UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR … · RESUMEN La candidiasis oral es una patología cada vez más...

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE ODONTOLOGÍA

CARRERA DE ODONTOLOGÍA

EFECTO ANTIMICOTICO DE LA STEVIA COMERCIAL Y EL

EXTRACTO ETANÓLICO DE Stevia rebaudiana AL 30% SOBRE

CEPAS DE Candida albicans. ESTUDIO IN VITRO

Proyecto de investigación presentado como requisito previo a la obtención del

título de odontóloga

Autor: Estacio Moreira Katherine Alexandra

Tutora: Dra. Myriam Katherine Zurita Solís

Quito, Octubre 2016

ii

AUTORIZACIÓN DEL AUTOR

Yo, Estacio Moreira Katherine Alexandra en calidad de autora del trabajo de Investigación

previo a la obtención del título de odontóloga realizado: “EFECTO ANTIMICOTICO DE

LA STEVIA COMERCIAL Y EL EXTRACTO ETANÓLICO DE Stevia rebaudiana

AL 30% SOBRE CEPAS DE Candida albicans. ESTUDIO IN VITRO”, autorizo a la

Universidad Central del Ecuador a hacer uso del contenido total o parcial que me pertenecen,

con fines estrictamente académicos o de investigación.

Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la presente autorización,

seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los artículos 5, 6, 8; 19

y demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su Reglamento.

También, autorizo a la Universidad Central del Ecuador realizar la digitalización y

publicación de este trabajo de investigación en el repositorio virtual, de conformidad a lo

dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.

Firma:

-----------------------------------------------------

Estacio Moreira Katherine Alexandra

C.C. N° 0804014439

iii

APROBACIÓN DEL TUTOR DEL TRABAJO DE TITULACIÓN

Yo, Myriam Katherine Zurita Solís, en mi calidad de tutor del trabajo de titulación,

modalidad Proyecto de Investigación, elaborado por KATHERINE ALEXANDRA

ESTACIO MOREIRA: cuyo título es: “EFECTO ANTIMICOTICO DE LA STEVIA

COMERCIAL Y EL EXTRACTO ETANÓLICO DE Stevia rebaudiana AL 30%

SOBRE CEPAS DE Candida albicans. ESTUDIO IN VITRO”, previo a la obtención de

Grado de Odontóloga: considero que el mismo reúne los requisitos y méritos necesarios en

el campo metodológico y epistemológico, para ser sometido a la evaluación por parte del

tribunal examinador que se designe, por lo que lo APRUEBO, a fin de que el trabajo sea

habilitado para continuar con el proceso de titulación determinado por la Universidad

Central del Ecuador.

En la ciudad de Quito a los 22 días del mes de septiembre del año 2016

--------------------------------------------------

Dra. Myriam Katherine Zurita Solís

DOCENTE-TUTOR

C.C. 1708118854

iv

APROBACIÓN DE LA PRESENTACIÓN ORAL/TRIBUNAL

El Tribunal constituido por: Dr. Fernando Rivadeneira, Dr. Ruth Vaca, Dr. Juán Viteri.

Luego de receptar la presentación oral del trabajo de titulación previo a la obtención del

título de odontóloga, presentado por la señorita Estacio Moreira Katherine Alexandra.

Con el título:

“EFECTO ANTIMICOTICO DE LA STEVIA COMERCIAL Y EL EXTRACTO

ETANÓLICO DE Stevia rebaudiana AL 30% SOBRE CEPAS DE Candida albicans.

ESTUDIO IN VITRO”

Emite el siguiente veredicto APROBADO

Fecha: 26 de octubre del 2016

Para la constancia de lo actuado firman:

Nombre Apellido Calificación Firma

Presidente Dr. Fernando Rivadeneira 18 …………...………

Vocal 1 Dr. Ruth Vaca 19 ….…..……..….....

Vocal 2 Dr. Juan Viteri 16 ……….…….…….

v

DEDICATORIA

A mis padres Rodrigo y Blanca por su amor incondicional, por ser motivación, inspiración

y ejemplo de lucha durante cada día en especial los más difíciles transcurridos en el

trayecto para la finalización de mi carrera universitaria.

vi

AGRADECIMIENTOS

A Dios por la hermosa familia que me dio, mi pilar.

A mi tutora Katherine Zurita Solís por su valioso tiempo dedicado a las asesorías para la

realización del presente trabajo.

A la Dra. Rachide Acosta y F. B. Darwin Roldan por su colaboración y asesoramiento en

el laboratorio de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador

A mis hermanos por sus palabras de aliento y ejemplo de perseverancia.

A Pedro Luis Barreiro por su paciencia en los días de estrés y por sus palabras de aliento.

vii

TABLA DE CONTENIDO

AUTORIZACIÓN DEL AUTOR ...................................................................................... ii

APROBACIÓN DEL TUTOR DEL TRABAJO DE TITULACIÓN ............................ iii

APROBACIÓN DE LA PRESENTACIÓN ORAL/TRIBUNAL .................................. iv

DEDICATORIA .................................................................................................................. v

AGRADECIMIENTOS ..................................................................................................... vi

TABLA DE CONTENIDO ............................................................................................... vii

ÍNDICE DE TABLAS ......................................................................................................... x

ÍNDICE DE GRÁFICOS ................................................................................................... xi

ÍNDICE DE FIGURAS ..................................................................................................... xii

RESUMEN ......................................................................................................................... xv

ABSTRACT ...................................................................................................................... xvi

INTRODUCCIÓN ............................................................................................................... 1

CAPITULO I ....................................................................................................................... 2

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ............................................................ 2

FORMULACIÓN DEL PROBLEMA................................................................. 3

OBJETIVOS .......................................................................................................... 4

1.3.1 OBJETIVO GENERAL ....................................................................................... 4

1.3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .............................................................................. 4

HIPÓTESIS ........................................................................................................... 5

JUSTIFICACIÓN ................................................................................................. 6

CAPITULO II ...................................................................................................................... 8

2 MARCO TEÓRICO.............................................................................................. 8

ANTECEDENTES ................................................................................................ 8

MICROBIOLOGIA .............................................................................................. 9

2.2.1 HONGOS ............................................................................................................. 10

CLASIFICACIÓN DE LOS HONGOS ............................................................ 10

RESISTENCIA Y SENSIBILIDAD DE LOS HONGOS A LOS

ANTIMICÓTICOS ............................................................................................. 11

viii

MICROFLORA MICÓTICA NORMAL DE LA BOCA................................ 12

2.2.2 CANDIDA ALBICANS ...................................................................................... 12

MORFOLOGÍA DE LA CANDIDA ALBICANS ............................................. 13

FACTORES DE VIRULENCIA ........................................................................ 13

FACTORES ESPECÍFICOS QUE AFECTAN LA DISTRIBUCIÓN DE

CANDIDA EN LA CAVIDAD BUCAL ............................................................. 15

CANDIDIASIS..................................................................................................... 15

2.3.1 CANDIDIASIS ORAL ........................................................................................ 15

ETIOPATOGENIA ............................................................................................. 15

TIPOS DE CANDIDIASIS ORAL .................................................................... 16

2.3.1.2.1 CANDIDIASIS SEUDOMEMBRANOSA AGUDA (MUGUET) ................... 16

2.3.1.2.2 CANDIDIASIS ATRÓFICA (ERITEMATOSA) ............................................ 17

2.3.1.2.3 CANDIDIASIS HIPERPLASICA CRÓNICA ................................................. 17

TRATAMIENTO ................................................................................................ 18

STEVIA REBAUDIANA .................................................................................... 18

2.4.1 HISTORIA DE LA STEVIA REBAUDIANA .................................................. 18

2.4.2 REGULACIONES............................................................................................... 19

2.4.3 CULTIVO EN ECUADOR................................................................................. 20

2.4.4 COMPOSICIÓN DE LA STEVIA .................................................................... 20

2.4.5 PROPIEDADES DE LA STEVIA ..................................................................... 20

CAPITULO III .................................................................................................................. 23

3 METODOLOGIA ............................................................................................... 23

TIPO DE DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN ............................................... 23

POBLACIÓN Y MUESTRA DEL UNIVERSO DE ESTUDIO ..................... 24

3.2.1 CRITERIOS DE INCLUSIÓN .......................................................................... 25

3.2.2 CRITERIOS DE EXCLUSION ......................................................................... 25

VARIABLES ........................................................................................................ 25

3.3.1 DEFINICIÓN DE VARIABLES ........................................................................ 25

3.1.1. OPERACIONALIZACIÓN DE VARIABLES................................................. 26

PROCEDIMIENTO ............................................................................................ 27

3.4.1 PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN DE EXTRACTO DE STEVIA

REBAUDIANA .................................................................................................... 27

ix

3.4.2 PREPARACIÓN DEL INOCULO: ACTIVACIÓN ....................................... 29

3.4.3 PREPARACIÓN DE MEDIO DE CULTIVO: SABOURAUD GLUCOSADO

AGAR ................................................................................................................... 33

3.4.4 PREPARACIÓN DE DISCOS ........................................................................... 34

3.4.5 SIEMBRA EN EL AGAR SABOURAUD GLUCOSADO.............................. 35

3.4.6 COLOCACIÓN DE LOS DISCOS EN EL CULTIVO ................................... 35

3.1.2. LECTURA DE LOS HALOS DE INHIBICIÓN ............................................. 37

3.4.7 MANEJO DE DESECHOS ................................................................................ 37

CAPITULO IV ................................................................................................................... 38

ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS ................................ 38

DISCUSIÓN ......................................................................................................... 44

CAPITULO V .................................................................................................................... 46

CONCLUSIONES ............................................................................................... 46

RECOMENDACIONES ..................................................................................... 47

BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................... 48

ANEXOS ............................................................................................................................ 51

x

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1 Distribución de Frecuencias de la prueba de Stevia comercial de Multidulzura ... 38

Tabla 2 Distribución de Frecuencias de la prueba del Extracto de Stevia al 30% .............. 39

Tabla 3 Distribución de Frecuencias de la prueba control positivo .................................... 40

Tabla 4 Cálculo estadístico de los extractos ........................................................................ 42

Tabla 5 Prueba t student pata muestra única ....................................................................... 43

xi

ÍNDICE DE GRÁFICOS

Gráfico 1 Distribución de frecuencias de la Stevia comercial Multidulzura ....................... 38

Gráfico 2 Distribución de frecuencias del Extracto de Stevia al 30%................................. 39

Gráfico 3 Distribución de frecuencias de Clorhexidina 0.125% ......................................... 40

Gráfico 4 Distribución intercuartil del Extracto de Stevia al 30% ...................................... 41

Gráfico 5 Distribución intercuartil de la Stevia comercial Multidulzura ............................ 41

Gráfico 6. Comparación de medias ..................................................................................... 42

xii

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Esquema que muestra las fases de un hongo. ...................................................... 11

Figura 2. Esquema de la morfología de la Candida albicans. yemas(1); Pseudohifas (2);

micelio(3); clamidosporas (4). .......................................................................... 13

Figura 3. Candidiasis pseudomembranosa. ......................................................................... 16

Figura 4. Dorso lingual marcadamente depilado, típico de candidiasis eritematosa crónica.

