1

Citometría de flujo

Introducción: Fundamentos

Dra. Edith Cortés Barberena

Departamento de Ciencias de la Salud 1

Fundamentos

Sistema de fluidos

2

¿Qué población es la de mayor tamaño? ¿Cómo se sabe esto?

Dispersión de luz por la célula en células de sangre Dispersión de luz por la célula en células de sangre completa lisadacompleta lisada

3

Corriente de la

muestra

Fuente de luz

Sistema óptico (Filtros ópticos)

Tamaño

Complejidad

Verde

Rojo

Detectores

Gráficas para análisis

Punto de

interrogación

Fluido

envolvente

SISTEMAS INTEGRANTES

DE UN CITÓMETRO DE

FLUJO

Amarillo

Sistemas que componen un Citómetro de Flujo:

Sistemas que componen un Citómetro de Flujo:

• Fluidos:

• Ópticos:

• Electrónicos:

Los avances en cada uno de estos sistemas hapermitido el desarrollo de citómetros conmayores capacidades en la medición de células.

• Fluidos:

• Ópticos:

• Electrónicos:

Los avances en cada uno de estos sistemas hapermitido el desarrollo de citómetros conmayores capacidades en la medición de células.

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Sistemas que componen un Citómetro de Flujo:

Sistemas que componen un Citómetro de Flujo:

• Fluidos: Para introducir y alinear a lascélulas para ser medidas.– Aire: Actualmente no se usa.

– Líquidos

• Fluidos: Para introducir y alinear a lascélulas para ser medidas.– Aire: Actualmente no se usa.

– Líquidos

6

2

Sistema de fluidosSistema de fluidos

Bomba de aire

Reguladorde fluido

Filtro

Celda de flujo

Depósito de fluido

Filtro de aire

Regulador dela muestra

Tubo de muestra

Desperdicio

7

Hay dos tipos de cámaras

AbiertasCerradas

Dirección del flujo

8

Punto de interrogación

Punto de interrogación

Punto de interrogación

Sistema de equipos BD

Los citómetros BD usan este tipo de cámara

9

SISTEMA DE INYECCIÓN DE MUESTRASISTEMA DE INYECCIÓN DE MUESTRA

Flujo de la muestraFlujo de la muestra

Tubo externoTubo externo

Dirección del Dirección del flujo de laflujo de lamuestramuestra

Tubo internoTubo interno

AireAire

10

Cámara tipo BD

Cerradas

Láser

Fluido

envolventeFluido de la muestra

Punto de

interrogación

11

• Este tipo de sistema de fluidos permite el paso suave, continuo y no pulsátil de la muestra.

Velocidad alta (60µL/min) Velocidad baja (12µL/min)

Flujo de la muestraFlujo de la muestra

La diferencia depresión entre losfluidos ayuda aalinear a lascélulas frente alláser.

12

3

Otros sistemas de fluidos

Otros controles de fluidos

• Otros equipos usan bombas peristálticas en combinación con frenos de fluidos y microprocesador para controlar directamente el fluido de la muestra.

• Ventaja: Disminución de costos. Compacto. Mantenimiento de bajo costo. En parte lo hace el usuario.

• Desventaja: Se obstruye frecuentemente.

Cambios en SIP

Tubo externo de acero inoxidable (como los otros). Tubo interno de polímero que baja al fondo del tubo.

Sistema de retro-alimentación dual en el diseño fluídico que controla la velocidad del flujo envolvente.

Ventajas: El cambio en el SIP asegura que se tome toda la muestra.

Se asegura la estabilidad del flujo de la muestra con el control del flujo envolvente.

Desventajas ¿?

13

Otros sistemas de fluidos

Otros cambios en el SIP

• El inyector de aire está separado del tubo inyector.

• Hay dos electrodos con diferentes alturas que detectan el volumen de la muestra leída.

• Ventaja: Se puede hacer conteo celular (céls/ml).

• Desventajas: ¿?

