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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
QUÍMICA FARMACÉUTICA
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA MEDIANTE LA EXTRACCIÓN
DE LA FRACCIÓN ACTIVA PRESENTE EN LAS HOJAS DE LA ESPECIE VEGETAL
Moringa oleífera FRENTE A MICROORGANISMOS PATÓGENOS
Proyecto de investigación presentado como requisito previo para la obtención del título de:
Químico Farmacéutico
AUTOR: Dayana Pamela Sarasti Moya
TUTOR: Borja Espín Dayana Paulina
DMQ, MARZO 2018
ii
DEDICATORIA
Este trabajo está dedicado a Dios y a mi
familia que son el pilar fundamental de mi vida.
iii
AGRADECIMIENTOS
A Dios por ser mi guía durante todas las etapas de mi vida.
A mi madre Nancy por su infinito amor y su apoyo incondicional hacia mí, por ser parte
de mis triunfos y fracasos, por siempre darme ánimos para seguir en los momentos
difíciles, gracias mamá por tu esfuerzo y dedicación día a día, todo lo que soy te lo debo
a ti.
A mi padre Carlos, por todo su apoyo y su ejemplo, por sus sabios consejos, que me han
servido para ser una buena persona, gracias por ser parte fundamental de mi formación y
estar presente en cada momento de mi vida. A mi tía Jenny, gracias por ser una amiga
para mí, por tu apoyo y cariño a lo largo de esta travesía.
A mis hermanos Yesy, Paula, Dennis y Martín por todo su cariño, por ser mis mejores
amigos, por siempre estar a mi lado alegrando mis días y dándome ánimos para continuar.
A mis tíos Pablo y Eddy por sus consejos diarios y por estar siempre pendientes de mí.
A mi compañero de vida Carlitos, con quien empezó este sueño y que hoy lo culminamos
juntos, gracias por tu amor, por tu apoyo en este largo camino, por ser parte de vida en
los buenos y malos momentos.
A mi Tutora MSc. Dayana Borja por su apoyo y paciencia durante toda esta investigación,
y por los conocimientos impartidos hacia mí, que hoy me llevan a este gran triunfo.
A mi tribunal, el Dr. Fernando Novillo por su ejemplo como docente, por colaborar
conmigo en esta investigación, por sus consejos y por ser como un amigo para mí y al Dr.
Trosky Yánez por sus consejos para mejorar mi investigación, por su paciencia y tiempo.
A la Dra. Susana López quien me ofreció su ayuda proporcionándome la especie vegetal
para este trabajo investigativo.
A la Dra. Rommy Terán por ser una guía durante el trabajo experimental en Microbiología
y su ayudante de cátedra Paola Obando por colaborar conmigo en esta investigación.
Al Dr. Carlos Calderón quien a lo largo de mi vida universitaria ha estado apoyándome
con sus consejos y pendiente de mí, gracias Doctor por ser mi profesor y un buen amigo
a la vez.
A mis amigas Jessy P. Jessy L. y Rose que han compartido tantos momentos a mi lado,
que han sido incondicionales conmigo, gracias por cada aventura juntas, por su apoyo en
los momentos difíciles.
A mis amigos Richy y Andrés F. a quienes conocí el primer día de universidad y que
hasta hoy se han convertido en personas muy importantes para mí, gracias por su amistad
sincera, por sus consejos y por los momentos vividos.
Finalmente mi más sincero agradecimiento a la Universidad Central del Ecuador,
Facultad de Ciencias Químicas que a través de los conocimientos impartidos por sus
docentes han permitido mi formación profesional.
Dayana.
iv
AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL
Yo, Dayana Pamela Sarasti Moya en calidad de autora del trabajo de investigación:
Evaluación de la actividad antimicrobiana mediante la extracción de la fracción
activa presente en las hojas de la especie vegetal Moringa oleifera frente a
microorganismos patógenos, autorizo a la Universidad Central del Ecuador, a hacer uso
de todos los contenidos que me pertenecen o parte de los que contienen esta obra, con
fines estrictamente académicos o de investigación.
Los derechos que como autora me corresponden con excepción de la presente
autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los
artículos 5, 6, 8; 19 y demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su
Reglamento.
También, autorizo a la Universidad Central del Ecuador a realizar la digitalización y
publicación de este trabajo de investigación en el repositorio virtual, de conformidad a lo
dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.
Quito, 09 de Marzo del 2018.
Dayana Pamela Sarasti Moya
C.I. 172492903-7
v
CONSTANCIA DE APROBACIÓN DEL TUTOR
Yo, en calidad de tutor del trabajo de investigación titulado: Evaluación de la actividad
antimicrobiana mediante la extracción de la fracción activa presente en las hojas de
la especie vegetal Moringa oleifera frente a microorganismos patógenos, elaborado
por la estudiante Dayana Pamela Sarasti Moya de la Carrera de Química Farmacéutica,
Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador, considero que el
mismo reúne los requisitos y méritos necesarios en el campo metodológico y en el campo
epistemológico, incluido las paginas preliminares, por lo que lo APRUEBO, a fin de que
sea sometido a la evaluación por parte del tribunal calificador que se designe.
Dado en la ciudad de Quito, a día 09 del mes de Marzo del 2018
Dayana Paulina Borja Espín
C.I. 171099384-9
vi
CONSTANCIA DE APROBACIÓN DEL TRABAJO FINAL POR EL
TRIBUNAL
El Tribunal constituido por: Dr. Fernando Novillo, Dr. Trosky Yánez y MSc. Dayana
Borja, luego revisar el trabajo de investigación titulado: Evaluación de la actividad
antimicrobiana mediante la extracción de la fracción activa presente en las hojas de
la especie vegetal Moringa oleifera frente a microorganismos patógenos, previo a la
obtención del título (o grado académico) de Química Farmacéutica presentado por la
señorita Dayana Pamela Sarasti Moya APRUEBA el trabajo presentado.
