MARCADORES MOLECULARES ÚTILES EN LA SELECCIÓN DE GENOTIPOS DE MELÓN (Cucumis melo L.,) RESISTENTES AL VIRUS DEL CRIBADO (MNSV)

F.J. Noguera, J. Capel y R. Lozano E. García y J.I. ÁlvarezDpto. Biología Aplicada (Área de Genética) S & G Semillas S.A.Escuela Politécnica Superior, Centro de Investigación y Ensayos Universidad de Almería Autovía E15, Km 417,5La Cañada s/n. Almería, 04120 El Ejido, Almería, 04700

Abstract

The incidence and the economic importance of melon necrotic spot virus (MNSV) make it one of the most harmful diseases of melon which affects significantly the world production of this horticultural crops. Resistance to this virus in melon is controlled by a single recessive gene nsv, despite the fact that not all the commercial hybrids are resistant. This is mainly due to the recessive genetic nature of the nsv gene, which needs to be introgressed into both parental lines and consequently greater technical requirements. We have identified molecular markers, some of them of codominant nature, tightly linked to the nsv gene from a cross between two breeding lines of the Galia type. These results have allowed the development of a fine map of the chromosome region flanking the nsv locus, which could be useful for breeding purposes.

Keywords: Maker assisted selection, MAS, molecular markers, biotic stress.

Resumen

La incidencia y las repercusiones económicas del virus de las manchas necróticas del melón, comúnmente denominado virus del cribado (MNSV), le convierten en uno de los patógenos más perjudiciales en el cultivo de melón. En melón, la resistencia a este virus está controlada por un solo gen nsv, a pesar de lo cual no todas las variedades híbridas que se comercializan son resistentes. Ello es fundamentalmente debido a la naturaleza genética recesiva del gen nsv, que hace necesario introgresar el gen en los dos parentales del híbrido con las dificultades técnicas y de infraestructura que ello conlleva para los programas de mejora. A partir de una población segregante del tipo varietal Galia, en este trabajo se han identificado marcadores moleculares, algunos codominantes, estrechamente ligados al gen que confiere resistencia a MNSV. Ello ha permitido elaborar un mapa relativamente saturado de marcadores moleculares de la región próxima al gen nsv, de gran utilidad en futuros programas de mejora genética.

Palabras clave: Mejora asistida por marcadores, MAS, marcadores moleculares.

1. Introducción

Los actuales programas de mejora genética en melón están encaminados a mejorar la producción y la calidad de los frutos, y encuadrado en el primer objetivo se encuentra la

introducción de resistencias a plagas y enfermedades. Entre los patógenos del melón, los daños producidos por el virus del cribado Melon Necrotic Spot Virus (MNSV), han sido tan importantes en zonas productoras como Almería, que ha llegado a constituir uno de los principales factores limitantes de la rentabilidad de este cultivo (Cuadrado et al., 1993). Entre los diferentes métodos de control de esta virosis causada por MNSV, sin lugar a dudas, el que ofrece mayores garantías de efectividad y menores incidencias medioambientales, es la utilización de variedades resistentes al virus del cribado. La resistencia genética a MNSV está conferida por el alelo recesivo del gen Nsv/nsv (Coudriet et al., 1981).

El desarrollo de nuevas variedades híbridas resistentes al MNSV mediante métodos de mejora clásica es un proceso que requiere de la selección de líneas parentales, portadoras ambas del alelo nsv en homocigosis. Ello conlleva, por un lado, la realización de múltiples inoculaciones artificiales con el agente patógeno para confirmar el genotipo de los descendientes de los diferentes cruzamientos, con el consiguiente riesgo medioambiental que ello supone (contaminación de substratos, posibilidad de escape del patógeno, etc). Y por otro lado, la naturaleza recesiva del alelo que confiere resistencia al virus hace que se duplique el número de generaciones (el espacio y mano de obra) que normalmente se requiere en un programa de mejora por retrocruzamiento

2. Material y Métodos

2. 1. Material Vegetal.

Se han utilizado líneas puras de melón (Cucumis melo L.) de los tipos varietales Galia, Piel de Sapo, Amarillo e Italiano. Dentro de cada tipo varietal se cruzó una línea susceptible con otra resistente a MNSV. En todos los casos, la F1 resultante del cruce resultó ser susceptible, al igual que ¾ de las plantas de la F2. Este resultado confirmó la naturaleza genética recesiva del gen nsv.