14

ElectrodoInyector de

aire

Tubo

inyector

de la

muestra

Tubo de

la

muestra

Electro

do

Otros sistemas de fluidos:

Celda de flujo microcapilar

• Se modifica para evitar el uso del flujo envolvente.

• Ventaja: Sistema compacto. Se usan menos células. Se producen menos desechos. El usuario puede remover la celda para la limpieza (menor costo de mantenimiento)

• Posible desventaja: Que se tape muy seguido la celda.

Enfoque acústico.

• Las células son enfocadas en una sola línea por ondas sonoras al pasar por una pieza que produce ultrasonido.

• Ventajas: Permite una mayor amplitud de concentración celular. Aumento o disminución de velocidad del fluido sin afectar alineación. Compacto.

• Desventaja: ¿?

15

Demostración de alineación acústica (enfoque)

Enfoque acústico apagado (OFF).

Muestra desalineada.

Enfoque acústico encendido (ON).

Muestra alineada

16

Fundamentos

Sistema óptico

17

Características de Características de Análisis: LuzAnálisis: Luz

Dispersión de la luz

(Tamaño y Complejidad)

Fluorescencias:Fluorescencias:

FL1FL1, , FL2FL2, , FL3FL3, , FL4FL4, , FL5FL5….….

4

Dispersión de luz por la célulaDispersión de luz por la célula

Luzdelláser

Luzdelláser

Dispersión lateral(SSC)

Dispersión lateral(SSC)

Dispersión frontal(FSC)

Dispersión frontal(FSC)

19

¿Cómo se identifican otras características?

• Uso de anticuerpos u otras proteínas conjugadas con fluorocromos.

• Intercalantes de ADN fluorescentes.

• Fluorocromos sensibles a pH, especies reactivas de O, etc.

• SE REQUIERE GENERAR UNA SEÑAL FLUORESCENTE.

20

Colorantes FluorescentesColorantes FluorescentesColorantes FluorescentesColorantes Fluorescentes

FITCFITCFITCFITC

PEPEPEPE

PerCPPerCPPerCPPerCP

APCAPCPara detectar a losanticuerpos unidos a lascélulas, se requiere el usode fluorocromos.

21

Sistemas que componen un Citómetro de Flujo: Óptico.Sistemas que componen un Citómetro de Flujo: Óptico.

• Óptica de excitación: Una fuente deexcitación para generar las señales.

• Óptica de colección: Filtros de luz quepermiten el paso luz en longitudes de ondaespecífica y refleja aquella que seadiferente.

• Óptica de excitación: Una fuente deexcitación para generar las señales.

• Óptica de colección: Filtros de luz quepermiten el paso luz en longitudes de ondaespecífica y refleja aquella que seadiferente.

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Sistemas que componen un Citómetro de Flujo:

Sistemas que componen un Citómetro de Flujo:

• Óptica de excitación: Comprende unafuente de excitación para generar lasseñales de luz y lentes para enfocar la luzen el punto de interrogación.

• Fuentes de luz:– Láseres: Argón, kriptón ion, HeNe, etc.

– Lámparas de arco (como los microscopios defluorescencia): Mercurio y mercurio-xenón.

• Óptica de excitación: Comprende unafuente de excitación para generar lasseñales de luz y lentes para enfocar la luzen el punto de interrogación.

• Fuentes de luz:– Láseres: Argón, kriptón ion, HeNe, etc.

– Lámparas de arco (como los microscopios defluorescencia): Mercurio y mercurio-xenón.

23

Fuentes de luz

• Se requiere que emita un número relativamente grande de fotones.

• ¿Por qué?

– Un tercio de la luz colectada se pierde en los filtros ópticos.

– Los detectores de diodo solo convierten la mitad de la señal luminosa a electrónica, mientras que los fotomultiplicadores solo un cuarto.

24

5

Características de las fuentes de luz.

25

Lámparas de arco y filamento, LEDs

• Requieren filtros para seleccionar la longitud de onda deseada.

• Luz dispersa en todas direcciones.

• Son insuficientes para la fluorescencia débil.