Para constancia de lo actuado firman:
vii
ÍNDICE DE CONTENIDOS
RESUMEN ................................................................................................................................ xv
ABSTRACT ............................................................................................................................. xvi
INTRODUCCIÓN ................................................................................................................. xvii
CAPÍTULO I ............................................................................................................................... 1
EL PROBLEMA ......................................................................................................................... 1
1.1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ................................................................ 1
1.2. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA..................................................................... 2
1.3. OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN ............................................................... 2
1.3.1. Objetivo general .................................................................................................. 2
1.3.2. Objetivos específicos ......................................................................................... 2
1.4. IMPORTANCIA Y JUSTIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN ................... 2
CAPÍTULO II ............................................................................................................................. 5
MARCO TEÓRICO ................................................................................................................... 5
2.1. ANTECEDENTES ..................................................................................................... 5
2.2. FUNDAMENTO TEÓRICO .................................................................................... 6
2.2.1. El árbol de Moringa oleífera: Descripción Morfológica ............................... 6
2.2.2. Taxonomía ........................................................................................................... 7
2.2.3. Distribución ......................................................................................................... 7
2.2.4. Composición química ........................................................................................ 8
2.2.5. Aplicaciones ........................................................................................................ 8
2.2.6. Flavonoides.......................................................................................................... 8
2.2.7. Caracterización de Flavonoides ........................................................................ 9
2.2.8. Procesos de extracción ..................................................................................... 10
2.2.9. Antimicrobianos ................................................................................................ 10
2.2.10. Mecanismos de resistencia bacteriana ........................................................... 10
2.2.11. Microorganismos patógenos ........................................................................... 11
2.2.11.1. Escherichia coli ........................................................................................ 12
2.2.11.2. Pseudomonas aeruginosa ........................................................................ 12
2.2.11.3. Staphylococcus aureus ............................................................................. 13
2.2.11.4. Klebsiella pneumoniae ............................................................................. 14
2.2.12. Métodos de evaluación antimicrobiana ......................................................... 14
2.2.12.1. Métodos de difusión ................................................................................. 15
2.2.12.2. Métodos de dilución ................................................................................. 17
viii
2.2.13. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) ..................................................... 18
2.2.14. Microdilución en placa .................................................................................... 19
2.2.15. Control Positivo ................................................................................................ 19
2.3. FUNDAMENTO LEGAL ....................................................................................... 20
2.4. HIPÓTESIS ............................................................................................................... 21
2.4.1. Hipótesis de trabajo .......................................................................................... 21
2.4.2. Hipótesis nula .................................................................................................... 21
2.5. CONCEPTUALIZACIÓN DE VARIABLES ...................................................... 21
CAPÌTULO III .......................................................................................................................... 23
METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN .................................................................... 23
3.1. DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN .................................................................... 23
3.2. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................... 23
3.2.1. Materiales .......................................................................................................... 23
3.2.2. Metodología ....................................................................................................... 25
3.2.2.1. Proceso de Recolección: .......................................................................... 25
3.2.2.2. Tratamiento de la muestra ....................................................................... 25
3.2.2.3. Proceso de Extracción .............................................................................. 25
3.2.2.4. Tamizaje Fitoquímico .............................................................................. 26
3.2.2.5. Cuantificación de flavonoides ................................................................. 27
3.2.2.6. Evaluación de la actividad antimicrobiana ............................................ 28
3.2.2.7. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) ............................................. 30
3.3. DISEÑO EXPERIMENTAL .................................................................................. 31
3.3.1. Diseño Factorial A x B .................................................................................... 31
3.4. TÉCNICA DE PROCESAMIENTO DE DATOS ............................................... 36
3.5. MATRIZ DE OPERACIONALIZACIÓN DE VARIABLES ........................... 36
CAPÍTULO IV.......................................................................................................................... 37
ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS ................................................................ 37
4.1. PROCESO DE EXTRACCIÓN ............................................................................. 37
4.1.1. Tamizaje Fitoquímico ...................................................................................... 38
4.2. CUANTIFICACIÓN FLAVONOIDES ................................................................ 39
4.3. ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA POR EL MÉTODO DE LOS POCILLOS
EN AGAR ............................................................................................................................. 41
4.4. MICRODILUCIÓN EN PLACA ........................................................................... 45
4.4.1. Evaluación del porcentaje de Inhibición ....................................................... 53
ix
CAPÍTULO V ........................................................................................................................... 66
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ................................................................... 66
5.1. Conclusiones ............................................................................................................. 66
5.2. Recomendaciones ..................................................................................................... 67
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................. 68
ANEXOS ................................................................................................................................... 73
x
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo 1. Certificado de Identificación botánica ................................................................. 73
Anexo 2. Hojas frescas y secas de Moringa oleifera ......................................................... 74
Anexo 3. Extracción por el Método Soxhlet ...................................................................... 74
Anexo 4. Marcha Fitoquímica ............................................................................................... 75
Anexo 5. Identificación de flavonoides, reacciones de coloración ................................. 76
Anexo 6. Cromatografía de Flavonoides ............................................................................. 76
Anexo 7. Cepas bacterianas ................................................................................................... 77
Anexo 8. Halos de inhibición formados a partir del extracto total de hojas frescas y secas
en bacteria Escherichia coli .................................................................................................... 77
Anexo 9. Halos de inhibición formados a partir de la fracción activa de hojas frescas y
secas en bacteria Escherichia coli ......................................................................................... 78
Anexo 10. Halos de inhibición formados a partir del extracto total de hojas frescas y
secas en bacteria Klebsiella pneumoniae ............................................................................. 78
Anexo 11. Halos de inhibición formados a partir de la fracción activa de hojas frescas y
secas en bacteria Klebsiella pneumoniae ............................................................................. 78
Anexo 12. Halos de inhibición formados a partir del extracto total de hojas frescas y
secas en bacteria Staphylococcus aureus .............................................................................. 79
Anexo 13. Halos de inhibición formados a partir de la fracción activa de hojas frescas y
secas en bacteria Staphylococcus aureus ............................................................................. 79
Anexo 14. Halos de inhibición formados a partir del extracto total de hojas frescas y
secas en bacteria Pseudomonas aeruginosa......................................................................... 79
Anexo 15. Halos de inhibición formados a partir de la fracción activa de hojas frescas y
secas en bacteria Pseudomonas aeruginosa......................................................................... 80
Anexo 16. Diluciones seriadas en microplaca para Escherichia coli con los diferentes
extractos ..................................................................................................................................... 80
Anexo 17. Diluciones seriadas en microplaca para Pseudomonas aeruginosa con los
diferentes extractos ................................................................................................................... 80
Anexo 18. Diluciones seriadas en microplaca para Staphylococcus aureus con los
diferentes extractos ................................................................................................................... 81
Anexo 19. Diluciones seriadas en microplaca para Klebsiella pneumoniae con los
diferentes extractos ................................................................................................................... 81
Anexo 20. Diagrama de flujo del Proceso de Extracción .................................................. 82
Anexo 21. Diagrama de causa efecto ................................................................................... 83
Anexo 22. Halos de Inhibición CLSI ................................................................................... 84
xi
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Estructuras de la especie vegetal Moringa oleifera ............................................. 7
Figura 2. Distribución de la especie vegetal Moringa oleifera . ......................................... 8
Figura 3. Estructura básica de un flavonoide . ...................................................................... 9
Figura 4. Estructura de la Quercetina ..................................................................................... 9
Figura 5. Escherichia coli al microscopio y en cultivo ...................................................... 12
Figura 6. Pseudomonas aeruginosa al microscopio y en cultivo. .................................... 12