.......................................................................................................................... 17

Figura 5. Formulación de muestra. ...................................................................................... 24

Figura 6. Hojas secas de Stevia rebaudiana ......................................................................... 27

Figura 7 Proceso de percolación para obtención del extracto de Stevia rebaudiana al 30%

.......................................................................................................................... 27

Figura 8. Proceso de filtración. ............................................................................................ 28

Figura 9. Radiación durante una hora. ................................................................................. 29

Figura 10. Cepa de Candida albicans sellado ...................................................................... 30

Figura 11. Ampolla que contiene la cepa. ........................................................................... 31

Figura 12. Hisopo sometido en cepa de Candida albicans .................................................. 31

Figura 13. Comparación del inoculo con el estándar Mcfarland de 0,5 turbidez. ............... 32

Figura 14. Inóculo primario de Candida albicans................................................................ 32

Figura 15. Inóculo en incubación. ....................................................................................... 33

Figura 16. Agar Sabouraud glucosado ................................................................................ 34

Figura 17. Preparación de discos con pipeta digital. ........................................................... 34

Figura 18. Siembra de Candida albicans en Agar Sabouraud Glucosado. .......................... 35

Figura 19. Rotulaión de placas. ........................................................................................... 36

Figura 20. Cultivos listos para incubar. ............................................................................... 36

Figura 21. Halo de inhibición medido mediante calibrador para método Kirby Bauer. ..... 37

Figura 22. Área de esterilización de desechos del laboratorio clínico de la Facultad de

Ciencias Química UCE ..................................................................................... 55

Figura 23. Aza estéril........................................................................................................... 59

Figura 24. Cámara de bioseguridad donde fue realizada la prueba. .................................... 59

Figura 25. Pinza estéril para colocación de discos. ............................................................. 60

Figura 26. Pipeta digital. ..................................................................................................... 60

xiii

Figura 27. 30 cajas petri utilizadas ...................................................................................... 61

Figura 28. Suero fisiológico utilizado como control negativo. ........................................... 61

Figura 29. Cepa de Candida albicans. ................................................................................ 62

Figura 30. Extracto etanólico al 30%; clorhexidina utilizada como control positivo; Stevia

comercial "Multidulzura" ................................................................................. 62

Figura 31. Discos divididos en grupos. ............................................................................... 63

Figura 32. Luz fluorescente para clara medición de resultados. ......................................... 63

Figura 33. Cultivo después de 48 horas de incubación. ...................................................... 64

xiv

ÍNDICE DE ANEXOS

Anexo 1.Certificado de control de calidad del extracto etanólico de stevia rebaudiana al 30%

............................................................................................................................. 51

Anexo 2. Certificación de la cepa de Candida albicans ...................................................... 52

Anexo 3. Certificado del Lab. Clínico de la Facultad de Ciencias Químicas UCE de haber

realizado el experimento. .................................................................................... 53

Anexo 4. Protocolo de manejo de desechos. ....................................................................... 54

Anexo 5 Realización de prueba piloto. ................................................................................ 56

xv

Efecto antimicotico de la stevia comercial y el extracto etanólico de stevia rebaudiana al

30% sobre cepas de candida albicans. Estudio in vitro

Autor: Katherine Alexandra Estacio Moreira


RESUMEN

La candidiasis oral es una patología cada vez más frecuente, Siendo la Candida albicans su

principal causante. Objetivo: determinar el efecto antimicótico de la Stevia rebaudiana en

dos diferentes presentaciones frente a la Candida albicans. Materiales y métodos: Para la

realización de éste estudio se elaboró un extracto etanólico de Stevia rebaudiana al 30% y

se adquirió comercialmente una presentación liquida, ambas fueron utilizadas para realizar

la prueba de sensibilidad sobre cultivos de Agar sabouraud con siembra de Candida

albicans; como control positivo el compuesto fue la clorhexidina al 0.12% y como control

negativo suero fisiológico. Se utilizó una muestra de 30 cultivos los cuales fueron incubados

por 48 horas a 37°C. Resultados: Se obtuvo halos de inhibición de crecimiento con una

media de 10,33mm de diámetro para la Stevia comercial y de 9,27mm para el extracto

etanólico de Stevia rebaudiana al 30%, el control positivo entro en un rango de muy sensible

y el control negativo no obtuvo efectividad. Conclusiones: Se determinó mediante la prueba

de T STUDENT que las dos presentaciones de Stevia generaron efecto antimicótico sobre

Candida albicans.

PALABRAS CLAVES: CANDIDIASIS ORAL / Candida albicans / Stevia rebaudiana.

xvi

Antifungal effect of commercial stevia and ethanolic extract of stevia rebaudiana at 30% on

strains of candida albicans. In vitro study

Author: Katherine Alexandra Estacio Moreira


ABSTRACT

The oral candidiasis is an increasingly common condition being Candida albicans the

principal etiological agent. Objective: determinate the antifungal effect of Stevia rebaudiana

in two diferent presentations against Candida albicans. Materials and methods: To carry

out this study, elaborated an 30% ethanol extract of Stevia rebaudiana and the another was

a commercial presentation acquired a liquid form, both were used to perform sensitivity test

on cultures of Agar Sabouraud with planting Candida albicans was prepared; as a positive

control compound was 0.12% chlorhexidine and physiological saline as negative control.

We used 30 cultures that were incubated for 48 hours at 37 ° C was used. Results: we

obtained inhibition halos were an average of 10,33mm for commercial Stevia and 9,27mm

for the 30% ethanolic extract of Stevia rebaudiana, the positive control entered a range of

very sensitive and the negative control did not get effectiveness. Conclusions: it was

determined through T STUDENT test that both Stevia’s presentations generated antifungal

effect against Candida albicans.

KEY WORDS: ORAL CANDIDIASIS / Candida albicans / Stevia rebaudiana.

1

INTRODUCCIÓN

Candida albicans es un microorganismo del reino fungi que si bien es cierto pertenece a la

microflora habitual de la boca siendo inofensiva, ésta puede volverse patógena por diferentes

factores desencadenantes principalmente cuando se produce una alteración o disminución

del sistema de defensa del cuerpo humano, provocando la candidiasis. (Brooks, Carroll,

Butel, Morse, & Mietzner, 2011)

Los pacientes que más comúnmente se ven afectados son aquellos inmunodeprimidos como

los portadores de VIH, pacientes que han sido sometidos a quimioterapia, personas en edades

extremas, es decir, los adultos mayores y los recién nacidos. Son también susceptibles a

desencadenar candidiasis los pacientes portadores de prótesis dentales en especial cuando

no se tiene un correcto aseo de la prótesis. (Cawson & Edell, 2009)

A nivel oral la candidiasis se presenta afectando la mucosa, la manera de tratar puede ser

medicamentosa vía parenteral con antimicóticos como la nistatina o el fluconazol entre otros

antimicóticos. Debido a la resistencia que poseen cada vez con mayor fuerza los

microorganismos a los medicamentos es necesario optar por soluciones alternativas, Waizel

(2010), menciona que las plantas medicinales usadas de forma correcta y con el debido

conocimiento son una buena opción, por lo que es de gran importancia conocer si plantas

como en éste caso la Stevia rebaudiana poseen actividad contra microorganismos aportando

así para futuras investigaciones.

Basándonos en estudios ya realizados en los cuales se analiza el efecto antimicrobiano de la

Stevia rebaudiana sobre otros microorganismos, nos animamos a realizar la presente

investigación, con el fin de determinar el efecto de inhibición de crecimiento que posee la

Stevia rebaudiana sobre Candida albicans.

Para la investigación se utilizó dos tipos de Stevia rebaudiana, una elaborada en laboratorio

el extracto etanólico de Stevia rebaudiana al 30% y la otra presentación fue una ya fabricada

que puede ser adquirida comercialmente. Ambas presentaciones se dispusieron con una

muestra de 30 repeticiones en cultivos de Candida albicans, junto con un control positivo y

uno negativo. Mediante el método de Kirby Bauer que es un método para determinar la

susceptibilidad de un microorganismo a un antimicrobiano se determinaron los resultados.

2

CAPITULO I

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

“El género Candida incluye ocho especies de hongos, de los cuales Candida albicans es,

con diferencia, el más prevalente” (Saap, Eversole, & Wysocki , 2005), principal causante

de la candidiasis que agrupa variantes mucocutáneas, entre estas la que corresponde al área

de estudio como es la candidiasis oral. (Regezi& Sciubba, 1991)

Saap (2005), menciona que la candidiasis oral es una patología que se presenta en varias

formas clínicas como son: la candidiasis seudomembranosa aguda (muguet), patologia

comunmente en recien nacido; la candidiasis atrófica (eritematosa), frecuente en portadores

de prótesis removibles mal ajustadas y con mas frecuencia en los pacientes que no limpian

efectivamente las prótesis ni se las quitan por la noche; la candidiasis hiperplasica crónica

que se presenta como placa blanca tambien conocida como leucoplasia candidiásica.

Según Regezi los grupos mas afectados son los lactantes y los ancianos,el 65% de los casos

de candidiasis cronica ocurre en adultos mayores que usan protesis totales, otro grupo es el

de pacientes con leucemia en los que esta presente en mas de la mitad, ademas de el 70% de

los pacientes con sida.

Como se ha descrito la Candida albicans es un hongo presente en flora normal de la mucosa

oral pero que frente a estímulos como una prótesis mal adaptada o un descenso del sistema

inmunológico hace que éste aumente y provoque la candidiasis (Neville, Damm, Allen, &

Bouquot, 2004). Cawson describe que para conbatir dicha patología se debe realizar un

tratamiento enérgico anti fúngico, pero que en ocasiones alguna placa residual puede

persistir y las lesiones recidivan después del tratamiento (2009).