• Son una alternativa barata.

• Principal aplicación: cuantificación de ADN.

26

Láser

• Una sola longitud de onda.

• Rayo de un punto pequeño. Iluminación uniforme.

• La mayoría producen entre 10 a 25 mW.

• Enfriamiento depende del poder del láser:

– 10 a 25 mW, enfriamiento por aire.

– 200 mW, enfriamiento por agua.

27

Láser

• Alineamiento del láser solo por personal del proveedor.

• Si se dañan, el costo del cambio es alto.

28

Óptica de excitación

Laser Longitud de onda

Fluorocromos

Azul

Argon-ión

488 nm FITC, PE, PerCP, PerCP-Cy5

Rojo

Diodo

635 nm APC

Violeta 407 nm Pacific Blue, Alexa Fluor 407 y

430, otros.29

Lente de enfoque

Fotodetector

Filtro de barrera

Filtro dicroico

Celda

FL1 verde

SSC azul

FL2 naranja

FL3 rojo

FSC azulLáser

Esquema general del sistema óptico

30

6

Lente de enfoque

Fotodetector

Filtro de barrera

Filtro dicroico

Celda

FL1 verde

PMTSSC

PMTFL2

PMTFL3

FSC azulLáser azul

Esquema general del sistema óptico

PMTFL4

Láser rojo

Filtros de luz y semi-espejos (lentes dicroicos)

32

Longpass (LP)De longitud amplia

Shortpass (SP)De longitud corta

BandpassDe intervaloAncho de banda

500 520 480 500 520

*¿Creían que era paso de banda? ¡A bailar!

500400 600 500400 600 500400 600

480

500

520

LP500 SP500 500/50

Óptica de adquisición

Detector Filtro Color Fluorocromos

FL1 530/30 nm

Verde FITC

FL2 585/42 nm

Amarillo-naranja

PE

FL3 670nm LP Rojo PerCP, PerCP-Cy5.5

FL4 661/16 nm

Rojo-naranja APC

33 Celda de flujoCelda de flujo

Láser de 488nmLáser de 488nm

SSC

FL1

FL3

FL4

FL2

Lente de enfoqueLente de enfoque 488/10488/10Diodo de FSCDiodo de FSC

530/30530/30

488/10488/10

585/42585/42

661/16661/16

670LP670LP

Divisor de haz 90/10Divisor de haz 90/10

Láser de diodo rojoLáser de diodo rojo

Espejo dicroico 560SPEspejo dicroico 560SPEspejo dicroico 640LPEspejo dicroico 640LP

Semi-espejo Semi-espejo

*Modificado del manual

del FACSCalibur

34

Cambios en la óptica

Diseño de pastel

• Arreglo de fotomultiplicadores en forma de pastel.

• Se reemplazan los lentes de enfoque y se disminuye el número de semi-espejos.

• Incrementa la captación de la luz al evitar la pérdida.

• Se reducen los problemas de la alineación de los láseres.

• Sistema muy compacto.

Diseño octagonal

• Láseres

• Lentes para moldear y enfocar los láseres

• Uso de fibra óptica.

• Se simplifica el cambio de filtros y espejos.

35Arreglo octagonal

D

F

H

AC

B

E

G

Señal del láser azul

Fibra óptica Filtro de

intervalo

Filtro dicroico

36

7

Citometría de flujo

Sistema electrónico: Detección de señales

37

Sistema electrónico

Convierte las señales ópticas a señales electrónicas usando detectores de luz y amplificadores de señal.

•Cada medida tomada de cada detectores referida como un parámetro.