Figura 7. Staphylococcus aureus al microscopio y en cultivo .......................................... 13
Figura 8. Klebsiella pneumoniae al microscopio y en cultivo ......................................... 14
Figura 9. Difusión por cilindro plac. ..................................................................................... 16
Figura 10. Difusión de disco en agar . .................................................................................. 16
Figura 11. Pocillos en agar. .................................................................................................... 17
Figura 12. Método de dilución ............................................................................................. 17
Figura 14. Concentración Mínima Inhibitoria: Dilución en caldo. ................................... 18
Figura 15. Placa para microdilución ..................................................................................... 19
Figura 16. Estructura química de la Ceftriaxona................................................................. 19
Figura 17. Extractor Soxhlet. ................................................................................................. 26
Figura 18. Esquema de cuantificación de flavonoides ....................................................... 28
Figura 19. Esquema de microdilución en placa .................................................................. 31
xii
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Susceptibilidad antimicrobiana del control positivo, Ceftriaxona ..................... 20
Tabla 2. Susceptibilidad antimicrobiana de la Ceftriaxona frente a las diferentes cepas
bacterianas ................................................................................................................................. 20
Tabla 3. Factores y niveles del diseño experimental, Fase III ........................................... 31
Tabla 4. Tratamientos del diseño, Fase III ........................................................................... 32
Tabla 5. Factores y niveles del diseño experimental, Fase IV ........................................... 32
Tabla 6. Tratamientos del diseño, Fase IV ............................................................................ 34
Tabla 7. ANOVA para un diseño factorial AxB ................................................................. 36
Tabla 8. Matriz de Operacionalización de Variables .......................................................... 36
Tabla 9. Porcentaje de rendimiento de extracción .............................................................. 37
Tabla 10. Resultados del Tamizaje Fitoquímico ................................................................. 38
Tabla 11. Datos de Concentración y Absorbancia del estándar Quercetina .................... 39
Tabla 12. Concentración de flavonoides en extractos totales y fracciones activas......... 40
Tabla 13. Halos de inhibición según el tipo de cepa bacteriana con el extracto total .... 41
Tabla 14. Análisis de Varianza para halos de inhibición formados por el Extracto Total
..................................................................................................................................................... 42
Tabla 15. Halos de inhibición según el tipo de cepa bacteriana con la fracción activa . 42
Tabla 16. Análisis de Varianza para halos de inhibición formados por la Fracción activa
..................................................................................................................................................... 43
Tabla 17. Halos de inhibición formados con el control positivo frente a cada cepa
bacteriana ................................................................................................................................... 44
Tabla 18. Resultados de absorbancia para el Extracto Total frente a las diferentes cepas
bacterianas ................................................................................................................................. 45
Tabla 19. Resultados de absorbancia para la Fracción activa frente a las diferentes cepas
bacterianas ................................................................................................................................. 47
Tabla 20. Porcentaje de Inhibición del Extracto Total frente a las diferentes cepas
bacterianas ................................................................................................................................. 53
Tabla 21. Análisis de Varianza para el porcentaje de Inhibición del Extracto total ....... 58
Tabla 22. Porcentaje de Inhibición de la Fracción Activa frente a las diferentes cepas
bacterianas ................................................................................................................................. 59
Tabla 23. Análisis de Varianza para el porcentaje de Inhibición de la Fracción activa . 64
Tabla 24. Concentración Mínima Inhibitoria de las diferentes cepas bacterianas en
relación al tipo de hoja. ............................................................................................................ 64
xiii
ÍNDICE DE GRÁFICAS
Gráfica 1. Porcentaje de Rendimiento de extracción a partir de Hojas Frescas y Secas 38
Gráfica 2. Curva de calibración del Estándar de Quercetina ............................................. 39
Gráfica 3. Concentración de flavonoides distribuidos según el tipo de hoja .................. 40
Gráfica 4. Promedio de los halos de inhibición con el Extracto Total ............................. 41
Gráfica 5. Promedio de los diámetros de los halos de inhibición con la Fracción activa
..................................................................................................................................................... 43
Gráfica 6. Promedio de los diámetros de los halos de inhibición con el control positivo
..................................................................................................................................................... 44
Gráfica 7. Concentración Mínima Inhibitoria del extracto total de hojas frescas y hojas
secas frente a Escherichia coli ................................................................................................ 49
Gráfica 8. Concentración Mínima Inhibitoria de la Fracción activa de hojas frescas y
hojas secas frente a Escherichia coli ...................................................................................... 49
Gráfica 9. Concentración Mínima Inhibitoria del extracto total de hojas frescas y hojas
secas frente a Pseudomonas aeruginosa ............................................................................... 50
Gráfica 10. Concentración Mínima Inhibitoria del extracto total de hojas frescas y hojas
secas frente a Pseudomonas aeruginosa ............................................................................... 50
Gráfica 11. Concentración Mínima Inhibitoria del Extracto total de hojas frescas y hojas
secas frente a Staphylococcus aureus .................................................................................... 51
Gráfica 12. Concentración Mínima Inhibitoria del extracto total de hojas frescas y hojas
secas frente a Staphylococcus aureus .................................................................................... 51
Gráfica 13. Concentración Mínima Inhibitoria del extracto total de hojas frescas y hojas
secas frente a Klebsiella pneumoniae .................................................................................... 52
Gráfica 14. Concentración Mínima Inhibitoria del extracto total de hojas frescas y hojas
secas frente a Klebsiella pneumoniae .................................................................................... 52
Gráfica 15. Porcentaje de Inhibición del Extracto Total frente a Escherichia coli ........ 54
Gráfica 16. Porcentaje de Inhibición del Extracto Total frente a Pseudomonas aeruginosa
..................................................................................................................................................... 55
Gráfica 17. Porcentaje de Inhibición del Extracto Total frente a Staphylococcus aureus
..................................................................................................................................................... 56
Gráfica 18. Porcentaje de Inhibición del Extracto Total frente a Klebsiella pneumoniae
..................................................................................................................................................... 57
Gráfica 19. Porcentaje de Inhibición de la Fracción activa frente a Escherichia coli ... 60
Gráfica 20. Porcentaje de Inhibición dela Fracción activa frente a Pseudomonas
aeruginosa ................................................................................................................................. 61
xiv
Gráfica 21. Porcentaje de Inhibición de la Fracción activa frente a Staphylococcus aureus
..................................................................................................................................................... 62
Gráfica 22. Porcentaje de Inhibición de la Fracción activa frente a Klebsiella pneumoniae
..................................................................................................................................................... 63
xv
TÍTULO: Evaluación de la actividad antimicrobiana mediante la extracción de la
fracción activa presente en las hojas de la especie vegetal Moringa oleífera frente a
microorganismos patógenos.
AUTOR: Dayana Pamela Sarasti Moya
TUTOR: Dayana Paulina Borja Espín
RESUMEN
El interés en la búsqueda de medicamentos a partir de extractos vegetales que tengan
poder antibacteriano, frente a infecciones potencialmente mortales causadas por
microorganismos patógenos, han permitido que el presente trabajo de investigación tenga
como propósito evaluar la actividad antimicrobiana mediante la extracción de la fracción
activa presente en las hojas de la especie vegetal Moringa oleífera frente a los principales
microorganismos patógenos que afectan la salud del ser humano. En este estudio se
obtuvieron extractos etanólicos por el Método de Soxhlet a partir de las hojas frescas y
hojas secas de esta especie vegetal. Se evaluó la actividad antimicrobiana del extracto
total y de la fracción activa mediante el método de los pocillos en agar frente a
microorganismos patógenos, obteniéndose como resultado que el extracto total y la
fracción extraída, exhiben patrones de sensibilidad eficaces frente a enterobacterias
(Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae) debido a que los halos de inhibición obtenidos
son ≥ 23 mm, superando los valores de referencia, un patrón de sensibilidad aceptable
para Staphylococcus aureus ya que los halos de inhibición obtenidos son ≥ 14 mm, por
lo tanto se puede determinar que estas cepas son sensibles a los extractos obtenidos, y una
susceptibilidad antimicrobiana intermedia frente a Pseudomonas aeruginosa ya que el
patrón de sensibilidad es ≥ 21 mm, por lo tanto con los halos de inhibición experimentales
obtenidos se puede deducir que esta cepa no es totalmente sensible a este tipo de extracto
ya que sus valores son menores que los de referencia.
PALABRAS CLAVES: MORINGA OLEIFERA, EXTRACTO TOTAL, FRACCIÓN
ACTIVA, ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA, PRINCIPALES
MICROORGANISMOS PATÓGENOS, SUSCEPTIBILIDAD.
xvi
TITLE: Evaluation of the antimicrobial activity by extracting the active fraction in the
leaves of the Moringa oleifera plant species against pathogenic microorganisms.
AUTHOR: Dayana Pamela Sarasti Moya
TUTOR: Dayana Paulina Borja Espín
ABSTRACT
The interest in the search for drugs that have an antibacterial effect against life-threatening
infections caused by pathogenic microorganisms, which have the present research work,
aims to evaluate the antimicrobial activity by extracting the active fraction present in the
leaves of the plant species Moringa oleifera against the main pathogenic microorganisms
that affect the health of the human being. In this study, ethanolic extracts were obtained
by the Soxhlet Method from the fresh leaves and dry leaves of this plant species. The
antimicrobial activity of the total extract and the active fraction was evaluated by the agar
well method against pathogenic microorganisms, obtaining as a result the total extract
and the fraction extracted, and exhibiting patterns of sensitivity against
enterobacteriaceae (Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae) because the inhibition
haloes obtained are ≥ 23 mm, exceeding the reference values, an acceptable sensitivity
pattern for Staphylococcus aureus since the inhibition haloes obtained are ≥ 14 mm,
therefore, it can be determined these strains are sensitive to obtained extracts, and an
intermediate antimicrobial susceptibility to Pseudomonas aeruginosa since the sensitivity
pattern is ≥ 21 mm, therefore with the experimental inhibition periods it can be deduced
that this strain is not totally sensitive to this type of extract since its values are lower than
those of reference.