Se sabe que el uso prolongado de antimicrobianos afecta el sistema de defensa, es por esto

que se realizan estudios sobre plantas para su uso como tratamiento coadyuvante. Algunos

estudios indican la actividad antimicrobiana de la Stevia rebaudiana, en especial con las

bacterias y hongos que atacan la mucosa oral. (Chilaca & Cava, 2014)

3

FORMULACIÓN DEL PROBLEMA

La presente investigación se realizará con el fin de evaluar si la Stevia rebaudiana en dos

diferentes presentaciones posee efectividad antimicótica sobre Candida albicans.

¿Genera la Stevia rebaudiana efectividad antimicótica in vitro frente a Candida albicans?

4

OBJETIVOS

1.3.1 OBJETIVO GENERAL

Determinar el efecto de inhibición de crecimiento que posee la Stevia comercial y el extracto

etanólico de Stevia rebaudiana al 30% sobre cepas de Candida albicans.

1.3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Medir la inhibición de crecimiento producida por la Stevia comercial y el extracto

etanólico de Stevia rebaudiana al 30% sobre Candida albicans ATCC® 1023,

utilizando el método Kirby-Bauer.

Comparar la inhibición de crecimiento producida sobre la Candida albicans tanto

por la Stevia comercial como por el extracto etanólico al 30% de la Stevia rebaudiana

con el control positivo.

5

HIPÓTESIS

El extracto etanólico de Stevia rebaudiana al 30% genera mayor efecto de

inhibición de crecimiento sobre las cepas de Candida albicans en relación con la

Stevia comercial “Multidulzura” después de 48 horas de incubación.

La Stevia comercial “Multidulzura” genera mayor efecto de inhibición de

crecimiento sobre las cepas de Candida albicans en relación con el extracto

etanólico de Stevia rebaudiana al 30% después de 48 horas de incubación.

6

JUSTIFICACIÓN

“Las propiedades medicinales de una gran cantidad de plantas es un hecho indiscutible y

reconocido por todos” (Rivas Ponce & Soriano, 1988), es por esto que basándose en el

estudio de Manish, Tadhani, & Rema en el que se encontró actividad inhibitoria in vitro en

extractos de hojas de Stevia rebaudiana contra hongos como R. oligosporus y A. niger

(2006), además de una recopilacion bibliográfica de Martínez Pérez que menciona actividad

antimicrobiana de la stevia tanto para bacterias como para hongos.(s.f) se ha decidido

realizar el presente estudio.

La presente investigación analiza a la Stevia rebaudiana en dos diferentes presentaciones

una desarrollada en laboratorio y otra adquirida comercialmente, siendo ésta última de

importancia ya que en caso de tener efecto antimicótico sobre Candida albicans, es a la que

el paciente puede acceder más fácilmente.

El poder medicinal de las plantas es debido en muchos casos a un solo producto químico de

entre los muchos que contiene o, en otros casos, a una mezcla de aquéllos “si éstos productos

son extraidos de la planta y no son destruidos al extraerlos, se podrán aplicar en dosis mas

precisas que las que se consiguen tomando una infusion de la planta” (Rivas Ponce &

Soriano, 1988).

Marsh & Martin mencionan que la variedad y numero de agentes antihongos que existe es

baja debido a la dificultad de desarrollar un agente antihongos que sea eficaz contra un

organismo determinado y esté desprovisto de efectos tóxicos contra las células del huesped

(2011), Saap, Eversole, & Wysocki , 2005 describen que los microorganismos fúngicos se

encuentran en la superficie del epitelio o próximos a la misma, por lo que la medicación anti

fúngica tópica es más efectiva que la medicación administrada por vía sistémica.

Un punto importante es que no hay reportes de algún efecto adverso por usar la Stevia, por

lo que tiene un amplio margen de seguridad. “En japón se consumen hasta 100 toneladas

métricas al año, donde tampoco se ha reportado reacciones adversas” (Vitery Sapuyes,

Escribano, Gamboa, & Chavarría, 2010). En septiembre de 1995 la Agencia Americana de

Drogas y Alimentos (FDA) aprobó a la Stevia como un complemento dietético.

7

Cabe mencionar la importancia del uso de productos fitoquímicos y extractos de plantas para

sustituir el efecto de la resistencia a las drogas antihongos que como describen Marsh &

Martin es un fenómeno cada vez más reconocido y se puede definir clínicamente como la

persistencia de signos y sintomas de la infección a pesar de la entrega adecuada de un nivel

normalmente apropiado y tolerable de la droga (2011).

Abreu, McBain, & Simoes ofrecen una posible solución al problema de la resistencia

medicamentosa que existe, haciendo referencia a estos componentes de origen natural que

con frecuencia actúan a través de diferentes mecanismos que los antimicrobianos

convencionales y pueden, por lo tanto, ser de uso en el tratamiento de microorganismos

resistentes. (2012)

Los resultados que se obtengan de esta investigación servirán como base para la realización

de futuras investigaciones de productos ya que como lo menciona Vitery Sapuyes,

Escribano, Gamboa, & Chavarría (2010) la Stevia posee propiedades unicas que la hacen

ideal como componente de enjuague bucal y pasta dental.

8

CAPITULO II

2 MARCO TEÓRICO

ANTECEDENTES

La candidiasis oral causada por Candida albicans es la principal micosis que se puede hallar

en boca (Marsh Philip D, 2011), la cual se puede presentar preferentemente en pacientes con

edades extremas como lo menciona Velasco (2002), y en pacientes inmunodeprimidos, o

con prótesis dentales. Para tratar esta patología se medica antimicóticos tópicos como la

nistatina. (Bascones, 2004)

Debido al aumento de resistencias a los antimicrobianos la medicina a través de las plantas

ofrece una alternativa, en este caso mediante el uso de la Stevia rebaudiana. Durante siglos,

las tribus guaraníes de Paraguay y Brasil han usado diferentes especies de Stevia,

especialmente la Stevia rebaudiana como endulzante para disminuir el sabor amargo de los

medicamentos a base de diferentes platas, y con fines medicinales. (Durán, Rodríguez,

Cordón, & Record, 2012)

La Stevia rebaudiana fue descrita por primera vez destacando su sabor dulce en 1887 por el

botánico suizo Moisés Santiago Bertoni, y en 1900 el químico paraguayo Ovidio Rebaudi

la estudió más a fondo logrando aislar sus principios activos responsables del dulzor.

(Brandle, Richman , Swason , & Chapman , 2002) Desde entonces se ha estudiado a la Stevia

no solo por sus propiedades endulzantes, sino también por sus características

antimicrobianas.

Varios son los estudios que han determinado que la Stevia rebaudiana tiene efecto

antimicrobiano utilizando un método in vitro con medios de cultivos y técnica de Kirby-

Bauer en la que se determina la efectividad de un antimicrobiano midiendo halos de

inhibición, a continuación se describirán algunos de estas investigaciones.

El estudio realizado por Manish en el 2006 titulado “In vitro antimicrobial activity of Stevia

rebaudiana Bertoni leaves” en el que determina el efecto que causa extractos de Stevia

9

rebaudiana elaborados en diferentes solventes como agua, metanol, etanol, y hexanol

utilizándolos sobre bacterias como: S. aureus, E. coli, P. vulgaris, B. megaterium, P.

aeruginosa, M. luteus; además de hongos como el R. oligosporus, y el A. niger.

En otra investigación brindada por Vitery y cols. (2010) Se estudió la “Actividad inhibitoria

de la Stevia rebaudiana sobre el Lactobacillus acidophillus y el Streptococcus mutans” en

donde se comparó los resultados obtenidos con un control positivo de vancomicina,

En el 2012 Chila y Cava, valoraron la actividad antimicótica del extracto etanólico al 10%,

20%, y 30% de Stevia rebaudiana contra Candida albicans utilizando medio de cultivo

Sabouraud Agar Glucosado que impide el crecimiento de bacterias. En el método utilizaron

una muestra de 30 cultivos.

La Dra. Pérez (2013) en su estudio evaluó el efecto antibacteriano in vitro del extracto

etanólico en diferentes concentraciones de Stevia rebaudiana sobre Streptococcus mutans

ATCC 25175, en el cual describe además la concentración mínima inhibitoria y la

concentración mínima bactericida de Stevia rebaudiana necesaria para actuar sobre S.

mutans.

MICROBIOLOGIA

Brooks, Carroll, Butel, Morse, & Mietzner (2011) describe a la microbiología como la

ciencia que estudia los organismos visibles con el auxilio de microscopio. La microbiología

médica que incluye la estomatológica, está compuesta por varias ramas que son la

bacteriología, la micología, la virología, la parasitología y la inmunología. (Negroni, 2009)

La parte de la microbiología que se encarga del estudio de los hongos es la micología, el

interés por esta rama de la ciencia se incrementó notablemente en las últimas tres décadas

debido a un considerable aumento de la frecuencia de las infecciones debidas a hongos y

este aumento a su vez se produjo por el incremento de las causas de inmunodepresión.

(Negroni, 2009)

10

2.2.1 HONGOS

Según Brooks, Carroll, Butel, Morse, & Mietzner (2011) se han descrito 80000 especies de

hongos, de los cuales 400 poseen importancia médica y solo 50 de ellos causan más del 90%

de las micosis presentes en humanos y otros animales. Velasco, (2002) menciona que dentro

del reino Fungi se distinguen dos grupos de hongos, los inferiores que no poseen pared

celular y que carecen de interes en patología humana y el grupo de los hongos verdaderos

que si poseen pared celular y se encuentran en el cuerpo humano.

Las células fúngicas son estructuralmente conformada como una célula eucariota (Murray,

Rosental, & Pfaller, 2007), y morfológicamente se presentan en formas ovaladas o

filamentosas en células alargadas, poseen una pared celular rígida integrada por quitina,

glucanos, mananos y proteínas. (Negroni, 2009). Brooks et al. (2011) menciona que los

hongos pueden ser unicelulares conocidos como levaduras o los pluricelulares conocidos

como mohos.

