los procesos inflamatorios las células mesoteliales proliferan y se

descaman al líquido seroso, son pleomorfas, se encuentran libres o formando

pequeños grupos.

Miden entre 15 y 25 micras, citoplasma abundante que se tiñen de color azul

entre gris y profundo, y presentan un halo perinuclear. El núcleo es redondo u oval,

ocupa un tercio o la mitad de la célula y en ocasiones se presentan mutinucleadas,

la membrana nuclear es regular, lisa y la cromatina uniformemente distribuida.

Algunas células mesoteliales tienen una morfología semejante a las células

plasmáticas.

Varios intentos de clasificar a las células mesoteliales de acuerdo a su

morfología se han realizado, pero aunque no se ha logrado estandarizar una

clasificación, se tienen:

26

a) Células proliferativas e hiperplásicas. Son aquellas células que se disponen

en grupos tienen un citoplasma que va de escaso a moderado y núcleo

hipercromático.

b) Células activas. Se refiere a las células con núcleo ligeramente irregular y

con presencia de nucléolos.

c) Células atípicas. Son aquellas células que recuerdan a las células malignas.

La cuantificación de amilasa en el líquido peritoneal es un examen de rutina,

valores altos se encuentran en los pacientes con pancreatitis traumática o aguda,

con pseudoquistes pancreático, y en las perforaciones gastrointestinales.

Las determinaciones de urea y creatinina son de utilidad cuando queremos

conocer si hay ruptura de la vejiga urinaria. Estos dos parámetros se encuentran

altos en el líquido, y en la sangre los valores de la urea está alto y la creatinina

normal. Si los valores en el líquido son iguales a los de sangre, se puede sospechar

de punción accidental de la vejiga durante la maniobra de paracentesis.

Los valores de glucosa son más bajos con relación a la sangre periférica en las

peritonitis tuberculosas y en carcinomatosis abdominal. En los casos de perforación

intestinal la fosfatasa alcalina suele estar aumentada.

La tinción de Gram y los cultivos para aerobios y anaerobios son importantes

para establecer la etiología de las peritonitis bacterianas, y la tinción de Zielh

Neelsen para investigar bacilos ácido resistentes en caso de sospechar tuberculosis

peritoneal.

2.6. Líquido Amniótico

El líquido amniótico es una fuente importante para evaluar las condiciones del

feto. Mediante algunas pruebas realizadas en este líquido se puede establecer el

27

grado de madurez pulmonar, revelar una complicación por isoinmunización por Rh, y

la presencia o ausencia de anormalidad nosocromal.

Aproximadamente seis días después de la fecundación, el óvulo fecundado

diferenciado en blastocito se implanta en la decidua del útero. El blastocito luego se

multiplica y se diferencia y forma el disco embrionario. Posteriormente, aparece un

aclaramiento entre el disco embrionario y el trofoblasto que progresivamente se

agranda y forma la cavidad amniótica.

La cavidad amniótica es completamente cerrada y envuelve al embrión. El

amnión es la membrana interna en contacto con el líquido, y está formada por una

capa de células cuboides sobre una membrana basal.

La función del líquido amniótico es proteger al feto, favorecer el movimiento

fetal, mantener la temperatura del feto y participar en la bioquímica homeostática

fetal.

La regulación del volumen del líquido amniótico y su composición es poco

conocida, sin embargo, a partir del segundo o tercer trimestre se produce un

intercambio de agua y solutos entre líquido y el feto por las siguientes vías:

absorción en el tracto respiratorio a nivel del capilar alveolar que están embebidos

de líquido, por reabsorción a nivel intestinal, y por vía urinaria.

A las 25 semanas de gestación antes de la queratinización hay un intercambio

a través de la piel fetal con el líquido amniótico de compuestos lípidos solubles, y

también de agua y solutos. Sin embargo, el mejor sitio de intercambio entre feto y

madre está a nivel del corion placentario en donde ambas circulaciones están en

íntimo contacto.

La vía de intercambio del agua es de líquido amniótico a la madre, entre madre

y feto y del feto al líquido, y el mayor proveedor de líquido es la orina fetal.

28

Durante el embarazo hay aumento progresivo del volumen de líquido

amniótico, debido probablemente al crecimiento del feto. A las 12 semanas el

volumen es aproximadamente de 35 ml., a las 18 semanas de 300 ml. y 800 ml. al

término del embarazo.

Se llama hidramnios cuando la cantidad supera los 2000 ml.. Generalmente

está asociada en un 20% con anormalidades en el sistema nervioso central o

digestivo del feto. Y cuando la cantidad de líquido amniótico es inferior a 300 ml. se

denomina oligohidramnio, que es compatible con malformaciones de las vías

urinarias.

2.6.1. Obtención de la muestra

La obtención del líquido se denomina amniocentesis y se lo hace

preferentemente por punción transabdominal, también se la puede hacer por vía

vaginal con el riesgo de causar una infección a la placenta post punción. También, la

obtención de la muestra por vía vaginal puede causar contaminación del líquido con

bacterias y con células proveniente de la vagina.

El momento más adecuado para realizar la punción es a las 16 semanas de la

última regla, o a las 14 semanas de gestación. Se debe practicar la amniocentesis

bajo estrictas medidas de asepsia y evitando causar daño a la placenta o al feto.

La cantidad de líquido a obtener debe de ser aproximadamente de 30 ml., y los

primeros 2 ml deben de descartarse porque pueden estar contaminados con sangre

proveniente de la maniobra de la punción.

La muestra debe ser procesada inmediatamente. Hay que reportar la

transparencia del líquido antes y después de la centrifugada, o si hay presencia de

29

sangre. Para el examen de madurez pulmonar fetal (relación L/S o foatidilglicerol) 6

o 7 ml deben ser refrigerados inmediatamente de obtenido.

El estudio celular se lo practica tomando una muestra del sedimento del líquido

centrifugado a baja velocidad (500 a 1000 g.) por 5 minutos. El estudio de la

bilirrubina se hace en líquido protegido de la luz, y para la investigación de Alfa-

fetoproteína se debe tomar conjuntamente a la madre sangre para separar suero y

hacer el cálculo de la relación.

Normalmente el líquido es incoloro, si presenta una coloración rosada por la

presencia de hematíes, es importante establecer si la sangre es de origen materna

causada accidentalmente al momento de la punción o por una hemorragia intra

amniótica, o si es de origen fetal.