•Los datos son adquiridos como unalista de valores de cada parámetro(variable) por cada evento (célula)

38

Láser

Dispersión lateral (SSC)

Dispersión frontal (FSC)

FotodiodoFotodiodo

Filtro

Señales generadas al incidir el láser en la célula

39Celda de flujoCelda de flujo

Láser de 488nmLáser de 488nm

SSC

FL1

FL3

FL4

FL2

Lente de enfoqueLente de enfoque 488/10488/10Diodo de FSCDiodo de FSC

530/30530/30

488/10488/10

585/42585/42

661/16661/16

670LP670LP

Divisor de haz 90/10Divisor de haz 90/10

Láser de diodo rojoLáser de diodo rojo

Filtro 560SPFiltro 560SPFiltro 640LPFiltro 640LP

Semi-espejo Semi-espejo

Detectores: PMT

Detector: Diodo

40

Detección de señales

Tiempo Tiempo Tiempo

Láser Láser Láser

41

Fotodiodo

• Es un semiconductor.

• Sensible a la luz.

• No requiere de fuente de poder externa para funcionar.

42

8

Detección de la dispersión de luz frontal

Láser

FITCFITC

PEPE

FSC

SSC

FotodiodoFotodiodo

Filtro

El detector de FSC convierte luz dispersada hacia delante en un pulso de voltaje proporcional al tamaño de la célula o partícula. 43

Tiempo

FS

C

Fotón

Fotodiodo

LIN

LOG

LIN

Pulsos en voltaje

Conversión de las señales ópticas en señales proporcionales electrónicas.

NivelesLevels

E00E01E02E03E-1

Pre-amplificador

FACSCalibur

Parámetro FSC

44

El detector de El detector de FSCFSC convierte luz convierte luz

dispersada hacia delante en un pulso dispersada hacia delante en un pulso

de voltaje proporcional al tamaño de la de voltaje proporcional al tamaño de la célula o partícula.célula o partícula.

Láser

Dispersión lateral (SSC)

Dispersión frontal (FSC)

FotodiodoFotodiodo

Filtro

Dispersión lateral y fluorescencia

45

El detector de SSC convierte la luz dispersada lateralmente en un pulso de voltaje proporcional al contenido en orgánulos membranosos (granularidad).

Fotomultiplicador (PMT)

Componentes electrónicos para generar el gradiente de voltaje

- - - --

- -- -

- --

--- --

Tubo al vacíoFotocátodo Electrones

Suministro de alto voltaje

Dinodo

Salida de la corriente de la señal

Modificado de Bogh y Duling, 1993. 46

Partes de un tubo fotomultiplicador (PMT)

• Fotocátodo.

• Sistema de entrada electro-óptica.

• Multiplicador de electrones.

• Ánodo.

47

Tiempo

SS

CF

L4

FL

1F

L2

FL

3

Fuente de poder del PMT

Fotón

Salida de la señal

Voltaje150-999 v

LIN

LOG

LOG

Pulsos en voltaje

Conversión de la señales ópticas en señales proporcionales electrónicas.

ParámetroParameter

SSCFL1FL2FL3FL4

48

9

Tiempo

Volt

s

Cuantificación de un pulso de voltaje.

Altu

ra d

el p

uls

o

Ancho del pulso

Área del pulso

Ancho del pulso

Área del pulso

49

Láser LáserCélula

Tiempo Tiempo Tiempo Tiempo Tiempo

SS

C

FS

C

FL

1

FL

2

FL

3

Convertidor análogo-digital 0.01v/canal

Interfase GP10

10000

Análisis de la altura del pulso

Análisis de la altura y conversión digital.

50

Amplificación de señales

• Lineal• (intervalos regulares)

• apropiada para:

– Señales que oscilan enun intervalo limitado(0-1,000)

– Con distribuciones conpicos estrechos comoel contenido en DNA.

• Logarítmica• (intervalos crecientes)

– Cubre un intervalo másamplio de variación dela señal (0-10,000). 51

Sistema electrónico

•La conversión de la señal de voltaje analógico adigital da como resultado valores que son mostradosen un eje dividido en canales.

•Cada canal corresponde a un valor de voltaje de laseñal.

2560 64 128 1920 64 128 192 25652

Sistema electrónico: Datos

Event Param1

FS

Param2

SS

Param3

FITC

Param4

PE

1 50 100 80 90

2 55 110 150 95

3 110 60 80 30

Datos de adquisición en modo de lista

53

Sistema electrónico: visualización

Los datos se muestran en forma de una gráfica a través de un programa (software).