CLASIFICACIÓN DE LOS HONGOS

Los hongos unicelulares denominados levaduras son de forma redondeada u ovoide y

como menciona Ryan & Ray (2010) se reproducen asexualmente mediante gemación

formando protrusiones o yemas (también llamados blastoconidios) que irán creciendo hasta

separarse y formar una nueva célula. En ocasiones las células hijas no se separan y forman

cadenas de células, que se denominan seudohifas y pueden confundirse con una hifa. Sin

embargo, algunas levaduras pueden llegar a formar hifas verdaderas. (Brooks, Carroll, Butel,

Morse, & Mietzner, 2011) (Prats, 2008)

Hongos filamentosos (mohos)

Prats (2008) describe a los hongos filamentosos pluricelulares como células alargadas con

la anchura de 3 a 15 um de diámetro y longitud variable. Crecen por extensión apical,

tabicándose para formar nuevas células que no se desprenden lo cual recibe el nombre de

hifas y éstas cuando se ramifican se denominan micelio. Los hongos filamentosos pueden

ser superiores generalmente de células delgadas (2-5 um) y que forman esporas externas, y

11

los hongos filamentosos inferiores se presentan con células más anchas (10-15 um), no están

tabicadas y sus esporas son formadas en el interior de estructuras suculares. (Brooks, Carroll,

Butel, Morse, & Mietzner, 2011) (Lamont, Hajisshengallis, & Jenkinson, 2014)

Figura 1. Esquema que muestra las fases de un hongo.

Fuente. (Velasco, 2002, pag. 218)

El medio de cultivo tradicional en micología, es el agar de Sabouraud que contiene glucosa

y peptona modificada y que no permite el crecimiento de bacterias además a este medio se

le puede agregar gentamicina o cloranfenicol para inhibir bacterias y hongos saprofitos

especialmente cuando la muestra no es estéril. (Brooks, Carroll, Butel, Morse, & Mietzner,

2011)

RESISTENCIA Y SENSIBILIDAD DE LOS HONGOS A LOS

ANTIMICÓTICOS

El estudio de la sensibilidad de los microorganismos es una de las funciones más importantes

de los laboratorios de microbiología clínica, su realización se desarrolla mediante las

pruebas de sensibilidad o antibiograma, cuyo principal objetivo es evaluar en el laboratorio

la respuesta de un microorganismo a uno o varios antimicrobianos. El antibiograma define

la actividad in vitro de un antimicrobiano frente a un microorganismo determinado y refleja

su capacidad para inhibir su crecimiento. (Murray, Rosental, & Pfaller, 2007)

Brooks et al. (2011) menciona que muchas micosis son difíciles de tratar, esto es debido a

que los hongos son eucariotas que como explica Negroni (2009), poseen un núcleo

estructural con membrana nuclear, al igual que lo seres humanos por lo que se comparte

12

genes homólogos y a consecuencia de esto son pocos los puntos de ataque en que actúan los

fármacos.

MICROFLORA MICÓTICA NORMAL DE LA BOCA

Los hongos constituyen generalmente una proporción relativamente pequeña de la

microflora oral. La población más grande de microflora de hongos en la boca humana se

compone de la Candida spp. Y de estas la Candida albicans es en gran medida la especie

más común, entre otras especies de Candida que se han aislado en boca incluyendo la

Candida glabrata, tropicalis, krusei, parapsilosis, y la guilliermondii. (Marsh & Martin,

2011) (Bascones, 2004)

2.2.2 Candida albicans

La Candida se distribuye uniformemente a través de la boca pero el sitio de aislamiento más

común en ésta es el dorso de la lengua. La presencia de Candida aumenta con la aplicación

de dispositivos intraorales tales como dentaduras o aparatos ortodónticos, particularmente

en el maxilar superior en la superficie del paladar. La Candida spp. Puede adherirse

fuertemente al acrílico. (Marsh Philip D, 2011). (Ceccotti, Sforza, Carzoglio, Luberti, &

Flichman, 2007)

La especie de Candida albicans es normalmente comensal inofensivo, cuando las

condiciones en la boca se alteran a una que favorezca la proliferación de la cándida, puede

ocurrir un cambio a un estado patógeno. (Marsh & Martin, 2011) Cawson, 2009 describe a

la Candida albicans como un parásito intracelular que crece dentro del citoplasma de las

células epiteliales, después de observarlas en el microscopio electrónico.

Se estima que está presente en más del 80% de todas las levaduras orales aisladas. (Marsh

& Martin, 2011). Entre un 25% y un 50% de las personas sanas portan microorganismos de

Candida en la microflora normal de la boca y de estos Candida albicans representa entre en

70% y 80% de las cepas. (Murray, Rosental, & Pfaller, 2007)

13

Morfología de la Candida albicans

Este hongo se presenta inicialmente con forma redondeada u ovoide y es unicelular, es decir,

como una levadura que produce yemas para su reproducción, su morfología puede cambiar

tornándose en células alargadas llamadas seudohifas

Candida albicans es un hongo dimórfico que como describe Pratz (2008) es todo

microorganismo que cambia su morfología Negroni (2009) menciona la capacidad de los

hongos del género Candida para crecer como levaduras, es decir células unicelulares ovoides

con blastoconidios que no son otra cosa que brotes en un extremo de la membrana, esto en

medios ricos en monosacáridos o disacáridos y en condiciones de aerobiosis; mientras que

en microaerobiosis y enriquecimiento con polisacáridos forman células alargadas llamadas

seudohifas. (Lamont, Hajisshengallis, & Jenkinson, 2014)

Figura 2. Esquema de la morfología de la Candida albicans. yemas(1); Pseudohifas (2);

micelio(3); clamidosporas (4).

Fuente. (Prats, 2008, pag. 95)

FACTORES DE VIRULENCIA

Adherencia.- Negroni (2009) la describe como la capacidad de adherirse tanto a

células del hospedero como a otros microorganismos e incluso a biomateriales de

dispositivos protésicos, en la cavidad oral esto permite que el organismo impida la

remoción a través de los efectos del flujo salival y del tragado. Marsh (2011) y

Lamont (2014) concuerdan en que las moléculas de la superficie de la Candida que

14

están implicadas en su adherencia se describen como adhesinas entre las cuales están

las manoproteinas y las adhesinas fibrilares y a su vez el componente de las células

huésped con que estas interactúan se refiere como receptores.

Morfología.- la Candida y particularmente la C. albicans una vez adherido al

huésped posee la capacidad de cambiar su morfología de levadura a una forma

filamentosa, con seudohifas o hifas verdaderas para penetrar el epitelio y aumentar

su resistencia a la fagocitosis. (Brooks, Carroll, Butel, Morse, & Mietzner, 2011)

(Lamont, Hajisshengallis, & Jenkinson, 2014)

Dimorfismo fenotípico.- son los cambios reversibles en la morfología de la colonia

inducida por la exposición a varios estímulos ambientales. El dimorfismo tiene

efectos en la adherencia, ya que como mencionan Ryan y Ray (2010) al cambiar la

forma de levadura a hifa ésta última tiene la capacidad de formar fijaciones fuertes a

las células epiteliales humanas. El dimorfismo es un factor que dependerá de la

virulencia que posea la cepa. (Murray, Rosental, & Pfaller, 2007)

Enzimas hidrolíticas.- facilita la destrucción de los tejidos del huésped, Marsh

(2011) describe las siguientes:

o Secreción de aspartil proteasa (SAP).- capacidad de degradar las proteínas

extracelulares de la matriz del huésped sería un factor patógeno obvio como

la destrucción de las proteínas del huésped implicadas en la defensa contra la

infección.

o Fosfolipasas (FP).- son enzimas que hidrolizan los fosfolípidos en ácidos

grasos. Su producción podría contribuir al daño de la membrana de la célula

huésped que podría promover a la lisis celular o exponer los receptores

facilitando la adherencia.

15

FACTORES ESPECÍFICOS QUE AFECTAN LA DISTRIBUCIÓN DE

Candida EN LA CAVIDAD BUCAL

El crecimiento de estos hongos está controlado por la microflora bacteriana, cuando esta

disminuye, por ejemplo por el tratamiento prolongado con antibióticos o cambios en el pH

hay proliferación de Candida y produce lesión. (Pérez & López , 2007)

CANDIDIASIS

La candidiasis ocurre en formas localizada y diseminada. La localizada se observa con

eritema y placas blanquecinas en pliegues cutáneos húmedos o en superficies mucosas

(algodoncillo oral). La enfermedad diseminada y en tejidos profundos se limita de manera

casi exclusiva a los individuos con inmunodepresión. (Ryan & Ray, 2010)

Es una enfermedad micótica causada por cualquiera de las especies del género Candida,

constituyéndose como una enfermedad oportunista, muy frecuente en nuestros días, en la

que siempre debemos investigar la presencia de factores favorecedores del crecimiento y

transformación patógena del germen. (Velasco, 2002)

2.3.1 CANDIDIASIS ORAL

Es la infección fúngica oral más frecuente, se la considera una micosis superficial producida

por agentes del género Candida especialmente C. albicans los cuales forman parte de la

microflora oral normal en muchas personas, especialmente en las que sufren de diabetes

mellitus y las que utilizan prótesis removibles. (Ibsen & Phelan, 2014) (Ceccotti, Sforza,

Carzoglio, Luberti, & Flichman, 2007)

ETIOPATOGENIA

Según Brooks (2014) la candidiasis oral surge por un incremento en el número local de

células de Candida y daño del epitelio, lo que permite la invasión local de levaduras y

seudohifas, ésta se hace sistémica cuando Candida penetra en la corriente sanguínea y las

defensas del hospedador no bastan para detener su proliferación. Velasco (2002) describe

16

los factores que facilitan la rotura del equilibrio saprófito-huésped, es decir, factores

predisponentes subdividiéndolos en:

Factores fisiológicos: edades extremas. Recién nacidos y adulto mayor.

Factores predisponentes generales: padecimientos sistémicos como diabetes,

leucemias, carencias de vitaminas, tratamientos quimioterápicos, SIDA e ingesta

prolongada de antibióticos y/o corticoides.

Factores predisponentes locales: xerostomía, mala higiene, mal estado bucal, y

prótesis defectuosas.

TIPOS DE CANDIDIASIS ORAL

2.3.1.2.1 CANDIDIASIS SEUDOMEMBRANOSA AGUDA (MUGUET)

“Forma clínica de infección por C. albicans, que consiste en placas blandas, cremosas, de

epitelio descamativo que contiene numerosos micelios enmarañados sobre una mucosa

eritematosa que se elimina fácilmente” (Saap, Eversole, & Wysocki, 2005). La

sintomatología suele ser mínima, pero puede producir dolor, ardor o disfagia en casos

extensos (Bascones, 2004).