Mediante la prueba de Kleihauer-Beyke se puede establecer la naturaleza de la

presencia de sangre en el líquido amniótico. El principio de la prueba se basa en que

la Hb fetal (Hb F) es resistente a la elusión ácida, mientras que no lo es la Hb de

adulto (Hb A). La prueba se la realiza del modo siguiente:

Reactivos:

a) Ácido cítrico 0,1 M (Solución Stock A).21 g. de ácido cítrico monohidratado

se diluye en 1000 ml. de agua destilada. Guardar en refrigeración.

b) Fosfato de sodio 0,2 M (Solución stock B).4.2 g. de fosfato dibásico de

sodio se disuelve en 500 ml. de agua destilada.

c) Solución Buffer de trabajo (pH 3.3). Se mezcla 73.4 partes de solución A

con 26.6 partes de solución B

d) Hematoxilina ácida (Colorante de Mayer)

e) Eosina Y, solución acuosa 0,5%

Técnica:

30

Se fijan los frotis en etanol 80% por 5 minutos. Se lava con agua y se deja

secar a medio ambiente. Se coloca los frotis en solución buffer de trabajo a 37° C

por cinco minutos. Se lava los frotis. Se cubren los frotis con Hematoxilina por 5

minutos. Lavar con agua. Y finalmente cubrir los frotis con la solución de Eosina.

Lavar, secar y observar al microscopio.

Al ser observadas las preparaciones al microscopio, los hematíes de origen

materno a parecen como estromas en sombra, en cambio que los hematíes de

origen fetal se verán de color rojo brillante. Otra prueba que permite diferenciar los

dos tipos de sangre es la electroforesis de hemoglobina.

El color “verdoso” que en ocasiones puede presentar el líquido amniótico se

debe a la mezcla de secreción intestinal fetal con el líquido, y se lo denomina

meconium. La intensidad del meconium puede ser estimado como: ligero, moderado

o espeso.

Los líquidos clasificados como espeso asemejan a color verde se sopa de

arveja y están asociados con el síndrome de aspiración mesoconial denominado

meconium crítico. También hay la posibilidad de cuantificar el meconium, el líquido

se lo coloca en un tubo de micro que se emplea para el hematocrito en sangre, se lo

centrifuga como si fuera tal, se lee la altura de meconium presente después de

centrifugado y se reporta en porcentaje. En el Cuadro 6 se observa como diferentes

coloraciones se asocian con posibles condiciones fetales.

31

Cuadro No. 6

Coloración del Líquido Amniótico asociados con condiciones fetales

Coloración Posible condición asociada

Incoloro o pajizo Normal (no es la regla pero sin embargo se presenta en las eritroblastosis)

Amarillento Eritroblastosis

Verdoso (meconium) Hipoxia fetal (excepto durante el embarazo reciente). Síndrome de aspiración mesoconial.

Rojo oscuro a pardo Muerte fetal

2.6.2. Madurez Dérmica Fetal

A partir del ectodermo al final de la neuralización se van a diferenciar las

células para constituir la epidermis, que está formada por dos capas: el peridermo

que es la capa más superficial, y la capa germinativa o basal que es la capa

profunda. El peridermo es la capa que juega rol importante en los intercambios

metabólicos entre la piel fetal y el líquido amniótico, desaparece antes del término

del embarazo, salvo en casos excepcionales como ocurre con el denominado niño

colodión (ejemplo la ictiosis).

De forma paulatina el peridermo se convierte en una estructura queratinizada

persistente con tendencia a la descamación a medida que avanza la gestación, es

decir que mientras no se inicia la maduración fetal, no habrá descamación celular en

el líquido amniótico.

De la semana 16 a la 20 comienza el esbozo de la descamación y del unto

sebáceo, el 50% de las células son de la capa profunda de la epidermis. Entre las 32

y 36 semanas predominan las células intermedias, y entre las 37 y 38 semanas

predominan las células superficiales anucleadas que reflejan la madurez fetal.

Identificación de las células. Al hacer el estudio de las preparaciones

citológicas hay que distinguir dos tipos de elementos: las células, y los elementos no

32

celulares como gotas de grasas (untos sebáceos) presentes en las gestaciones

avanzadas cuando el feto está maduro, y lanugo y otros.

Para el estudio celular se emplea la tinción con azul de Nilo.

Reactivo:

Azul de Nilo Solución acuosa al 1%

Técnica:

Centrifugar el líquido a velocidad baja por 5 minutos. Descartar el sobrenadante

en otro tubo y colocar sobre una lámina cubreobjeto una gota del sedimento más

una gota de la solución de azul de Nilo. Cubrirlo con un cubreobjeto y pasarlo por la

llama suavemente para que se fijen las células. Contar 500 células y promediar el

porcentaje. Hay que tratar de buscar las áreas en las cuales no se formen cúmulos

celulares.

Identificación de las células presentes en el líquido amniótico. Se pueden

diferenciar los siguientes tipos celulares:

a) Células amnióticas. Tienen un tamaño de 20 a 30 micras, son de forma

redondas u ovaladas, caracterizadas por un citoplasma de color azul

intenso, con presencia de vacuolas, y un núcleo central redondo u ovalado

hipercromático. Son células que se originan en el amnio y son frecuentes

encontrarlas hasta la semana 33, y luego disminuyen progresivamente

hasta el final del embarazo.

b) Células poliédricas. Tienen de 40 a 50 micras con un citoplasma de color

azul pálido, tienen contorno poligonal frecuentemente con plegaduras, con

núcleo central u ovalado con escasa estructura cromática. En ocasiones

tienen escasas granulaciones de color naranja. Permanecen más o menos

33

constantes durante todo el embarazo, por lo tanto no guardan relación con

la madurez fetal.

c) Células Naranjas. Son células anucleadas de 50 60 micras, que tienen un

color naranja o incoloro en su citoplasma, el color está en función del

contenido lipídico. Proceden de la epidermis, así a medida que el feto

madura también aumentan el número de células naranja. En embarazo de

32 semanas el porcentaje será mayor del 20%. El conglomerado de células

cada vez será mayor partir de la semana 39. En el Cuadro 7 se presenta la

madurez fetal por citología líquido amniótico.

Cuadro No. 7

Apreciación de madurez fetal por citología líquido amniótico

MADUREZ FETAL

Celularidad abundante o media

Agrupación celular de 2+ a 3+

Porcentaje de células naranjas mayor del 20%

Grasa extracelular abundante o media

Células anucleadas 20% o más

En casos muy aislados, como ocurre con los fetos muertos por varios días, se

podrá observar células descamativas del tracto respiratorio. Estas células son

cúbicas, altas, de coloración basófila, con su núcleo en el tercio inferior y se

caracteriza principalmente por la presencia de cilios en el polo apical celular.

2.6.3. Defectos del Tubo Neural: Alfa Fero Proteína

La formación de la placa neural, las hojas neurales y su cierre para formar el

tubo neural se llama neurulación, y el embrión en esta etapa se denomina neurula.

34

La formación del tubo neural comienza el día 22-23 después de la fecundación, en la

región de la cuarta, quinta y sexta somitas, que representa la futura región cervical.

En este período los 2/3 de la placa y tubo neural darán origen al cerebro, y el 1/3

caudal dará lugar a la médula espinal.

La fusión de las hojas neurales ocurre de forma irregular en dirección

caneocaudal, el tubo neural está abierto en ambos extremos y se comunica

libremente con el líquido amniótico. La abertura craneal denominada neuroporo

rostral o anterior se cierra el día 24, y el neuroporo caudal o posterior el día 27.

