UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS FORESTALES

ESCUELA DE CIENCIAS FORESTALES

DEPARTAMENTO DE INGENIERIA DE LA MADERA

MEDIOS DE CULTIVO LIQUIDOS PARA EL DESARROLLO DE

INOCULOS DE HONGOS DE PUDRICION BLANCA APLICABLES EN BIOPULPAJE KRAFT

Memoria para optar al Título Profesional de Ingeniero en Maderas

RODRIGO ALEJANDRO MORALES VERA

Profesor Guía: Ing. Forestal, Dr., Sr. Ricardo Silva Soto

SANTIAGO - CHILE 2006

UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS FORESTALES

ESCUELA DE CIENCIAS FORESTALES

DEPARTAMENTO DE INGENIERIA DE LA MADERA

MEDIOS DE CULTIVO LIQUIDOS PARA EL DESARROLLO DE INOCULOS DE HONGOS DE PUDRICION BLANCA APLICABLES

EN BIOPULPAJE KRAFT

Memoria para optar al Título Profesional de Ingeniero en Maderas

RODRIGO ALEJANDRO MORALES VERA

Calificaciones: Nota Firma Prof. Guía Sr. Ricardo Silva S. 6,9 .................................... Prof. Consejero Sr. Javier González M. 7,0 ................................... Prof. Consejero Sr. René Carmona C. 6,7 ....................................

SANTIAGO - CHILE 2006

AGRADECIMIENTOS En este capitulo me gustaría dar las gracias en forma muy sincera y afectuosa a mis

padres, que durante toda mi vida me han entregado todo lo necesario, tanto el sustento

económico, pero lo mas importante, su apoyo e incondicional amor que me han dado a lo

largo de mi vida, GRACIAS GLORIA Y TOÑO LOS QUIERO MUCHO !!!!!!!!

Por otro lado, no puedo dejar de mencionar a mi queridísimo hermano SERGIO, que

siempre ha estado a mi lado en todos los procesos importantes de mi vida, y con sus

conversaciones energéticas y astrales me han ayudado a tener claro mi camino, además

gracias por tu apoyo como traductor, el cual se hace presente en el summary de esta

memoria, a ti SERGIO gracias !!!

Al gran y estimado profesor RICARDO SILVA, excelente académico, gran persona, el cual

siempre estuvo cuando necesite su ayuda, muy motivador y cercano con sus alumnos,

pero no por ello dejando de lado su alto grado de exigencia con sus alumnos, lo cual

siempre ha demostrado en todas sus evaluaciones, RICARDO siga así, puesto que ayuda

a obtener lo mejor de cada uno de sus alumnos.

Al Sr. JAVIER GONZALÉZ, gran profesor y excelente académico, con el cual conté

siempre que lo necesité, por todos los momentos compartidos con él, manteniendo

siempre su gran sencillez y gran altura de miras, mucha suerte en su nuevo cargo y

muchas gracias por todo.

A todos los profesores que con su ayuda pude culminar este trabajo, en especial al Sr.

RENÉ CARMONA por cumplir con los plazos acordados en la corrección de esta

memoria, al Sr. ALEJANDRO BOZO gran profesor siempre dispuesto ha ayudar, y a

todos los profesores del Dpto. de Ingeniería de la Madera: Misael Gutiérrez, Tomás

Karsulovic, Aldo Cisternas, Rose Marie Garay, etc.

Al mejor de todos los técnicos de laboratorio a Don LUIS FRIAS, gran compañero de

trabajo y excelente persona, siempre está ahí para una buena conversación, consejo, etc.

No cambies nunca LUCHITO muchas gracias por todo!!!!

A todos mis compañeros de ANTUMAPU, sigan disfrutando de la vida y de las ventajas de

estar en este gran ANTUMAPU querido.

A todas las secretarias de la facultad MARIELA, PANCHITA, gracias por ayudarnos con

los trámites engorrosos de la burocracia de la U. de CHILE, y a ti GIANINA gracias por tu

ayuda en la realización de extensión de la facultad, siempre cuenta conmigo.

Y por supuesto a mi queridísima guachita más linda…..SOLE, siempre he sentido tu

apoyo en todo este largo proceso de titulación, sigamos disfrutando de esta vida que

contigo es mucho más bella y espero que nos vayamos juntitos a donde realmente

queremos estar, ya falta poquito…I LOVE YOU.

Gracias a impresiones ABACO S.A., los cuales me realizaron todo el trabajo de impresión

de esta memoria.

A la Energía Suprema o más conocida como DIOS, gracias por darme todas las

oportunidades que se me han abierto a lo largo de la vida.

A todos los nombrados y a los que por algún motivo no se encuentran en los párrafos

anteriores GRACIAS !!!

RODRIGO MORALES VERA

RESUMEN

El presente trabajo, el cual fue desarrollado en el Departamento de Ingeniería de la

Madera de la Facultad de Ciencias Forestales de la Universidad de Chile, está inserto

dentro del marco del proyecto FONDEF DO2I – 1086: Factibilidad de biopulpaje Kraft

aplicado a especies del género Eucalyptus.

Esta memoria de título consistió en el estudio de dos tipos de medios de cultivo líquidos,

con el fin de ser utilizados en biopulpaje Kraft. El constituyente básico de estos medios fue

extraíbles de Eucalyptus globulus; diferenciándose uno de otro por la incorporación de

nutrientes adicionales N-P-K.

Estos medios de cultivo se evaluaron mediante la viabilidad de ellos para el desarrollo de

inóculos de dos hongos de pudrición blanca (167 y 140) a través de pruebas

microscópicas. Además se cuantificó la pérdida de peso de material leñoso, producida por

estos inóculos en “pin chips” de Eucalyptus globulus en dos tiempos de exposición, 30 y

45 días. También se midió el crecimiento radial miceliar de estos inóculos en un medio

estacionario agar-malta, y finalmente se determinó el potencial enzimático oxidativo que

poseían estos inóculos mediante una prueba en medios estacionarios, denominados

ácido gálico.

Los resultados obtenidos indican que ambos medios de cultivo líquidos propuestos, son

viables para el desarrollo de las cepas 167 y 140, sin embargo, el medio de cultivo sin

nutrientes adicionales resultaría el más conveniente para su aplicación en el campo del

biopulpaje por ser más económico.

La mayor pérdida de peso de material leñoso (13,36%) se logró con el hongo 140

cultivado sobre un medio con nutrientes adicionales, sin embargo, el hongo 167 logró un

crecimiento radial mayor que el presentado por la cepa 140, y además posee un potencial

enzimático mayor que el obtenido por el hongo 140; lo cual sería un indicio que el sistema

enzimático del hongo 140 es menos selectivo sobre la lignina que el del hongo 167.

Esta investigación permitió obtener antecedentes relevantes respecto a los medios de

cultivo líquidos utilizados, los cuales fueron una efectiva fuente energética para el

desarrollo de las dos cepas estudiadas (167 y 140). Estos hongos mostraron, además,

una efectiva pérdida de peso de material leñoso, crecimiento radial de micelio y capacidad

enzimática, por lo cual son factibles de utilizar en el proceso de biopulpaje Kraft.

PALABRAS CLAVES

Medios de cultivo

Pudrición blanca

Sistemas enzimáticos

Biopulpaje

Biotecnología

SUMMARY

This research, which was made at the Wood Engineering Department of the Forest

Sciences Faculty of the University of Chile, is part of the FONDEF DO21 – 1086 project’s

frame: Factibility of Kraft biopulping, applied to species of the Eucalyptus genre.

This investigation consisted on the study of two types of liquid culture media, in order to be

used in Kraft biopulping; the main basis of these culture media was extractives from

Eucalyptus globulus; the difference between one culture medium and another was the

incorporation of additional nutrients N-P-K.

These culture media were evaluated through their own viability for the inoculs

development, from two white rot fungi (167 and 140), by means of microscopy tests.

Furthermore, the weight loss of wood material in pin chips of Eucalyptus globules,

obtained by these inoculs, was quantified in two exposure times (30 and 45 days). The

radial growth of these inoculs was also measured in agar malt stationary medium, and

finally, the enzymatic oxidative potential that these inoculs had was obtained by means of

a test in a stationary medium called galic acid.

The obtained results indicated that both of the proposed liquid culture media are viable for

the development of the fungi 167 and 140; however, the culture medium, without additional

nutrients, results more convenient for it application in biopulping due to it has a low

elaboration cost.

The highest weight loss of wood material (13,36%) was obtained with the fungus 140

coming from a medium with additional nutrients; however, the fungus 167 obtained a radial

growth higher than the one shown by the fungus 140, and also has an enzymatic potential

higher than the one obtained by the fungus 140, which could indicate that the enzymatic

system of the fungus 140 is less selective on the lignin than the one of the fungus 167.

Through this research, it was possible to obtain relevant antecedents with regard to the

liquid culture media, which were an effective energetic source for the development of the

two used fungi (167 and 140) which subsequently showed an effective weight loss of wood

material, radial growth and enzymatic capacity, with the aim of being used in the Kraft

biopulping process.

KEY WORDS Culture media

White rot fungi

Enzimatic system

Biopulping

Biotechnology

INDICE 1 INTRODUCCION 1

2 REVISIÓN BIBLIOGRAFICA 3

2.1. Pudrición blanca 3

2.1.1. Hongos participantes 3

2.1.2. Sistemas enzimáticos 5

2.2. Medios de cultivo 8

2.2.1 Generalidades respecto a la composición de los medios de cultivo 8

2.2.2 Condiciones físico-químicas de los medios de cultivo 9 2.2.3 Principales tipos de medios de cultivo 10

2.2.3.1 Medios de cultivo según el sustrato 10

• Medios sólidos 10

• Medios semisólidos 10

• Medios líquidos 10

2.2.3.2 Medios de cultivo según su utilización 11

• Medios para aislamiento 11

• Medios para crecimiento 11

• Medios de identificación 11

• Medios de mantenimiento de cepas 12

2.2.3.3 Medios de cultivo según su composición 12

• Medios naturales 12

• Medios semi-sintéticos 12

• Medios sintéticos 12

• Medios complejos 12

2.2.3.4 Medios de cultivo según su presentación 13

• Medios deshidratados 13

• Medios ya preparados 13

• Medios sólidos en placas Petri 13

• Medios sólidos en tubo 13

• Medios líquidos en tubo 13

2.2.4 Efecto de algunas sustancias sobre la actividad enzimática ligninolítica 14

de los HPB

2.3 Pulpaje y biopulpaje 19

2.3.1 Pulpaje convencional 19

2.3.2 Biopulpaje 21

2.4 Eucalyptus globulus 25

2.4.1 Generalidades 25

2.4.2 Extraíbles en Eucalyptus globulus 26

3 MATERIALES Y MÉTODOS 28

3.1 Materiales 29

3.2 Métodos 30

3.2.1 Diseño experimental 30

3.2.1.1 Factibilidad de medios de cultivo líquidos 30

3.2.1.2 Pérdida de peso de material leñoso 31

3.2.1.3 Crecimiento radial del micelio 33

3.2.1.4 Capacidad enzimática 34

3.2.2 Metodología de laboratorio 35

3.2.2.1 Preparación del medio de cultivo inicial 35

3.2.2.2 Preparación de medios de cultivo líquidos 36

3.2.2.3 Evaluación de la viabilidad de los medios de cultivo formulados 37

3.2.2.4 Medición de variables respuesta 38

• Pérdida de peso de material leñoso 38

• Crecimiento radial del micelio 39

• Capacidad enzimática 41

4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 43

4.1 Evaluación de la viabilidad del cultivo líquido 44

4.2 Pérdida de peso de material leñoso 45

4.3 Crecimiento radial de micelio 51

4.4 Capacidad enzimática 55

5 CONCLUSIONES 59

6 BIBLIOGRAFÍA 60

7 APÉNDICES 68

1 INTRODUCCION

Hoy en día, el desarrollo de la actividad industrial requiere no sólo la optimización de

factores productivos y económicos, sino también la disminución de la contaminación

ambiental asociada a los procesos de producción. Prueba de ello es la existencia de

normas específicas al respecto, como las ISO 14000 y otras, las que de una u otra forma

obligan a las industrias a emplear tecnologías respetuosas con el medio ambiente, si se

quiere competir adecuadamente en mercados cada vez más globalizados. En este

sentido, las industrias forestales no son la excepción, presentándose la biotecnología

(tecnologías limpias) como una buena herramienta para cumplir con tales objetivos.

En el año 2006, las exportaciones forestales chilenas en el periodo enero-octubre

alcanzaron la cifra de US $ 3.208 millones, lo que representa un aumento de 8,9%

respecto a igual período de 2005. La pulpa blanqueada de pino consolida su liderazgo, al

alcanzar una participación de 33,7% en el total exportado por el sector forestal, junto a la

producción de pulpa de fibra corta, la cual está en constante aumento, y a las

producciones de papel periódico y cartulinas. La industria de celulosa y papel en las

exportaciones forestales es, sin lugar a dudas, la más importante de este sector.

En este contexto, una de las principales biotecnologías que se podrían aplicar en la

industria de la celulosa y papel se denomina biopulpaje; ésta se define como el

tratamiento de astillas de madera con hongos degradadores de lignina, previo al pulpaje

(Akhtar et al, 1996). Los resultados de los estudios aplicando esta técnica muestran una

reducción en los requerimientos energéticos y mejoramiento del producto final, como por

ejemplo mejoras en las propiedades mecánicas del papel (Scott et al, 1998a). Otros

logros obtenidos son la reducción de los contaminantes sólidos, líquidos y gaseosos,

generados principalmente en la cocción, lavado y blanqueo en el proceso Kraft (González

et al, 1996).

No obstante, existen problemas que se deben superar para llevar a cabo el biopulpaje a

una escala industrial, entre los cuales se pueden mencionar: lograr el grado de asepsia

necesario que permita evitar contaminaciones; reducir los costos del inóculo, tanto en su

producción como en su aplicación, y mantener un ambiente no contaminado en la pila de

astillas (Scott et al, 1998b). Por las dificultades anteriormente descritas, la presente

memoria propone diversos medios de cultivo líquidos, cuya utilización permitiría minimizar

los problemas de contaminación y reducir tanto los costos de producción como de

aplicación de los inóculos, pudiendo emplearse métodos simples como son la aspersión

de las trozas o la inmersión de ellas en piscinas con inóculo, contribuyendo de este modo

a optimizar el proceso de biopulpaje en su conjunto. De este modo, los objetivos

planteados en la siguiente memoria fueron:

Objetivo general

• Proponer y evaluar medios de cultivo líquidos para el desarrollo de inóculos a

nivel masivo, de dos hongos de pudrición blanca, con el fin de ser utilizados

en procesos de biopulpaje Kraft de Eucalyptus globulus Labill.

Objetivos específicos

• Formular medios de cultivo líquidos, que permitan el desarrollo de dos hongos

de pudrición blanca (140 y 167).

• Determinar la variable pérdida de peso de material leñoso, como respuesta

a los factores presencia de nutriente y tiempo de incubación.

• Determinar las variables, crecimiento radial de micelio y capacidad

enzimática, como respuesta al factor presencia de nutriente.

2 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2.1 Pudrición blanca La pudrición blanca es una forma de degradación biológica de la madera cuyo resultado

es el blanqueamiento de ésta. El término es comúnmente utilizado para describir la

apariencia macroscópica de la madera degradada (Eaton et al, 1993).

2.1.1 Hongos participantes El mayor grupo de hongos causantes de pudrición blanca pertenece a la clase

Basidiomicetes, que comprende cientos de especies que causan pudrición en coníferas y

latifoliadas en todo el mundo. También, algunos hongos pertenecientes a la clase

Ascomicetes y, particularmente a los géneros Daldinia, Hypoxylon, Ustulina y Xilaria,

producen pudrición blanca en latifoliadas (Eriksson et al, 1990; Eaton et al, 1993).

La producción de enzimas del tipo fenol-oxidasas es lo que distingue a los hongos de

pudrición blanca (HPB) de los demás basidiomicetes degradadores de madera y

causantes de otros tipos de pudrición (Eaton et al, 1993).

Los hongos basidiomicetes de pudrición blanca son los únicos organismos que poseen la

capacidad de degradar lignina completamente en CO2 y H2O. Bajo condiciones

ligninoliticas, los hongos de pudrición blanca producen enzimas extracelulares

(peroxidasas y oxidasas) y un metabolito secundario (veratril alcohol). De todos los grupos

de microorganismos ligninoliticos, los basidiomicetes de pudrición blanca son

probablemente los más eficientes y los más estudiados.

Según Zabell y Morrell (1992), los HPB pueden atacar todos los componentes de la

madera consumiendo tanto Polisacáridos (celulosa y hemicelulosa) como lignina. Sin

embargo, una gran cantidad de especies causan una degradación selectiva de la lignina y

poliosas en la lamela media, como también, en la pared celular. Su estrategia es

descomponer la lignina de la madera para tener acceso a las poliosas y celulosa que

están integrados en la matriz lignocelulósica (Highley y Dashek, 1998). Esta habilidad de

los hongos de pudrición blanca los convierte en organismos altamente deseables en las

industrias papeleras, donde la lignina debe removerse o modificarse, sin alterar

significativamente la celulosa.

Durante la acción de los HPB en la degradación de los componentes estructurales de la

madera, es posible distinguir tres procesos: el primero es la alteración simultánea de los

constituyentes de la pared celular (holocelulosa y lignina); otro tipo de proceso es la

degradación de la lignina y luego holocelulosa, y por último la modificación primeramente

de holocelulosa y posteriormente la lignina. (1)

Los HPB penetran la madera, mayoritariamente, a través de los radios parenquimáticos,

para posteriormente con sus hifas penetrar a los lúmenes de las fibras a través de las

puntuaciones (simples o areoleadas), como también en campos de cruce o causando

erosiones o perforaciones, a través de acciones enzimáticas en la pared celular. La

degradación de la lignina propiamente tal, va desde el lumen de la fibra hacia la capa S2

de la pared celular, con posterior degradación de la lámela media, lo cual conduce a la

separación de las fibras (Silva, 2002a).