Figura 3. Candidiasis pseudomembranosa.


DeLong & Burkhar (2015) hace referencia a este tipo de candidiasis como una encontrada

comúnmente en neonato de la misma manera Pérez y López (2007) mencionan que el recién

nacido debido a que no tiene colonización saprofita desarrollada puede infectarse con

Candida al pasar por el canal del parto; además generalmente está presente en

17

inmunodeprimidos, quimioterapias, uso prolongado de antibióticos, siendo más frecuente

en pacientes infectados por el VIH. (Ceccotti, Sforza, Carzoglio, Luberti, & Flichman, 2007)

2.3.1.2.2 CANDIDIASIS ATRÓFICA (ERITEMATOSA)

Marsh & Martin, (2011) la describe como una variedad de candidiasis a la cual la mucosa

está adelgazada, lisa y de color rojo brillante, con síntomas de ardor y aumento de

sensibilidad; normalmente se encuentra en el paladar, bajo una prótesis, pero también se

puede encontrar sobre la lengua y otras superficies mucosas. (Saap, Eversole, & Wysocki,

2005)

Figura 4. Dorso lingual marcadamente depilado, típico de candidiasis eritematosa crónica.


Se ha denominado también estomatitis protésica debido a que se presenta en área de prótesis

mal ajustadas y con más frecuencia en pacientes que no se retiran la prótesis por la noche.

Los pacientes se quejan de sensibilidad intensa y dolor ante la exposición a líquidos calientes

y fríos. (Ibsen & Phelan, 2014) (Negroni, 2009)

2.3.1.2.3 CANDIDIASIS HIPERPLASICA CRÓNICA

Produce una gruesa placa adherida a la mucosa, la cual como describe Ibsen & Phelan (2014)

no se desprende fácilmente al frotar a diferencia del muget, y se distingue de una leucoplasia

mediante biopsia. La localización clásica es el “dorso de la lengua y la mucosa oral

retrocomisural”, la placa es de grosor variable, y suele tener una textura nodular. (Cawson

& Edell, 2009)

18

TRATAMIENTO

Ryan & Ray (2010) hace énfasis en que se debe eliminar todo factor pre disponente como

una prótesis mal ajustada o contaminada, xerostomía y factores de tipo sistémico. Velasco,

(2002) describe que en el caso de estomatitis protésica se debe reparar los posibles desajustes

protésicos o la confeccion de nueva protesis de ser necesario, realizar una correcta higiene

de ésta, dejar de usarla al dormir y colocarla en anfotericina B o Clorhexidina al 2% o

hipoclorito al 5-10%.

Lamont, Hajisshengallis, & Jenkinson (2014) mencionan que el tratamiento para la

candidiasis oral es tópico, concuerda con esto Arce Mendoza (2009) argumentando que tanto

la nistatina como la anfotericina B o el ketoconazol en gel dan buen resultado al usarlo sobre

la mucosa de tres a cuatro veces al día, y solo en casos más complicado como cuando la

superficial se ha hecho sistémica o en pacientes inmunodeprimidos después de una

valoración del caso se deberá administrar antimicóticos de forma parenteral como el

ketoconazol de 200 a 400 mg diarios o fluconazol 100mg al día.

Stevia rebaudiana

La Stevia rebaudiana es una planta originaria del sudeste de Paraguay, pertenece a la familia

de las asteráceas. Es un arbusto que puede alcanzar de 65 a 80cm, y cultivadas hasta 1 m de

altura, sus hojas son lanceoladas sin peciolos, opuestas, con margen y miden alrededor de

5cm de longitud por 2 cm de ancho, crece en suelos arenosos cerca de arroyos de la parte

selvática subtropical. (Durán, Rodríguez, Cordón, & Record, 2012) (Bertoni, 2011)

2.4.1 HISTORIA DE LA Stevia rebaudiana

HISTORIA

Desde hace varios años las hojas de Stevia se han utilizado como endulcolorante para el mate

o como té medicinal entre los indígenas del Paraguay, quienes la conocen como “Kaa hee”

que significa hierba dulce (Durán, Rodríguez, Cordón, & Record, 2012)

19

En la época de la colonia en el siglo XVI, los españoles reportaron por primera vez el

consumo de la Stevia, (por los nativos sudamericanos). En 1887 fue identificada por el

botánico Moises Bertoni, quien fue el primero en elaborar estudios y publicaciones sobre

esta planta (Bertoni, 2011)

Posteriormente el químico paraguayo Ovidio Rebaudio aisló los principios activos de esta

planta y fue así como se descubrió que los componentes endulzantes eran glucósidos:

esteviósido y rebaudiósido A (Wallin, 2008).

2.4.2 Regulaciones

En 1970 en Japón se aprobó el uso de la Stevia en alimentos y bebidas, lo que significó la

sustitución de los endulcolorantes químicos artificiales. En Paraguay, Brasil, Chile y

Argentina también están autorizados su producción y comercialización. (Marin, 2004)

En Estados Unidos en 1995, la FDA aprobó la Stevia como endulcolorante, sometiéndola,

sin embargo a un sinnúmero de restricciones, como por ejemplo, solo se la podía consumir

como ingrediente de productos dietéticos, y venderse únicamente en tiendas naturistas

(Wallin, 2008)

En la unión europea han existido, de igual manera, prohibiciones para la comercialización

de Stevia. Sin embargo, como se menciona en la reunión 69de la JEFCA (Joint FAO/OMS

Expert Commite on food additives) en el año 2008, la Unión Europea extendió la aprobación

para la utilización de la Stevia en todos los usos actualmente aceptados para el aspartame, lo

que sugiere que el mercado en Europa tiene un gran potencial de expansión. Recientemente

(Abril del 2010), la autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) evaluó la

estabilidad de los esteviol glicósidos y estableció inclusive una ingesta diaria admitida (IDA)

para su uso de hasta 4 mg/Kg de peso corporal, lo que equivale a 720 mg para una persona

de 60 kg.

20

2.4.3 Cultivo en ecuador

La producción de Stevia en Ecuador ha ido creciendo los últimos años, se ha establecido que

la empresa Agroestevia que pertenece al ingenio Valdez es el mayor productor a nivel

nacional; está ubicada en cerecita provincia del Guayas y tiene 17 hectáreas de Stevia,

aunque actualmente se encuentra ampliando su cultivo. El ingenio Valdez exporta gran parte

de su producción, utiliza otra parte para su industrialización y una mínima cantidad lo vende

al mercado local. (Ibarra, 2011)

2.4.4 COMPOSICIÓN DE LA Stevia

Los principios de la Stevia rebaudiana se deben a sus componentes activos naturales

presente en las hojas, que son el Esteviósido y rebaudiósidos A, B, C, D, y E; dulcósido A y

Esteviolbiósido. (Kolb, Herrera, Ferreira, & Uliana, 2001), aparte de los glucósidos ya

mencionados, las hojas de Stevia contienen Ac. ascórbico, β-caroteno, cromo, cobalto,

magnesio, hierro, potasio, fósforo, rivoflavina, tiamina, estaño y zinc; además de estos se

encuentran productos químicos como apigenina, austroinilina, avicularin, β-sitoesterol,

ácido caféico, campesterol, cariofileno, centaureidin, ácido clorogénico, clorofila,

kaempferol, luteolina, quercetina, estigmasterol entre otras. (Sharma, y otros, 2006)

2.4.5 PROPIEDADES DE LA Stevia

Contra la diabetes

La principal propiedad analizada de la Stevia rebaudiana es la de endulzar mediante sus

glucósidos sin alterar el nivel de glucosa en las personas que lo consumen por lo que se está

abriendo campo cada vez más como endulcolorante mayormente usado por pacientes de

diabetes. (Anton et. Al 2010) (Chen et. Al. , 2005)

21

Control de peso y la obesidad

El consumo de Stevia es importante para la gente que desea perder peso, no solo porque

ayuda a disminuir la ingesta de calorías, sino porque reduce los antojos y la necesidad de

estar comiendo dulces.

Anton et. Al. (2010) midieron los efectos de la Stevia sobre la ingesta de alimentos, saciedad,

glucosa y niveles de insulina en comparación con el aspartamo y la sacarosa. Durante 3 días

aplico una precarga de cada endulzante (Stevia 290 kcal, aspartamo 290 kcal y sacarosa 493

kcal) 20 minutos antes de cada comida (desayuno, almuerzo y cena) a 40 individuos (19

normales y 12 obesos entre 18 y 50 años), además midió los niveles de glucosa en sangre 20

minutos antes y después de cada precarga. Los resultados de este experimento revelaron que

las personas que recibieron las precargas de Stevia y aspartame consumieron la misma

cantidad de alimentos que las que recibieron sacarosa a pesar de que consumió menos

calorías, además se observó una reducción en los niveles de glucosa e insulina postprandial

en aquellos que consumieron Stevia y una reducción de 1 Kg de peso.

La Stevia contra la hipertensión

Por años, las tribus guaraníes de Paraguay y Brasil han usado diferentes de Stevia

especialmente la Stevia rebaudiana, como endulzante para contrarrestar el sabor amargo de

los medicamentos a base de diferentes plantas y bebidas con fines medicinales que incluyen

la regulación de la glicemia y la hipertensión. (Lee et. Al. 2001)

Los primeros estudios tanto en animales y seres humanos demostraron que el esteviosido y

el extracto de Stevia tiene efecto vasodilatador, diurético y cardiotónico regulando la presión

y los latidos del corazón (Melis, Rocha, & Augusto, 2009)

Se han realizado diversos estudios sobre el efecto del extracto de hojas de Stevia contra la

hipertensión: Melis 1996 observo un efecto hipotensor en ratas entre 40 y 60 días después

de la administración de extracto de hojas de Stevia; del mismo modo, se reduce la presión

arterial en ratas después de dosis orales repetidas de esteviósido a 25 mg / Kg peso corporal

por día durante 6 semanas. (Chen, Jeppesen, Nordentoft, & Hermansen, 2007)

22

Los estudios en seres humanos han demostrado también el efecto del esteviósido en el

sistema cardiovascular. El esteviósido provoca bradicardia e hipotensión. Del mismo modo

un efecto hipotensor ligero fue observado en personas que recibieron un te preparado a base

de Stevia rebaudiana al día durante 30 días. (Kolb, Herrera, Ferreira, & Uliana, 2001)

Stevia como inmunomodulador

Un inmunomodulador es cualquier sustancia que ayuda a regular el sistema inmunológico,

no tiende a aumentar la inmunidad sino que la normaliza optimizando la respuesta inmune.