KEY WORDS: MORINGA OLEIFERA, TOTAL EXTRACT, ACTIVE FRACTION,
ANTIBACTERIAL ACTIVITY, MAIN PATHOGENIC MICROORGANISMS,
SUSCEPTIBILITY.
xvii
INTRODUCCIÓN
La proliferación de enfermedades causada por microorganismos patógenos es una
preocupación generalizada, que constituye un factor de riesgo para la salud, es por esto
que se buscan fuentes naturales que inhiban el crecimiento bacteriano; descubriendo en
las plantas compuestos bioactivos para tal fin.
Moringa oleifera es una planta con innumerables propiedades nutritivas y
terapéuticas de la cual se puede aprovechar todas sus partes (semillas, raíz, hojas, flores,
vainas y frutos). Varios estudios demuestran las propiedades medicinales de la moringa
como antioxidante, en enfermedades respiratorias, cardiovasculares, gastrointestinales,
endocrinas, en el sistema nervioso central, en el sistema inmunológico y como
antibacteriano (Bonal, 2012).
Esta investigación se ha centrado básicamente en el estudio de la actividad
antimicrobiana que presenta esta especie vegetal frente a los principales microorganismos
patógenos que afectan la salud del ser humano entre los cuales tenemos cepas bacterianas
de Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Klebsiella
pneumoniae.
En el capítulo uno de este trabajo de investigación se analiza y se describe
detalladamente el planteamiento y formulación del problema basado principalmente en
como evaluar el efecto antimicrobiano mediante la extracción de la fracción activa
presente en las hojas de la especie vegetal Moringa oleífera frente a microorganismos
patógenos. En este capítulo se describen también los objetivos de esta investigación tanto
de forma general como específica. Finalmente se detalla la importancia y justificación de
realizar esta trabajo, con el fin de que este estudio sirva como un aporte para futuras
investigaciones.
En el capítulo dos se describe el marco teórico de la investigación, se empieza
detallando los antecedentes a este estudio, es decir, los trabajos anteriormente realizados
que sirvieron como base para esta investigación. Posteriormente se describe el
fundamento teórico, donde se analiza y se detalla la descripción morfológica, taxonomía,
distribución, propiedades, composición química y aplicaciones de la especie vegetal
Moringa oleifera, así como los procesos de extracción y los métodos de evaluación
antimicrobiana frente a microorganismos patógenos. Se detalla también la formulación
de la hipótesis describiendo la hipótesis nula como la hipótesis alternativa. Finalmente se
realiza la conceptualización de las variables.
En el capítulo tres se describe la metodología a utilizar durante este trabajo de
investigación donde se detalla el diseño que se va a llevar a cabo en este trabajo
investigativo, los métodos y materiales requeridos, el diseño experimental, la matriz de
operacionalización de las variables y procesamiento de datos.
En el capítulo cuatro se realiza el análisis y discusión de los resultados, bajo los
cuales se determina el mejor porcentaje de extracción entre hojas frescas y hojas secas,
se analiza los metabolitos secundarios presentes en esta especie vegetal, así como la
xviii
concentración de activo en los diferentes extractos obtenidos. Se determina la actividad
antimicrobiana mediante el método de los pocillos en agar, comprobando que tipo de
extracto presenta mejor actividad antimicrobiana comparando con los patrones de
sensibilidad. Finalmente se realiza la concentración mínima inhibitoria por el método de
microdilución en placa de cada extracto frente a las diferentes cepas bacterianas.
En el capítulo cinco se establecen las conclusiones de este trabajo de
investigación de acuerdo a los objetivos planteados y en relación a los resultados
obtenidos. También se describen algunas recomendaciones que servirán para futuras
investigaciones acerca de esta especie vegetal que presenta múltiples propiedades.
1
CAPÍTULO I
EL PROBLEMA
1.1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La salud pública enfrenta una crisis global a causa de las resistencias bacterianas.
Esta crisis tiene diversas dimensiones, todas igualmente importantes, sobre el uso
inapropiado de los antibióticos existentes que han acelerado exageradamente su resistencia.
Actualmente la falta de disponibilidad de antibióticos efectivos para las diferentes
poblaciones, ausencia de innovación y desarrollo de nuevos antibióticos han
comprometido la salud de las personas.
La proliferación de enfermedades causada por microorganismos patógenos es una
preocupación generalizada, que constituye un factor de riesgo para la salud, es por esto que
se buscan fuentes naturales que inhiban el crecimiento bacteriano; descubriendo en las
plantas compuestos bioactivos para tal fin (Corzo, 2012).
Desde el descubrimiento de los antibióticos, estos se han convertido en
medicamentos imprescindibles en la práctica médica, tanto para la prevención como para
el tratamiento de infecciones bacterianas en salud humana. En las últimas décadas, debido
principalmente al uso excesivo o inadecuado de los mismos se ha ido observando la
progresiva aparición de bacterias resistentes a la acción de estos fármacos. El desarrollo de
la resistencia a los antibióticos se presenta como uno de los mayores problemas de salud
pública, que es necesario afrontar en el momento actual, especialmente la aparición y
diseminación de bacterias multirresistentes y la escasez de tratamientos alternativos
(Ministerio de Medio Ambiente , 2017).
Según la OMS el uso excesivo e indiscriminado de antibióticos se ha convertido en
una de las principales amenazas para la salud mundial, ya que las bacterias se han vuelto
resistentes haciendo que las infecciones más comunes no puedan ser asistidas y que los
tratamientos actuales dejen de funcionar, de tal manera que las infecciones ocasionadas por
patógenos resistentes a los antibióticos han aumentado la duración de las hospitalizaciones,
los costos médicos y la mortalidad.
La producción farmacéutica en el Ecuador a partir de plantas de uso medicinal es
escasa, además los fitofármacos producidos son de venta libre sin comprobar la calidad de
los mismos constituyendo así un factor de riesgo para quienes consuman estos productos
que generalmente no cumplen con las exigencias establecidas de seguridad y eficacia.
La emergencia de la resistencia bacteriana ha generado nuevos intereses en la
búsqueda de medicamentos con poder antibacteriano, prueba de ello es el aumento en los
últimos años del número de publicaciones, centradas en los productos naturales y actividad
antimicrobiana, como fuentes de moléculas bioactivas frente a microorganismos con alta
capacidad infectiva (Ramírez & Marín, 2009).
2
1.2. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA
¿Presentan actividad antimicrobiana los extractos obtenidos a partir de las hojas
frescas y hojas secas de la especie vegetal Moringa oleífera frente a microorganismos
patógenos de: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y
Klebsiella pneumoniae?
1.3. OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN
1.3.1. Objetivo general
Determinar la actividad antimicrobiana frente a microorganismos patógenos a partir
de la extracción de la fracción activa de las hojas frescas y secas de la especie
vegetal Moringa oleífera.
1.3.2. Objetivos específicos
Realizar la identificación botánica de la especie vegetal.
Realizar el proceso de extracción a partir de las hojas frescas y secas de la especie
vegetal Moringa oleífera por el método de Soxhlet utilizando como solvente etanol
(70°).
Realizar una marcha fitoquímica de los extractos obtenidos para identificar los
metabolitos presentes en las hojas frescas y secas de la especie vegetal Moringa
oleífera, mediante pruebas de identificación y perfil cromatográfico.
Determinar cuantitativamente el porcentaje de flavonoides presente en los extractos
obtenidos mediante valoración espectrofotométrica utilizando como marcador
Quercetina.
Evaluar la actividad antimicrobiana mediante el método de los pocillos en agar
frente a cepas bacterianas de Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,
Staphylococcus aureus y Klebsiella pneumoniae.
Determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) mediante el método de
microdilución en placa frente a cepas bacterianas de Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Klebsiella pneumoniae.
1.4. IMPORTANCIA Y JUSTIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN
La frecuencia de infecciones potencialmente mortales causadas por
microorganismos patógenos ha aumentado en todo el mundo y se está convirtiendo en una
importante causa de morbilidad y mortalidad. La creciente prevalencia de cepas
multirresistentes de bacterias y la aparición reciente de cepas con susceptibilidad reducida
a los antibióticos aumentó el espectro de las infecciones bacterianas "intratables" y añade
urgencia a la búsqueda de nuevas estrategias de lucha contra las diferentes infecciones
(Rahman, 2009).
Por un largo tiempo las plantas han sido una fuente importante de productos
naturales para la salud humana. Las propiedades antimicrobianas de las plantas han sido
3
investigadas en varios estudios en todo el mundo y muchos de ellos se han utilizado como
alternativas terapéuticas debido a sus propiedades antibióticas (Rahman, 2009). El uso de
los agentes antimicrobianos en la terapéutica de las enfermedades infecciosas, ha
constituido un acontecimiento sin precedentes, porque la curación y control de las
infecciones ha permitido modificar favorablemente el panorama de la morbilidad y
mortalidad del adulto, en el que estas afecciones ocupaban el primer lugar entre las causas
de muerte (Cordiés & Hamilton, 1998).
Con la finalidad primordial de incentivar y acelerar la investigación de nuevos
antibióticos, la Organización Mundial de la Salud (OMS) publicó en marzo del 2017 su
primera lista de “patógenos prioritarios” resistentes a los antibióticos, que incluye las
bacterias más peligrosas para la salud humana. La OMS divide su lista en tres categorías
por su urgencia en la necesidad de encontrar nuevos antibióticos: prioridad crítica, elevada
o media.
En el grupo de prioridad crítica y elevada se incluyen bacterias multirresistentes
que han adquirido resistencia a un elevado número de antibióticos. Estas son espacialmente
peligrosas para la salud humana y presentan un alto riesgo de contagio en hospitales,
residencias de ancianos y entre pacientes inmunodeficientes. Por lo que en este trabajo de
investigación se incluyen para su estudio las siguientes bacterias de prioridad crítica:
Pseudomonas aeruginosa, enterobacterias como: Klebsiella pneumoniae y Escherichia
coli y de prioridad media: Staphylococcus aureus.
Actualmente se ha generado un problema que deriva del mal uso de los antibióticos,
especialmente del consumo excesivo o inadecuado de los mismos, por lo cual la OMS
sugiere en la práctica médica y a quienes conforman los equipos de salud, que es de gran
importancia incluir la educación y capacitación a los pacientes sobre el uso de antibióticos,
soporte a las decisiones terapéuticas a través del mejoramiento de los servicios de
diagnóstico, implementación de guías de tratamiento, auditar su prescripción, dispensación
y promoción.
A pesar de la existencia de potentes agentes antibióticos y antifúngicos, las cepas
están apareciendo continuamente de forma resistente o multirresistente, imponiendo la
necesidad de una búsqueda intensa y el desarrollo de nuevos fármacos. Por lo tanto, la
búsqueda de nuevas fuentes de antibióticos debe ser un proceso continuo (Rahman, 2009).
Para preservar la eficacia de estos valiosos medicamentos es necesario asegurar su uso
responsable y prudente, aumentando la concienciación y el conocimiento sobre las
resistencias antimicrobianas (Ministerio de Medio Ambiente , 2017).
De acuerdo a la Organización Mundial de Salud, tres cuartos de la población en
países en desarrollo utilizan plantas medicinales como su principal fuente de tratamientos
contra enfermedades (Luqman & Ibrahim , 2014). Muchos de los usos documentados de
las plantas medicinales del Ecuador son vagos y se refieren en su mayoría a síntomas (tos,
fiebre, diarrea, dolor) más no a enfermedades diagnosticadas. Sin embargo, su acción
terapéutica es evidente, por lo que el estudio de la farmacología de los compuestos
4
bioactivos – los compuestos químicos en plantas que tienen actividad biológica en el
cuerpo humano – es necesaria (De la Torre & Navarrete, 2008).
La extracción de los bioactivos presentes en las hojas de la especie vegetal Moringa
oleifera generan un precedente de gran importancia ya que éstos podrían presentarse como
una opción terapéutica frente a diferentes patologías relacionadas con infecciones
producidas por microorganismos patógenos frente a los cuales éstos serán efectivos
mediante su efecto antimicrobiano. Este trabajo servirá además para investigaciones
posteriores de productos naturales obtenidos a partir de la especie vegetal Moringa oleifera
debido a las diferentes actividades farmacológicas que presenta y tomando en cuenta que
actualmente los fitofármacos tienen un valor terapéutico importante para el tratamiento y
prevención de distintas enfermedades, además de que éstos proveen oportunidades
ilimitadas para el hallazgo de nuevos fármacos.
5
CAPÍTULO II
MARCO TEÓRICO
2.1. ANTECEDENTES
“Potenciales aplicaciones de Moringa oleifera. Una revisión crítica” Martín, C. (2013)
En este artículo de investigación se presenta una amplia revisión bibliográfica sobre
las diferentes aplicaciones, usos y propiedades que presenta la especie vegetal Moringa
oleifera. En este estudio se detalla los usos medicinales de esta planta así como la
justificación fitoquímica de los efectos terapéuticos. También se describe sus diferentes
propiedades entre las cuales tenemos: actividad antimicrobiana, antioxidante,
antiinflamatoria, hipoglucemiante, antihipertensiva y su uso frente al cáncer. Se muestra
también sus efectos adversos y aplicaciones a nivel industrial. El análisis crítico de la
bibliografía disponible sobre la utilización de Moringa oleifera revela que, aunque todavía
quedan puntos por aclarar, una parte considerable de los beneficios que se le atribuyen
están confirmados científicamente. Según los autores del presente artículo, esta especie es
un biorrecurso de mucho interés para su explotación (Martín & García , 2013).
“Antibacterial Activity of Leaf Juice and Extracts of Moringa oleifera Lam. against
Some Human Pathogenic Bacteria” Rahman, M. (2009)
En este artículo de investigación se describe la actividad antibacteriana del extracto
de las hojas de Moringa oleifera, in vitro mediante la comparación entre extractos acuosos
y etanólicos los cuales fueron utilizados por el método de disco de difusión en agar y por
concentración mínima inhibitoria contra bacterias patógenas humanas. Ambos extractos
mostraron una potente actividad antimicrobiana frente a bacterias Gram negativas y Gram
positivas por lo que podrían ser utilizados como antibióticos naturales de espectro
extendido, sin embargo cabe recalcar que el extracto etanólico presenta una marcada
diferencia en cuanto al extracto acuoso, ya que el primero no exhibe actividad
antimicrobiana frente a Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes. Los
investigadores determinaron que los bio - componentes que contiene la planta son análogos
al antibiótico tetraciclina lo que le confiere su capacidad antimicrobiana de espectro
extendido (Rahman, 2009).
“Antimicrobial activity of moringa oleifera lam., leaf extract, against selected bacterial
and fungal strains” Devendra, B. (2011)
En este artículo de investigación publicado por la Revista Internacional de Farmacia
y Biociencias, se describe la potente capacidad antimicrobiana que posee la especie vegetal
Moringa oleifera Lam frente a una amplia gama de patógenos bacterianos como:
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Streptococcus
pyogenes e inclusive algunos hongos como Aspergillus niger y Candida albicans. El
estudio demostró que los extractos de las hojas en cloroformo son muchos más eficaces
6
que los extractos en los que se utilizó éter de petróleo. Los investigadores concluyeron que
los extractos de esta especie vegetal tienen excelentes propiedades curativas frente a
patógenos infecciosos sin efectos secundarios en comparación a los antibióticos sintéticos,
sin embargo se necesita más estudios para aislar metabolitos secundarios que podrían
causar interacciones en el organismo humano (Devendra, 2011).