En fases avanzadas de pudrición, las paredes celulares son erosionadas extensamente, y

con frecuencia se observan numerosas perforaciones en las paredes de células

adyacentes. Una forma diferente de ataque a la pared celular se puede observar en los

hongos de pudrición blanca que degradan selectivamente la lignina. La hifa en el lumen

de la célula degrada progresivamente la lignina, desde el lumen junto a la pared

secundaria hacia la lámela media. Como el proceso de deslignificación continúa, la lámela

media es degradada y las células son separadas. La deslignificada pared secundaria; rica

en celulosa, permanece relativamente inalterada. La degradación de la lignina se hace

extensa a lo largo de las paredes de la célula, originándose de sólo uno o dos filamentos

hifales en cada lumen de célula. La disposición del parénquima radial facilita el acceso

dentro de la madera, y permite una distribución extensa del hongo (Akhtar et al, 1997).

(1): Comunicación personal Dr. Juan Donoso G. Teléfono: 02 – 314 29 297

La apariencia de la madera atacada por HPB es de tono fuertemente decolorado y

blanquizco, sin embargo, en las etapas tempranas de la pudrición se pueden presentar

matices café. En un número pequeño de casos, la degradación puede presentarse en

áreas discretas y pequeñas; cuando esto ocurre, se ocupa el término “bolsillos de

pudrición blanca”, o pudrición en forma de grano de arroz. En alguna variedad de casos la

madera con pudrición blanca se vuelve de apariencia fibrosa, debido a la separación de

las células en la porción de la lámela media, sin embargo, en otras formas de pudrición

blanca la apariencia es mas bien algodonosa. Las especies latifoliadas, en general, son

más susceptibles a la pudrición blanca que las coníferas (Eaton et al, 1993).

2.1.2 Sistemas enzimáticos

El sistema enzimático revela que los hongos de pudrición blanca producen enzimas

oxidativas e hidrolíticas, que actúan en la degradación de ciertos componentes de la

pared celular, tales como lignina y holocelulosa (Silva, 2002a).

Akhtar y colaboradores (1997) señalan diversos estudios que indican tres enzimas

oxidativas, lignina peroxidasas (LiP), manganeso peroxidasas (MnP), y lacasas son

responsables de la fragmentación inicial del polímero de lignina y producción de

compuestos de bajo peso molecular en hongos de pudrición blanca (solubilización). No

todos estos hongos producen aparentemente las tres enzimas, aunque algunos,

incluyendo Trametes versicolor, si lo hacen. Otros, como Phanerochaete chrysosporíum,

producen sólo LiP y MnP, mientras que Ceriporíopsis subvermispora produce sólo MnP y

lacasa, y Phlebia ochraceofulva produce sólo LiP y lacasa.

Según Eaton y colaboradores (1993), una gran variedad de enzimas resultan ser

importantes en la depolimerización de la lignina, entre estas: lignina peroxidasas, lacasas,

manganeso peroxidasas, demetoxilasas, enzimas generadoras de H2O2 y enzimas

degradadadoras de monómeros tales como: celobiosa dehidrogenasa, ácido vanílico

hidroxilasa y dioxigenasa trihidroxibenceno. Sin embargo, indudablemente las más

importantes son lignina peroxidasas, manganeso peroxidasas y lacasas.

Según Zabel y Morrel (1992), los mayores cambios estructurales que ocurren por la

acción de los HPB incluyen, demetilación, oxidación de átomos de carbono α,

modificación de las cadenas entre carbono α y carbono β de las unidades fenil propano,

modificaciones directas de una cadena de arilglicerol - β - aryl éter e hidroxilación y

modificación de los anillos aromáticos. Estos autores, además, señalan que en el análisis

de lignina residual, en diversos estados de pudrición, se aprecia una constante pérdida de

grupos metoxilo e incrementos en oxígeno y contenido hidroxil. Numerosos estudios han

demostrado que la actividad ligninolítica en varios HPB, se inicia en respuesta a diversos

eventos fisiológicos, los cuales son incitados principalmente por la carencia de algún

nutriente en el medio de cultivo como nitrógeno, carbono, azufre o fósforo (Tapia, 1994).

En estudios realizados en medios de cultivo líquidos con hongos como Phanerochaete

chrysosporium y condiciones óptimas de pH (4,5), sin agitación y presiones parciales altas

de oxígeno, limitaciones de nutrientes esenciales, como la del nitrógeno, incrementan la

lignólisis. Limitaciones de carbono y de azufre también arrojan similares resultados. Sin

embargo, en Pleurotus ostreatus y Lentinus edodes no arrojó el mismo comportamiento

dado que altas concentraciones de nitrógeno en el medio no deprimieron la actividad

ligninolítica, por lo tanto, la relación entre el nivel de nitrógeno y el grado de actividad

ligninolítica no es universal entre los hongos de pudrición blanca (Eaton et al, 1993).

Las LiP son glicoproteinas monoméricas que contienen un grupo hemo (hierro-

protoporfirina IX) como grupo prostético (Tien y Kirk, 1984). Tienen un peso molecular de

entre 38 y 43 KDa y un punto isoeléctrico (pI) que varía entre 3,3 y 4,7 (Kirk et al., 1986).

Para su actividad dependen de la presencia de H2O2, y catalizan la oxidación de

compuestos fenólicos y no fenólicos, hidrocarburos aromáticos policiclicos y otros

compuestos que son resistentes al ataque microbiano; habiéndose demostrado su

capacidad para oxidar una amplia variedad de compuestos modelo de lignina (Glenn et

al., 1983).

Las MnP son glicoproteinas que contienen el grupo hemo como grupo prostético. Tienen

un peso molecular de entre 40 y 47 KDa y un pI que fluctúa entre 3 y 4. Por ser una

peroxidasa requiere para su actividad la presencia de H2O2 pero además lo es de Mn2+,

siendo este último el sustrato principal ya que MnP lo oxida a Mn 3+, siendo el Mn3+

generado un agente capáz de oxidar modelos fenólicos (originando radicales fenoxilo) y

no fenólicos de lignina (Gold et al, 1989). Además, y dado su pequeño tamaño, este ion

puede actuar en zonas internas de la lignina, inaccesibles a un ataque enzimático directo.

Las lacasas (p-difenol oxígeno reductasa) son enzimas del tipo fenoloxidasa, que continen

varios átomos de cobre en su estructura. Son glicoproteinas con un peso molecular entre

60 y 140 KDa y un contenido en carbohidratos que fluctúa entre 15 y 20%, siendo las

variaciones de tamaño debidas sobre todo a las diferencias en el contenido glucídico. Las

lacasas se incluyen dentro del pequeño grupo de enzimas llamadas "proteinas de cobre

azules" u "oxidasas azules", denominadas así por el color azul intenso que les confiere la

presencia de cobre. Este grupo de oxidasas incluye, además de las lacasas, la ascorbato

oxidasa, presente en plantas, y la proteina plasmática de mamíferos ceruloplasmina

(Reinhammar y Malmström, 1981).

Diferentes compuestos fenólicos y proteínas han sido probadas como inductores de

lacasa en diferentes hongos. La lacasa del hongo Polyporus sanguineus, causa una

demetilación y oxidación de determinados compuestos aromáticos de la lignina, liberando

CO2. Sandhu y Arora (1984), realizaron inducción de lacasa en Polyporus sanguineus con

distintos compuestos fenólicos, tales como, ácido galico, resorcinol y orcinol a una

concentración de 0,1%, y ácido tánico y ácido salicílico, a una concentración de 0,05%.

Los resultados indican, que la mejor respuesta se logra en medios con agar malta más el

inductor ácido tánico, con un incremento de actividad lacasa de 38,5 % respecto al

control.

Shin et al (1998), en un estudio utilizando al hongo Coriolus hirsutus, realizó una

caracterización de las propiedades de lacasa en un cultivo líquido con limitaciones de

nitrógeno; Coriolus hirsutus creció en frascos erlenmeyer de 200 ml, con 50 ml de medio

de cultivo a 28º C y con agitación de 200 rpm. El medio de cultivo contenía, por litro: 7,2 g

glucosa, 5,0 g de KH2PO4, 0,2 CaCl2(H2O), 0,5 g MgSO4(7H2O), 54 mg NH4Cl, 5 µg biotin,

100 µg tiamina y 20 ml de una traza de solución mineral. Finalmente, la caracterización

bioquímica fue: la masa molecular de lacasa nativa fue estimada en 80 kDa, indicando

que la enzima es una proteína monómerica.

2.2 Medios de cultivo 2.2.1 Generalidades respecto a la composición de los medios de cultivo

Los medios de cultivo pueden definirse como un conjunto de elementos o sustancias que

garantizan a un microorganismo, célula, o a un grupo de ellos, los nutrientes necesarios

para su conservación, crecimiento y desarrollo (Vázquez, 2002).

En general, los medios de cultivo son una mezcla equilibrada de nutrientes que, en

concentraciones adecuadas y con condiciones físicas óptimas, permiten un buen

crecimiento de los microorganismos. Contienen una base mineral, fuente de carbono, de

nitrógeno y azufre; atmósfera adecuada y los factores de crecimiento necesarios. Pueden

ser de origen natural o artificial y posibilitan, además, la identificación o diferenciación de

una célula o microorganismo dentro de un conjunto de ellos, e incluso inhiben el

desarrollo de otros (Vázquez, 2002).

El elevado ritmo de desarrollo de la industria biofarmacéutica y de la biotecnología abrió

nuevas perspectivas en el diseño de los medios de cultivo y sus componentes, pero

también ha impuesto conceptos referentes a los requisitos de calidad de estos

productos (Vázquez, 2002).

Por su naturaleza y función, los componentes fundamentales de estos medios pueden

agruparse como agua, bases nutritivas, extractos, infusiones y otros, carbohidratos

(azúcares, agar y sus derivados, almidones y varios más), sales minerales (orgánicas e

inorgánicas) y colorantes e indicadores (Vázquez, 2002).

Los medios de cultivo para el desarrollo de los microorganismos deben cumplir con

requerimientos energéticos y no energéticos. Dentro de los requerimientos energéticos

encontramos elementos que serán fuentes de energía para el microorganismo en cultivo;

éstas pueden ser fuentes más energéticas, como carbono (glucosa, lactosa, maltosa,

almidón), y menos energéticas como el nitrógeno (en forma de proteínas, péptidos o

aminoácidos). Con respecto a los requerimientos no energéticos existen fuentes tales

como azufre, fósforo y iones metálicos, entre los que se cuentan el sodio, potasio,

magnesio y hierro (Granados y Villaverde, 1997).

En cuanto al nitrógeno, es necesario considerar que en la madera existen muy bajos

niveles de este elemento. La relación carbono/nitrógeno (C:N) en la madera, es

aproximadamente (300–1200):1. En el micelio de los hongos, el nitrógeno contenido

puede ser más de 100 veces superior al que se encuentra en la madera. Es claro que los

HPB deben conservar y reciclar constantemente el nitrógeno celular, y que la fuente de

nitrógeno disponible para la hifa puede ser suplementada, ya sea en forma de nitritos,

nitratos, amoniacos o también nitrógeno orgánico en la forma de aminoácidos (Eaton,

1993).

2.2.2 Condiciones físico-químicas de los medios de cultivo

Según Granados y Villaverde (1997) aparte de las condiciones nutritivas que debe cumplir

un medio de cultivo, existen las condiciones físico-químicas apropiadas que permiten el

crecimiento adecuado del microorganismo en estudio. De acuerdo a esto se deben

considerar las siguientes condiciones:

Temperatura: Todo microorganismo necesita una temperatura óptima para su adecuado

desarrollo, ya sea para su crecimiento o sobrevivencia. Según Eaton and Hale (1993), la

mayoría de los hongos son organismos mesófilos, es decir, crecen en un rango de

temperatura de 10 y 40º C, con una temperatura óptima de entre 20 y 30º C.

Humedad: Corresponde a la cantidad de agua que va a necesitar el microorganismo para

su crecimiento. En general, cualquier medio sólido o líquido requiere una cierta proporción

de agua. En el caso de los hongos, la humedad adecuada para su desarrollo según Eaton

and Hale (1993) se encuentra entre 30% y 80%.

pH: La presencia de iones hidrógeno libres que se encuentran en el medio es relevante

para el desarrollo de los microorganismos en cultivo. En el caso de los hongos, la mayoría

de ellos crece en un rango de pH de 4 y 7, con un óptimo de 5 y 6. Es importante

mencionar que en un medio de cultivo pueden existir variaciones del pH, como

consecuencia de las reacciones que se producen durante la degradación de los nutrientes

por parte de los hongos.

Oxígeno: En el caso de los microorganismos aeróbicos, es fundamental la presencia de

oxígeno en el medio de cultivo. Como los hongos son organismos aerobios, su respiración

se produce cuando existe presencia de oxígeno.

2.2.3 Principales tipos de medios de cultivo Existen muchos tipos distintos de medios de cultivo, así como diferentes clasificaciones

de estos. A continuación se describen los principales medios de cultivo clasificados según

el sustrato, utilización, composición y presentación (Granados y Villaverde, 1997).

2.2.3.1 Medios de cultivo según el sustrato

• Medios sólidos

Corresponden a aquellos medios donde la proporción en agar está siempre por encima

del 1,5%. Este tipo de medios es muy importante en la actualidad ya que permite el

aislamiento, purificación, y visualización del crecimiento en colonias, así como

identificarlos a través de medios específicos.

• Medios semisólidos Son medios intermedios entre los líquidos y sólidos, donde su proporción en agar suele

ser inferior al 0,5% pero suelen presentar una cierta cantidad de sustrato sólido que les

proporciona una consistencia semisólida.

• Medios líquidos

Corresponden a los también denominados caldos. No contienen agar y su composición

además suele tener una fuente de carbono, sales minerales y, en algunas ocasiones,

según las características del medio, factores de crecimiento, vitaminas, peptonas, etc.

Son muy importantes para la realización de múltiples pruebas bioquímicas, como también

para la realización de inóculos.

2.2.3.2 Medios de cultivo según su utilización

• Medios para aislamiento Son medios muy diversos pero con la particularidad común de obtener a partir de ellos

colonias aisladas. Éstos según su composición, se pueden dividir a su vez en:

Medios enriquecidos: Son medios a los cuales se les añade además de los componentes

básicos, uno o varios elementos que facilitan el crecimiento de algún tipo de

microorganismo generalmente exigentes, lo que nos permite aislar el microorganismo que

buscamos.

Medios selectivos: Son medios en cuya composición presentan algún componente o

componentes que van impedir el crecimiento de algún otro tipo de microorganismo,

estableciendo con ello una selección del tipo de microorganismo que sí puede crecer.

Medios diferenciales: Corresponden a aquellos medios que presentan las mismas

propiedades de los medios selectivos, pero presentan sustancias que al ser utilizadas, o

no, por el microorganismo que va a crecer en dicho medio, dan una información

suplementaria y específica, es decir diferencial.

• Medios para crecimiento Son medios ya sea en forma líquida o sólida que sirven para el cultivo de la mayoría de

los microorganismos. Su composición va a corresponder a una fuente de carbono, una de

nitrógeno, sales y agua.

• Medios de identificación Son medios que pueden tener las mismas características que los diferenciales, por tanto,

nos van a servir para identificar el crecimiento y características de algún tipo de

microorganismo.

• Medios de mantenimiento de cepas Son medios que suelen tener los nutrientes necesarios para mantener a las cepas vivas

durante períodos de tiempo relativamente largos manteniéndose tales medios

generalmente a temperaturas lo suficientemente bajas en cada caso como para impedir

su crecimiento.

2.2.3.3 Medios de cultivo según su composición

• Medios naturales

Son aquellos cuyos componentes orgánicos e inorgánicos se encuentran en la naturaleza,

se suelen preparar artesanalmente y, en general, pueden estar constituidos por ciertos

tejidos, líquidos orgánicos, etc.; por ejemplo la leche, el huevo, la patata, sangre, etc.

• Medios semi-sintéticos Son medios donde parte de su composición corresponde a extractos naturales como

levadura, malta, patata, sangre, leche, etc., a los que se añaden constituyentes sintéticos

o químicamente definidos para el crecimiento del microorganismo.

• Medios sintéticos Corresponden a estructuras sintéticas más o menos puras y químicamente definidas, que

están o pueden estar disueltas en agua destilada en proporciones determinadas de forma

que se obtenga una solución adecuada para permitir el crecimiento del tipo o tipos de

microorganismos que se desee.

• Medios complejos

Su composición no está exactamente definida como sucede con los medios sintéticos, es

decir, no es rigurosamente constante, y sus materias primas se originan a partir de tejidos

animales y vegetales, entre ellas podemos encontrar carne de músculo, de hígado, de

corazón, clara o yema de huevo, azúcares, peptonas, etc.

2.2.3.4 Medios de cultivo según su presentación • Medios deshidratados

Son medios que se comercializan tal cual y una vez en el laboratorio deben ser

preparados adicionando la cantidad de agua correspondiente en condiciones totalmente

asépticas o una vez preparados se esterilizarían en un autoclave. Su composición es muy

variable y puede ser de tipo básico o más complejo.

• Medios ya preparados Son medios que han sido elaborados por las casas comerciales presentando un

determinado control de calidad y características específicas adecuadas a cada tipo de

cultivo. Este tipo de medios pueden presentarse en forma de placas, en tubo, como

formas sólidas, en frascos, como medios semisólidos o líquidos, en doble fase, etc.