Este comportamiento se debe a que contiene alcaloides que contribuyen a la defensa celular

y valor hormonal. (Sharma, y otros, 2006)

Chen, (2005) realizó un ensayo en ratas para determinar la actividad inmunomoduladora del

esteviósido en diferentes parámetros del sistema inmune en tres dosis diferentes (6,25; 12,5;

25 mg/Kg peso). El estudio demostró que los esteviósidos aumentan sustancialmente la

proliferación en el LPS de Coe-A y B y células T estimuladas, respectivamente. Por lo tanto,

demostró que la Stevia es prometedora como agente inmuno-modulador, pues actúa

mediante la estimulación de la inmunidad celular y función fagocítica.

Efecto antimicrobiano

Se ha demostrado en estudios realizados que la Stevia contribuye a la prevención de la caries

ya que este no puede ser fermentado (11), además de comprobarse su efecto batericida y

bacteriostático sobre varias bacterias entre estas el Streptococcus muttans principal agente

que interviene en la caries dental. Manish (2006) hace mención también sobre sus

características antibióticas y anti fúngicas.

Actualmente se realizan investigaciones en Ecuador para la implementación de la Stevia

como parte del alimento de animales por sus propiedades antibióticas, por lo cual constituye

un producto promisorio en el área de producción orgánica de animales.

23

CAPITULO III

3 METODOLOGIA

Tipo de Diseño de la investigación

Este trabajo será realizó basado en diferentes tipos de investigación:

Estudio Experimental de Tipo Microbiológico.- Ya que es un estudio in vitro, que

fué realizado en un laboratorio microbiológico bajo condiciones de control.

Estudio transversal.-debido a que las variables fueron observadas en un solo

momento.

Prospectivo: Estudio en el cual el registro de los datos será orientado al futuro, ya

que pueden ser utilizados como base para nuevas investigaciones.

24

POBLACIÓN Y MUESTRA DEL UNIVERSO DE ESTUDIO

UNIVERSO: No se conoce con exactitud el tamaño total de la población por ello se estima

con fórmulas que no consideran ese aspecto.

MUESTRA.- Para determinar el tamaño de la muestra se utilizó la fórmula para

comparación de medias:

Elaboración: Ing. Guerrero

Figura 5. Formulación de muestra.

25

3.2.1 CRITERIOS DE INCLUSIÓN

Cepas puras de Candida albicans ATCC® 1023

Cultivo Agar Sabouraud Glucosado.

Extracto etanólico de Stevia rebaudiana al 30% conservado con las debidas medidas

de almacenamiento.

Stevia comercial en estado líquido con registro sanitario.

3.2.2 CRITERIOS DE EXCLUSION

Cultivo de Candida albicans con mala práctica de almacenamiento.

Cultivo Agar Sabouraud Glucosado libre de contaminación antrópica.

Stevia comercial expirado.

VARIABLES

3.3.1 DEFINICIÓN DE VARIABLES

VARIABLE DEPENDIENTE

Efecto inhibitorio: Impide o detiene el crecimiento del microorganismo, en este caso la

Candida albicans. Para medición se utilizara el método Kirby-Bauer, en el que se miden los

halos de inhibición observados alrededor de los discos que contienen la sustancia inhibitoria.

Para la incubación y crecimiento del hongo se utilizara el medio de cultivo Agar Sabouraud

Glucosado. (Marsh Philip D, 2011)

VARIABLE INDEPENDIENTE

Stevia rebaudiana: es una especie del género Stevia de la familia de las Asteráceas nativa

de la región tropical de Sudamérica, hace varias décadas se cultiva por sus componentes

edulcorantes y su contenido calórico, además se han publicado artículos donde describe

propiedades antimicrobianas. (Abreu, McBain, & Simoes, 2012)

Control positivo: Clorhexidina al 0.12%

Control negativo: suero fisiológico

https://es.wikipedia.org/wiki/Especie_(biolog%C3%ADa)

https://es.wikipedia.org/wiki/Stevia_(g%C3%A9nero)

https://es.wikipedia.org/wiki/Aster%C3%A1cea

https://es.wikipedia.org/wiki/Clima_tropical

https://es.wikipedia.org/wiki/Edulcorante

https://es.wikipedia.org/wiki/Calor%C3%ADa

26

3.1.1. OPERACIONALIZACIÓN DE VARIABLES

VARIABLES CONCEPTO DIMENSIÓN INDICADORES ESCALA

DEPENDIENTE

Efecto inhibitorio

Es la capacidad que posee

una sustancia de impedir

el crecimiento de un

microorganismo, en este

caso de la Cándida

Albicans ATCC® 10231,

en cual se medirá a través

de halos de inhibición

conocido como Método

Kirby-Bauer.

Regla milimétrica

< a 9mm es Resistente.

De 9 mm a 13 mm es

sensible al límite.

De 14mm a 18 mm es

sensible intermedio

>a 19mm es sumamente

sensible.

Cuantitativa

0

1

2

3

INDEPENDIENTE

Stevia rebaudiana

Especie del

género Stevia de la familia

de las Asteráceas que se

usa como endulcolorante

y se estudian sus

propiedades

antimicrobianas.

Extracto de las hojas secas

trituradas en la q se utilizó

como solvente alcohol

etanólico, por

percolación.

1: Extracto etanólico de

Stevia rebaudiana al 30%

Nominal

0

1

Extracto acuoso de hojas

de Stevia

2: Stevia comercial

Variable control

Sustancias control

Sustancias probadas de

inhibición o no de

crecimiento de C. albicans

1: control positivo

2:control negativo

1: Clorhexidina al 0.12%

2: suero fisiológico

0

1

https://es.wikipedia.org/wiki/Especie_(biolog%C3%ADa)

https://es.wikipedia.org/wiki/Stevia_(g%C3%A9nero)

https://es.wikipedia.org/wiki/Aster%C3%A1cea

27

PROCEDIMIENTO

3.4.1 Procedimiento de obtención de extracto de Stevia rebaudiana

1. Para obtener el extracto de Stevia rebaudiana se partió de la planta lavada

desinfectada y seca en una proporción de 1: 3, 1 parte de planta y 2.5 partes de

solución extractora; la solución extractora compuesta por 70 % alcohol etílico

potable y 30 % de agua destilada, para este caso particular se partió de un peso de

30 g de las hojas secas trituradas de la planta y un volumen de 70 ml de etanol

absoluto potable y de 30 ml de agua destilada estéril.

Figura 6. Hojas secas de Stevia rebaudiana

Fuente: investigación.

Elaboración: Katherine Estacio.

Figura 7 Proceso de percolación para obtención del extracto de Stevia rebaudiana al 30%



28

2. La planta junto con la solución extractora se las colocó en un recipiente de polietileno

con boca ancha y se sometió a percolación por 72 horas. La percolación es un proceso

mediante el cual la solución extrae los principios activos presentes en la planta la

cual al estar en contacto continuo con la solución extractora logra que se produzca

el fenómeno de difusión de los activos de la planta hacia el solvente hasta que se

alcance un equilibrio, este equilibrio se logra entre las 60 y 72 horas de percolación.

3. Una vez obtenido el extracto se lo sometió a calentamiento por 30 minutos a

temperatura de alrededor de 45 ° para concentrar el extracto; se lo filtró y luego se

dejó en reposo por 24 horas.

Figura 8. Proceso de filtración.



29

4. Pasado este tiempo se lo envasó en los recipientes previamente lavados y

desinfectados; se sometió a irradiación con el fin de eliminar la contaminación

bacteriana. El proceso se lo realizó en cámara de radiación ultravioleta por 1 hora.

Figura 9. Radiación durante una hora.



5. Con este procedimiento de extracción se obtienen extractos fluidos al 100 % de

concentración de activos puesto que al llegar a un equilibrio de concentración de

principios activos en la planta y en la solución extractora, el fenómeno de difusión

se detiene y la extracción llega a su límite máximo; es decir, no se pueden extraer

más activos de la planta.

3.4.2 Preparación del inoculo: Activación

Se utilizó una cepa de Cándida albicans ATCC® 1023. El significado de ATCC es

American Type Culture Collection, lo que indica que es un material biológico

certificado. Para la activación de la cepa de Candida Albicans se utilizó las

indicaciones entregadas por MEDIBAC, empresa proveedora de la misma:

30

1. Se dejó el duopack que contenía la cepa sin abrir para que se equilibre a la

temperatura ambiente. Se rasgó la funda.

Figura 10. Cepa de Candida albicans sellado



2. Se arrancó la porción de lengüeta con la etiqueta y se adjuntó al cultivo primario

para darle registro de control de calidad.

3. Se sujetó (sólo una vez) la ampolla en la parte superior del empaque (justo debajo

del menisco de fluido de la ampolla) encontrando la tapa para liberar el

hidratante.

4. Se sostuvo verticalmente y se presionó en la superficie dura para facilitar el flujo

de fluido a través del eje en la parte inferior de la unidad que contenía una bolita.

Se permitió que el fluido pase a través del mango de la torunda y en la parte

inferior de la unidad que contenía el sedimento.

31

Figura 11. Ampolla que contiene la cepa.



5. Se apretó en la parte inferior de la unidad, se aplastó el precipitado en el líquido

hasta que la suspensión estuvo homogénea.

6. Inmediatamente, fuertemente se saturó un hisopo con los materiales hidratados y

se hizo la transferencia a un T.S.B. de 10ml que es el Agar Tripcasa de Soya el

cual permite el crecimiento vigoroso de microorganismos, en éste caso de

Candida albicans.

Figura 12. Hisopo sometido en cepa de Candida albicans



32

7. Para la preparación del inóculo se tomó como referencia un estándar con una

turbidez de 0.5 Mcfarland. Se comparó la turbidez de manera visual.

Figura 13. Comparación del inoculo con el estándar Mcfarland de 0,5 turbidez.



8. Mediante la eliminación adecuada de riesgo biológico, se desechó el empaque.

9. Se incubó inmediatamente el inóculo a la temperatura de 35 centígrados durante

48 horas.