Luego las paredes del tubo se engrosan para formar el cerebro y la médula

espinal, y la luz del tubo neural es convertida en el sistema ventricular del cerebro y

en el canal central de la médula espinal.

Por lo tanto los defectos del tubo neural quedan establecidos en los primero 28

días de la concepción. La Alfa feto proteína (AFP) es formada en el hígado fetal y el

saco vitelino, y sus niveles en el feto pasan por tres etapas: un incremento

exponencial dentro de la semana 14 de gestación por aumento de su formación,

disminución gradual entre las semanas 14 y 32 debido una expansión del volumen

plasmático, y caída abrupta al término del embarazo debido a la maduración del

hígado con disminución de la formación. Su presencia en el líquido amniótico deriva

de la micción fetal y del epitelio amniótico.

La cuantificación de AFP en el líquido se lo puede realizar con cualquier técnica

que se emplea en química sanguínea. Los niveles encontrados en la semana 20 son

elevados alcanza las cifras de 1200 ng/ml., en la semana 31 está alrededor de 350

ng/ml. Hay tendencia a disminuir los valores hasta 150 ng./ml. en la semana 39, y

tiende a estabilizarse hasta la semana 43.

35

Valores muy altos se encuentran en los líquidos amnióticos provenientes de

embarazos patológicos, como acráneo, malformaciones múltiples y polihidramnio

acompañado de malformación congénita (onfalocele).

2.6.4. Madurez Pulmonar Fetal

El desarrollo pulmonar embrionario se hace en cuatro etapas:

a) Periodo Pseudoglandular (5-17 semanas). El pulmón parece una glándula a

causa de que las divisiones bronqueales se están diferenciando en un

sistema de conducción de aire. La respiración no es posible en esta etapa.

b) Período Canalicular (16-25 semanas). Se han formado los bronquiolos

respiratorios y la vascularización pulmonar aumenta enormemente. La

respiración es posible hacia el final de este período porque comienza a

formarse los sacos terminales.

c) Período saco Terminal (24-40 semanas). Las células epiteliales de los

sacos terminales de origen endodérmico se hacen más planas

(pneumocitos tipo I), y hay un activo desarrollo de la red capilar y linfática.

Hacia las 25 y 28 semanas el feto tiene un peso de 1000 gr. y habrá

suficientes sacos alveolares como para permitir la sobrevida de un

prematuro.

d) Período Alveolar (período fetal tardío hasta los 8 años de edad). Los sacos

terminales se transforman en los alvéolos de estructura compleja en los

cuales los pneumocitos tipo I se transforman en tipo II que comienzan a

secretar surfactante, una sustancia capaz de bajar la tensión superficial a

los rangos biológicos los niveles de la interfase aire-alvéolos, manteniendo

la permeabilidad de los alvéolos y previniendo la atelectasia pulmonar.

36

Durante el desarrollo hay proliferación de los pneumocitos tipo II y de los

cuerpos lamelares (inclusiones osmiofílicos) intracitoplasmáticos, estos últimos

aumentan en tamaño y número, y emigran de la región perinuclear hacia la

superficie celular siendo entonces depositados en el espacio alveolar.

Anteriormente se considera a la lecitina como el componente más importante

del surfactante pulmonar, pero recientemente se ha demostrado que la lecitina debe

ser estabilizada previamente por dos fosfolípidos ácidos, el fosfatidilinositol y el

fosfatidilglicerol. La producción de estos dos últimos a su vez es regulada por los

niveles de mioinositol.

El síndrome de dificultad respiratoria se debe a una carencia de fosfatidilglicerol

porque su formación está bloqueada, debido a la eliminación de su precurso, el

citidinadifosfato diglicérido, a nivel de los pneumocitos tipo II, por la presencia de

altos niveles extracelulares de mioinositol.

Existen en el comercio un kit que nos permiten investigar mediante anticuerpos

monoclonales el fosfatidilglicerol (PG), y también investigar por técnica micrométrica

los fosfolípidos guardados a nivel de los cuerpos lamelares, para conocer la

madurez pulmonar fetal.

La prueba de la espuma o de Clements en sencilla y nos permite valorar

también la madurez pulmonar. Se basa en la capacidad del surfactante pulmonar

presente en el líquido amniótico para formar una espuma estable en presencia de

etanol.

Reactivos:

a) Etanol de 95°

b) Solución salina al 0,9%

Técnica:

37

Rotular dos tubos de ensayo A y B, proceda a pipetear de la forma en que se

indica en el Cuadro Np. 8.

Cuadro No. 8

Forma de pipetear el tubo A y B

TUBO A TUBO B

Líquido amniótico 1,0 ml 0,5 ml

Solución salina 0,0 ml 0,5 ml

Etanol de 95° 1,0 ml 1,0 ml

Tapar ambos tubos y agitarlos vigorosamente. Dejar en reposo por 15 minutos

y luego realizar la lectura.

Lectura:

Se lo hace en la interfase líquido-aire en los tubos frente a un fondo negro. A la

altura del menisco debe observarse un anillo continuo para ser considerado positivo.

Si al contrario, el anillo presenta discontinuidad en algunas de sus partes se

considerará negativo.

Resultados de la Prueba:

Si los tubos A y B son positivos, la prueba es positiva.

Si el tubo A es positivo y el B negativo, la prueba es dudosa.

Si el tubo A y B son negativos, la prueba es negativa.

Líquido amniótico con meconio puede dar un falso positivo. Si está

contaminado con sangre es recomendable centrifugar el líquido a baja velocidad

(500 r.p.m) por cinco minutos. Si el hematocrito del sobrenadante es menos de 3%

se procede a realizar la prueba.

38

Una prueba adicional es medir la absorbancia del líquido amniótico a una

longitud de onda de 650 nm en un espectrofotómetro. Existe madurez pulmonar si se

obtiene una absorbancia igual o mayor de 0,150. La prueba se basa en que los

fosfolípidos son insolubles en el agua, y el líquido aumenta su turbidez en proporción

directa al progreso del embarazo y al aumento de la concentración de los

fosfolípidos. El espectrofotómetro es puesto en “cero” con agua destilada, y el líquido

debe ser centrifugado a 2000 g. por 10 minutos antes de la medición.

2.6.5. Madurez Renal Fetal: Creatinina

La relación entre los niveles de creatinina y la edad gestacional, junto con la

disminución de la osmolaridad del líquido amniótico, parece que se debe al aumento

progresivo de la depuración de la creatinina y a la reabsorción del sodio.

Se señala a la orina fetal como el principal contribuyente al incremento de la

concentración de creatinina en el líquido amniótico. También se señala que el

mecanismo básico del egreso de creatinina del saco amniótico es la deglución fetal.

El volumen de líquido deglutido está en relación con la edad fetal, en forma similar al

volumen de orina excretado. El feto a término deglute 500 ml. de líquido en 24 horas.