• Medios sólidos en placas Petri Son medios sólidos que ocupan una superficie lo suficientemente grande como para

poder visualizar perfectamente las colonias de microorganismos en cultivo (mucho mejor

que en tubo). Estos medios se utilizan mucho para obtener cultivos puros partiendo de

una colonia previamente aislada. En general, el sistema en placa es uno de los medios

que permiten mejor el aislamiento de microorganismos que puedan crecer en él.

• Medios sólidos en tubo Los medios sólidos en tubo corresponden a tubos con agar inclinado y solidificado con el

fin de aumentar la superficie donde se va a producir el crecimiento del microorganismo

una vez sembrado. Estos tipos de medio son útiles para la conservación de cepas, porque

la desecación es menor en medios sólidos en tubo que en las placas Petri.

• Medios líquidos en tubo Estos medios nos permiten visualizar colonias pero tienen muchas aplicaciones como por

ejemplo, pruebas bioquímicas que permiten la determinación del indol, la reducción de

nitratos a nitritos, la fermentación de la glucosa, lactosa u otro tipo de azucar , etc.

2.2.4 Efecto de algunas sustancias sobre la actividad enzimática ligninolítica de los HPB

Numerosos estudios dan cuenta de la incidencia de los niveles de nitrógeno en el medio

de cultivo sobre la actividad ligninolítica; sin embargo, si el efecto es positivo o negativo

depende del hongo. Para algunas cepas, altos niveles iniciales de nitrógeno en el medio

reprimen la actividad ligninolítica, la que sólo se activa durante el metabolismo secundario

(Kirk et al., 1978). Por el contrario, en otros hongos se ha demostrado que altas

concentraciones de nitrógeno estimulan la producción de actividad enzimática ligninolítica,

particularmente lacasa (Buswell y Odier, 1987).

Según Reddy (1992), en estudios con Phanerochaete chrysosporíum la producción de las

enzimas LiP y MnP, tanto en cantidad como en tipos, responde directamente a los

cambios realizados en los medios de cultivo. Por ejemplo, limitaciones de nitrógeno

favorecen la producción de enzimas degradadoras de lignina (LiP y MnP), mientras que

un exceso de nitrógeno en el medio reprimen la producción de estas enzimas. Esta

relación inversa se extiende también a los nutrientes carbono y azufre. En cultivos

limitados en nitrógeno se han detectado al menos seis isoenzimas diferentes de LiP (H1,

H2, H6, H7, H8 y H10) y cuatro isoenzimas de MnP (H3, H4, H5 y H9) (Kirk et al., 1985).

Kaal y colaboradores (1995), estudiaron cinco especies de hongos de pudrición blanca

con respecto a su crecimiento en masa de micelio y actividad enzimática en tres medios

de cultivo, peptona - N, baja concentración de N y alta concentración de N. Los resultados

en cuanto a crecimiento, mostraron que altas concentraciones de N mejoran la capacidad

generadora de micelio. Con respecto a la capacidad enzimática: LiP fue producida por

Phanerochaete chrysosporíum en medios con limitaciones de N, mientras que en

Bjerkandera spp la producción de LiP se presentó en medios con altas concentraciones

de N; la producción de MnP se presentó en todos los casos en el medio con peptona – N

y lacasa fue detectada sólo en los cultivos de Pleurotus ostreatus y Lentinula edodes,

ambos en medios con altas concentraciones de N.

Vares y Hatakka (1997) estudiaron la capacidad degradadora de lignina sintética y

producción de enzimas ligninoliticas en medios de cultivo líquidos y bajo variadas

condiciones de crecimiento, en varias especies de hongos basidiomicetes. La

mineralización de la lignina no excedió el 14% en 29 días de tratamiento. Hubo diferentes

respuestas de los hongos al elevar la concentración de Mn 2+ y de sodio malonate. Esta

respuesta estuvo marcada por los distintos sistemas enzimáticos de cada hongo. Se

observó una producción de LiP en Trametes gibbosa y Trametes trogii. Producción de

distintos tipo de MnP se observó en los hongos Trametes gibbosa, Trametes trogii,

Trametes hirsuta y Abortipurus biennis. Además, se detectaron dos de tres tipos de

lacasa.

Wuyep y colaboradores (2003) investigaron la influencia de iones metálicos en la

producción y regulación de ligninasa y la extensión del micelio en dos tipos de

basiodiomicetes, Lentinus squarrosulus y Psathyrella atroumbonata, cultivados sobre

residuos lignocelulósicos. Encontraron que los iones Mn2+ y Ca2+ estimularon el

crecimiento de ambos hongos y la extensión del micelio significantemente. La producción

de lignina peroxidasa se incrementó de 2 a 12 veces bajo la influencia de los iones Mn2+ y

Ca2+ a concentraciones de 20 a 80 mM respectivamente. Los iones Mg2+ y K+ no

estimularon el crecimiento ni la extensión del micelio fúngico, por el contrario, los cultivos

fúngicos se desactivaron después de 6 días.

Wuyep y colaboradores (2003) encontraron que la degradación de las astillas de madera,

medida a través de ensayos de pérdida de peso, en presencia de los hongos Lentinus

squarrosulus y Psathyrella atroumbonata alcanzó un 35 - 50% en la concentración 60 – 80

mM, para Mn2+, y 40 - 60 mM para Ca2+. La biodegradación de la madera fue

significativamente más baja, alrededor de un 2 a 5% en presencia de Mg2+ y K+.

Collins y colaboradores (1997), en estudios realizados con el hongo de pudrición blanca

Trametes versicolor, encontraron que la producción de lacasa no está regulada

necesariamente por el gen del hongo, a través de enzimas constitutivas, sino que además

esta puede ser activada por la presencia de ciertos nutrientes, tales como nitrógeno,

cobre y un número importante de inductores aromáticos.

Shuttleworth et al (1986), examinaron la habilidad del hongo Rhizoctonia praticola de

producir e inducir lacasa. Potenciales inductores fueron utilizados, tales como:

compuestos fenolicos, anilinas y ácidos benzoicos, los que fueron adicionados a una

concentración de 1 mM en el medio de cultivo. El medio, antes de la adición de los

inductores, fue mantenido a temperatura ambiente (22 y 25º C), y una vez agregados los

inductores se mantuvo a una temperatura de 15º C. De los 11 compuestos probados, sólo

5 tuvieron un efecto inductor (p-Aminofenol, o-metoxianilina, ácido 2,4-Dihidroxibenzoico,

p-Toluidina y p-metoxianilina). El inductor más efectivo fue p-anisidina (p-metoxianilina),

obteniendo 30 veces mayor actividad de lacasa que el control. También se encontraron

otros parámetros que influyen en la producción de lacasa, como la temperatura,

concentración de los inductores y tiempo de adición de los inductores.

El desarrollo de actividad enzimática extracelular en los cultivos del hongo basidiomicete

Trametes versicolor fue estudiado por Johansson y Nyman (1992). Ellos probaron medios

de cultivo líquidos estacionarios con limitaciones de carbono y nitrógeno, cuya

temperatura de incubación fue de 27º C. Con la adición de MnSO4 en una concentración

de 200 uM, se obtuvo producción de MnP; la mayor actividad MnP se obtuvo en el décimo

día de incubación de los medios.

Por otra parte, algunos autores han reportado que, entre otros parámetros, la tasa de

agitación y en menor grado el tipo de agitación (circular o elíptica) pueden tener un efecto

importante sobre la cantidad y tipo de enzimas producidas (Ashter et al., 1988).

Nerud y colaboradores (1991) encontraron que cultivos de Trametes hirsuta en estático,

suficientes en nitrógeno y limitados en carbono, favorecían la producción enzimática de

LiP. Los mismos autores reportan además una fuerte dependencia de la actividad LiP,

MnP y lacasa, de la presencia de alcohol veratrílico en el medio de cultivo.

Eggert et al (1996), estudiando el sistema ligninolítico del hongo Pycnoporus

cinnabarinus, probaron diversos inductores para la producción de las distintas enzimas.

Para la producción de LiP utilizaron alcohol veratrílico, para la inducción de MnP

emplearon MnSO4 y para lacasa 2,5 xilidina, ácido veratrico, guaiacol y lignosulfato. Los

resultados no mostraron actividad LiP ni MnP; en cambio, la actividad lacasa aumentó

cerca de nueve veces, con concentraciones de 10 -19 µM de 2,5 xilina; sin embargo, un

aumento de estas concentraciones disminuyen la actividad lacasa.

Szklarz et al, 1989 estudiaron la producción de actividad extracelular de fenol-oxidasas y

peroxidasas en ocho tipos de hongos basidiomicetes degradadores de la madera.

Coriulus versicolor, Phellinus igniarius y Lycoperdon sp. mostraron altas actividades de

lacasa. Phanerochaete chrysosporium y Piptoporus betulinus manifestaron actividad de

MnP, mientras que Chaetomiun piluliferum y Chaetomiun celullolyticum expresaron bajas

actividades de peroxidasas. En Lenzites trabea no se encontró ningún tipo de actividad

extracelular de enzimas oxidasas ni peroxidasas. Los autores encontraron marcadas

diferencias en las actividades de fenol-oxidasas entre dos tipos de Coriulus versicolor,

uno de ellos aislado más recientemente que el otro. Este resultado sugiere que los

hongos pueden perder su capacidad de producción de enzimas cuando son cultivados por

largos periodos de tiempo. Bajo las condiciones experimentales desarrolladas durante el

estudio no se encontró ninguna actividad de ligninasa en ninguno de los hongos

estudiados.

Muñoz y colaboradores (1996), realizaron estudios con el hongo de pudrición blanca

Pleurotus eryngii en relación a la producción de lacasa en medios de cultivo líquidos,

cuyo extracto principal era glucosa-amonio y tartrato de levadura, con o sin inductores. Se

obtuvieron los siguientes resultados: en el medio base se observaron una mayor y una

menor banda de lacasa. La intensidad de la mayor banda de lacasa no mostró cambios

con la adición de inductores. Sin embargo, la menor banda de lacasa fue intensamente

inducida por paja de trigo, alcali lignina y ácidos vainillinico y verátrico.

Por otra parte, Garzillo et al (1998) desarrollaron investigaciones con el hongo Trametes

trogii y su relación con la inducción de lacasa, crecido en medio líquido sintético GB7

suplementado con extracto de levadura, glucosa, (NH4)2SO4, K2HPO4 y KH2PO4. Los

cultivos de mantuvieron a una agitación constante de 180 rpm y a una temperatura de 28º

C. En algunos medios se le adicionaron por separado, como potenciales inductores, paja

de trigo (desde 1% a 6%) o 2,5 xililidina (0,2 mM o 0,5 mM). Los resultados obtenidos

indican que la paja de trigo aumenta la actividad lacasa. Por el contrario, la xilidina no

muestras efectos en la actividad lacasa.

Palmieri et al (1999), estudiaron la inducción de Lacasa en Pleurotus ostreatus con CuSO4

en medios de cultivo líquido. La composición base del cultivo era dextrosa potato 24 g/l,

extracto de paja 5 g/l y la adición del suplemento cúprico a una concentración de 150 uM.

Transcurridos 6 días de incubación se incrementó 50 veces la actividad máxima del

control. Además, el incremento de la actividad enzimática sería proporcional a la cantidad

de Cu adicionado. Así también la cantidad de Cu no afecta el crecimiento en biomasa del

hongo.

2.3 Pulpaje y biopulpaje 2.3.1 Pulpaje convencional El pulpaje o pasteo persigue la separación de las fibras celulósicas que constituyen la

madera desde la matriz lignocelulósica, lo que puede realizarse por diferentes métodos

implicando, según éste, diferentes grados de remoción de la lignina. En la actualidad,

prácticamente el 100% de las pastas producidas en el mundo se obtienen por procesos

de pulpaje químicos o mecánicos (Silva, 2006).

En la producción de la pulpa mecánica se utiliza prácticamente toda la fibra de madera

que existe en el tronco en la que se incluyen tanto los carbohidratos (celulosa y

hemicelulosa) como la lignina. En este tipo de procesos, el grado de extracción de la

lignina es mínimo, obteniéndose rendimientos muy altos, por sobre el 90%. (Silva, 2006)

La pulpa mecánica tradicional se obtiene presionando la madera contra una superficie

abrasiva de un cilindro rotatorio. Este proceso de fabricación de la pulpa mecánica se

inicia con la entrega a la fábrica de los troncos de madera para pulpa limpios y

descortezados en longitudes de 40 a 150 cm, dependiendo del tipo de molino a utilizar:

Luego los troncos se colocan dentro del molino, y son reducidos a pasta mecánica por la

piedra del mismo. Para obtener una temperatura apropiada, se agrega agua a la piedra y

la pulpa va entonces de la fosa del molino hacia los depuradores gruesos o de astillas, en

donde se separan pedazos de madera relativamente grandes y astillas. Posteriormente, la

suspensión diluida se bombea a los depuradores finos, y la pulpa aceptada, a los

espesadores o a los prensa pastas en donde, respectivamente, se prepara para su uso en

la fábrica de papel, o para su embarque en forma de hojas o paquetes húmedos (Libby,

1967).

El pulpaje mecánico tradicional ha experimentado numerosas modificaciones a lo largo

del tiempo. Entre estas se cuentan la incorporación de los refinadores, que permitió

trabajar con astillas en vez de troncos, y la inclusión de una etapa de tratamiento térmico

(con vapor) antes del pulpaje (pulpas termomecánicas) (Silva, 2006).

En cuanto a los procesos químicos, el más utilizado es el proceso al sulfato o kraft,

mediante el cual se genera casi el 70% del total de pastas de madera producidas en el

mundo. Este procedimiento permite eliminar cerca del 95% de la lignina presente en la

madera (Silva, 2006).

El pulpaje Kraft permite separar las fibras de la madera extrayendo la lignina mediante la

acción de ciertos reactivos químicos, específicamente sulfuro de sodio e hidróxido de

sodio, bajo determinadas condiciones de temperatura y presión, reactivos que constituyen

el licor de cocción. Se produce además, una extracción y disolución de gran parte de las

hemicelulosas, sin lograrse la extracción total de la lignina, quedando un remanente de

ésta en la pasta (lignina residual).

Figura Nº 1: Proceso de producción de pulpa Kraft. (Fuente: www.papelnet.cl)

El pulpaje Kraft (figura Nº 1) se resume en cuatro etapas fundamentales (Vial, 1989):

Una saturación completa de las astillas de licor de cocción acompañado de un aumento

de la temperatura y presión dentro del digestor. Esta fase inicial alcanza temperaturas

cercanas a los 150º C, donde se disuelve entre el 20 y el 25% del total de la lignina.

Una segunda fase, de cocción, que comienza cuando se detiene el suministro de calor al

proceso, manteniéndose estas condiciones por un tiempo determinado, permitiendo que

se produzcan las reacciones de deslignificación. Esta etapa se denomina fase gruesa y se

desarrolla aproximadamente a 170º C, lo que produce la disolución de cerca del 60% de

la lignina presente en la madera.

La tercera etapa consiste en someter las astillas cocidas a una violenta baja de presión, lo

que provoca la separación de las fibras. Esta etapa se denomina fase residual de

deslignificación, y durante ella se produce la disolución de aproximadamente un 10 a 15%

de la lignina originalmente presente en la madera.

La cuarta etapa consiste en la extracción del licor de las fibras mediante un lavado,

realizado generalmente en un tambor rotatorio vacío.

2.3.2 Biopulpaje El rápido desarrollo de la producción industrial coincide con un interés creciente en la

biotecnología, la cual involucra la utilización de procesos biológicos o enzimáticos en

diversas áreas industriales. Esta ha llegado a ser posible por el desarrollo de

microorganismos altamente especializados, los que pueden ser directamente empleados

en los procesos o a través del aislamiento de las enzimas que ellos producen (Zaid,

2004).

El biopulpaje es definido como el tratamiento de astillas o trozas de madera con hongos

de pudrición blanca que degradan selectivamente lignina antes del pulpaje, es un proceso

experimental que ha sido investigado extensamente durante los últimos años. Éste ha

sido estudiado principalmente como un pre-tratamiento para el pulpaje mecánico. La

aplicación de este pre-tratamiento trae consigo una serie de ventajas, como la reducción

del consumo de energía, la cual para el caso del pulpaje termo-mecánico, corresponde al

mayor costo; un aumento en la calidad del papel mejorando sus propiedades, y la

reducción del impacto medio ambiental negativo del proceso de pulpaje Kraft, debido a la

disminución en el uso de reactivos (Akhtar et al, 1997).

Aunque se ha mostrado la potencial aplicación de tratamientos fúngicos en el pulpaje,

falta aún incorporar muchos aspectos de ingeniería y procesos para poder explotar esta

tecnología. Sin embargo, en los últimos años los grandes avances de la biotecnología

forestal se han centrado en el mejoramiento genético y en la industria de la celulosa y

papel (biopulpaje y bioblanqueo), demostrando que estos procesos pueden tener una baja

tasa de contaminación, ser más limpios y económicos (González y Donoso, 1999).

Con el conocimiento más acabado de la influencia de los factores ecológicos u otros como

el hibridismo, se ha podido determinar cuales son las condiciones (físicas, químicas y

biológicas) más favorables para el crecimiento y el comportamiento degradador de los

HPB en la madera, los cuales son aspectos importantes que se deben considerar al

momento de llevar el pre-tratamiento a una escala industrial (Donoso et al, 1999).

Según Messner et al (1998), existen dos mecanismos que están involucrados en el

biopulpaje: primero, existe una modificación de la pared celular, probablemente a causa

de un agente difusor, y segundo una clara mejora en la penetración y difusión de los

agentes químicos de cocción efectos causados por la acción del hongo sobre el chip.