Figura 14. Inóculo primario de Candida albicans.



33

Figura 15. Inóculo en incubación.



3.4.3 Preparación de medio de cultivo: Sabouraud Glucosado Agar

Medio que se utilizó para el aislamiento, identificación y conservación de hongos patógenos

y saprófitos.

Fundamento

Medio de cultivo recomendado por Nolteen 1986 para el aislamiento y desarrollo de hongos.

En el medio de cultivo, la pluripeptona y la glucosa, son los nutrientes para el desarrollo de

microorganismos. “El alto contenido de glucosa, la presencia de cloranfenicol y el pH ácido,

favorecen el crecimiento de hongos por sobre el de bacterias, además, al medio de cultivo,

pueden agregarse otros agentes selectivos de crecimiento” (Williams & Lewis, 2000).

Procedimiento

Se suspendió 65g de polvo del medio deshidratado por litro de agua destilada. Se dejó

reposar 5 minutos y se mezcló hasta uniformar. Se calentó agitando frecuentemente y se

hirvió 1 minuto hasta disolver. Se esterilizó 15 minutos a 121ºC y se colocó Gentamicina

(presentación en ampollas adquirida comercialmente). Finalmente se vertió en cajas Petri se

dejó enfriar y solidificar.

34

Figura 16. Agar Sabouraud glucosado



3.4.4 Preparación de discos

Se dispusieron los discos de papel filtro previamente esterilizados en autoclave y secados en

estufa en cajas Petri estériles, donde se los dividió en 4 grupos de 30, se le colocó 20

microlitros de cada sustancia a evaluar para cada grupo, es decir, al primer grupo de discos

Stevia comercial “Multidulzura”, al segundo grupo extracto etanólico de Stevia rebaudiana

al 30%, al tercer grupo el control positivo que fue la Clorhexidina al 0.12% y al cuarto grupo

el control negativo que en éste caso fue el suero fisiológico, esto utilizando una micropipeta

digital para mejor exactitud, puesto que una sobrecarga falsearía los resultados.

Figura 17. Preparación de discos con pipeta digital.



35

3.4.5 Siembra en el Agar Sabouraud Glucosado

Una vez que estuvo solidificado el Agar Sabouraud Glucosado, se procedió a realizar una

siembra por agotamiento o estría múltiple con un hisopo estéril se sumergió en el inóculo ya

preparado, posterior se realizaron estrías con dicho hisopo en el agar, las estrías se las realizó

en tres direcciones y alrededor lo que permitió en la Candida albicans crezca en toda la

superficie.

Figura 18. Siembra de Candida albicans en Agar Sabouraud Glucosado.



Se dejó secar las placas por 5 minutos para luego proceder a la colocación de los discos las

preparados.

3.4.6 Colocación de los discos en el cultivo

Previo a la colocación de los discos se rotuló cada una de las cajas Petri con el número de

repetición y la señalización de “Cl” para la Clorhexidina al 0.12%, “Sf” para el suero

fisiológico, “MD” para la Stevia comercial “Multidulzura” y “PE” para el extracto etanólico

al 30% de la planta Stevia rebaudiana.

36

Figura 19. Rotulaión de placas.



Se dispuso con una pinza estéril 1 disco en cada caja Petri por cada presentación de Stevia

(Stevia comercial “Multidulzura” y extracto etanólico de Stevia rebaudiana al 30%) al igual

que 1 disco del control positivo que en éste caso fue la Clorhexidina al 0.12% y 1 por el

control negativo que en este fue suero fisiológico, quedando cuatro discos por cada cultivo.

Se dejó reposar la caja petri durante 15 minutos para luego voltearla y depositarla en la estufa

de incubación a 37°C por 48 horas.

Figura 20. Cultivos listos para incubar.



37

3.1.2. Lectura de los halos de inhibición

Después de dos días con un calibrador para método de ensayo de la susceptibilidad de Kirby

Bauer se midieron los halos de inhibición que se produjeron en cada una de las cajas Petri,

para lo cual se tomó como referencia las pautas de Duraffourd.

Figura 21. Halo de inhibición medido mediante calibrador para método Kirby Bauer.



Posterior se compararon las lecturas con los halos de inhibición que resultaron del control

positivo que fue la clorhexidina al 0.12%, para interpretar.

3.4.7 Manejo de desechos

Para evitar riesgo de contaminación por desechos, en el laboratorio en el que se trabajó se

realizó un adecuado manejo interno y externo de residuos peligrosos biológicos infecciosos,

de modo que no atenta contra la salud de los seres humanos.

38

CAPITULO IV

ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

Una vez realizada la investigación procede al análisis de los resultados obtenidos para la

medición de la inhibición de crecimiento, producida por la Stevia comercial y el extracto

etanólico de Stevia rebaudiana al 30%, sobre Cándida albicans ATCC® 1023, mediante el

método Kirby-Bauer, utilizando la herramienta estadística SPSS V22 y el Excel 2016.

Inicialmente se realizará el análisis descriptivo de los datos según el tipo de presentación de

Stevia aplicado:

Tabla 1 Distribución de Frecuencias de la prueba de Stevia comercial de Multidulzura Categoría Medición

en mm

Frecuencia Porcentaje

válido

Porcentaje

acumulado

Sensible al

límite

9 mm 7 23.3 23.3

10 mm 12 40.0 63.3

11 mm 8 26.7 90.0

12 mm 3 10.0 100.0

Total 30 100.0

Fuente : Resultados pruebas de laboratorio

Elaboración : Ing. Fernando Guerrero

La tabla 1 refleja los grupos de datos que han sido utilizados para la demostración del efecto

inhibitorio de la Stevia comercial de nombre “Multidulzura”, para el crecimiento de las cepas

de Candida albicans en 48 horas; donde el 40% de las mediciones corresponden a 10mm,

mientras que un 26,7% miden 11 mm; así mismo, el 23.3% posee un diámetro de 9 mm

quedando finalmente un 10% que mide 12 mm de donde estos resultados indican que este

extracto es sensible al límite.

Gráfico 1 Distribución de frecuencias de la Stevia comercial Multidulzura



712

830

51015

Stevia comercial Multidulzura

39

El gráfico 1 permite determinar con claridad la distribución de la variable Stevia comercial

“Multidulzura” en referencia al diámetro de los halos y la frecuencia de cada resultado

obtenido en el que se destaca el de 10 mm con 12 repeticiones.

Tabla 2 Distribución de Frecuencias de la prueba del Extracto de Stevia al 30% CATEGORÍA MEDICIÓN Frecuencia Porcentaje

válido

Porcentaje

acumulado

Sensible al

límite

8 mm 3 10.0 10.0

9 mm 16 53.3 63.3

10 mm 11 36.7 100.0

Total 30 100.0

Fuente: Resultados pruebas de laboratorio


En la tabla 2 se aprecian los grupos de datos que han sido utilizados para la demostración

del efecto inhibitorio del extracto etanólico d-e Stevia rebaudiana al 30%, para el

crecimiento de las cepas de Candida albicans en 48 horas; donde el 53.3% de las mediciones

corresponden a 9 mm, mientras que un 36,7% miden 10 mm; finalmente un 10% que mide

8 mm. Estos resultados indican que este extracto es sensible al límite.

.

Gráfico 2 Distribución de frecuencias del Extracto de Stevia al 30% Fuente : Resultados pruebas de laboratorio


El gráfico 2 muestra la distribución del variable extracto de Stevia al 30%, en referencia al

diámetro de los halos y la frecuencia de cada resultado obtenido donde se destaca que la

medida con mayor frecuencia es 9 mm con 16 repeticiones.

316 11

0

10

20

Extracto de Estevia al 30%

40

Tabla 3 Distribución de Frecuencias de la prueba control positivo

Con Clorhexidina 0,125% CATEGORÍA MEDICIÓN Frecuencia Porcentaje

válido

Porcentaje

acumulado

Sensible al

límite

13 mm 1 3.3 3.3

Muy Sensible 14 mm 8 26.7 30.0

15 mm 14 46.7 76.7

16 mm 7 23.3 100.0

Total 30 100.0



La tabla 3 refleja los grupos de datos que resultaron del grupo control con Clorhexidina al

0.125% para el crecimiento de las cepas de Candida albicans en 48 horas; donde el 46.7%

de las mediciones corresponden a 15mm, el 26,7% miden 14 mm; así mismo, el 23.3% posee

un diámetro de 16 mm quedando finalmente un 3.3% que mide 13 mm.

Gráfico 3 Distribución de frecuencias de Clorhexidina 0.125%



También se establecieron las comparaciones entre los efectos inhibitorios producidos por la

Stevia comercial y el extracto etanólico de Stevia rebaudiana al 30% sobre Candida albicans

para finalmente establecer el efecto inhibitorio con el control positivo que en este caso es la

Clorhexidina al 0,125%

18

147

05

1015

13 14 15 16

Sensible allímite

Muy Sensible

Clorhexidina 0,125%

41

Gráficos de caja y bigote para establecer la distribución intercuartil de los datos en las

distribuciones:

Gráfico 4 Distribución intercuartil del Extracto de Stevia al 30%



El gráfico 4 permite observar la distribución intercuartil del extracto etanólico de Stevia al

30%, donde se observa que está sesgada a la izquierda y no posee valores atípicos, cabe

anotar que la mayoría de datos se concentran entre la mediana y el tercer cuartil.

Gráfico 5 Distribución intercuartil de la Stevia comercial Multidulzura



El gráfico 5 permite observar la distribución intercuartil del extracto de la Stevia comercial

“Multidulzura”, donde se observa que presenta una simetría y no posee valores atípicos, cabe

anotar que la mayoría de datos se concentran entre la mediana y el tercer cuartil.

Q1

Q3

Me

Me

Q1

Q3

42

Tabla 4 Cálculo estadístico de los extractos

Estadísticas de muestra única Estadísticos

MULTI DULZURA N 30

Media 10.33

Desviación estándar 0.935

Media de error estándar 0.171

EXTRACTO DE ESTEVIA

AL 30%

N 30

Media 9.27



CLORHEXIDINA 0,125% N 30

Media 14.90





La tabla 4 permite observar los estadísticos calculados para cada uno de los extractos en

donde se tiene la media, desviación estándar y la media del error estándar. En lo que respecta

a la media aritmética, el valor más bajo corresponde al extracto etanólico de Stevia al 30%

(9.27); sin embargo, el valor 9.27 ˃ 8, que es el límite entre resistencia a la inhibición y la

sensibilidad a la misma según las pautas utilizadas.