La creatinina absorbida del intestino es transferida a la placenta o reciclada al líquido

amniótico a través de los riñones.

La misma técnica empleada para la determinación de creatinina sérica puede

ser utilizada para el líquido amniótico. Antes de la determinación la muestra debe ser

centrifugada para remover el vermix y meconio. Puede ser procesada hasta 24

horas después de la obtención. El valor crítico indicativo de madurez renal es de 2.0

mg./dl.

39

2.6.6. Madurez Hepática Fetal: Bilirrubina

La bilirrubina puede ser detectada en el líquido amniótico normal a las 12

semanas de gestación, disminuye progresivamente en el último trimestre de la

gestación y hay tendencia a desaparecer para la semana 38 de amenorrea. Este

descenso se debe al mayor desarrollo y maduración de la capacidad hepática de

conjugar a la bilirrubina (desarrollo del sistema enzimático fetal), a la disminución de

las proteínas, y al perfeccionamiento gradual de la deglución fetal.

No se ha establecido cómo llega la bilirrubina al líquido amniótico, pero se han

sugerido las siguientes rutas:

a) Secreciones traqueobronquiales.

b) Excreciones a través de la mucosa del tracto gastrointestinal superior.

c) Orina y meconio fetal.

d) Difusión a través del cordón umbilical y la piel fetal.

Estudio espectrofotométrico del Líquido Amniótico. Las muestras de

líquido amniótico para el análisis espectrofotométrico se pueden agrupar en:

a) Aquellas tomadas antes de la semana 16 de gestación, usadas para

evaluación genética.

b) Las tomadas después dela semana 28, para evaluar hemólisis en

incompatibilidades Rh.

c) Las tomadas cerca del término del embarazo, para evaluar madurez fetal en

embarazo de alto riesgo.

Técnica:

El líquido debe ser obtenido en un tubo de ensayo protegido de la luz, con el fin

de que los pigmentos bilirrubinoides no se destruyan ante la luz solar, artificial o se

40

produzca la lisis de los hematíes contenidos en el líquido.

El líquido se centrifuga a 3.000 r.p.m. por diez minutos.

Se agrega el líquido a la cubeta del espectrofotómetro, usando agua destilada

como blanco.

Se realiza una lectura de la densidad óptica del líquido en estudio cada 20 nm.,

comenzando con 340 nm. y llegando hasta 700 nm. con un lectura obligatoria en 450

nm. Debe de utilizarse agua destilada como blanco en cada lectura de densidad

óptica.

Los valores obtenidos son llevados a un papel semilogarítmico en donde se

traza una curva. De la unión de las lecturas obtenidas se forma una gráfica, si no

existe bilirrubina se obtiene una línea recta, pero en el caso de que la hubiera

observaremos una jiba alrededor del 450 nm.

Entre los puntos 365 nm. y 555 nm. se traza una recta que será la línea base.

A la lectura obtenida en los 450 nm. se le sustrae la cantidad que marque el

punto corta la recta base en esos 450 nm.

El módulo absoluto del resultado de esa sustracción es la variación de la

densidad óptica y representa el delta de absorción de la bilirrubina (ADO).

Interpretación de los datos:

El ADO está íntimamente relacionado a la edad gestacional. En los

embarazos mayores de 36 semanas el valor de ADO será menor de 0,020,

con tendencia a desaparecer a la semana 38.

Valores mayores de 0,020 puede corresponder a una gestación a término.

Cuando se comparan las curvas de absorbancia de fetos normales y

eritroblastóticos se observa que la distorsión a 450 nm. aumenta a medida que

41

mayor es la hemólisis, por lo tanto es usada para predecir el grado de afectación

fetal.

En igual forma la oxihemoglobina, que se libera de la hemólisis de los

eritrocitos, contenida en el líquido se visualiza en la curva de absorbancia como pico

en las lecturas entre 408 y 415 nm.

También se ha publicado que en los casos de embarazo con hidrocefalia existe

una disminución del valor ADO en 450 nm., posiblemente relacionado con el

aumento del volumen del líquido amniótico que acompaña a esta patología.

2.7. Conteo Celular Manual

En el laboratorio se puede tener un fluido muy claro y procesarlo directamente,

o un fluido un poco turbio al cual se le puede hacer una dilución 1 a 10 para leerlo en

la cámara. Al ver los resultados se puede pensar que se debió diluirlo más porque

hay muchas células, pero en lugar de hacer una nueva dilución se decide contar solo

en el área de los eritrocitos, y si no se encuentran células en la dilución se cuenta en

ambos lados en lugar de volver a hacer la dilución porque no hay tiempo para

repetirla.

El Colegio Americano de Patólogos establece que se debe tener un

procedimiento en el laboratorio que especifique, basado en cuantas células se

observan en el cuadro de la cámara, en que área de la cámara se debe contar, pero

suele ocurrir que no se lo hace si se tienen más de cien células. El conteo celular no

es tan crítico como el tipo de célula en sí.

El conteo celular en un fluido es crítico si está elevado o si está bajo, en sangre

periférica es más preocupante si se tiene 400 o 500 células en el conteo de

42

leucocitos, especialmente cuando se está en el rango bajo, porque conteos bajos de

leucocitos si se están yendo hacia arriba o hacia abajo hacen la diferencia.

En los fluidos corporales, si se está en el rango normal a nadie le preocupa el

límite bajo, excepto en el fluido cefalorraquídeo para asegurarse que es normal, lo

importante es poder decir porque el conteo está elevado y cuales son esas células.

Las diluciones pueden ser diferentes todo el tiempo, y el área en donde se

cuenta también puede ser diferente todo el tiempo, aún los cálculos matemáticos

son diferentes y se pueden cometer errores en estos. El principal problema con los

fluidos corporales es que nunca son iguales.

2.8. Conteo Celular Automatizado

Actualmente existen soluciones de tecnología avanzada que ayudan a los

laboratorios clínicos en la demanda de información clínicamente relevante, en la

mejora de los tiempos de respuesta y en la optimización de sus recursos.

2.8.1. Equipo XT-4000i

El XT-4000i de Sysmex, es un analizador hematológico automatizado

cuantitativo con múltiples parámetros; designado a ser utilizado para el diagnóstico

in vitro y usado para el tamizaje de poblaciones celulares de pacientes que se

atienden en el laboratorio clínico. Las especificaciones técnicas se encuentran en el

Anexo 1.

El XT-4000i clasifica y cuenta los siguientes parámetros en muestras de sangre

total: WBC, RBC, HGB, HCT, VCM, MCH, CHCM, PLT, NEUT%/#, LYMPH%/#,

MONO%/#, EO%/#, BASO%/#, IG%/#, RDW-CV, RDW-SD, MPV, RET%/#, IRF,

43

RET-He y tiene un modo de líquidos corporales, para el análisis de fluidos

corporales.