2.2. Extracciones de ADN y reacciones de PCR.

Las extracciones de ADN así como las reacciones con el marcador RAPD (cri1), el marcador SCAR (cri2) y el análisis de estas reacciones se realizaron tal y cono se describe en García et al., (1998). La construcción de los “bulks” de ADN se llevó a cabo mediante mezclas de cantidades equivalentes de ADN procedente de cada genotipo seleccionado.

3. Resultados y Discusión

El marcador cri1 fue identificado en un genotipo Galia estrechamente ligado al gen nsv (0,9 cM) y sin embargo, en nuestro país se cultivan otros tipos varietales como los tipos Amarillo, Piel de Sapo, Cantaloup (Charentais) e Italiano (que está comenzando a cultivarse), por lo que se determinó la utilidad de dicho marcador, así como la distancia genética que le separaba del gen Nsv, en estos cultivares.

Con el fin de determinar si el marcador RAPD cri1 era polimórfico entre los genotipos parentales de las poblaciones F2 y F3, se realizaron reacciones PCR en las mismas condiciones que las utilizadas en los genotipos Galia donde este marcador fue identificado. En la figura 1 puede observarse que dicho marcador era polimórfico, no sólo en el tipo Galia tal y como se había descrito previamente, sino también en el tipo

Amarillo. El mismo resultado se obtuvo con el marcador cri2, lo cual sugiere que en ambos tipos varietales el alelo de resistencia tendría un mismo origen.

Figura 1. Resultado de la amplificación del marcador RAPD cri1 (flecha) en los genotipos parentales de cada tipo varietal estudiado. G = Galia, P = Piel de Sapo, A = Amarillo, I = Italiano y C = Cantaloup, R = genotipo resistente, S = genotipo sensible. En la línea M se encuentra un marcador de tamaño molecular.

La estrategia seguida en todos los casos fue la realización de cruzamientos entre líneas puras, una sensible (Nsv, Nsv) y otra resistente (nsv, nsv) a MNSV. De cada F2

segregante para el carácter se sembraron entre 200 y 500 individuos, según los casos (ver Tabla 1), a los que, en estado de cotiledón expandido, se les practicó el fitotest de resistencia a MNSV según protocolo de Cuadrado et al. (1993), encaminado a diferenciar las plantas sensibles de las resistentes.

Tabla 1.- Resultado del ensayo de resistencia al MNSV.

Tipo varietal Plantas sensibles Plantas resistentes 2

Piel de Sapo 162 59 0,560

Amarillo 218 85 0,220

Italiano 321 85 0,059

Cantalupo 341 91 0,059

Agradecimientos

Este trabajo ha sido financiado por la Comisión Interministerial de Ciencia y Tecnología, a través del Proyecto XX-XXS-2002, así como por la Fundación para la Investigación Agraria de la Provincia de Almería, FIAPA (Proyecto nº YY-00-2002).

Referencias

Allard R.W. 1956. Formulas and tables to facilitate the calculation of recombination values in heredity. Hilgardia, 24, 235-278.

Coudriet, D.L., Kishaba, A.N., y Bohn, G.W. 1981. Inhirance of resistance to Muskmelon Necrotic Spot Virus in a melon aphid-resistant breeding line of muskmelon. J. Am. Hort. Sci. 106:789-791.

Cuadrado, I.M. Gómez, J. y Moreno P. 1993. El virus de las manchas necróticas del melón (MNSV) en Almería. Bol. San. Veg. Plagas 19:93-106.

García, E., Noguera, J., Jamilena, M., Capel, J. y Lozano, R. 1998. Identificación y mapeo de marcadores moleculares ligados al gen de resistencia al virus del cribado en melón (MNSV). Actas de Horticultura 22:148-155.

Kosambie, D.D. 1994. The estimation of map distances from recombination values. Ann Eugen. 12:172-175.

Michelmore, R.W., Paran, I., Kesseli, V. 1991. Identification of markers linked to disease-resisntance genes by bulked segregant analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9828-9832.

Paran, I. y Michelmore, R.W. 1993. Develoment of reliable PCR-based markers linked to downy midew resistance genes in lettuce. Theor Appl. Genet., 85:985-993.