“Phytochemical and antibacterial investigations of moringa (Moringa oleifera) leaf
extract on selected bacterial pathogens” Abubakar, I. (2016)
Este artículo de investigación tuvo como objetivo principal evaluar los beneficios
para la salud que presenta la hoja de Moringa oleifera, utilizando extractos metanólicos y
acuosos en diferentes concentraciones (1:1 y 1:2) para determinar su cribado fitoquímico
y su actividad antimicrobiana aplicando el método de difusión en agar frente a cepas de
Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Streptococcus pneumoniae. El cribado
fitoquímico indicó la presencia de metabolitos secundarios tales como: alcaloides,
flavonoides, antraquinonas, taninos y fenoles. En ambos extractos se mostró actividad
notable contra el crecimiento de las bacterias seleccionadas, pero el extracto metanólico en
mayor proporción que el extracto acuoso. El resultado de este estudio mostró que Moringa
oleifera podría ser un medicamento antibacteriano valioso en el tratamiento de infecciones
causadas por los organismos de ensayo (Abubakar, 2016).
“Antibacterial Efficacy of Moringa oleifera Leaf against Medically Important Clinical
Pathogens” Manikandan, P. (2016).
En este artículo de investigación se describe la actividad antimicrobiana de las hojas
de Moringa oleifera frente a cepas bacterianas de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae,
Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pyogenes, Bacillus sp, Proteus sp, Salmonella sp
y Shigella sp. Utilizando como solventes para el proceso de extracción acetona,
cloroformo, metanol y éter de petróleo en diferentes concentraciones y el método de
difusión de disco en agar para la susceptibilidad microbiana. Se obtuvo como resultado
final que el extracto de las hojas en metanol mostró mayor actividad antimicrobiana frente
a todas las cepas establecidas por lo que se puede concluir que esta planta sería una opción
terapéutica para infecciones causadas por patógenos debido a su alto potencial antibiótico
(Manikandan, 2016).
2.2. FUNDAMENTO TEÓRICO
2.2.1. El árbol de Moringa oleífera: Descripción Morfológica
Moringa oleifera es una especie de muy rápido crecimiento. Alcanza de 7-12 m de
altura y de 20-40 cm de diámetro, con una copa abierta tipo paraguas y fusto recto, la
corteza es blanquecina. Aporta una elevada cantidad de nutrientes al suelo, además de
protegerlo de factores externos como la erosión, la desecación y las altas temperaturas
(Polini, 2011).
7
Las hojas son compuestas de unos 20 cm de largo con hojuelas delgadas oblongas
u ovaladas de 1 a 2 cm. de largo de color verde claro.
Las flores son bisexuales, con pétalos de color crema y estambres amarillos, muy
numerosos y fragantes, son polinizadas por abejas, otros insectos y algunas aves.
Los frutos en cápsulas trilobuladas, dehiscentes, de 20 a 40 cm de longitud.
Contienen de 12 a 25 semillas por fruto. Las semillas son de forma redonda y color castaño
oscuro, con tres alas blanquecinas. Cada árbol puede producir de 15 000 a 25000 semillas
por año. Las vainas maduras permanecen en el árbol por varios meses antes de partirse y
de liberar las semillas, las cuales son dispersadas por el viento, agua y probablemente
animales.
Las semillas son carnosas cubiertas por una cáscara fina de color café. Poseen tres
alas o semillas aladas de 2,5 a 3 mm de largo. Al quitar la cáscara se obtiene el endospermo
que es blanquecino y muy oleaginoso. Cuando se almacenan las semillas por más de dos
meses disminuye su poder germinativo.
La raíz principal mide varios metros y es carnosa en forma de rábano. Es pivotante
y globosa lo que le brinda a la planta cierta resistencia a la sequía en periodos prolongados.
Si se le hacen cortes a la corteza, produce una goma de color rojizo parduzco (Polini, 2011).
2.2.2. Taxonomía
Figura 1. Estructuras de la especie vegetal
Moringa oleifera
Nombre
Científico:
Moringa
oleifera Lam
Reino: Plantae
División: Magnoliophyta
Clase: Magnoliopsida
Orden: Brassicales
Familia: Moringaceae
Género: Moringa
Especie: Moringa oleifera
(Sherwin & Olson, 2012)
2.2.3. Distribución
Moringa oleifera, es un árbol perteneciente a la familia Moringaceae, es nativo de
las estribaciones meridionales del Himalaya. En la actualidad se cultiva prácticamente en
todas las regiones tropicales, subtropicales y semiáridas del mundo. Puede crecer en
condiciones de escasez de agua, pero su cultivo intensivo, con irrigación y fertilización,
aumenta los rendimientos de biomasa hasta superar las 100 toneladas por hectárea (Martín
& García , 2013).
8
Figura 2. Distribución de la especie vegetal Moringa oleifera (Polini, 2011).
2.2.4. Composición química
La corteza de la raíz contiene afomina y espiraquina. Las semillas y la raíz
contienen 4 (a-L-ramnosiloxi) benzilisocianato y pterigospermina. El aceite contiene
ácidos palmitico, esteárico, benoptérico y moríngico (Sherwin & Olson, 2012).
La semilla contiene aceite fijo (21%): ácidos oleico (67.5%), esteárico (10.5%);
bencenoides: (α-L-ramnosil-oxi) fenil-acetonitrilo, 4-hidroxi-fenilacetonitrilo y 4-hidroxi-
fenilacetamida, moringina, niazirina, derivados de bencil-carbamatos; misceláneos:
niazimicina; compuestos sulfurados: bencil-4-rhamnosil-oxi-glucosinolato,
pterigospermina, 4-(α-L-ramnosil-oxi)-bencil isocianato y derivados; esteroles: derivados
de daucosterol (Tramil, 2017).
La hoja contiene bencenoides: derivados de bencil-carbamatos y bencil-
tiocarbamatos; alcaloides: colina, ácido nicotínico; flavonoides: gossipitina, quercetina y
derivados, rutina; compuestos sulfurados: derivados de isotiocianato; misceláneos:
niazicina A, B, niazimina A, B (Tramil, 2017).
2.2.5. Aplicaciones
- Alimentación humana: valor nutritivo, vitamínico y mineral
- Usos medicinales: tos, fiebre, vómitos, etc.
- Prevención del cáncer
- Actividad antiinflamatoria
- Actividad antioxidante
- Actividad antimicrobiana
- Actividad hipoglucemiante y antihipertensiva (Martín & García , 2013).
2.2.6. Flavonoides
El término flavonoides proviene del latín "flavus", que significa "amarillo" y refiere
a una serie de metabolitos secundarios presentes en las plantas. Son pigmentos naturales
responsables de los colores vivos de muchas frutas y verduras y del color otoñal de las
hojas. Comprenden un grupo de compuestos polifenólicos a los que se les atribuye
9
propiedades antioxidantes, antiinflamatorias, antitrombóticas, antimicrobianas,
antialérgicas, antitumorales y antiasmáticas.
Estructuralmente están compuestos de dos anillos aromáticos (A y B) ligados a un
anillo pirano (C), obteniendo un esqueleto de difenilpiranos común en la mayoría de
flavonoides (Escamilla, 2009).
Figura 3. Estructura básica de un flavonoide (Escamilla, 2009).
Quercetina
Es un flavonoide tricíclico que se encuentra glicosilado, específicamente es un flavonol
que en su estructura presenta un grupo carbonilo en posición 4 y un grupo –OH en posición
3 del anillo C. (Escamilla, 2009). Los glicósidos flavonoides son considerados como
importantes productos medicinales para la prevención o el tratamiento de varias
enfermedades.