El modo de líquidos corporales, da un conteo de los parámetros WBC-BF,

RBC-BF, MN%, MN#, PMN%, PMN# y TC-BF# en líquido cefalorraquídeo (LCR),

líquidos serosos (peritoneal, pleural, pericárdico) y líquido sinovial. Los fluidos

serosos y sinoviales, pueden ser colectados en EDTA para prevenir la formación de

coágulos.

Figura 1. Sistema Automatizado de hematología XT-4000i de Sysmex.

IG es la abreviación de granulocitos inmaduros, que incluyen a los

metamielocitos, mielocitos y promielocitos. Estos parámetros son reportable en el

XT-4000i, lo que permite al laboratorio, ofrecer un diferencial de 6 partes.

El IRF es la combinación de la proporción de reticulocitos de mediana y alta

fluorescencia.El IRF ha demostrado ser útil en la evaluación de la actividad

eritropoyética de la médula ósea, particularmente después de un trasplante de

médula ósea y respuesta a la administración de eritropoyetina (EPO) en pacientes

renales.

44

El contenido de hemoglobina de los reticulocitos, es una indicación directa de la

incorporación del hierro a los eritrocitos. Los cambios en el RET-He predicen

cambios futuros en la hemoglobina e índices eritrocitarios.

El XT-4000i utiliza la tecnología base de la serie X: impedancia (corriente

directa), enfoque hidrodinámico, sulfo-hemoglobina (SLS) y citometría de flujo

fluorescente.

El sistema automatizado de hematología XT-4000ide Sysmex utiliza el poder

de las tecnologías de citometría de flujo fluorescente y enfoque hidrodinámico.

Mediante un exclusivo diodo láser con tecnología de vanguardia, lacitometría de flujo

de Sysmex proporciona la sensibilidad necesaria para medir y diferenciar tipos

celulares en muestras de sangre total y de fluidos corporales.

La tecnología de citometría de flujo y enfoquehidrodinámico, le permite al XT-

4000i diferenciar de manera consistente las poblaciones normales deleucocitos,

eritrocitos y plaquetas de las anormales, disminuyendo el número de intervenciones

manuales.

Tecnologías avanzadas de Sysmex.El XT-4000i de Sysmex tiene múltiples

tecnologías que trabajan en conjunto para producir conteos exactos de WBC,

análisis diferencial, reticulocitos y plaquetas. Los cuatro avances tecnológicos

disponibles en el XT-4000i:

Citoquímica.

Detección de Corriente Directa.

Análisis óptico de dispersión de luz (Angulo de luz frontal y lateral).

Fluorescencia (Tinción y luz fluorescente lateral).

45

Esas tecnologías avanzadas brindan beneficios tecnológicos para varios

parámetros clínicos importantes:

Conteo de WBC y conteo de Basófilos.

Análisis diferencial de WBC: Neutrófilos, Linfocitos, Monocitos, Eosinófilos y

Granulocitos Inmaduros (IG).

Reticulocitos.

Plaquetas ópticas medidas por fluorescencia PLT-O.

Citoquímica. Para realizar un conteo y clasificación exacta de las células, cada

tipo celular tiene que ser separado de los otros tipos celulares. El XT-4000i logra

esto a través de la citoquímica. Se usan los principios de citoquímica para la lisis

celular específica. Cada tipo de células se lisan de forma diferente dependiendo de

las características físicas y químicas de cada célula. El XT-4000i usa lisis de células

específicas para dar mejor separación de las diferentes poblaciones celulares para

mejor exactitud.

Ciertas mediciones requieren que las células sean lisadas o sus membranas

levemente afectadas para que los organelos (estructuras intracelulares) puedan ser

teñidos y se hagan mediciones ópticas. El XT-4000i usa un sistema de reactivos

lisantes específicos que explotan propiedades específicas de las membranas de las

diferentes células, para separar las células de aquellas que van a ser medidas. Este

principio se usa para el conteo de WBC, Basófilos, Linfocitos, Monocitos, Eosinófilos,

Reticulocitos e IG.

Citometría de flujo fluorescente en el XT-4000i.El XT-4000i tiene un sistema

óptico con láser basado en citometría de flujo fluorescente. Un citómetro de flujo es

46

un instrumento que pasa una corriente de células en una sola fila a través de una o

más regiones detectoras en las cuales se caracterizan las propiedades físicas o

químicas de las células.

Los citómetros de flujo típicamente hacen múltiples mediciones ópticas y

electrónicas de cada célula analizada. Las mediciones ópticas requieren una fuente

de luz, muy similar a los analizadores tradicionales de química. Los analizadores

más sofisticados, como el XT-4000i usan tinciones fluorescentes para ofrecer mejor

separación de los tipos celulares. El XT-4000i utiliza un láser semi-conductor como

fuente de luz, el cual proporciona beneficios que otros estilos de láser antiguos

(como el láser argón o de helio) no ofrecen.

Eritrocitos y plaquetas. Son contados en un canal exclusivo que utiliza como

método de detección la impedancia o corriente directa (CD) combinada con la

tecnología de enfoque hidrodinámico. De esta forma se superan los retos en el

conteo celular tales como coincidencia o recirculación y unos discriminadores

automáticos separan las dos poblaciones celulares.

Aún en muestras con concentraciones extremadamente bajas o inusualmente

altas, el XT-4000i analiza los eritrocitos y las plaquetas con gran precisión y

exactitud, un esquema gráfico se muestra en la Figura 2.

Figura 2. Conteo de eritrocitos y plaquetas.

47

Los RBC y PLT al ser analizados por un sistema de enfoque hidrodinámico se

eliminan errores potenciales en contadores celulares tales como coincidencia,

recirculación y cambios asociados con los métodos de análisis tradicionales. Esta

característica proporciona conteos exactos de RBC/PLT y de la determinación del

tamaño celular, aún en conteos altos o bajos.

Tecnología para la medición de leucocitos. Sistema de análisis adaptativo

de poblaciones (A.C.A.S).El XT-4000i genera múltiples mediciones para cada

glóbulo blanco medido. El resultado se muestra gráficamente en un dispersograma

bi-dimensional con una medición en el eje X, y una segunda medición en el eje Y.

Se necesita un sofisticado algoritmo para analizar esta información.

Los analizadores hematológicos más antiguos dependían de discriminadores

fijos para cada parámetro medido y para determinar cada tipo celular. Sin embargo,

las células muestran demasiada variación de una muestra a otra. El sistema de

análisis adaptativo de poblaciones usado en el XT-4000i es un modelo estadístico

que esencialmente “auto-aprende” y ajusta los límites de cada parámetro para

brindar el mejor ajuste para cada célula – el modelo estadístico más cercano al ojo

humano y el juicio mental.