Gomez (1995), concluye que no se manifiesta una alta biodegradación de los

componentes químicos de la madera, sin embargo, se supone un desdoblamiento de las

cadenas moleculares para los casos de la lignina, celulosa, y sustancias pécticas; lo cual

se traduce en mayores rendimientos de pulpaje.

Oriarán y colaboradores (1991) postulan que el proceso mejora, por que existe una mejor

penetración del licor de cocción durante la digestión. Esto puede deberse al aumento de

la porosidad, consecuencia de la remoción de biomasa por las enzimas, que mejoran la

accesibilidad del licor a los componentes de la pared celular, o por una mejor relación

holocelulosa/lignina que entra al digestor.

El pretratamiento de astillas de madera con hongos de pudrición blanca a escala de

laboratorio ha demostrado varios beneficios, entre ellos un ahorro de energía y mayor

resistencia del papel en pulpaje mecánico, un incremento en el rendimiento y mayor

resistencia del papel en pulpaje kraft y una reducción en el número kappa e incremento en

la blancura del papel en pulpaje al sulfito (Wall et al, 1994; Gonzalez et al, 1998; Gonzalez

et al, 2001).

Messner et al, (1998) demostraron que para hongos basidiomicetes, existen reducciones

del número kappa entre 30% y 50%; mientras tanto, con hongos ascomicetes se han

observado reducciones de entre 7% y 10% para el pulpaje denominado al biosulfito. Sin

embargo, para el pulpaje biokraft las reducciones del número kappa fueron sólo un poco

mejor para hongos basidiomicetes que para el hongo ascomicete Ophiostoma piliferum.

Para un experimento con trozas de Pinus resinosa, sometido a un ataque de Phlebiopsis

gigantea, Blanchette y colaboradores, (1998) observaron un aumento de la porosidad de

la pared celular y una reducción del consumo de energía (9 a 27% menos) en pulpaje

mecánico. Akhtar et al, (1998) revelan ahorros energéticos en pulpaje mecánico de entre

27% y 40% con distintas especies de HPB enriquecidas con licor de maíz, sobre chips de

álamo.

Según González y colaboradores (2001), en experiencias realizadas en Chile, trabajando

con pino radiata y Pleurotus ostreatus, se logró disminuir el número kappa en un 9%,

obteniendo mejores rendimientos y altos grados de polimerización en la fibra de celulosa.

El proceso de blanqueo es mucho más fácil en el biopulpaje, usando menos productos

clorados y con mejores grados de brillo en el papel. El biopulpaje puede ser aplicado sin

restricciones tanto en latifoliadas como en coníferas.

Chen y colaboradores (1999), lograron una disminución del tiempo total de pulpaje kraft

de un 20% al tratar astillas de Pinus banksiana en paquetes compactados con el hongo

Ceriporiopsis subvermispora.

Según González y colaboradores (1996) en la industria de celulosa, los principales

factores de contaminación provienen de las etapas cocción, lavado y blanqueo. Scott et

al, (1995), hallaron que los efluentes de un pulpaje al sulfito de Pinus taeda redujeron en

gran parte su toxicidad al haber tratado la madera con un HPB.

Debido a las actuales presiones en torno al tema de la protección ambiental,

especialmente provenientes del mercado internacional, en los últimos años se han

realizado importantes avances en el diseño de ingeniería de los procesos de producción

de celulosa. Los cambios se han centrado en la introducción de mecanismos para la

disminución en la generación de residuos, ya sea de manera preventiva (cambios y

mejoras de tecnología e insumos) o incluyendo tratamiento previo a su disposición final.

Entre estas mejorías se incluyen el descortezado en seco, la cocción modificada y

extendida, la deslignificación con oxígeno y ozono, y el blanqueo con dióxido de cloro

(proceso ECF) o sin cloro (proceso TCF); los siguientes pasos a seguir apuntan a la

incorporación de mejoras biotecnológicas, como es el caso del biopulpaje y bioblanqueo

(Silva, 2002b).

Actualmente se plantean desafíos de desarrollo sustentable, que involucren objetivos

sociales y económicos sin afectar el ambiente ni los recursos naturales, siendo esta una

de las principales metas de la industria de celulosa y papel para el siglo XXI. Una serie de

convenciones ya se han adoptado para el desarrollo sustentable, entre éstas, políticas

que integran aspectos productivos y prevención de la polución (IPPC), mejorando las

expectativas medioambientales futuras. Los principales problemas a abordar son el

cambio climático, la acidificación y la disminución de recursos naturales (González, 2003).

2.4 Eucalyptus globulus

2.4.1 Generalidades El género Eucalyptus corresponde botánicamente a la clase Angiospermas, subclase

dicotiledóneas y familia Mirtaceae. Existen en el género más de 500 especies originarias

de Australia y de algunas islas cercanas, encontrándose variadas formas y tamaños dada

su amplia distribución natural y gran número de especies. En particular, Eucaliptus

globulus es originario del sudeste de Australia y Tasmania (Prado y Barros, 1991).

Las plantaciones de Eucalyptus globulus presentan en general, un incremento volumétrico

anual de 20 a 30 metros cúbicos por hectárea, pudiendo llegar a los 45 metros cúbicos en

las condiciones más favorables (Vita, 1990). Los árboles poseen corteza rugosa y

persistente en la parte baja, y en la parte alta se desprende en tiras largas dejando una

superficie lisa de color gris azulado. La madera es de color café amarillento claro, textura

gruesa, normalmente de grano entrelazado, con anillos de crecimiento bastante

diferenciados, de gran dureza, pesada y moderadamente durable. Su peso especifíco

promedio es de 689 kg/m3 (INFOR, 1986).

Las propiedades fisicoquímicas de la madera inciden en los procesos de la celulosa

obtenida de ella. Entre estas se encuentran la densidad básica, contenido de extraíbles,

presencia de vasos, contenido de lignina, edad de los árboles y características de las

fibras. En el caso de las fibras, tienen gran importancia la longitud, el diámetro y el

espesor de pared. Eucapytus globulus presenta una longitud de fibra entre 0,81 y 1,06

mm, diámetros de fibra de 19,59 um, y espesor de pared de 2,36 um, valores que

aumentan con la edad (Prado y Barros, 1991).

Según Consuegra (1994) el interés por diversificar las plantaciones actuales

considerando, entre otros, el rápido crecimiento, su menor contenido de lignina, y

aspectos fitosanitarios, hace que se vea al Eucalyptus como el género más viable para su

utilización en la industria de celulosa y papel.

2.4.2 Extraíbles en Eucalyptus Globulus

Los extraíbles representan un gran número de compuestos orgánicos. El grupo más

importante en términos de cantidad son los polifenoles y las resinas. Los polifenoles están

presentes en angiospermas y gimnospermas, e incluyen a un gran número de

componentes químicos orgánicos, entre estos los taninos. Estos materiales de origen

orgánico están presentes en formas mezcladas (Panshin y De-Zeeuw, 1970).

Los extraíbles se pueden agrupar de acuerdo al solvente utilizado para la extracción. Es

así como se reconocen extracciones en agua fría, en agua caliente, en etanol-tolueno y

en soda (Diaz-Vaz, 2003).

La extracción en agua fría elimina sales orgánicas presentes en lúmenes celulares. Del

mismo modo, se extraen los azúcares, gomas, galactanos, porciones de taninos y de

pigmentos. Por otra parte, la extracción en agua caliente incrementa los solubles con

agua fría y, además, hidroliza algunos polisacáridos (Diaz-Vaz, 2003).

La extracción con etanol-tolueno elimina de la madera ceras, grasas, resinas, aceites,

colorantes orgánicos, taninos, gomas e incluso materiales solubles en agua (Diaz-Vaz,

2003).

Los solubles en soda, esto es, hidróxido de sodio al 1%, corresponden a poliosas

(pentasanos y hexosanos), productos de degradación de celulosa, de lignina y algo de

resinas (Diaz-Vaz, 2003).

En comparación con muchas otras especies, la madera de Eucalyptus tiene un alto

contenido de extraíbles, que varía considerablemente según la especie. La cantidad de

extraíbles fenólicos aumenta desde la médula hacia el exterior en el duramen, y

disminuye en la albura. El mismo patrón de distribución se encuentra en todo el árbol, aún

cuando los contenidos de extraíbles son menores en la parte superior (Hillis, 1978).

Mansilla et al (1991) analizaron muestras de Eucalyptus globulus provenientes de

individuos con edades de 10 y 25 años y de troncos sin resina ni acumulación de nudos,

obteniendo cerca de un 5,1% de extraíbles.

Por otra parte Peredo (1999) realizó estudios de contenido de extraíbles en Eucalyptus

globulus sobre material proveniente de rodales pertenecientes a Bosques Arauco y

Forestal Valdivia, pero sólo con el solvente etanol tolueno. Los resultados obtenidos se

muestran en el cuadro Nº 1.

Cuadro Nº 1: Contenido de extraíbles según edad y procedencia para Eucalyptus globulus, según

Peredo (1999)

Especie Edad % Extraíbles (años) Bosques Arauco Forestal Valdivia 5-7 0,35 -

E.globulus 8-10 0,44 0,58 11-13 0,37 0,42 14-16 0,36 0,36

Paz y Pérez (1999) realizaron estudios químicos a Eucalyptus globulus y Eucalyptus

nitens, detectando un menor contenido de lignina y un mayor contenido de holocelulosa

en Eucalyptus globulus, lo cual sería una característica favorable a esta especie desde el

punto de vista de aptitud pulpable. En cuanto a los extraíbles, su presencia fue mayor en

Eucalyptus globulus, los valores obtenidos se muestran en el cuadro Nº 2

Cuadro Nº 2: Contenido de extraíbles en individuos con entre 10 -13 años con distintos solventes

para Eucalyptus globulus, según Paz y Pérez (1999)

Tipo de solvente Extraíbles (%) Agua Fría 1,5 Agua Caliente 4,5 Alcohol-Benceno 2

Total 8

3 MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 Materiales Para llevar a cabo este trabajo se utilizó como materia prima inicial “pin chips” de

Eucalyptus globulus Labill, provistos por la empresa Celulosa ARAUCO S.A. Se entiende

por “pin chip” a una partícula de madera de entre 3 y 9 mm de longitud, la cual es

desclasificada por subdimensión en el proceso de astillado para el pulpaje (figura Nº 2).

Los materiales y equipos restantes se encuentran en los laboratorios de Biodeterioro y

Preservación de la Madera, Química de la Madera y Celulosa y Papel, todos ellos

pertenecientes al Departamento de Ingeniería de la Madera de la Facultad de Ciencias

Forestales de la Universidad de Chile. Su listado es el siguiente:

Cepas de HPB, 140 y 167. (Basidiomycetes, Aphyllophorales).

Agar - Agar

Extracto de malta

Complejo nutritivo (N-P-K)

Ácido gálico

Material de vidrio (Matraces, vasos, pipetas, etc)

Cámara de flujo laminar (Figura Nº 3)

Agitador orbital (Figura Nº 4)

Autoclave (Figura Nº 5)

Estufa de secado

Balanza digital

Cámara de incubación (Figura Nº 6)

Microscopio óptico (Figura Nº 7)

Rota-vapor (Figura Nº 8)

Figura Nº 2: Muestra de “Pin-chip” Eucaliptus globulus.

Figura Nº 3: Cámara de flujo laminar

Figura Nº 4: Agitador orbital

Figura Nº 5: Autoclave

Figura Nº 6: Cámara de incubación a 25 ºC

Figura Nº 7: Microscopio óptico

Figura Nº 8: Rota-vapor

3.2 Métodos 3.2.1 Diseño experimental Para cumplir con los objetivos planteados en el estudio, se diseñó un experimento en dos

fases. La primera de ellas dice relación con la formulación de medios de cultivo líquidos,

con o sin la incorporación de nutrientes adicionales N-P-K, y la evaluación de la capacidad

de tales medios de servir como sustrato de crecimiento de dos hongos de pudrición

blanca (cepas 140 y167).Tal capacidad, se determinó desde un punto de vista cualitativo,

a través de la observación del prendimiento de los hongos en el medio, es decir, de la

presencia de micelio fúngico. En la segunda fase y una vez comprobada la capacidad de

los medios como sustrato de crecimiento para los hongos en estudio, se determinó

cuantitativamente, de acuerdo a las variables respuesta pérdida de peso de material

leñoso, crecimiento radial de micelio y capacidad enzimática, la potencialidad de los

hongos crecidos en los distintos medios estudiados para biodegradar la madera y,

particularmente, su potencial producción de enzimas ligninolíticas ( a través de la variable

respuesta capacidad enzimática).

La descripción del experimento, desde el punto de vista de su diseño, se presenta en los

apartados 3.2.1.1 al 3.1.1.4; los cuales se presentan a continuación.

3.2.1.1 Factibilidad de medios de cultivo líquidos Este punto se relaciona con la viabilidad de los medios de cultivo líquidos en cuanto a

permitir el desarrollo de los hongos en estudio (140 y 167). Para ello se prepararon los

diferentes medios líquidos, tanto con la incorporación de nutrientes adicionales N-P-K

(cultivo Nº 2) como sin ellos (cultivo Nº 1). En el cuadro Nº 3 se indican los dos medios

formulados.

Cuadro Nº 3: Resumen de medios de cultivo formulados

Nº Incorporación Nºcultivo N - P - K Replicas

1 NO 32 SI 3

612

Subtotal (un hongo)Total (dos hongos)

Como se observa en el cuadro Nº 3 se realizaron tres repeticiones de cada medio de

cultivo formulado, con el fin de enfrentar una potencial contaminación, para así tener la

posibilidad de eliminar alguna de ellas. Una vez probada la factibilidad, a través de la

observación de micelios en un microscopio óptico, estos medios fueron utilizados en todos

los ensayos posteriores de este estudio.

3.2.1.2 Pérdida de peso de material leñoso

La pérdida de peso del material leñoso, fue la primera variable cuantificable que se

estableció como variable respuesta. Para determinar las diferencias en la variable

respuesta pérdida de peso del material leñoso se estableció un análisis de varianza

(ANDEVA) con diseño trifactorial, que incluyó las siguientes variables de entrada: tipo de

hongo, presencia o ausencia de nutrientes adicionales N-P-K y tiempo de incubación. En

el cuadro Nº 4 se detallan los ensayos realizados para evaluar la pérdida de peso de

material leñoso provocada por los hongos en estudio, con sus respectivas repeticiones.

Cuadro Nº 4: Resumen de ensayos para evaluar la perdida de peso de material leñoso

Nº Tiempo de Nºcultivo incubación (días) Repeticiones

1 30 51 45 52 30 52 45 5

2040

Subtotal (un hongo)Total (dos hongos)

De esta manera se tiene un conjunto de 2 x 2 x 2 = 8 tratamientos distintos, con cinco

repeticiones de cada uno. El modelo general asociado a este diseño experimental, donde

el factor A corresponde a tipo de hongo, el factor B corresponde a presencia o ausencia

de nutrientes adicionales y el factor C corresponde a tiempo de incubación, es:

Y ijkl = µ + α i + β j + γ k + (αβ) ij + (αγ) ik + (βγ) jk + (αβγ) ijk + З ijkl

Con i = 1,…, a (a=2)

j = 1,…, b (b=2)

k = 1,…, c (c=2)

l = 1,…, n (n=5)

Donde:

Y ijkl : l-ésima observación de pérdida de peso (%) para el tratamiento (i,j,k)

µ : Efecto de la media

α i : Efecto principal causado por el i-ésimo nivel del factor A (tipo de hongo)

β j : Efecto principal causado por el j-ésimo nivel del factor B (presencia o ausencia de

nutrientes adicionales)

γ k : Efecto principal causado por el k-ésimo nivel del factor C (tiempo)

(αβ) ij : Efecto de la interacción del i-ésimo nivel del factor A con el j-ésimo nivel del factor

B

(αγ) ik : Efecto de la interacción del i-ésimo nivel del factor A con el k-ésimo nivel del

factor C

(βγ) jk : Efecto de la interacción del j-ésimo nivel del factor B con el k-ésimo nivel del

factor C

(αβγ) ijk : Efecto de la interacción del i-ésimo nivel del factor A con el j-ésimo nivel del

factor B y el k-ésimo nivel del factor C

З ijkl : Error aleatorio

Al existir diferencias estadísticamente significativas al 95% de confianza, se utilizó la

prueba de intervalos múltiples de Duncan, para comparar las medias de los diferentes

tratamientos.

3.2.1.3 Crecimiento radial del micelio La segunda variable cuantificable que se estableció como variable respuesta fue el

crecimiento radial que presentó el micelio inoculado en un medio estacionario. Para

determinar las diferencias en esta variable respuesta, se estableció un análisis de

varianza (ANDEVA) con diseño bifactorial, que incluyó las siguientes variables de entrada:

tipo de hongo y presencia o ausencia de nutrientes adicionales N-P-K. El cuadro Nº 5

especifica los ensayos realizados para evaluar el crecimiento radial de los hongos en

estudio, con sus respectivas repeticiones.

Cuadro Nº 5: Resumen de ensayos para evaluar el crecimiento radial

Nº Nºcultivo Repeticiones

1 52 5

Subtotal (un hongo) 10Total (dos hongos) 20

De esta manera se tiene un conjunto de 2 x 2 = 4 tratamientos distintos, con cinco

repeticiones de cada uno. El modelo general asociado a este diseño experimental, donde

el factor A corresponde a tipo de hongo, el factor B corresponde a presencia o ausencia

de nutrientes adicionales, es:

Y ijl = µ + α i + β j + (αβ) ij + З ijkl

Con i = 1,…, a (a=2)

j = 1,…, b (b=2)

l = 1,…, n (n=5)

Donde:

Y ijl : l-ésima observación de crecimiento radial de micelio para el tratamiento (i,j)

µ : Efecto de la media

α i : Efecto principal causado por el i-ésimo nivel del factor A (tipo de hongo)

β j : Efecto principal causado por el j-ésimo nivel del factor B (presencia o ausencia de

nutrientes adicionales)

(αβ) ij : Efecto de la interacción del i-ésimo nivel del factor A con el j-ésimo nivel del factor

B

З ijkl : Error aleatorio

Al existir diferencias estadísticamente significativas al 95% de confianza, se utilizó la

prueba de intervalos múltiples de Duncan, para comparar las medias de los diferentes

tratamientos.