Gráfico 6. Comparación de medias


Elaboración : Ing. Fernando Guerro

En el gráfico 6 se evidencia la comparación de medias, donde se observa un promedio de

14,90mm de halos de inhibición para el control positivo, un promedio de 10,33mm de halos

de inhibición para la Stevia comercial “Multidulzura” representado con la barra azul, y para

el extracto etanólico de Stevia rebaudiana al 30% se obtuvo un promedio de 9,27mm de

10,339,27

14,90

Media en milimetros

Comparación de medias

MULTIDULZURA

EXTRACTO DEESTEVIA AL30%CLORHEXIDINA 0,125%

43

diámetro representado con la barra roja siendo el promedio más bajo obtenido en relación

con los antes mencionados.

Para determinar el efecto antimicótico producido nos basamos en las pautas de Duraffourd

descritas en la tabla 1. Se determinó mediante T-student la significancia con relación a las

pautas de Duraffourd.

DIÁMETRO DE HALO CARACTERÍSTICA DE

SENSIBILIDAD

INFERIOR A 8 mm Nula (-)

ENTRE 8 Y 14 mm Sensibilidad límite

(sensible=+)

ENTRE 14 Y 20 mm Muy sensible (++)

SUPERIOR A 20 mm Sumamente sensible (+++)

Tabla 5 Prueba t student pata muestra única

Valor de prueba = 8

t Gl Sig.

(bilateral)

Diferencia

de medias

95% de intervalo

de confianza de la

diferencia

Inferior Superior

MULTI

DULZURA

13.079 29 0.000 2.233 1.88 2.58

EXTRACTO DE

ESTEVIA AL

30%

10.846 29 0.000 1.267 1.03 1.51

CLORHEXIDINA

0,125%

47.064 29 0.000 6.900 6.60 7.20



La tabla 5 presenta los resultados de la prueba t student, para muestra única, se aplicó esta

prueba para establecer el nivel de inhibición comparado con el valor límite (r ˂ 8) para

determinar la sensibilidad de cada uno de los extractos utilizados.

Como se analizó en la tabla 4, todos los extractos son sensibles o a su vez producen el efecto

inhibitorio del crecimiento de las cepas de Candida albicans, la prueba de t student devuelve

valores de p (Sig.) que tienden a 0 por lo tanto si 0 ˂ 0.05, se puede rechazar la hipótesis

nula dado que se ha obtenido y valor de α menor. Por otra parte, el valor t calculado en cada

caso es mayor al valor t teórico según los grados de libertad y el nivel de confianza, por los

tanto se ratifica que se rechaza la hipótesis nula.

44

DISCUSIÓN

En el estudio in vitro realizado se analizó a la Stevia rebaudiana en dos presentaciones: el

extracto etanólico al 30% de la planta y a la Stevia comercial “Multidulzura” ambas para

determinar el efecto antimicótico que pudiesen tener sobre Candida albicans, dando como

resultado halos de inhibición con una media de 10,33mm de diámetro para la Stevia

comercial y de 9,27mm de diámetro para el extracto etanólico de Stevia rebaudiana al 30%,

lo que indicó que Candida albicans es sensible a mencionadas presentaciones de Stevia,

basándonos en las pautas de Durafford al igual que en la investigación de finalización de

carrera presentada por Pérez (2013) “efecto antibacteriano in vitro del extracto etanólico de

Stevia rebaudiana sobre Streotococcus mutans” donde los extractos se consideraron activos

si el diámetro de la zona de inhibición era de 8 mm o más.

Chilaca y Cava (2014) en su estudio “Valoración in vitro de la actividad antimicótica del

extracto de Stevia rebaudiana contra Candida albicans” determinaron que el extracto de

Stevia rebaudiana al 10% sobre la siembra de Candida albicans genera un halo promedio

de 12 mm; para el extracto de Stevia rebaudiana al 20% generó un halo promedio de 16 mm

y para el extracto al 30% se obtuvo un halo promedio de 20 mm, siendo valores mayores

que los obtenidos en el presente estudio, se asume que la diferencia de datos puede estar

dada por el método para la obtención del extracto de Stevia.

Existen estudios en los que se analizó a la Stevia rebaudiana sobre otros microorganismos

que cabe mencionar como el realizado por Manish, Tadhani, & Rema (2006), en el cual

elaboraron extractos de Stevia con diferentes solventes como agua, metanol, acetato de etilo

y hexano contra cuatro bacterias gram positivas (B. subtilis, S. aureus, M. letus, B.

megaterium), cuatro gram negativas (S. marcensens, P. aeruginosa, E. coli, P. valgaris) y

hongos como R. oligosporus y A. niger en los que se observo resultados con halos desde los

9 mm contra B. sublitis, hasta 22 mm contra R. oligosporus, siendo resultados muy elevados

en contraste con los resultados q generó en éste estudio sobre Candida albicans.

De la misma forma Vitery Sapuyes, Escribano, Gamboa, & Chavarría, (2010) realizo un

estudio in vitro similar al de Manish donde se comparó la influencia de extractos de Stevia

rebaudiana elaborados con diferentes solventes, pero en éste caso sobre microorganismos

45

que comúnmente se encuentran en cavidad oral como son Streptococcus mutans y

Lactobacillus acidophilus del cual resultó que el extracto con agua como solvente dio un

halo de 9 mm de diámetro tanto para S. mutans como para L. acidophillus; el extracto

metanólico produjo un halo promedio de 11.5mm para el S. mutans y 12mm para el L.

acidophillus; del extracto con acetato de etilo como solvente resultó 11.5mm para el S.

mutans y 10.5 mm para el L. acidophillus; del extracto con hexano como solvente se obtuvo

14.5 mm y 15.5 mm para S. mutans y L. acidophillus.

A diferencia de ésta investigación en la que se tomaron los datos a las 48 horas, en el estudio

de Vitery se tomaron las mediciones de los halos a las 72 horas de incubación de los cultivos

por lo que se podría decir que los extractos de Stevia rebaudiana tuvieron un efecto tardío

sobre los microorganismos.

46

CAPITULO V

CONCLUSIONES

Se determinó que tanto la Stevia comercial como el extracto etanólico de Stevia

rebaudiana al 30% genera inhibición de crecimiento sobre la cepa de Candida

albicans basado en las pautas de Durafford.

Mediante el método de Kirby Bauer se obtuvo un halo de inhibición de crecimiento

de Candida albicans para la Stevia comercial con una media de 10,33 mm, siendo

mayor que la media de los halos que generaron el extracto etanólico al 30% de Stevia

rebaudiana un halo de 9, 27mm.

El control positivo en éste caso la Clorhexidina al 0.12% obtuvo un halo de inhibición

de una media de 14,90mm lo que indicó un mayor efecto antimicótico que la Stevia

rebaudiana en sus dos presentaciones, tomando en cuenta que son productos

sintéticos elaborados con este fin q poseen investigaciones de años de precedencia.

47

RECOMENDACIONES

Se debe realizar nuevas investigaciones con diferentes porcentajes de concentración

de la Stevia rebaudiana para encontrar mejores resultados.

Analizar si la Stevia tiene efecto sobre otras especies de Candida, como Candida

glabrata, C. krusei, y C. tropicalis; esto debido a que son especies que también se

encuentran presentes en la candidiasis aunque en menor porcentaje.

Continuar con investigaciones que permitan conocer el poder antimicrobiano que

pueda poseer la Stevia rebaudiana en especial contra microorganismos que afectan

a nivel oral con el fin de a futuro determinar la viabilidad para desarrollar enjuagues

bucales a base Stevia rebaudiana que puedan servir como tratamiento coadyuvante

o de prevención a enfermedades de cavidad bucal.

Se debería analizar la sensibilidad de Candida albicans sometida a extractos de

Stevia rebaudiana a diferentes tiempos de incubación, es decir, a las 24 horas, a las

48 horas y las 72 horas.

48

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51

ANEXOS

Anexo 1.Certificado de control de calidad del extracto etanólico de stevia rebaudiana al 30%

52

Anexo 2. Certificación de la cepa de Candida albicans

53

Anexo 3. Certificado del Lab. Clínico de la Facultad de Ciencias Químicas UCE de haber

realizado el experimento.

54

Anexo 4. Protocolo de manejo de desechos.

55

Figura 22. Área de esterilización de desechos del laboratorio clínico de la Facultad de

Ciencias Química UCE

56

Anexo 5 Realización de prueba piloto.

Proceso de filtración

Radiación por 1 hora

ELABORACIÓN DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE STEVIA REBAUDIANA AL

30%

Stevia comercial

y clorhexidina

Extracto etanólico d

Stevia rebaudiana al

30%

ACTIVACION Y SIEMBRA DE Candida albicans

57

Esterilización de aza

para preparar la Candida

albicans

Nivel de turbidez 0.5

Mcfarland

siembra de Candida albicans en Sabouraud Agar

Glucosado

cepa ya activada

Hisopo cargado en Cándida

albicans

58

PREPARACIÓN Y COLOCACIÓN DE DISCOS DE KIRBY-BAUER CON

SUSTANCIAS A EVALUAR

Colocación de los discos

Medida de 20 micro

litros con la pipeta

Colocación de los 20 micro litros de

cada una de las sustancias.

Resultado de prueba piloto

Se presentó un halo de inhibición

de 9.8 mm con el extracto etanólico

de Stevia rebaudiana al 30%.

59

MATERIALES UTILIZADOS

Figura 23. Aza estéril

Figura 24. Cámara de bioseguridad donde fue realizada la prueba.

60

Figura 25. Pinza estéril para colocación de discos.

Figura 26. Pipeta digital.

61

Figura 27. 30 cajas petri utilizadas

Figura 28. Suero fisiológico utilizado como control negativo.

62

Figura 29. Cepa de Candida albicans.

Figura 30. Extracto etanólico al 30%; clorhexidina utilizada como control positivo; Stevia

comercial "Multidulzura"

63

Figura 31. Discos divididos en grupos.

Figura 32. Luz fluorescente para clara medición de resultados.

64

Figura 33. Cultivo después de 48 horas de incubación.

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR … · RESUMEN La candidiasis oral es una patología cada vez más...

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