Los analizadores de la serie XT detectan y analizan las señales de dispersión

lateral y fluorescencia lateral en el canal del Diferencial. La intensidad de la señal de

dispersión lateral depende de la complejidad de las lobulaciones nucleares y de la

presencia de gránulos en el citoplasma. A mayor lobulaciones en el núcleo y

granulaciones, la intensidad de dispersión lateral será mayor. La intensidad de la

fluorescencia lateral refleja la concentración de ácidos nucléicos ADN y ARN en la

célula. Una concentración mayor de ADN y ARN, produce mayor intensidad de

48

fluorescencia lateral. Como se genera la información desde el láser, los WBC son

separados en diferentes poblaciones usando el sistema adaptativo de poblaciones

celulares (A.C.A.S.) para formar el un gráfico de dispersión del diferencial, como se

muestra en la Figura 3.

En el dispersograma del DIFF se analizan 4 poblaciones leucocitarias:

Neutrófilos

Linfocitos

Monocitos

Eosinófilos

Figura 3. Dispersograma del diferencial de leucocitos.

La tecnología de fluorescencia permite alXT-4000i diferenciar de forma

confiable las poblaciones normales de leucocitos, de las poblaciones anormales de

los mismos. La sensibilidad de la citometría de flujo fluorescente, proporciona al

laboratorio un alto nivel de confianza en el reporte exacto del análisis diferencial de

leucocitos, aún en muestras de pacientes críticos con conteos bajos de los mismos.

El XT-4000i de Sysmex ofrece un diferencial de 6 partes, el cual incluye un

conteo de granulocitos inmaduros(IG% e IG#). Este conteo de IG proporciona

resultados reportables y cuantitativos para granulocitos inmaduros (metamielocitos,

mielocitos y promielocitos).

49

Determinación del diferencial de leucocitos. En el canal del DIFF, un

reactivo lisante específico se usa para romper los eritrocitos y las plaquetas y lisar

levemente las membranas de los leucocitos. Luego se adiciona una tinción

fluorescente de Polimetina para teñir el ácido nucléico (ADN o ARN) en los

leucocitos.

El XT-4000i detecta y analiza las señales de dispersión lateral y fluorescencia

lateral en el canal del DIFF (ver Figura 4). La intensidad de la dispersión lateral

depende de la complejidad de las lobulaciones y de la presencia de gránulos en el

citoplasma. Entre más grandes sean las lobulaciones y las granulaciones, la

intensidad de dispersión lateral de luz es mayor.

La intensidad de fluorescencia lateral refleja la concentración de ADN y ARN en

la célula. Una concentración mayor de ácidos nucléicos produce una intensidad de

fluorescencia mayor. La información que se genera a partir del láser, hace que los

leucocitos se separen en diferentes poblaciones usando el sistema adaptativo de

poblaciones (A.C.A.S. por sus siglas en ingles) para formar el dispersograma del

diferencial.

Figura 4. El Canal Diff.

50

Análisis para fluidos corporales. El analizador XT-4000i incluye un modo

específico para fluidos corporales. Este modo proporciona conteos reportables de

eritrocitos, leucocitos y diferencial de leucocitos de dos partes (polimorfonucleares y

mononucleares), además de un conteo total(TC-BF) para todas las muestras de

fluidos corporales comunes (LCR, sinovial y serosos).El analizador aplica

tecnologías probadas de impedancia y citometría de flujo fluorescente que aseguran

un conteo exacto en fluidos corporales.

Figura 5. Conteo de leucocitos en un fluido corporal

El analizador proporciona los siguientes beneficios:

Sensibilidad y linealidad extendidas; conteos de eritrocitos y leucocitos

reportables con 3 unidades decimales.

Diferencial de 2 partes para leucocitos.

No requiere un tratamiento previo de la muestra.

No requiere reactivos adicionales.

No requiere material de control de calidad adicional.

Una revisión automática del conteo de fondo antes de analizar una muestra.

Velocidad de trabajo

51

o CBC y diferencial: 100 muestras/hora

o CBC con 100% Reticulocitos: 80 muestras/hora

Parámetros especiales incluyendo IG y RET-He.

Análisis de fluidos corporales con linealidad extendida en límites bajo y alto

y diferencial de 2 partes.

Control de Calidad mejorado; control e-CHECK(XE).

Productividad mejorada.

Mejor tiempo de respuesta.

Disminución en las intervenciones manuales.

52

CAPITULO TRES

3. METODOLOGÍA

3.1. Diseño de la investigación

El estudio de investigación es de tipo comparativo, prospectivo, de corte

transversal, y cuantitativo porque se fundamenta en aspectos observables y

susceptibles de cuantificar.

Comparativa. El objetivo es comparar el comportamiento de un evento entre

los grupos de datos observados. En la comparación se obtendrán semejanzas y

diferencias.

De campo. Es una investigación de campo que se la realiza en el mismo lugar

en que se producen los acontecimientos, y toma los datos es de forma directa.

Cuantitativa. La preponderancia del estudio de los datos está basada en medir

cantidades para cuantificarlas y compararlas. El proceso de medición es

fundamental para la investigación ya que proporciona conexión entre la observación

y la expresión matemática de las relaciones cuantitativas.

Prospectivo. Según la planificación para la toma de datos el estudio es

prospectivo porque para obtener los datos que se necesitaban para la investigación,

se planificó solicitarlos a una institución de salud.

Transversal. Por su prolongación en el tiempo, el estudio se circunscribe a un

período de tiempo específico y los datos se toman por una sola vez.

Observacional. Según la intervención del investigador, este estudio es

observacional, ya que durante la realización del mismo no existe intervención del

investigador, los datos reflejan como se van dando los eventos, totalmente

independientes de la voluntad del investigador.

53

3.2. Nivel de Estudio

El nivel de este estudio es descriptivo, ya que usará el diagrama de frecuencias

para describir el comportamiento del conteo manual y del automático. Las

diferencias numéricas que se encuentren servirán para comparar los dos tipos de

conteo.

3.3. Población

Morles, 1994 considera:

“La población o universo se refiere al conjunto para el cual serán válidas las

conclusiones que se obtengan: de los elementos o las unidades (personas,

instituciones o cosas) involucradas en la investigación”.

La población motivo de este estudio consiste en todos los exámenes, que se

hicieron en forma manual y en forma automática en el Laboratorio Clínico del

Hospital Luis Vernaza.

Criterios de inclusión: Se incluyen todos los exámenes que se hicieron en el

Laboratorio Clínico.

3.4. Muestra

La muestra que se utilizó tiene las siguientes características:

Lugar: Laboratorio Clínico del Hospital Luis Vernaza.

Población de estudio: Pacientes del Hospital Luis Vernaza.

Criterios de inclusión: Todos los pacientes

Muestreo: Es a nivel explicativo, ya que incluyen a todos los datos disponibles

en el laboratorio por tener accesibilidad a dicha institución de salud.

54

Variables: Cantidad de exámenes por rangos de conteo.

3.5. Instrumentos de la investigación

Para la recopilación de los datos del conteo manual se usó un formato digital

en el cual se registran los resultados de los exámenes. Los datos del conteo

automático se tomaron directamente del equipo Sysmex XT-4000.