La Quercetina presenta numerosos efectos beneficiosos para la salud humana, incluyendo
actividad antibacteriana, antitumoral, protección cardiovascular, prevención de las
cataratas, efectos antihipertensivos, etc.
Figura 4. Estructura de la Quercetina
2.2.7. Caracterización de Flavonoides
Reacciones de Coloración
La reacción más usual para la detección de flavonoides en un extracto de p lanta es
la reacción de Shinoda: al extracto alcohólico se añaden pequeñas limaduras de magnesio
y unas cuantas gotas de HCl concentrado, el desarrollo inmediato de coloración es
indicativo de la presencia de: Flavonas: amarillo o rojo, Flavanoles: rojo a magenta,
Flavanonas: rojo, magenta, violeta o azul e Isoflavonas: amarillo que además pueden
estar acompañadas de abundante espuma. (Lock, 1997).
10
Otra reacción utilizada para la identificación de flavonoides es la de Cianidina,
mediante la cual al extracto obtenido se le añade una solución de alcohol etílico 50° y HCl
concentrado en una relación 2:1 (v/v) con limaduras de magnesio, observándose una
resultado positivo con la formación de una coloración anaranjada rojiza que se desarrolla
lentamente (Delporte, 2010).
Cuantificación espectrofotométrica de flavonoides
Este tipo de análisis permite determinar la cantidad de un metabolito específico presente
en un extracto, mediante la comparación con un estándar definido y a una longitud de onda
establecida de acuerdo a la absorción del activo.
2.2.8. Procesos de extracción
Para lograr una concentración adecuada de los principios activos contenidos en las
plantas y que su acción sea más efectiva es necesario realizar diversos procedimientos
mediantes los cuales sean extraídos aquellos con solventes adecuados que se seleccionan
de acuerdo a la solubilidad y la estabilidad que posean las sustancias beneficiosas. Los
métodos de extracción permiten obtener los productos en formas farmacéuticas adecuadas
para su administración oral o externa de acuerdo al lugar de acción que se recomiende . Las
farmacopeas han incluido dentro de sus especificaciones regulaciones con fundamento
científico para garantizar la calidad de estos preparados, los cuales no precisan de un
control tan exacto como los medicamentos oficiales, pero deben observarse algunos
cuidados en cuanto a la conservación y tiempo de almacenamiento (Bravo, 2013).
Los métodos de extracción dependen de la naturaleza química de las sustancias,
presentes en la planta y al propósito de la investigación. Si el trabajo va dirigido al
aislamiento de sustancias para la comprobación de actividad biológica, la extracción del
material vegetal debe hacerse utilizando solventes que se seleccionan de acuerdo a la
solubilidad y la estabilidad que posean las sustancias beneficiosas. Frecuentemente
extracción se realiza con solventes orgánicos de bajo punto de ebullición (alcohol, acetato
de etilo) y de baja reactividad. Algunas veces es conveniente desengrasar el material
vegetal con éter de petróleo (extracto etéreo) o hexano. El alcohol es generalmente más
eficaz para recuperar la mayoría de los metabolitos secundarios. Los extractos son
evaporados bajo presión reducida o liofilizados, en el caso de extracción con agua
(Marcano & Hasegawa, 2002).
2.2.9. Antimicrobianos
Sustancias naturales o sintéticas que se utiliza con fines terapéuticos para el
tratamiento de enfermedades infecciosas causada por bacterias patógenas.
2.2.10. Mecanismos de resistencia bacteriana
Las bacterias, por su alta capacidad de adaptación, pueden desarrollar mecanismos
de resistencia frente a los antibióticos.
Existe una resistencia natural o intrínseca que es propia de cada familia, especie o
grupo bacteriano, donde todas las bacterias de la misma especie son resistentes a algunas
11
familias de antibióticos y eso les permiten tener ventajas competitivas con respecto a otras
cepas y pueden sobrevivir en caso que se emplee ese antibiótico (Vignoli, 2011). La
resistencia adquirida es la realmente importante desde un punto de vista clínico: es debida
a la modificación de la carga genética de la bacteria y puede aparecer por mutación
cromosómica o por mecanismos de transferencia genética (Daza, 2010).
Las bacterias se hacen resistentes a los antibióticos desarrollando mecanismos que
impiden al antibiótico ejercer su acción. Los mecanismos de resistencia de las bacterias son
fundamentalmente tres:
1) Inactivación del antibiótico por enzimas: La bacteria produce enzimas que
inactivan al antibiótico; En este caso la enzima, elaborada por la bacteria, inactiva
a la molécula de la droga volviéndola incapaz de actuar. Hay que tener presente que
este mecanismo es el único capaz de inactivar a la molécula de antimicrobiano
(Daza, 2010).
2) Impermeabilidad de la membrana o pared celular: Las bacterias producen
mutaciones en las porinas de la pared que impiden la entrada de ciertos antibióticos
o alteran los sistemas de transporte. En otras ocasiones pueden provocar la salida
del antibiótico por un mecanismo de expulsión activa, impidiendo que se acumule
en cantidad suficiente para que actúe eficazmente (Daza, 2010).
3) Alteración de su punto diana: impidiendo o dificultando la acción del antibiótico.
Aquí podemos contemplar las alteraciones a nivel del ADN girasa y del ARN de
las enzimas producidas generando una reducción de la afinidad del receptor por la
molécula de antimicrobiano (Daza, 2010).
Una misma bacteria puede desarrollar varios mecanismos de resistencia frente a
uno o muchos antibióticos y del mismo modo un antibiótico puede ser inactivado por
distintos mecanismos de diversas especies bacterianas, todo lo cual complica sobremanera
el estudio de las resistencias de las bacterias a los distintos antimicrobianos.
2.2.11. Microorganismos patógenos
Algunos microorganismos son capaces de penetrar y multiplicarse en otros seres
vivos, a los que perjudican, originando una infección; son los denominados
microorganismos patógenos. Los problemas que causa una infección dependen del tipo de
patógeno, el modo en que se transfiere, dosis o concentración de patógenos, persistencia
de los microorganismos y la resistencia del organismo infectado (Hernández E. , 2016).
Suelen clasificarse en virus, bacterias, hongos y parásitos.
Bacterias: Las bacterias se caracterizan por estar formadas por una única célula sin
núcleo; por esto son denominadas organismos unicelulares procariontes. Estos organismos
se caracterizan también por tener una membrana celular firme, que los rodea y protege. Su
reproducción es asexual, se produce cuando las células generan otras células idénticas y
suele ser una reproducción muy rápida, si las condiciones son favorables (Rodríguez,
2015). Entre las principales bacterias a estudiar tenemos:
12
2.2.11.1. Escherichia coli
Figura 5. Escherichia coli al microscopio y en cultivo (Arnal, 2016)
Se trata de una bacteria patógena que normalmente vive en el intestino del hombre,
no suele causar ningún tipo de problema y es considerado un microorganismo de nuestra
flora bacteriana normal, y que es necesaria para el funcionamiento correcto del proceso
digestivo. Sin embargo, algunas cepas por intercambio de material genético, han adquirido
la capacidad de causar infecciones y provocar diarreas sangrantes (Armora & Gómez,
2012).
Morfología: Escherichia coli es un bacilo Gram negativo, de 1 – 3 μm por 0.5 μm, que se
presenta sólo, en pares, en cortas cadenas o formando grupos.
Metabolismo: anaerobio facultativo de la familia Enterobacteriaceae.
Hábitat: Escherichia coli pertenece a un grupo de bacterias presentes en el intestino del
ser humano y animales, siendo, la gran mayoría, inocuas en ellos. Sin embargo, hay algunas
cepas de Escherichia coli productoras de toxinas, llamadas verotoxinas o toxinas de tipo
shiga que pueden causar cuadros gastrointestinales graves en el ser humano entre ellos
diarrea (Rodríguez & Angeles, 2002).