Parámetro 1

Par

ámet

ro 2

54

10

Análisis de datos

O como se pueden visualizar los datos.

55

Vocabulario

• Parámetro: Característica física o química de una célula.

– Intrínseca: Se obtiene sin necesidad de reactivos. Ej. Desviación de luz, autofluorescencia.

– Extrínseca: Se usan reactivos para revelarlos.

Por cierto, se le dicen pruebas al uso de reactivos en citometría.

56

Histograma

Histograma de side scatter (90°) de una muestra de

sangre lisada y marcada con anticuerpos

fluorescentes. Shapiro, 2004.

57

Gráficos de punto (Dot plots)

• Se obtienen gráficos por combinación de dos parámetros.

• Mejor visualización de poblaciones.

• En este ejemplo se grafican linealmente la desviación frontal y la lateral de luz.

Linfocitos

Monocitos

Granulocitos

58

Picos y valles

• Una manera que era muy utilizada es el histograma de dos parámetros.

• En este ejemplo se grafica SSC y la fluorescencia en escala logarítmica.

59

Gráficas de punto tridimensionales

• Shapiro les llama gráficos de nube.

• Es difícil interpretar estas gráficas.

• Una población puede quedar cubierta por otra.

60

11

Gráfica de densidad

• Los colores o la intensidad de un color indican abundancia de eventos.

61

Gráficos de contorno

62

Gate

• ¿Qué es un “gate”?

• ¿Qué significa hacer un “gating”?

Linfocitos

Monocitos

Granulocitos

Tamaño relativoTamaño relativo

Com

ple

jid

ad

rela

tiva

Com

ple

jid

ad

rela

tiva

63

Con “gating”

Gate

• Se puede definir como la selección de una región de análisis para visualizar una población en otra gráfica y parámetros.

Linfocitos

Monocitos

Granulocitos

Tamaño relativoTamaño relativo

Com

ple

jid

ad

rela

tiva

Com

ple

jid

ad

rela

tiva

T

BSin “gating”

64

Vocabulario

• Citometría multiparamétrica: Se realizan mediciones simultáneas de un número de diferentes substancias en las células.

65

Vocabulario

• FSC: Desviación de luz frontal o de ángulo pequeño. Las siglas se derivan de las palabras en inglés “forward scattering”.

66

12

Vocabulario

• SSC: Desviación de luz lateral, ortogonal, 90° o de ángulo amplio. Las siglas se derivan de las palabras en inglés “side scattering”.

67

¿Qué es la fluorescencia?¿Qué es la fluorescencia?¿Qué es la fluorescencia?¿Qué es la fluorescencia?

LasLas moléculasmoléculas fluorescentesfluorescentes tienentienen lala capacidadcapacidad dedeabsorberabsorber energíaenergía dede lala luzluz.. SeSe lesles conoceconoce comocomofluorescenciafluorescencia oo fluoróforofluoróforo..

ElEl fluorocromofluorocromo liberalibera lala energíaenergía enen formaforma porpor::••VibraciónVibración yy disipacióndisipación dede calorcalor..

LasLas moléculasmoléculas fluorescentesfluorescentes tienentienen lala capacidadcapacidad dedeabsorberabsorber energíaenergía dede lala luzluz.. SeSe lesles conoceconoce comocomofluorescenciafluorescencia oo fluoróforofluoróforo..

ElEl fluorocromofluorocromo liberalibera lala energíaenergía enen formaforma porpor::••VibraciónVibración yy disipacióndisipación dede calorcalor..

488 nm

Energía de luz incidente

Energía de luz incidente

> 530 nm

Estructura en común 68

Vocabulario

• Fotoblanqueamiento: El fotón blanquea una molécula fluorescente por rompimiento de un doble enlace.

488 nm

Energía de luz incidente

No hay fluorescencia.

Estructura en común

Se rompe el doble enlace.

69