3.6. Procedimiento de la investigación

Se aplica el proceso descriptivo para el estudio, y se lo realiza acorde a las

siguientes fases:

Planteamiento del problema.

Revisión bibliográfica.

Línea de investigación.

Delimitación del estudio.

Obtención de datos.

Procesamiento de datos.

Análisis de datos.

Conclusiones y recomendaciones.

3.7. Fuentes de información

Fuente primaria. Es la información proporcionada por el Laboratorio Clínico

del Hospital Luis Vernaza.

Fuente secundaria. Es la información que se recopiló de diferentes fuentes

bibliográficas incluido el internet.

55

3.8. Procesamiento y análisis de datos

Los datos obtenidos con el instrumento de investigación, fueron estandarizados

y tabulados en una herramienta de base de datos digital, luego se organizaron para

poder obtener el gráfico estadístico de distribución de frecuencias de acuerdo a las

siguientes etapas:

Análisis de los valores del conteo.

Se agruparon los valores del conteo por rangos.

Se obtuvo la cantidad de exámenes por rangos de conteo.

Se hizo el gráfico de distribución de frecuencias de cantidad de exámenes

por rangos de conteo, tanto para el conteo manual como para el

automático.

Se analizaron los gráficos de distribución de frecuencias.

Con base al análisis se dio respuesta a los objetivos planteados.

3.9. Análisis de los resultados

Conteo de leucocitos

Al comparar el conteo de leucocitos realizado de forma manual y automático,

se puede observar que los dos métodos presentan la misma tendencia, y que a

partir del segundo rango de conteo, el método automático tiene muestras que caen

dentro de rangos altos de conteo, (ver Gráfico 1).

56

Gráfico No. 1

Conteo de Leucocitos

Conteo de leucocitos mononucleares

En el siguiente gráfico se puede observar la comparación del conteo de

leucocitos mononucleares realizado de forma manual y automático, los dos métodos

presentan el mismo comportamiento, sin embargo hay mayor cantidad de muestras

por rangos en el conteo automático.

Gráfico No. 2

Conteo de Leucocitos Mononucleares

0

20

40

60

80

100

120

0-800 801-1600 1601-2400 2401-3200 3201-4000 4001-175000

CANTIDADDE EXAMENES

RANGOS DE CONTEO

(uL)

CONTEO DE LEUCOCITOS

AUTOMÁTICO

MANUAL

0

5

10

15

20

25

30

35

0-20 21-40 41-60 61-80 81-100

CANTIDADDE EXAMENES

RANGOS DE CONTEO

(%)

CONTEO DE LEUCOCITOS MONONUCLEARES

AUTOMÁTICO

MANUAL

57

Conteo de leucocitos polimorfonucleares

En el siguiente gráfico se puede observar la comparación del conteo de

leucocitos polimorfonucleares realizado de forma manual y automático, los dos

métodos presentan el mismo comportamiento, sin embargo hay mayor cantidad de

muestras por rangos en el conteo automático

Gráfico No. 3

Conteo de Leucocitos Polimorfonucleares

Conteo de hematíes

Cuando se compara el conteo de hematíes realizado por el método manual y

automático, se puede observar que los dos métodos presentan la misma tendencia,

y que en el primer rango hay mayor cantidad de exámenes que caen dentro de ese

rango en el conteo automático, (ver Gráfico 4).

58

Gráfico No. 4

Conteo de Hematíes

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0-1000 1001-2000 2001-3000 3001-4000 4001-5000

CANTIDADDE EXAMENES

RANGOS DE CONTEO

(%)

CONTEO DE HEMATÍES

AUTOMÁTICO

MANUAL

59

CAPITULO CUATRO

4. MARCO ADMINISTRATIVO

4.1. Conclusiones

Los inconveniente que se han identificado en el método manual son

los siguientes:

o Requiere personal cualificado y entrenado.

o Existe una relativa imprecisión entre observadores.

o Recuento diferencial sobre 100 células.

o Es un proceso lento.

o Se requieren recursos elevados en tiempo y personal.

o Es necesario un largo periodo de tiempo para la emisión de

resultados al médico clínico.

Las ventajas del método automático se detallan a continuación:

o El mismo personal técnico encargado del Sysmex XT-4000.

o Control de calidad versus imprecisión manual.

o Recuento diferencial en un volumen importante de muestra.

o Es un método rápido que permite ahorro de tiempo en el

procesamiento de las muestras y en la emisión de resultados.

60

o El método automático se muestra útil para el análisis de

líquidos biológicos en el laboratorio clínico, suponiendo una

clara optimización de recursos.

o Proporciona más información con un solo análisis de la

muestra, para ayudar en la determinación rápida y monitoreo

de estados de enfermedad clínica. Proporciona un

diagnóstico temprano y monitoreo del paciente con respecto a

las poblaciones celulares inmaduras.

o Proporciona exactitud y sensibilidad en el análisis de células

anormales; obtiene el resultado correcto desde la primera

vez, con mayor frecuencia que aquellos sistemas que no

utilizan esta tecnología.

o Mejora la productividad y el tiempo de respuesta para las

pruebas de rutina y de urgencias.

o Reduce la intervención técnica manual debida a la inigualable

linealidad, además de proporcionar resultados de forma

rápida.

o Proporciona información clínica para muestras de muy bajo

volumen. Para este modo, se requieren 40µL de una dilución

1:5

o Conteos exactos de WBC bajos. Los conteos de neutrófilos

absolutos, son esenciales en el monitoreo de la terapia en

pacientes inmunocomprometidos. Monitoreo de leucocitos

durante la quimioterapia

61

o Conteos exactos de plaquetas en los límites bajos, mediante

tecnología fluorescente. Conteos exactos de plaquetas en

presencia de elementos que interfieren como fragmentos de

RBC y plaquetas gigantes

o Diferencial de WBC mejorado mediante el uso de tecnología

fluorescente, para una mejor separación, no solo de

poblaciones celulares normales, sino también de poblaciones

celulares anormales

o Conteos exactos de reticulocitos e IRF mediante tecnología

fluorescente. El conteo de reticulocitos, el estándar de oro de

Sysmex, el IRF y RET-He, como indicadores del cambio en la

actividad medular

4.2. Recomendaciones

Se recomienda usar la tecnología del XT-400i por las siguientes

razones:

Porque es un apoyo en el diagnóstico y monitoreo de enfermedades

leucocitarias. Por ejemplo, cada año, más de 88,300 personas en

Estados Unidos, son diagnosticadas con leucemia, linfoma y

mieloma. En Estados Unidos 2,400 niños, sabrán que tienen

leucemia antes de terminar el siguiente grado escolar, lo que llevará

a un 80% de leucemias infantiles. La leucemia linfocítica crónica

(LLC) afectará a 5,000 adultos este año. Pero con tratamiento,

alrededor del 95% de los niños, pueden alcanzar remisión completa

62

con una tasa de curación del 50-60%. A pesar de que la LLC no se

puede curar, con tratamiento, la mitad de los pacientes con LLC,

sobrevivirán 6 años y el 25% vivirá más de 10 años. La

quimioterapia disminuye la actividad de la médula ósea y coloca al

paciente en riesgo de sangrado debido a la anemia y

trombocitopenia.