3.2.1.4 Capacidad enzimática La capacidad enzimática fue la última variable cuantificable que se estableció como

variable respuesta para determinar la eficacia de los medios líquidos formulados. Para

determinar las diferencias en esta variable respuesta, se estableció un análisis de

varianza (ANDEVA) con diseño bifactorial, que incluyó las siguientes variables de entrada:

tipo de hongo y presencia o ausencia de nutrientes suplementarios N-P-K. El cuadro Nº

6 especifica los ensayos realizados para evaluar la capacidad enzimática de los hongos

en estudio, con sus respectivas repeticiones.

Cuadro Nº 6: Resumen de ensayos para evaluar la capacidad enzimática

Nº Nºcultivo Repeticiones

1 52 5

Subtotal (un hongo) 10Total (dos hongos) 20

De esta forma se tiene un conjunto de 2 x 2 = 4 tratamientos distintos, con cinco

repeticiones de cada uno. El modelo general asociado a este diseño experimental, donde

el factor A corresponde a tipo de hongo, el factor B corresponde a presencia o ausencia

de nutrientes adicionales, es:

Y ijl = µ + α i + β j + (αβ) ij + З ijkl

Con i = 1,…, a (a=2)

j = 1,…, b (b=2)

l = 1,…, n (n=5)

Donde:

Y ijl : l-ésima observación de capacidad enzimática para el tratamiento (i,j)

µ : Efecto de la media

α i : Efecto principal causado por el i-ésimo nivel del factor A (tipo de hongo)

β j : Efecto principal causado por el j-ésimo nivel del factor B (presencia o ausencia de

nutriente)

(αβ) ij : Efecto de la interacción del i-ésimo nivel del factor A con el j-ésimo nivel del factor

B

З ijkl : Error aleatorio

Al existir diferencias estadísticamente significativas al 95% de confianza, se utilizó la

prueba de intervalos múltiples de Duncan, para comparar las medias de los diferentes

tratamientos.

3.2.2 Metodología de Laboratorio

Las experiencias se realizaron en el Laboratorio de Biodeterioro y Preservación,

perteneciente al Departamento de Ingeniería de la Madera. Estas se dividen en cuatro

etapas.

3.2.2.1 Preparación del medio de cultivo inicial Para la génesis de las cepas de los hongos, se procedió a preparar un medio sólido

estacionario en discos Petri, denominado agar-malta. Su formulación corresponde a 2 g

de agar – agar y 3 g de extracto de malta, diluidos en 100 ml de agua destilada. Este fue

preparado de la siguiente manera:

En una balanza se pesaron las cantidades correspondientes de agar – agar y de extracto

de malta. Con la ayuda de una probeta se midieron 100 ml de agua destilada caliente

para la disolución de los componentes, luego se procedió a mezclar ambos componentes

y se homogeneizaron mediante agitación con una varilla de vidrio. Posteriormente se

vació en cada uno de los discos Petri de 9 cm de diametro, un volumen de 12,5 ml de

medio, el cual lentamente solidificó al enfriarse.

Una vez solidificado el medio, las placas fueron esterilizadas en autoclave a una

temperatura de 121º C y presión 15 lb/cm2 durante 20 minutos. Posteriormente se

inocularon los hongos en las placas Petri, utilizando para ello la cámara de flujo laminar.

Después de sembrados los inóculos, las placas fueron llevadas a la cámara de

incubación, a 25º C, hasta que el micelio completó la superficie de la placa, lo cual se

logró aproximadamente en 7 días. Para evitar un crecimiento excesivo, las placas fueron

colocadas en un refrigerador a una temperatura de 5º C.

3.2.2.2 Preparación de medios de cultivo líquidos En esta etapa se prepararon dos diferentes medios de cultivo líquidos, cuya composición

básica fue agua destilada y extractos de Eucalyptus globulus Labill, a un 5% de

concentración volumen/volumen, diferenciándose uno de otro en la incorporación del

complejo nutritivo N-P-K. Estos tres nutrientes se adicionaron a través de los compuestos

NaNO3, Ca (H2PO4)2 H2O y KCl respectivamente.

Los medios de cultivo líquidos fueron preparados en matraces de 500 ml, conteniendo

150 ml totales de compuesto. En el cuadro Nº 7 se presenta la concentración porcentual

de cada componente del medio de cultivo líquido.

Cuadro Nº 7: Concentración % de cada componente del medio de cultivo líquido

Nº Extracto N P Kcultivo (%) (%) (%) (%)

1 5 0 0 02 5 0,500 0,250 0,125

Para la obtención del extracto, se procedió a mezclar, en una relación 2:1 (solvente,

sustrato) los “pin chips” de Eucalyptus globulus Labill con agua caliente en un vaso de

precipitado; posteriormente se agitó la mezcla hasta que se homogenizó, y se llevó a un

baño termostático por 45 minutos aproximadamente a una temperatura de 90 º C. Una

vez transcurrido el tiempo, la mezcla se filtró con ayuda de un matraz kitasato, papel filtro

y bomba de vacío. A continuación y una vez vaciada la mezcla completamente, se

procedió a lavar los residuos de “pin chip” con 200 ml de agua destilada, la que finalmente

formó parte del extracto que aun estaba dentro del kitasato. Para obtener un extracto con

el pH apropiado (5,5 - 6), se le adicionaron algunas gotas de ácido clorhídrico 1M.

Finalmente, utilizando un rota-vapor, se llevó el extracto a una concentración del 50%

volumen/volumen.

Obtenido de esta forma el extracto, se vació la cantidad correspondiente en el matraz de

500 ml y luego se agregó agua destilada hasta completar los 150 ml requeridos. Luego de

esto, se agregó la porción de complejo nutritivo y se colocaron 2 perlitas de vidrio para

que durante la agitación del medio, el micelio inoculado permaneciera disgregado en la

solución. El matraz fue tapado con algodón y se procedió a esterilizar en autoclave a una

temperatura de 121º C y presión 15 lb/cm2 durante 20 minutos.

En la cámara de flujo laminar se sembró el medio líquido con el inóculo del hongo en

estudio. Para esto, se extrajo con un asa metálica una porción de micelio del hongo (de

aproximadamente 1 cm2 de superficie) desde el disco Petri que contenía la cepa madre

desarrollada sobre agar-malta, y se introdujo en el matraz previamente esterilizado. El

matraz se tapó con algodón y fue dispuesto en un agitador orbital para la incubación, el

cual se mantuvo a una temperatura aproximada de 25º C y con agitación constante de

150 r.p.m. durante 20 días.

3.2.2.3 Evaluación de la viabilidad de los medios de cultivo formulados

Una vez transcurridos los 20 días, se determinó la viabilidad como medio de desarrollo de

los hongos 140 y 167, de los medios de cultivo líquidos formulados según se describe en

el punto 3.2.2.2 del capítulo de Materiales y Métodos. Se procedió a tomar una muestra

de los medios, y se observó en un microscopio la presencia o ausencia de micelio. La

existencia de micelio en esta muestra fue considerada como la evidencia de la viabilidad

del medio formulado para el desarrollo de los hongos. Esta actividad permitió cumplir con

el primer objetivo específico del estudio.

3.2.2.4 Medición de variables respuesta.

• Pérdida de peso de material leñoso

La pérdida peso de material leñoso se midió a través de la degradación que causa el

micelio inoculado sobre “pin chip” de Eucalyptus globulus Labill en dos tiempos de

incubación, 30 y 45 días. En el cuadro Nº 8 se detallan los ensayos realizados para

evaluar la pérdida de material leñoso provocada por los dos hongos en estudio.

Cuadro Nº 8: Resumen de ensayos para evaluar la perdida de peso de material leñoso

Nº Tiempo de Nºcultivo incubación (días) Repeticiones

1 30 51 45 52 30 52 45 5

2040

Subtotal (un hongo)Total (dos hongos)

La preparación de cada tratamiento se realizó de la siguiente manera:

En un matraz de 500 ml se vació la cantidad de “pin chips”, a un 66% de contenido de

humedad (en base húmeda), equivalente en peso a 10 g secos. Para ello se mezcló una

parte de “pin chips” anhidro por dos partes de agua destilada. Luego, el matraz fue tapado

con algodón y se procedió a esterilizar en autoclave a una temperatura de 121º C y

presión 15 lb/cm2 durante 20 minutos.

En una campana de flujo laminar se realizó la inoculación de una alícuota de medio de

cultivo líquido. Esto se llevó a cabo extrayendo, con una pipeta 1 ml de medio de cultivo,

el que fue introducido en el matraz previamente esterilizado. El matraz se tapó con

algodón y fue llevado a la cámara de incubación a 25º C durante el tiempo de duración del

ensayo, 30 o 45 días.

Transcurrido el tiempo de tratamiento se llevó el material biodegradado a una estufa a

103º C para eliminar el agua y el micelio del “pin chips”. El porcentaje de pérdida de peso

se calculó mediante la relación:

Donde:

p.p. (%): Porcentaje de pérdida de peso

Pi: Peso anhidro inicial de “pin chips”

Pf: Peso anhidro final de “pin chips”

• Crecimiento radial del micelio La segunda forma de medir la eficacia del medio de cultivo líquido fue mediante la prueba

de crecimiento radial que presentó el micelio inoculado en un medio estacionario de

agar/malta. El cuadro Nº 9 especifica los ensayos realizados para evaluar el crecimiento

radial de los dos hongos en estudio.

Cuadro Nº 9: Resumen de ensayos para evaluar el crecimiento radial

Nº Nºcultivo Repeticiones

1 52 5

Subtotal (un hongo) 10Total (dos hongos) 20

La prueba de crecimiento radial se realizó de la siguiente manera:

Se procedió a preparar un medio sólido estacionario en discos Petri, cuya formulación fue

de 2 g de agar – agar y 3 g de extracto de malta, diluidos en 100 ml de agua destilada.

Este medio fue preparado igual que el medio descrito en el apartado 3.2.2.1, con la

diferencia que las placas Petri utilizadas para este ensayo (crecimiento radial de micelio)

eran de 15 cm de diámetro, y a cada una de ellas se le vació un volumen de 50 ml de

medio.

p.p. (%) = (Pi – Pf) x 100

Pi

Posteriormente, se procedió a la inoculación de los hongos. Se tomó, con la ayuda de un

gotario, una gota de cultivo líquido que contenía al hongo ya desarrollado, y se dejó caer

en el centro de la placa Petri con agar-malta. Una vez inoculados los hongos, las placas

se llevaron a la cámara de incubación a 25º C. Transcurridos 3 días aproximadamente, se

comenzó a medir, con una regla, diariamente su crecimiento, obteniendo así un registro

completo del desarrollo del micelio en su crecimiento radial. En la figura Nº 9 se muestra

la forma en que se midieron dos radios de crecimiento perpendiculares (R1 y R2), para

luego tener un promedio de ellos, obteniendo así un radio de crecimiento más

representativo.

Figura Nº 9: Muestra de mediciones de radios de crecimiento en placa con el hongo ya

desarrollado.

• Capacidad enzimática Para evaluar la capacidad enzimática, es decir, la producción de enzimas ligninolíticas, se

procedió a medir el radio del halo de oxidación generado por tales enzimas en un medio

sólido estacionario que hemos denominado ácido gálico. Su formulación consta de 0,5 g

de ácido gálico, 1,5 g de agar – agar y 3 g de extracto de malta, diluidos en 100 ml de

agua destilada. El cuadro Nº 10 especifica los ensayos realizados para evaluar la

capacidad enzimática de los hongos en estudio.

Cuadro Nº 10: Resumen de ensayos para evaluar la capacidad enzimática

Nº Nºcultivo Repeticiones

1 52 5

Subtotal (un hongo) 10Total (dos hongos) 20

La prueba de capacidad enzimática se realizó de la siguiente manera:

En una balanza se pesaron las cantidades correspondientes de ácido gálico, agar – agar

y extracto de malta. Con la ayuda de una probeta se midieron 100 ml de agua caliente

para la disolución de los componentes, los que se mezclaron y homogeneizaron con una

varilla de vidrio; posteriormente se procedió a vaciar en cada uno de los discos Petri un

volumen de 12,5 ml de medio, el cual lentamente solidificó al enfriarse.

Una vez solidificado el medio, las placas fueron esterilizadas en autoclave a una

temperatura de 121º C y presión 15 lb/cm2 durante 20 minutos. Posteriormente, se

procedió a la inoculación de los hongos. Se tomó, con la ayuda de un gotario, una gota de

cultivo líquido que contenía al hongo ya desarrollado y se dejó caer en el centro de la

placa Petri con el medio ácido gálico-agar-malta. Una vez inoculados los hongos, las

placas se llevaron a la cámara de incubación a 25º C. Luego, iniciado el crecimiento del

hongo, se comenzó a medir con una regla, el tamaño radial del halo de oxidación, durante

un período de 7 días. En la figura Nº 10 se muestra como se midieron dos radios

perpendiculares de halos oxidativos (R1 y R2), para luego obtener un promedio de ellos,

teniendo así un radio oxidativo más representativo.

Figura Nº 10: Muestra de mediciones de radios de halos oxidativos en placa con el hongo ya

desarrollado.

4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1 Evaluación de la viabilidad de los medios de cultivo líquidos formulados Tal como se indicó en el apartado 3.2.2.3 del capitulo Materiales y Métodos, una vez

obtenidos los potenciales medios de cultivo, estos fueron inoculados con los dos hongos

bajo estudio, procediéndose a su incubación en las condiciones descritas en el

mencionado apartado. Transcurridos 20 días de incubación, se tomó una muestra del

medio y se observó al microscopio la presencia o ausencia de micelio en este. En las

figuras 11 a la 14 se muestran las distintas vistas de los micelios en los diferentes medios

de cultivo líquidos formulados, donde “CN” significa medios de cultivo con nutrientes

adicionales y “SN” corresponde a medios de cultivo sin nutrientes adicionales.

Lente 40/0,65

Lente 10/0,30

Lente 4/0,14

Figura Nº 11: Vistas microscópicas de micelio del hongo 167-CN en medio de cultivo líquido

Lente 40/0,65

Lente 10/0,30

Lente 4/0,14

Figura Nº 12: Vistas microscópicas de micelio del hongo 167-SN en medio de cultivo líquido

Lente 40/0,65

Lente 10/0,30

Lente 4/0,14

Figura Nº 13: Vistas microscópicas de micelio del hongo 140-CN en medio de cultivo líquido

Lente 40/0,65

Lente 10/0,30

Lente 4/0,14

Figura Nº 14: Vistas microscópicas de micelio del hongo 140-SN en medio de cultivo líquido

A través de la observación de los micelios, se comprobó la viabilidad de los distintos

medios de cultivo líquidos formulados, puesto que permiten el desarrollo efectivo de los

hongos en estudio. Cabe hacer notar en este punto, que los extraíbles de Eucalyptus

globulus, incorporados a los medios de cultivo fueron obtenidos por extracción con agua

caliente y correspondieron en peso a un 4,7% de la muestra analizada, valor muy similar

al obtenido por Paz y Pérez (1999). En consecuencia, estos extraíbles, base principal de

los medios de cultivo formulados, y entre cuyos componentes se encuentran sales

orgánicas, azúcares, gomas, taninos y algunos polisacáridos (citados en la bibliografía)

son factibles de emplear en la formulación de medios de cultivo líquidos para el desarrollo

de los hongos estudiados. A través de esta prueba se cumple con el primer objetivo

específico planteado en este trabajo.

4.2 Pérdida de peso de material leñoso En el cuadro Nº 11 se muestran los resultados de la pérdida de peso de material leñoso

con sus respectivas repeticiones, para los dos hongos estudiados, en las condiciones con

y sin nutrientes adicionales N-P-K, a 30 y 45 días de ensayo.

Cuadro Nº 11: Resultados de pérdida de peso con sus respectivas repeticiones para los hongos

167 y 140 bajo las distintas condiciones de nutrientes adicionales y tiempos de ensayo.

Pérdida de Peso (%) Con Nutrientes (CN) Sin Nutrientes (SN) Tipo de hongo 30Días 45 Días 30Días 45 Días

8,00 8,75 9,74 11,72 7,30 8,88 9,79 13,17

167 8,23 9,22 10,48 11,38 8,62 9,24 10,24 11,52 8,07 8,95 11,66 11,47

Prom. (*) 8,05 9,01 10,38 11,85 7,41 12,04 8,73 10,96 7,20 14,74 9,47 11,30

140 7,39 11,50 11,10 12,80 9,63 14,03 9,86 12,07 9,87 14,49 8,83 11,95

Prom. 8,30 13,36 9,60 11,82 (*) Prom. = Promedio

Figura Nº 15: Diagrama de Pareto para pérdida de peso de material leñoso

En el diagrama de Pareto (figura Nº 15) se muestran los efectos de cada variable sobre la

pérdida de material leñoso, en donde se observa una línea paralela al eje de las

ordenadas, indicando el límite a partir del cual los factores que tienen un efecto real sobre

la variable respuesta se extienden a la derecha de ella con un 95 % de confianza.

Además el diagrama de Pareto nos entrega el orden de importancia de los efectos en la

variable respuesta, los cuales son: tiempo, interacción tipo de hongo – nutrientes,

nutrientes, interacción tipo de hongo - tiempo, tipo de hongo y la interacción tipo de hongo

– nutrientes – tiempo.

El análisis de varianza indica que el efecto causado por el tiempo de exposición de las

muestras en el ensayo pérdida de peso, es estadísticamente significativo, al considerar un

nivel de confiabilidad de un 95% (Apéndice Nº 1 y Figura Nº 15). Las pruebas Duncan

indican que a mayor tiempo de exposición son mas altos los porcentajes de degradación

(Figura Nº 16 y Apéndice Nº 2), A 45 días de exposición se obtiene una pérdida de peso

promedio de 11,51%, mientras que a 30 días se tiene un pérdida de peso promedio de

9,08%. Estos resultados son predecibles, puesto que los hongos al estar mayor tiempo en

contacto con su fuente de nutrición, consumirán mayor cantidad ella.

Figura Nº 16: Gráfico de medias para tiempo de exposición

El análisis estadístico con un nivel de confiabilidad de un 95% muestra que el efecto

causado por la ausencia o presencia de nutrientes sobre la pérdida de peso, es

estadísticamente significativo. (Apéndice Nº 1)

Los resultados de las pruebas de comparación múltiple de Duncan, nos revelan que la

ausencia de nutrientes es la mejor alternativa para un mayor porcentaje de pérdida de

material leñoso (Figura Nº 17 y Apéndice Nº 2). Este comportamiento se podría explicar

de la siguiente forma: los hongos al tener una cantidad de nutrientes adicionales

(diferentes a la madera) disueltos en el medio poseen mayores fuentes energéticas y no

energéticas, por lo tanto, no necesitan degradar material leñoso para obtener los

componentes necesarios para la obtención de su energía. Por el contrario, al no tener

nutrientes adicionales disueltos en el medio, los hongos deben degradar el material en

exposición, para acceder a su fuente energética.

9,68

10,91

9,00

9,20

9,40

9,60

9,80

10,00

10,20

10,40

10,60

10,80

11,00

11,20

Con Nutrientes (CN) Sin Nutrientes (SN)

Pérd

ida

de P

eso(

%)

Figura Nº 17: Variación de la pérdida de peso según nutrientes

Al analizar el efecto causado por el tipo de hongo sobre la pérdida de peso, se verifica

que existen diferencias estadísticamente significativas entre éstos, al considerar un nivel

de confianza de un 95%. (Apéndice Nº 1)

En la figura Nº 18 se observa que el hongo 140 logró mayor pérdida de peso de material

leñoso que el hongo 167, con un 10,77% promedio versus un 9,82% promedio

respectivamente. Esto se comprueba con la prueba Duncan entre las medias (Apéndice

Nº 2). Según este resultado, el hongo 140 es mucho más agresivo al momento de

degradar material lignocelulósico que el hongo 165, por lo tanto, suponiendo que ha

mayor degradación de material leñoso se elimina más porcentaje de lignina, el hongo 140

tendría mayor potencial de ser aplicado en el biopulpaje.

Figura Nº 18: Gráfico de medias para tipo de hongo

Las interacciones entre los efectos: Tipo de Hongo-Nutrientes, Tipo de Hongo -Tiempo y

Tipo de Hongo-Nutrientes-Tiempo; son estadísticamente significativas a un 95 % de

confiabilidad (Apéndice Nº 1).

Al observar la figura Nº 19, se puede ver que el comportamiento de los hongos frente a la

incorporación de nutrientes adicionales es distinto: mientras que al hongo 167 lo inhiben

en su comportamiento degradativo, al hongo 140 prácticamente no lo afectan. Esto quiere

decir que el hongo 167, al tener mayor presencia de nutrientes adicionales en el medio,

prefiere tomarlos para su metabolismo y deja en segundo plano la degradación del

material leñoso para obtener su energía, en cambio, el hongo 140 continúa con su

comportamiento degradativo de material leñoso aún con la incorporación de nutrientes

adicionales al medio. Por lo tanto, el metabolismo del hongo 140 es más estable frente a

la incorporación de nutrientes adicionales en comparación al hongo 167.

Figura Nº 19: Variación de la pérdida de peso con la interacción entre tipo de hongo y nutrientes

Figura Nº 20: Variación de la pérdida de peso con la interacción entre tipo de hongo y tiempo

Para ambos hongos, el mejor tiempo de exposición de los “pin chips” para su degradación

es de 45 días (Figura Nº 20). Los niveles de degradación de material leñoso en los

primeros 30 días de incubación son muy similares para ambos hongos, sin embargo, en

los siguientes 15 días de incubación, el grado de pérdida de peso adicional alcanzado por

del hongo 140 (3,64%, entre el día 31 y el 45) es tres veces más alta que el obtenido con

el hongo 167 (1,21%). Puede decirse entonces que el hongo 140, una vez transcurridos

los 30 días de incubación, posee un sistema degradador de material madera más potente

y/o efectivo que los días anteriores, y también que el del hongo 167.

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

14,00

16,00

30 Días 45 Días

TIEMPO (días)

PÉR

DID

A D

E PE

SO % 167-CN

167-SN140- CN140- SN

Figura Nº 21: Pérdida de peso (%) promedio en los dos tiempos de exposición, por tipo de hongo y

con presencia o ausencia de nutrientes adicionales.

En la figura Nº 21 se puede observar la mejor combinación para la variable pérdida de

peso de material leñoso, entre los factores tipo de hongo, ausencia o presencia de

nutrientes adicionales y tiempo de ensayo. Esta interacción se logra con el hongo 140,

con nutrientes suplementarios y 45 días de exposición, con un 13,36% de pérdida de

peso, seguido por la combinación hongo 167, sin nutrientes y 45 días de incubación,

logrando un 11,85%, y muy cercanamente el 11,82% obtenido por la interacción del

hongo 140, sin nutrición adicional y a 45 días de exposición. Esto comprueba que a

mayores tiempos de incubación se produce una mayor biodegradación de material leñoso.

Además, el hongo 140 es más degradador de material lignocelulósico que el hongo 167,

siendo el comportamiento de ambos hongos frente a los nutrientes adicionales totalmente

antagónico. Estos antecedentes nos permitirían elegir al hongo 140 como la mejor opción

frente al hongo 165, al momento de ser aplicados en el biopulpaje.

4.3 Crecimiento radial de micelio En el cuadro Nº 12 se muestran los resultados, con sus respetivas repeticiones, de

crecimiento radial miceliar (mm), para los dos hongos estudiados, en las condiciones con

y sin nutrientes adicionales.

Cuadro Nº 12: Resultados de crecimiento radial de micelio (mm) para los hongos 167 y 140, bajo

distintas condiciones de nutrición con sus respectivas repeticiones.

Crecimiento Radial de Micelio (mm) Tipo hongo Con Nutrientes (CN) Prom. Sin Nutrientes (SN) Prom.

167 8,25 8,79 8,71 9,33 8,21 8,66 8,58 8,38 8,25 8,58 8,46 8,45 140 8,21 8,63 8,5 8,08 7,92 8,27 7,92 7,88 8,21 8,17 8,17 8,07

Figura Nº 22: Diagrama de Pareto para crecimiento radial de micelio

El principal efecto sobre el crecimiento radial de micelio es el tipo de hongo, lo que se

comprueba con el análisis de varianza, a una confiabilidad del 95% (Apéndice Nº 3). Esto

se observa claramente en el diagrama de Pareto para crecimiento radial de micelio

(Figura Nº 22). Los resultados de comparación de medias de Duncan (Apéndice Nº 4),

nos indican que el hongo de más rápido crecimiento es el hongo 167, con 8,56 mm.

promedio de crecimiento diario, versus 8,17 mm. promedio de crecimiento diario para el

hongo 145 (Figura Nº 23 y Cuadro Nº 12). En experiencias realizadas en el laboratorio de

Biodeterioro y Preservación de la Madera, perteneciente al Departamento de Ingeniería

de la Madera de la Facultad de Ciencias Forestales de la Universidad de Chile, se han

encontrado similares resultados, donde el hongo 167 tiene un crecimiento mayor que el

hongo 140. Esta prueba nos muestra que el hongo 167 posee una mayor colonización en

superficie del medio, que el hongo 140, por lo tanto, si se desea un hongo que se

expanda más rápido en la superficie de la pila de “chips”, la mejor alternativa es el hongo

167.

Figura Nº 23: Gráfico de medias para tipo de hongo

En cuanto al efecto de los nutrientes adicionales y la interacción de los efectos tipo de

hongo y nutrientes suplementarios, no poseen un efecto estadísticamente significativas,

sobre la variable respuesta crecimiento radial miceliar. (Apéndice Nº 3 y Figura Nº 22)

En las siguientes figuras (Nº 24 y Nº 25) se muestran los crecimientos logrados por los

distintos hongos, donde cada uno de ellos provenía de medios de cultivo con nutrientes

adicionales N-P-K o sin ellos. En ellas se puede observar, sin mayores diferencias, que

ambos hongos en estudio crecieron normalmente en los medios estacionarios agar/malta.

167 – CN (medio con nutrientes adicionales)

167 – SN (medio sin nutrientes adicionales)

Figura Nº 24: Crecimiento radial logrado por el hongo 167 proveniente de dos medios distintos.

140 – CN (medio con nutrientes adicionales)

140 – SN (medio sin nutrientes adicionales)

Figura Nº 25: Crecimiento radial logrado por el hongo 140 proveniente de dos medios distintos

En la figura Nº 26, se puede observar que el hongo que mejor se comporta en su

crecimiento radial a lo largo del tiempo es el hongo 167, tanto con como sin nutrientes

adicionales. Esto podría deberse a que el hongo 167 posee en su genética una capacidad

de crecimiento y generación de micelio mayor que la del hongo 140, ya que ambos

hongos fueron sembrados sobre el mismo medio (agar-malta) y tuvieron las mismas

condiciones de incubación.

0

10

20

30

40

50

60

70

Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7

TIEMPO (días)

CR

ECIM

IEN

TO R

AD

IAL

(mm

)

167- CN167- SN140- CN140- SN

Figura Nº 26: Crecimiento radial (mm) a través del tiempo, por tipo de hongo y con presencia o

ausencia de nutrientes adicionales.

4.4 Capacidad enzimática En el cuadro Nº 13 se muestran los resultados, con sus respectivas repeticiones, de la

capacidad enzimática mostrada a través del crecimiento radial del halo de oxidación (mm)

para los dos hongos estudiados, en las condiciones con y sin nutrientes adicionales

Cuadro Nº 13: Resultados de capacidad enzimática de micelio (mm) para los hongos 167 y 140,

bajo distintas condiciones de nutrición con sus respectivas repeticiones.

Capacidad enzimática de micelio (mm) Tipo hongo Con Nutrientes (CN) Prom. Sin Nutrientes (SN) Prom.

167 3,53 3,48 3,53 3,57 3,32 3,48 3,42 3,58 3,67 3,96 4,33 3,79 140 3,38 3,25 3,04 4 3,29 3,39 2,83 3,04 3,27 3,38 3,48 3,2

Figura Nº 27: Diagrama de Pareto para capacidad enzimática

El análisis de varianza (Apéndice Nº 5) y el diagrama de Pareto (Figura Nº 27) indican que

el efecto causado por el tipo de hongo sobre la variable respuesta capacidad enzimática,

es estadísticamente significativo, al considerar un nivel de confiabilidad de un 95%. Con

las pruebas Duncan se demuestra que el hongo con mayor vigor en esta prueba es el

hongo 167, con 3,64 mm de tamaño radial promedio del halo, por sobre los 3,3 mm que

logró el hongo 140 (Figura Nº 28 y Apéndice Nº 6). Esto estaría demostrando que el

hongo 167 posee un sistema enzimático oxidativo más activo que el hongo 140. Dado que

las enzimas fúngicas del tipo ligninolíticas pertenecen fundamentalmente al tipo oxidativo,

y que una de los efectos que se persiguen en el biopulpaje es la degradación de la lignina

por el hongo, la cepa 167 sería una mejor alternativa para su utilización en este

bioproceso.

Figura Nº 28: Gráfico de medias para tipo de hongo

En las siguientes figuras (Nº 29 y Nº 30) se muestran las capacidades enzimáticas

logradas por los distintos hongos, donde cada uno de ellos provenía de medios de cultivo

con nutrientes adicionales N-P-K o sin ellos. Se puede observar un oscurecimiento en

todos los medios, lo que índica una oxidación de los mismos causada por la actividad

enzimática extracelular de los dos hongos en estudio.

167 – CN (medio con nutrientes adicionales)

167 – SN (medio sin nutrientes adicionales)

Figura Nº 29: Capacidad enzimática lograda por el Hongo 167 proveniente de dos medios distintos

140 – CN (medio con nutrientes adicionales)

140 – SN (medio sin nutrientes adicionales)

Figura Nº 30: Capacidad enzimática lograda por el Hongo 140 proveniente de dos medios distintos

En la figura Nº 31 se observa que el mejor comportamiento en relación a la capacidad

enzimática, se logró con el hongo 167 y en ausencia de nutrientes adicionales, lo cual es

muy importante para esta investigación, puesto que la ausencia de nutrientes

suplementarios permite una disminución en los costos de producción de inóculos.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7

TIEMPO (días)

RA

DIO

HA

LO (m

m )

167- CN

167- SN

140- CN

140- SN

Figura Nº 31: Capacidad enzimática (mm.) a través del tiempo, por tipo de hongo con presencia o

ausencia de nutrientes adicionales

Es importante mencionar que el hongo 167 fue la cepa que presentó, en promedio, la

menor pérdida de peso de material leñoso en comparación al hongo 140. Esto indicaría

que los sistemas enzimáticos de ambos hongos son distintos, puesto que el hongo 140, al

degradar más material lignocelulósico y poseer menor actividad enzimática oxidativa,

presentaría menor selectividad frente a la lignina, biodegradando entonces material

holocelulósico, lo cual es un efecto no deseado en relación a su potencial aplicación en el

biopulpaje.

Por lo anteriormente expuesto se recomienda realizar un estudio más acabado y

específico frente a las enzimas generadas por estos hongos (140 y 167), para así

dilucidar qué tipos de enzimas son producidas al momento de biodegradar la madera.

Paralelamente, es necesario realizar un análisis químico de la madera biodegradada, con

el objeto de identificar cuáles de sus componentes son principalmente afectados por la

acción fúngica.

6 CONCLUSIONES Los dos tipos de medio cultivo elaborados permiten el desarrollo adecuado de los hongos

de pudrición blanca ensayados (cepas 167 y 140).

En cuanto a la biodegradación de la madera causada por los hongos en estudio, existen

diferencias significativas en sus efectos, siendo un poco más agresivo el hongo 140, con

un 10,77% de pérdida de peso promedio versus un 9,82% promedio para el hongo 167.

Ambos hongos logran una mayor biodegradación a los 45 días de exposición de los “pin-

chips”.

La condición de ausencia de nutrientes adicionales en los medios de cultivo provee, con

ambos hongos, un mejor resultado en la pérdida de peso, con una diferencia de 1,23% de

pérdida de material leñoso sobre la presencia suplementaria de nutrientes. Sin embargo,

la adición de nutrientes adicionales al medio, tiene un efecto distinto en los hongos

estudiados; mientras que el hongo 140 mantiene su tasa de degradación en el tiempo, por

el contrario, el hongo 167 la disminuye.

Existen diferencias en cuanto al crecimiento radial miceliar de los hongos ensayados,

siendo en promedio el de la cepa 167 un 5% superior al obtenido con la cepa 140.

En relación a la capacidad enzimática, el hongo 167 desarrolla un halo de oxidación más

amplio en comparación al hongo 140, con radios promedio de 3,64 mm y 3,3 mm

respectivamente.

En general, todas las pruebas realizadas (pérdida de peso de material leñoso, crecimiento

radial de micelio y capacidad enzimática), muestran que la ausencia de nutrientes

adicionales constituye la mejor opción con miras al biopulpaje. Sin embargo, existen

diferencias de comportamiento entre ambos hongos estudiados ante esta alternativa,

puesto que al hongo 140 lo estimulan en su comportamiento, mientras que por el

contrario, al hongo 167 lo inhibe en su acción.

Si bien es cierto, la cepa 140 fue la que, en general, produjo mayores niveles de pérdida

de peso de material leñoso que la cepa 167, presentó a su vez menor crecimiento radial y

menor capacidad enzimática oxidativa. Esto indicaría que, muy probablemente, la acción

biodegradativa del hongo 140 es menos selectiva sobre la lignina que la del hongo 167.

7 BIBLIOGRAFÍA AKHTAR, M.; KIRK, T. K. y BLANCHETTE, R. A. 1996. Biopulping: An overview of

consortia research. En: PROCEEDINGS OF 6th International conference on Biotechnology

in the Pulp and Paper Industry: Advances in Applied and Fundamental Research. pp. 187

– 192. AKHTAR, M.; BLANCHETTE, R.; KENT, T. 1997. Advances in Biochemical

Engineering/ Biotechnology, "Fungal Delignification and Biomechanical Pulping of wood".

Vol 57: 159-195. AKHTAR, M.; SCOTT, G.; SAWNEY, R. Y KIRK, T. 1998. Overview of biomechanical and

biochemical pulping research. In: ERIKSSON, K. y CAVACO-PAULO, A. (Eds.) Enzyme

applications in fiber processing. Ed. American Chemical Society, Washington DC.E.E.U.U.

pp. 15 – 26. (ACS symposium series).

ASHTER, M. ; TONON, F. ; COIRREAU,G. and ODIER, E.1988. Biochemistry and

genetics of cellulose degradation. Aubert JP, Beguin P y Millet J (eds.) Academic, London.

BLANCHETTE, R.; BEHRENDT, C.; WILLIAMS, D. y IVERSON, S. 1998. A new approach

to effective biopulping: treating logs with Phlebiopsis gigantean. In:7 th INTERNATIONAL

conference on biotechnology in pulp and paper industry .Hyatt Regency Hotel. Vancouver,

BC Canada. pp. s.p. (oral presentations Vol.A)

BUSWELL, J.A. and ODIER, E. 1987. Lignin Biodegradation . CRC Crit. Rev.