El uso de la tecnología de reticulocitos automatizada de Sysmex, ha

sido establecida como el estándar de oro en el conteo de

reticulocitos. El conteo de reticulocitos en el XT-4000i, fue

desarrollado a partir de este estándar de oro.

Se eliminan los problemas del conteo manual debido a que la

automatización da una mejor precisión.

El método manual es lento que necesita personal especialmente

entrenado y, aún así, presenta una amplia variabilidad de resultados

entre observadores. Por este motivo es deseable la automatización

ya que permite estandarizar el proceso de las pruebas diagnósticas,

mejora la precisión y la simplifica.

63

BIBLIOGRAFIA

1. Iovine-Selva (1975). El Laboratorio en al Clinica. Panamericana

2. Rinaldi, A. N. (1982). Líquido Céfalo Raquideo. Panamericana.

3. Klein-Iglesias. (1985). Examen del líquido sinovial. Acta Bioq. Clin.

Latinoam. vol.XIX.

4. Viguer-Garcia. (1995). Laboratorio y Atlas de citologia. Interamericana.

5. Boehringer, M. (1995). ADA.Adenosina Desaminasa.

6. King, S. (1989). Urinalysis and Body Fluids. F.A.Davis. Company.

7. Kjeldsberg, C. y Knight, J. Body Fluids. ASCP. 3th.Edition, Chicago.

8. Suarez, R. Liquido amniótico. Diagnostico de madurez fetal y defecto

tubo Neural. Cátedra de Obstetricia HUC. Unid. de Perinatología.

U.C.V.

9. https://www.sysmex.com

ANEXOS

ANEXO 1

Especificaciones Técnicas del XT-4000i de Sysmex

Excelente desempeño • Plataforma confiable

Requiere bajos volúmenes de muestra.

Sistema de mantenimiento y monitoreo remoto por medio del

sistema de comunicaciones de Sysmex (SNCSTM por sus siglas

en inglés) para un mejor desempeño.

Calificado por la compañía externa independiente, IMV

ServiceTrak 2011, como el proveedor de más alta confiabilidad

durante 11 años consecutivos.

Información diagnósticareportable a partir del análisis de una sola muestra

Diferencial de 6 partes para leucocitos en sangre total

(neutrófilos+ linfocitos +monocitos + eosinófilos + basófilos +

granulocitos inmaduros) y con alarma de eritroblastos medidos

por fluorescencia.

Conteo de células en fluidos corporales y diferencial de 2 partes.

Parámetros para la evaluación de anemia; reticulocitos, IRF y

RET-He.

Capacidad de medición de plaquetas por fluorescencia óptica y

por impedancia.

Fácil de usar

Menús intuitivos.

Opción de ayuda a bordo para la resolución rápida de problemas.

Información completa de control de calidad.

Manejo de reactivos por códigos de barras.

ANEXO 2

Resumen de la tecnología del XT-4000i

Parámetro Canal XT Principio Información

celular

Tecnologías

principales

RBC

Plaquetas-I

MCV

HCT

RBC

Impedancia con

enfoque hidrodinámico

Detección por altura

de acumulación de

pulsos

Tamaño

Hemoglobina

HGB

Colorimétrico-SLS

Concentración

de

hemoglobina

Tecnologías

avanzadas de

Sysmex

WBC

Basófilos

WBC/Baso

Dispersión frontal/

Dispersión lateral

Tamaño,

complejidad

interna

Neutrófilos

Linfocitos

Monocitos

Eosinófilos

IG

DIFF

Dispersión frontal/

Fluorescencia

Complejidad

interna

Contenido de

ADN

Reticulocitos

IRF

Plaquetas-O

RET

Dispersión frontal/

Fluorescencia

Tamaño

Contenido de

ARN y ADN

ANEXO 3

XT-4000i Parámetros medidos y tecnología Sangre total y fluidos

corporales

Parámetro Detector Principio/Tecnología Información celular

Análisis de sangre total

RBC, PLT RBC Enfoque hidrodinámico y

corriente directa (CD)

Tamaño

HCT RBC Enfoque hidrodinámico y

corriente directa (CD)

Detección de la altura por

acumulación de pulsos

HGB HGB Colorimétrico SLS-HGB Concentración de

Hemoglobina

Diferencial de

WBC

Neutrófilos

Linfocitos

Monocitos

Eosinófilos

IG

DIFF

Citometría de flujo

fluorescente y dispersión

lateral

Complejidad interna

Contenido de RNA y DNA

WBC

Basófilos

WBC Citometría de flujo

fluorescente, dispersión lateral

y frontal

Tamaño y complejidad interna

Reticulocitos

PLT ópticas

RET-He

IRF

Retic

Citometría de flujo

fluorescente y dispersión

frontal

Tamaño y complejidad interna

Análisis de fluidos corporales

WBC-BF DIFF Citometría de flujo

fluorescente y dispersión

lateral

Complejidad interna

Contenido de RNA y DNA

RBC-BF RBC Enfoque hidrodinámico y

corriente directa (CD)

Tamaño

MN*

PMN**

DIFF Citometría de flujo

fluorescente y dispersión

lateral

Complejidad interna

Contenido de RNA y DNA

*MN = Mononuclear

**PMN = Polimorfonuclear

GLOSARIO DE TERMINOS

WBC.- Conteo total de leucocitos.

RBC.- Conteo total de eritrocitos.

HGB.- Hemoglobina.

HCT.- Hematocrito.

MCV.- Volumen corpuscular medio.

MCH.- Hemoglobina corpuscular media.

MCHC.- Concentración de hemoglobina corpuscular media.

PLT.- Conteo total de plaquetas.

NEUT%/#.- Conteo de Neutrófilos en número absoluto y en porcentaje.

LYMPH%/#.- Conteo de Linfocitos en número absoluto y en porcentaje.

MONO%/#.- Conteo de Monocitos en número absoluto y en porcentaje.

EO%/#.- Conteo de Eosinófilos en número absoluto y en porcentaje.

BASO%/#.- Conteo de Basófilos en número absoluto y en porcentaje.

IG% / #.- Conteo de Granulocitos Inmaduros en número absoluto y en

porcentaje.

RDW-CV.- Ancho de distribución eritrocitaria –CV.

RDW-SD.- Ancho de distribución eritrocitaria-SD.

MPV.- Volumen medio plaquetario.

RET%/# .- Conteo de Reticulocitos en número absoluto y en porcentaje.

IRF.- Fracción de Reticulocitos Inmaduros.

Ret-He.- Equivalente de hemoglobina del reticulocito.