Biotechnol.6:1-60

CHEN, Y.; SCHMIDT, E. y OLSEN, K. 1999. A bipulping fungus in compression-baled,

nonsterile green pine chips enhancing Kraft and refiner pulping. Wood and Fiber Science,

31(4): 376 – 384.

COLLINS, P. y DOBSON A. 1997. Regulation of laccase gene transcription in Trametes

versicolor . Microbiology Departament, University College, Cork, Ireland.

CONSUEGRA, R.1994. Caracterización del Eucalyptus globulus (Labill) como materia

prima pulpable. Memoria, Ingeniería Forestal. Universidad de Chile. Santiago, chile.93p.

DIAZ - VAZ, J.E. 2003. Anatomía de Maderas. Facultad de Ciencias Forestales,

Universidad Austral de Chile, Valdivia. Chile. 150p.

DONOSO, J. GONZALEZ, J. DONOSO, J. 1999. Influence of ecological factors in the

behavior of white decay fungi. Appita 53 (1) 75-84. New Zealand.

EATON, R., HALE, M. 1993. Wood. Decay, Pests and Protection. Chapman Hall, London.

546 p.

EGGERT, C., TEMP, U., and ERIKSSON K. E. 1996. The ligninilytic system of the white

rot fungis Pycnoporus cinnabarinus: purification and characterization of the laccase.

Department of Biochemistry and Molecular Biology and Center for Biological Resource

Recovery, University of Georgia.

ERIKSSON, K. E., BLANCHETTE, R. A., and ANDER, P., 1990. Microbial and enzimatic

degradation of wood and wood components.

GARZILLO, A.M.; COLAO, M.C.;CARUSO, C.; CAPORALE, C.; CELLETI, D. and

BUONOCORE, V. 1998. Laccase from white-rot fungus Trametes troggi. Dipartimento di

Agrobiologia e Agrochimica, Universita della Tucsia, Via San Camillo de Lellis, 01100

Viterbo, Italy.

GLENN, J. ; MORGAN, M. ; MAYFIELD, M. ; KUWAHARA, M. and GOLD, M. 1983. An

extracellular H2O2 requiring enzyme preparation involved in lignin biodegradation by the

white-rot basidiomycete Phanerochaete chrysosporium. Biochemical and Biophysical

Resume.

GOLD, M. ; WARIISHI, H. ; and VALLI, K.1989. Extracellular peroxidases involved in lignin

degradation by the white-rot basidiomycete Phanerocahete chryososporium. Biocatalysis

in Agricultural Biotechnology. American Chemical Society.

GOMEZ, A. 1995. Evaluación de la biodegradación de la lignina de Pinus Radiata D. Don

alterada por la acción de hongos de pudrición blanca y su efecto en el pulpaje Kraft. Tesis

de Magíster en Ciencias Forestales. Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales.

Universidad de Chile. Santiago. 83 p.

GONZALEZ, J.; DE LA MAZA, C. y ALEXANDROFF, M. 1996. Coeficientes de

contaminación generados por la industria forestal en Chile. In: ACTAS VII reunión de

investigación y desarrollo de productos forestales. Parque Feria FISA. Santiago.

Programa bosque nativo, D.T.I., U. de Chile, manufacturera de Fibropaneles Trupan S.A.

472 p.

GONZÁLEZ, J.; DONOSO, J. 1999. Biopulping in Radiata pine and Eucalyptus globulus.

32° Congreso Anual de Celulosa y Papel. ABTCP. Sao Paulo, Brasil.

GONZÁLEZ, J.; DONOSO, J.; ALLISON, B.; VALENZUELA, C. 2001. Biotechnologies for

Kraft pulp production: results of experiences in Chile and future perspectives. Revue ATIP

55 (5) :14-17.

GONZÁLEZ, J. 2003. Pulp and Paper Industry and the Environment: Prospects of

Biotechnology. Societies and Environments. World Forest, Markets and Policies.

GRANADOS, R ; VILLAVERDE , M. 1997. Microbiología. Editorial Paraninfo. España. 355

p.

HIGHLEY, K. and DASKEK, W. 1998. Biotechnology in the study of brown and white rot

decay. In: Bruce, A. & Palfeyram, J. (eds), Forest Product Biotechnology. pp 15 – 33

HILLIS, W. E. 1978. Wood quality and utilization in: W.E. Hillis and A.G. Brown (editors)

Eucalytus for wood production CSIRO Australia. 434 p.

INFOR.1986. Especies forestales exóticas de interés económico para Chile.168p.

JOHANSSON T. y NYMAN P. 1993. Isozymes of lignin peroxidase and manganese

peroxidase from white-rot basidiomycete Trametes versicolor. Department of

Biochemistry, Chemical Center, University of Lund, s-221 00 Lund, Sweden.

KAAL, E., FIELD, J., and JOYCE, T. 1995. Increasing ligninolytic enzyme activities in

several white rot basidiomycetes by nitrogen – sufficient media. College of Forest

Resources, Department of Wood and Paper Science, North Carolina State University,

Raleigh. USA.

KIRK, T. K. ; SCHULTZ, E.; CONNORS, W.; LORENTZ,L. and ZEIKUS, J. 1978. Influence

of culture parameters on lignin metabolism by Phanerochaete chrysosporium. Arch.

Microbiology.

KIRK, T.K. and SHIMADA, M. 1985. Lignin biodegradation: The microorganism involved

and the physiology and biochemistry of degradation by white-rot fungi. En: Biosynthesis

and Biodegradation of Wood Components, Higuchi, T. (eds.) Uni. Tokyo.

KIRK, T. K. ; CROAN, S. ; TIEN, M.; MURTAGH, K. and FARRELL, R. 1986. Production of

multiple ligninase by Phanerochaete chrysosporium, selected growth conditions and use of

a mutant strain. Enzyme Microbiol Technology

LIBBY, C., EARL. 1967. Ciencia y Tecnología sobre Pulpa y Papel. Editorial Continental,

México, 2 vol

MANSILLA, H., GARCIA, R., TAPIA, J., DURAN, H., URZUA, S. 1991. Chemical

characterization of Chilean hardwoods. Word Sci. Technol. Vol 25 : 145- 149

MESSNER, K.; KOLLER, K.; WALL, M.; AKHTAR, M Y SCOTT, G. 1998. Fungal

treatment of wood chips for chemical pulping. In: YOUNG, R. y AKHTAR, M. (Eds.).

Environmentally friendly technologies for the pulp and paper industry. John Wiley & Sons,

Inc. pp. 385 – 419.

MUÑOZ, C.; GUILLÉN F.; MARTINEZ, A.T.; y MARTINEZ, M.J. 1996. Induction and

characterization of laccase in the ligninolytic Fungus Pleurotus eryngii. Departamento de

Microbiología Molecular, Centro de Investigaciones Biológicas, Consejo Superior de

Investigaciones Científicas, Velásquez 144, E-28006 Madrid, Spain.

NERUD, F.; ZOUCHOVA, Z. and MISURCOVA, Z.1991. Ligninolytic properties of different

white rot fungi. Biotech.Lett.13: 657-660.

ORIARAN, T.; LABOSKY, P. y BLAKENHORN, P. 1991. Kraft pulp and papermaking

properties of Phanerochaete chrysosporium degraded red oak. Wood and Fiber Science

23 (3): 316 – 327.

PALMIERI, G.; GIARDINA, P.; BIANCO C.; FONTANELLA B.; and SANNIA GIOVANNI.

1999. Copper induction of laccase isoenzymes in the ligninolytic fungus Pleurotus

ostreatus. Dipartamento di Chimica Organica e Biologica, Università di Napoli Federico II,

Naples, Italy.

PANSHIN. A.J., DE- ZEEUW, C. 1970. Textbook of wood technology, vol 1, third esdition,

structure, identification, uses y properties of the commercial woods of the United States

and Canada. Mc Graw Hill series in foresta resources. E.E.U.U. 652p.

PAZ, J., PEREZ, L. 1999. Análisis comparativo de las propiedades microscópicas y

microscópicas de la madera de Eucalyptus nitens y Eucalyptus globulus. En: Silvotecna

XII. Realidad potencial del Eucalyptus en Chile: cultivo silvicola y su uso industrial, parque

Jorge Alessandri, 26 – 28 de agosto 1999. Concepción, Chile. 219-319p.

PEREDO, M. 1999. Propiedades de la madera y aptitud pulpable de algunas especies de

Eucalyptus cultivados en Chile. En: Silvotecna XII. Realidad potencial del Eucalyptus en

Chile: cultivo silvicola y su uso industrial, parque Jorge Alessandri, 26 – 28 de agosto

1999. Concepción, Chile. 221-327 p.

PRADO, J. y BARROS, S. 1991. Eucalyptus: Principio de Silvicultura y Manejo. Instituto

Forestal. Corporación de Fomento de la Producción. Santiago. Chile. 90p.

REDDY, C.A. 1992. An overview of the recent advances of the physiology and molecular

biology of lignin peroxidases of Phanerocahete chryososporium. Department of

Microbiology and Public Health and the NSF Center for Microbial Ecology, Michigan State

University, East Lansing, MI, USA.

REINHAMMAR, B. and MALMSTROM, B. 1981 Blue copper-containing oxidadses. En:

Copper proteins. Metal ions biology: Vol 3. Spiro TG. (eds.) . John Wiley and Sons. New

York.

SANDHU, D. and ARORA, D.1984. Laccase production by Polyporus Sanguineus under

nutritional and environmental conditions. Department of Biology, Guru Nanak Dev

University, Amritsar-143005.India.

SHIN, K. y KIM, C. 1998. Properties of laccase purified from nitrogen limited culture of

white rot fungus Coriulus hirsutus. Department of Microbiology, College of Sciences,

Taejon 300-716 and Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, Taejon

305-600, Korea.

SHUTTLEWORTH, K. L.; POSTIE L. y BOLLAN J. 1986. Production of induced laccase by

the fungus Rhizoctonia praticola. Laboratory of Soil Microbiology, Department of

Agronomy. The Pennsylvania State University. University Park, PA, USA.

SILVA, R. 2002a. Antibiosis entre hongos lignívoros y hongos antagónicos para efecto del

biopulpaje de madera de Pinus radíata. Memoria Ingeniero Forestal. Universidad de Chile.

120 p.

SILVA, R. 2002b. Obtención de enzimas lignolíticas producidas por hongos

basidiomicetos. Evaluación de su aplicación al blanqueo de pulpas de madera. Tesis

Doctoral. Universidad Politécnica de Madrid. Madrid, España. 211 p.

SILVA, R. 2006. Industrias de Celulosa y Papel: Calidad, Medioambiente y Biotecnología.

En: Ambiente Forestal. Revista extensión Vol 1, Nº 1. Facultad de Ciencias Forestales

Universidad de Chile.

SCOTT, G.; LENTZ, M.; AKHTAR, M.; SYKES, M. and ABUBAKR, S. 1995.

Environmental aspects of biosulfite pulping. In: PROCEEDINGS OF 1995 international

environmental conference; 1995 May 7-10; Atlanta, GA. TAPPI PRESS: 1155 – 1161.

Book 2.

SCOTT, G.; LENTZ, M.; AKHTAR, M.; HORN, E.; SWANEY, R. and SHIPLEY, D. 1998a.

Incorporating biopulping technology into wood yard operations. 9p.

SCOTT, G.; LENTZ, M.; AKHTAR, M. and SWANEY, R. 1998b. Engineering, scale-up and

economics aspects of fungal pretreatement of woods chips. In: YOUNG, R. y AKHTAR, M.

(Eds.). Environmentally friendly technologies for the pulp and paper industry. John Wiley &

Sons, Inc. pp. 341 – 383.

SZKLARZ, G. D.; ANTIBUS, R. K.; SINSABAUGH R. L. y LINKINS A. L. 1989. Production

of phenol oxidases and peroxidases by Wood-rotting fungi. Biology Department, Clarkson

University, Potsdam, New York 13676. USA.

TAPIA, J. 1994. Efecto del Nitrógeno sobre la Mineralización de Lignina por el Hongo

Ceriporiopsis subvermispora. Trabajo de Graduación Licenciado en Bioquímica.

Universidad de Santiago de Chile. 90 p.

TIEN, M. and KIRK, T.K. 1984. Ligning-degrading enzyme from Phanerochaete

chrysosporium: Purification, characterization, and catalytic properties of a unique H2O2 –

requiring oxygenase. National Academy of Science. USA.

VARES, T. and HATAKKA, A. 1997. Lignin-degrading activity and lygninolytic enzimes of

different white rot fungi: effects of manganese and malonate. Department of Applied

Chemistry and Microbiology. University of Helsinki, Finland.

VAZQUEZ, A. 2002. Medios de cultivo, otro logro de BIOCEN. [en

línea] < http://www.elhabanero.cubaweb.cu > [consulta: 20 diciembre 2004]

VIAL, G. 1989. Comportamiento de las pulpas obtenidas a partir de Pinus radiata D.Don

mediante prensado húmedo estático. Memoria Ingeniería Forestal. Santiago, Universidad

de Chile, Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales.

VITA, A. 1990.Establecimiento y manejo de especies vegetales aptas para su utilización

como fuentes de energía. Centro de estudio de zonas áridas. Facultad de Ciencias

Agrarias y Forestales.Universidad de Chile. 66p.

WALL, M. B., BRECHER, J., FRITZ, AL., IERSON, S. and NOEL, 1994. Catarpip

treatment of wood chips to improve chemical pulping efficiency. Biological Sciences

Symposium, Wisconsin, U.S.A., p 67-76.

WUYEP, P., KHAN, A., NOK, A. 2003. Production and regulation of lignin degrading

enzymes from Lentinus squarrosulus (mont.) Singer and Psathyrella atroumbonata Pegler.

African Journal of Biotechnology. Vol 2 (11). pp 444 – 447.

ZAID, L.2004. Estudio del Biodeterioro en madera de Eucalyptus globulus Lab. por el

Método Gravimétrico. Memoria Ingeniero de la Madera. Universidad de Chile. 65 p

ZABEL, R. Y MORRELL, J. 1992. Wood Microbiology. Decay and its prevention. Chapter

8 and 9. Harcourt Brace Jovanovich Publishers. Academic Press, Inc. USA. 476 pp.

APÉNDICES

APENDICE Nº 1 ANALISIS DE VARIANZA PARA PÉRDIDA DE PESO

Análisis de la Varianza paraPÉRDIDA DE PESO % - Sumas de Cuadrados de Tipo III--------------------------------------------------------------------------------Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado Medio Cociente-F P-Valor--------------------------------------------------------------------------------EFECTOS PRINCIPALES A:TIPO DE HONGO 8,96809 1 8,96809 10,47 0,0028 B:NUTRIENTES 15,2276 1 15,2276 17,79 0,0002 C:TIEMPO 58,9518 1 58,9518 68,86 0,0000

INTERACCIONES AB 18,4145 1 18,4145 21,51 0,0001 AC 14,6652 1 14,6652 17,13 0,0002 BC 3,41056 1 3,41056 3,98 0,0545 ABC 7,00569 1 7,00569 8,18 0,0074

RESIDUOS 27,397 32 0,856155--------------------------------------------------------------------------------TOTAL (CORREGIDO) 154,04 39--------------------------------------------------------------------------------Los cocientes F están basados en el error cuadrático medio residual.

APENDICE Nº 2 CONTRASTE DE MUESTRAS MÚLTIPLES DUNCAN PARA PÉRDIDA DE PESO

Contraste Múltiple de Rangos DUNCAN para PÉRDIDA DE PESO % según TIPO DE HONGO

--------------------------------------------------------------------------------Método: 95,0 porcentaje LSDTIPO DE HONGO Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos--------------------------------------------------------------------------------167 20 9,8215 0,2069 X 140 20 10,7685 0,2069 X--------------------------------------------------------------------------------Contraste Diferencias +/- Límites--------------------------------------------------------------------------------140 - 167 *0,947 0,59601 --------------------------------------------------------------------------------* indica una diferencia significativa. Contraste Múltiple de Rangos DUNCAN para PÉRDIDA DE PESO % según NUTRIENTES

--------------------------------------------------------------------------------Método: 95,0 porcentaje LSDNUTRIENTES Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos--------------------------------------------------------------------------------SI 20 9,678 0,2069 X NO 20 10,912 0,2069 X--------------------------------------------------------------------------------Contraste Diferencias +/- Límites--------------------------------------------------------------------------------NO - SI *1,234 0,59601 --------------------------------------------------------------------------------* indica una diferencia significativa. Contraste Múltiple de Rangos DUNCAN para PÉRDIDA DE PESO % según TIEMPO

--------------------------------------------------------------------------------Método: 95,0 porcentaje LSDTIEMPO Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos--------------------------------------------------------------------------------30 20 9,081 0,2069 X 45 20 11,509 0,2069 X--------------------------------------------------------------------------------Contraste Diferencias +/- Límites--------------------------------------------------------------------------------30 - 45 *-2,428 0,59601 --------------------------------------------------------------------------------* indica una diferencia significativa.

APENDICE Nº 3 ANALISIS DE VARIANZA PARA CRECIMIENTO RADIAL Análisis de la Varianza paraCREC RADIAL mm - Sumas de Cuadrados de Tipo III--------------------------------------------------------------------------------Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado Medio Cociente-F P-Valor--------------------------------------------------------------------------------EFECTOS PRINCIPALES A:TIPO DE HONGO 0,741125 1 0,741125 8,72 0,0094 B:NUTRIENTES 0,206045 1 0,206045 2,42 0,1391

INTERACCIONES AB 0,000125 1 0,000125 0,00 0,9699

RESIDUOS 1,36056 16 0,085035--------------------------------------------------------------------------------TOTAL (CORREGIDO) 2,30786 19--------------------------------------------------------------------------------Los cocientes F están basados en el error cuadrático medio residual.

APENDICE Nº 4 CONTRASTE DE MUESTRAS MÚLTIPLES DUNCAN PARA CRECIMIENTO RADIAL

Contraste Múltiple de Rangos DUNCAN para CREC RADIAL mm según TIPO DE HONGO

--------------------------------------------------------------------------------Método: 95,0 porcentaje LSDTIPO DE HONGO Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos--------------------------------------------------------------------------------140 10 8,169 0,0922144 X 167 10 8,554 0,0922144 X--------------------------------------------------------------------------------Contraste Diferencias +/- Límites--------------------------------------------------------------------------------140 - 167 *-0,385 0,276459 --------------------------------------------------------------------------------* indica una diferencia significativa.

APENDICE Nº 5 ANALISIS DE VARIANZA PARA CAPACIDAD ENZIMÁTICA Análisis de la Varianza paraCAP ENZIMÁTICA mm - Sumas de Cuadrados de Tipo III--------------------------------------------------------------------------------Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado Medio Cociente-F P-Valor--------------------------------------------------------------------------------EFECTOS PRINCIPALES A:TIPO DE HONGO 0,588245 1 0,588245 6,94 0,0181 B:NUTRIENTES 0,016245 1 0,016245 0,19 0,6675

INTERACCIONES AB 0,310005 1 0,310005 3,66 0,0740

RESIDUOS 1,35688 16 0,084805--------------------------------------------------------------------------------TOTAL (CORREGIDO) 2,27137 19--------------------------------------------------------------------------------Los cocientes F están basados en el error cuadrático medio residual.

APENDICE Nº 6 CONTRASTE DE MUESTRAS MÚLTIPLES DUNCAN PARA CAPACIDAD ENZIMÁTICA

Contraste Múltiple de Rangos DUNCAN para CAP ENZIMÁTICA mm según TIPO DE HONGO

--------------------------------------------------------------------------------Método: 95,0 porcentaje LSDTIPO DE HONGO Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos--------------------------------------------------------------------------------140 10 3,296 0,0920896 X 167 10 3,639 0,0920896 X--------------------------------------------------------------------------------Contraste Diferencias +/- Límites--------------------------------------------------------------------------------140 - 167 *-0,343 0,276085 --------------------------------------------------------------------------------* indica una diferencia significativa.

APENDICE Nº 7 RESULTADOS EXPERIMENTALES DE PÉRDIDA DE PESO

30 DÍAS HONGO 167

matraz Nutrientes W matraces (g) W chips (g) W total (g) W final (g) W pérdida (g) % Pp. 8 CN 175,08 10 185,08 184,28 0,8 8,00

17 CN 173,98 10,41 184,39 183,63 0,76 7,30 18 CN 161,25 10,08 171,33 170,5 0,83 8,23 21 CN 177,27 10,67 187,94 187,02 0,92 8,62

23 CN 158,95 10,78 169,73 168,86 0,87 8,07

Prom: 8,05

D.Estandar : 0,48

Var: 0,23

matraz Nutrientes W matraces (g) W chips (g) W total (g) W final (g) W pérdida (g) % Pp. 2 SN 141,99 10,68 152,67 151,63 1,04 9,74

11 SN 174,35 10,21 184,56 183,56 1 9,79 12 SN 146,49 10,59 157,08 155,97 1,11 10,48 13 SN 158,33 10,16 168,49 167,45 1,04 10,24

26 SN 148,81 10,12 158,93 157,75 1,18 11,66

Prom: 10,38

D.Estandar : 0,78

Var: 0,61 45 DÍAS HONGO 167

matraz Nutrientes W matraces (g) W chips (g) W total (g) W final (g) W pérdida (g) % Pp. 3 CN 174,01 10,4 184,41 183,5 0,91 8,75 5 CN 144,09 10,36 154,45 153,53 0,92 8,88

10 CN 174,59 10,52 185,11 184,14 0,97 9,22 14 CN 153,54 10,07 163,61 162,68 0,93 9,24

24 CN 179,01 10,06 189,07 188,17 0,9 8,95

Prom: 9,01

D.Estandar : 0,21

Var: 0,05

matraz Nutrientes W matraces (g) W chips (g) W total (g) W final (g) W pérdida (g) % Pp. 6 SN 160,61 10,24 170,85 169,65 1,2 11,72

22 SN 177,66 10,48 188,14 186,76 1,38 13,17 28 SN 178,46 10,37 188,83 187,65 1,18 11,38 29 SN 172,95 10,16 183,11 181,94 1,17 11,52

31 SN 176,21 10,46 186,67 185,47 1,2 11,47

Prom: 11,85

D.Estandar : 0,75

Var: 0,56

30 DÍAS HONGO 140

matraz Nutrientes W matraces (g) W chips (g) W total (g) W final (g) W pérdida (g) % Pp. 4 CN 174,35 10,25 184,6 183,84 0,76 7,41 5 CN 139,9 10,55 150,45 149,69 0,76 7,20 9 CN 175,08 10,42 185,5 184,73 0,77 7,39

14 CN 173,99 10,38 184,37 183,37 1 9,63

20 CN 154,21 10,23 164,44 163,43 1,01 9,87 Prom: 8,30

D.Estandar : 1,33

Var: 1,77

matraz Nutrientes W matraces (g) W chips (g) W total (g) W final (g) W pérdida (g) % Pp. 13 SN 160,6 10,42 171,02 170,11 0,91 8,73 21 SN 177,73 10,14 187,87 186,91 0,96 9,47 24 SN 181,64 10,72 192,36 191,17 1,19 11,10 25 SN 174,59 10,24 184,83 183,82 1,01 9,86

30 SN 177,63 10,08 187,71 186,82 0,89 8,83 Prom: 9,60

D.Estandar : 0,96

Var: 0,92 45 DIAS HONGO 140

matraz Nutrientes W matraces (g) W chips (g) W total (g) W final (g) W pérdida (g) % Pp. 2 CN 149,01 10,3 159,31 158,07 1,24 12,04 6 CN 166,66 10,31 176,97 175,45 1,52 14,74

11 CN 158,95 10,78 169,73 168,49 1,24 11,50 16 CN 153,48 10,48 163,96 162,49 1,47 14,03

22 CN 167,89 10,28 178,17 176,68 1,49 14,49 Prom: 13,36

D.Estandar : 1,49

Var: 2,21

matraz Nutrientes W matraces (g) W chips (g) W total (g) W final (g) W pérdida (g) % Pp. 15 SN 173,11 10,49 183,6 182,45 1,15 10,96 18 SN 153,52 10,62 164,14 162,94 1,2 11,30 26 SN 178,29 10,31 188,6 187,28 1,32 12,80 27 SN 163,04 10,36 173,4 172,15 1,25 12,07

29 SN 154,86 10,88 165,74 164,44 1,3 11,95 Prom: 11,82

D.Estandar : 0,72

Var: 0,51

APENDICE Nº 8 RESULTADOS EXPERIMENTALES DE CRECIMIENTO RADIAL

Crec. Radial Hongo 167 CN Delta CREC RADIAL (mm) Delta 1 Delta 2 Delta 3 Delta 4 Delta 5 Delta 6 Prom muestra

1 8,75 8,75 8 9,25 8,25 8,5 8,58 3 8 9 8,25 8 8,25 8,75 8,38 4 7,75 8 9,5 9 7,25 8 8,25 5 8,75 9,25 7,75 8,75 9,25 7,75 8,58 6 8,5 9,75 7,25 8,75 8,25 8,25 8,46 Prom dispersion

Prom: 8,35 8,95 8,15 8,75 8,25 8,25 8,450 Desv.Estandar 0,45 0,65 0,84 0,47 0,71 0,40 0,585

Varianza: 0,21 0,42 0,71 0,22 0,50 0,16 0,368

Crec. Radial Hongo 167 SN

Delta CREC RADIAL (mm) Delta 1 Delta 2 Delta 3 Delta 4 Delta 5 Delta 6 Prom muestra 2 8 9 8,75 8,25 8,25 7,25 8,25 3 7,75 9,75 9,75 8 8,25 9,25 8,79 5 8,75 9,25 9,25 8,75 8,25 8 8,71 8 10 10,25 9 8 9,5 9,25 9,33 9 8 9 8,5 8,75 7,25 7,75 8,21 Prom dispersion

Prom: 8,50 9,45 9,05 8,35 8,30 8,30 8,658 Desv.Estandar 0,92 0,54 0,48 0,38 0,80 0,91 0,671

Varianza: 0,84 0,29 0,23 0,14 0,64 0,83 0,496

Crec. Radial Hongo 140 CN Delta CREC RADIAL (mm) Delta 1 Delta 2 Delta 3 Delta 4 Delta 5 Delta 6 Prom muestra

1 9,75 6,75 7,75 8,5 8 8,5 8,21 2 10 7,25 8,25 8,25 8,25 9,75 8,63 3 9 8,25 8,25 7,75 8,75 9 8,50 4 9 7,25 6,75 8 8,75 8,75 8,08 6 8,5 7,25 7 8,25 7,75 8,75 7,92

Prom dispersión

Prom: 9,44 7,38 7,75 8,13 8,44 9,00 8,35

Desv.Estandar: 0,52 0,63 0,71 0,32 0,38 0,54 0,51

Varianza: 0,27 0,40 0,50 0,10 0,14 0,29 0,28 Crec. Radial Hongo 140 SN Delta CREC RADIAL (mm) Delta 1 Delta 2 Delta 3 Delta 4 Delta 5 Delta 6 Prom muestra

1 9 7,5 7 8 7,5 8,5 7,92 2 9,75 7,5 6,75 8,5 7,75 7 7,88 3 9,25 7,75 7,75 8 7,75 8,75 8,21 6 9 7,25 8 9 7,75 8 8,17

7 10,25 7,5 7 8,25 7,25 8,75 8,17

Prom dispersión

Prom: 9,25 7,43 7,32 8,36 8,43 7,64 8,07

Desv.Estandar 0,35 0,24 0,49 0,40 1,43 1,14 0,68

Varianza: 0,13 0,04 0,35 0,23 0,02 0,60 0,23

CREC.RADIAL 167-CN

DIA Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7

Nº P.P./ RADIO mm Prom Prom Prom Prom Prom Prom Prom

1 11,5 20,25 29 37 46,25 54,5 63

3 11,5 19,5 28,5 36,75 44,75 53 61,75

4 10,5 18,25 26,25 35,75 44,75 52 60

5 7,5 16,25 25,5 33,25 42 51,25 59

6 12 20,5 30,25 37,5 46,25 54,5 62,75

PROM 10,6 18,95 27,9 36,05 44,8 53,05 61,3

CREC.RADIAL 167-SN

DIA Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7

Nº P.P./ RADIO mm prom prom prom prom prom prom prom

2 10,25 18,25 27,25 36 44,25 52,5 59,75

3 9,75 17,5 27,25 37 45 53,25 62,5

5 16,5 25,25 34,5 43,75 52,5 60,75 68,75

8 7,5 17,5 27,75 36,75 44,75 54,25 63,5

9 13,25 21,25 30,25 38,75 47,5 54,75 62,5

prom 11,45 19,95 29,4 38,45 46,8 55,1 63,4

CREC.RADIAL 140-CN

DIA Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7

Nº P.P./ RADIAL mm prom prom prom prom prom prom prom

1 10 19,75 26,5 34,25 42,75 50,75 59,25

2 10 20 27,25 35,5 43,75 52 61,75

3 9,25 18,25 26,5 34,75 42,5 51,25 60,25

4 10,5 19,5 26,75 33,5 41,5 50,25 59

6 10,25 18,75 26 33 41,25 49 57,75

Prom 10 19,25 26,6 34,2 42,35 50,65 59,6

CREC.RADIAL 140-SN

DIA Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7

Nº P.P./ RADIO mm prom prom prom prom prom prom prom

1 11,25 20,25 27,75 34,75 42,75 50,25 58,75

2 12,25 22 29,5 36,25 44,75 52,5 59,5

3 10 19,25 27 34,75 42,75 50,5 59,25

6 13 22 29,25 37,25 46,25 54 62

7 11,25 21,5 29 36 44,25 51,5 60,25

PROM 11,55 21 28,5 35,8 44,15 51,75 59,95

APENDICE Nº 9 RESULTADOS EXPERIMENTALES DE CAPACIDAD ENZIMATICA

Cap.Enzimática Hongo 167 CN Delta Radio Halo (mm) Delta 1 Delta 2 Delta 3 Delta 4 Delta 5 Delta 6 Prom muestra

2 3,25 4 3,25 3,25 3,15 4,25 3,53 4 3,75 4 3,25 2,25 3,4 4,25 3,48 8 4,25 3,5 3 3 3,9 3,5 3,53 9 4,25 3,5 3,5 3 3,4 3,75 3,57

11 4,5 3 2,75 2,5 3,9 3,25 3,32 Prom.dispersión

Prom: 4,00 3,60 3,15 2,80 3,55 3,80 3,48 Desv.Estandar 0,50 0,42 0,29 0,41 0,34 0,45 0,40

Varianza: 0,25 0,18 0,08 0,17 0,11 0,20 0,16 Cap.Enzimática Hongo 167 SN

Delta Radio Halo (mm) Delta 1 Delta 2 Delta 3 Delta 4 Delta 5 Delta 6 Prom muestra 1 4,25 3,25 2,5 2,75 4,25 3,5 3,42 2 5,25 5 1,75 2,5 4 3 3,58 3 4,75 3,25 2,25 3 4,5 4,25 3,67 5 5,5 2,25 3,5 3,25 5,5 3,75 3,96 8 5,75 3,25 3 4 4 6 4,33 Prom.dispersión

Prom: 5,10 3,40 2,60 3,10 4,45 4,10 3,79 Desv.Estandar 0,60 0,99 0,68 0,58 0,62 1,15 0,77

Varianza: 0,36 0,99 0,46 0,33 0,39 1,33 0,64

Cap.Enzimática Hongo 140 CN Delta Radio Halo (mm) Delta 1 Delta 2 Delta 3 Delta 4 Delta 5 Delta 6 Prom muestra

2 3 3,75 4,25 3 3,5 2,75 3,38 3 3,75 4,25 3,5 2,75 2,5 2,75 3,25 4 3 3,25 3,5 2,75 3,25 2,5 3,04 5 4,75 4,5 3,75 4 3,75 3,25 4,00 7 3,75 2 4 3,5 3 3,5 3,29

Prom dispersion

Prom: 3,65 3,55 3,80 3,20 3,20 2,95 3,39

Desv.Estandar 0,72 0,99 0,33 0,54 0,48 0,41 0,58

Varianza: 0,52 0,98 0,11 0,29 0,23 0,17 0,38

Cap.Enzimática Hongo 140 SN Delta Radio Halo (mm) Delta 1 Delta 2 Delta 3 Delta 4 Delta 5 Delta 6 Prom muestra

1 3,00 3,25 3,75 2,75 2,00 2,25 2,83 2 3,75 3,50 3,75 2,75 3,00 2,75 3,04 3 3,00 4,00 3,75 3,25 2,75 3,00 3,27 4 3,50 4,25 4,00 2,50 3,25 3,25 3,38 6 4,00 3,25 3,50 4,25 2,50 3,50 3,48

Prom dispersion

Prom: 3,45 3,65 3,75 3,10 2,70 2,95 3,27

Desv.Estandar: 0,45 0,45 0,18 0,70 0,48 0,48 0,46

Varianza: 0,20 0,21 0,03 0,49 0,23 0,23 0,23

CAP.ENZIMATICA 167-CN

DIA Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Nº P.P./ RADIO HALO mm Prom Prom Prom Prom Prom Prom Prom

2 9 12,25 16,25 19,5 22,75 25,9 30,15 4 9 12,75 16,75 20 22,25 25,65 29,9 8 8,25 12,5 16 19 22 25,9 29,4 9 7,25 11,5 15 18,5 21,5 24,9 28,65

11 10,75 15,25 18,25 21 23,5 27,4 30,65

PROM 8,85 12,85 16,45 19,6 22,4 25,95 29,75

CAP.ENZIMÁTICA 167-SN

DIA Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Nº P.P./ RADIO. HALO mm prom prom prom prom prom prom prom

1 10 14,25 17,5 20 22,75 27 30,5 2 16,5 21,75 26,75 28,5 31 35 38 3 17,75 22,5 25,75 28 31 35,5 39,75 5 11,75 17,25 19,5 23 26,25 31,75 35,5

8 13,5 19,25 22,5 25,5 29,5 33,5 39,5

prom 13,9 19 22,4 25 28,1 32,55 36,65

CAP.ENZIMATICA 140 -CN

DIA Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Nº P.P./ RADIO HALO Prom Prom Prom Prom Prom Prom Prom

2 10,5 13,5 17,25 21,5 24,5 28 30,75 3 9,25 13 17,25 20,75 23,5 26 28,75 4 9,5 12,5 15,75 19,25 22 25,25 27,75 5 2,75 7,5 12 15,75 19,75 23,5 26,75

7 11,75 15,5 17,5 21,5 25 28 31,5

PROM 8,75 12,4 15,95 19,75 22,95 26,15 29,1

CAP.ENZIMÁTICA 140 - SN

DIA Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Nº P.P./ RADIO HALO prom prom prom prom prom prom prom

1 11,75 14,75 18 21,75 24,5 26,5 28,75 2 7 10,75 14,25 18 20,75 23,75 26,5 3 7,75 10,75 14,75 18,5 21,75 24,5 27,5 4 6,75 10,25 14,5 18,5 21 24,25 27,5

6 10,5 14,5 17,75 21,25 25,5 28 31,5

PROM 8,75 12,2 15,85 19,6 22,7 25,4 28,35