2.2.11.2. Pseudomonas aeruginosa
Figura 6. Pseudomonas aeruginosa al microscopio y en cultivo (Mahajan, 2011).
13
Es un patógeno que causa infecciones en personas inmunocomprometidas, como
por ejemplo personas con quemaduras de la piel, pacientes que reciben quimioterapia para
el cáncer, pacientes con fibrosis quística, al tipo de infecciones antes mencionadas se le s
llama infecciones de un patógeno oportunista (aprovechar situaciones desfavorables del
paciente para enfermar), también produce muchos casos de infecciones nosocomiales (en
hospitales), como neumonías (González J. , 2015).
Morfología: Son bacilos cortos, en parejas, en cadenas o aislados, Gram negativos,
presentan un tamaño que está entre 0.5 μm y 0.8 μm de espesor por 1.5 μm y 3.8 μm de
largo. No forma esporas.
Hábitat: El género Pseudomonas prácticamente se encuentra distribuido en todas partes,
por ejemplo en agua, suelos, vegetación, gasolina, objetos inanimados, en humanos,
animales, etc.
Metabolismo: Tiene un metabolismo aerobio estricto-oxidativo, no fermenta
carbohidratos, sus requerimientos nutricionales son sencillos prácticamente crece en agua (González J. , 2015).
2.2.11.3. Staphylococcus aureus
Figura 7. Staphylococcus aureus al microscopio y en cultivo (Mulcahy, 2013)
Los Staphylococcus son microorganismos que se asocian con infecciones humanas,
son colonizadores principalmente de superficies cutáneas y mucosas. Staphylococcus
aureus es la principal especie patógena de su género, causa común de infecciones diversas,
tanto de origen comunitario como hospitalario . Estas bacterias pueden vivir en muchas
superficies de la piel sin ocasionar daño alguno, sobre todo alrededor de la nariz, la boca,
los genitales y el ano. Pero, cuando la piel se rompe o perfora por cualquier motivo, los
estafilococos pueden introducirse en la herida y provocar una infección.
El principal reservorio de Staphylococcus aureus es el ser humano, hallándose en
los portadores sanos, especialmente en las fosas nasales, así como en los pacientes
infectados. La colonización puede asentar sobre la mucosa nasal, orofaringe, epidermis
íntegra, úlceras crónicas cutáneas, o en heridas en fase de cicatrización (Camarena, 2011).
14
Morfología: Son cocos Gram positivos, se observa asociación en racimos irregulares
(similar aún racimo de uvas), carecen de flagelos, no producen esporas y rara vez pueden
tener cápsula.
Metabolismo: No son exigentes con sus requerimientos nutricionales , son aerobios
facultativos y crecen favorablemente a temperaturas de 30-37°C, son capaces de crecer en
medios altamente salinos (7.5-10% NaCl)
Hábitat: Flora normal de las narinas (fosas nasales), nasofaringe, región perineal (en mujer
en hombre) y piel. Puede colonizar diversas superficies epiteliales y mucosas (Cruz, 2011).
2.2.11.4. Klebsiella pneumoniae
Figura 8. Klebsiella pneumoniae al microscopio y en cultivo (The Biocote Team, 2015).
Es un tipo de bacteria que forma parte de la flora normal gastrointestinal, sin
embargo su importancia médica radica debido a que es una bacteria oportunista es decir
que frente a pacientes inmunológicamente comprometidos pueden producir enfermedades
nosocomiales como infecciones respiratorias, urinarias, neumonías, etc. Las cepas de K.
pneumoniae tienen el potencial para causar morbilidad y mortalidad, particularmente en
las unidades de cuidados intensivos pediátricos y servicios quirúrgicos (González, 2013)
Morfología: Son bacilos Gram negativos de la familia Enterobacteriaceae, con un tamaño
entre 0.5 μm y 2.0 μm, forma endoesporas y no presenta flagelo, por lo que es inmóvil.
Metabolismo: Son microorganismos facultativos anaerobios, crecen favorablemente a
temperaturas entre 30°C y 37°C. Tienen la enzima de catalasa, ureasa, fermenta
muchos carbohídratos, como la lactosa, por lo tanto son capaces de formar ácidos fuertes
en sus procesos metabólicos.
Hábitat: forma parte de la flora normal gastrointestinal.
2.2.12. Métodos de evaluación antimicrobiana
Diferentes métodos de laboratorio pueden ser usados para determinar in vitro la
susceptibilidad de bacterias ante agentes microbianos, pero estos no son igualmente
15
sensibles o no se basan en los mismos principios, permitiendo que los resultados sean
influenciados por el método seleccionado, los microorganismos usados y el grado de
solubilidad de cada compuesto evaluado (Ramírez & Marín, 2009).
Los métodos para evaluar la actividad antibacteriana están clasificados, en tres
grupos principales: Métodos de difusión, métodos de dilución, bioautografía. En general
se propone usar los métodos de difusión (en papel o en pozo) para estudiar compuestos
polares, y los métodos de dilución para sustancias polares y no polares (Ramírez & Marín,
2009).
Las metodologías aplicadas siempre consideran la estandarización de la
concentración bacteriana a utilizar, con el ánimo de evitar un crecimiento exhaustivo, que
impida el análisis de los resultados o proporcione resultados errados lo cual puede variar
significativamente la respuesta del extracto vegetal o aceite, indicando la necesidad de
utilizar concentraciones mayores de éste para inhibir el crecimiento del microorganismo
(Ramírez & Marín, 2009).
La concentración de bacterias usada para el estudio de susceptibilidad en el
laboratorio ha sido estandarizado en 1,5 x 108 unidades formadoras de colonias (ufc)/mL,
lo cual equivale a un patrón de 0.5 en la escala de Mac Farland. Es recomendable tomar el
inoculo de cultivos en la fase exponencial de crecimiento y siempre tomar 4 o 5 colonias
de un cultivo puro para evitar seleccionar variantes atípicas. Los medios de cultivo más
utilizados en dichas técnicas son el agar Mueller Hinton y agar tripticasa soya, ya que sus
componentes facilitan el crecimiento de diferentes cepas bacterianas y mayor difusión de
las muestras (Ramírez & Marín, 2009).
2.2.12.1. Métodos de difusión
Los métodos de difusión son: método de pocillos en placa, cilindro placa y la
difusión en disco. Estos métodos se fundamentan en la difusión de sustancias en el agar
donde ha sido previamente sembrado un determinado microorganismo. La formación de
un halo alrededor del sitio donde se colocó la sustancia indica que esta tiene actividad
antimicrobiana. El halo debe medirse y compararse contra el de un antibiótico patrón.|
Dependiendo del diámetro de inhibición se puede establecer si el microorganismo es
sensible, moderadamente sensible o resistente al producto analizado (Terán, 2017).
Método de cilindro en placa: Esta técnica es la más utilizada dada su exactitud y
sensibilidad; se fundamenta en la difusión del antibiótico desde un cilindro vertical (o desde
una perforación circular en el agar) a través de una capa de agar solidificada en una placa
de Petri hasta inhibir totalmente el crecimiento del microorganismo añadido en el medio
de cultivo, en un área circular o zona de inhibición entorno al cilindro que contiene una
solución del antibiótico. Las distintas respuestas obtenidas (diámetros de los halos de
inhibición) son proporcionales a las dosis de antibiótico utilizadas.
16
Figura 9. Difusión por cilindro placa (San Martín, 2006).
Método de difusión de disco en agar: está apoyado por datos clínicos y de
laboratorios; y presenta la ventaja que sus resultados son altamente reproducibles. La
técnica está basada en el método originalmente descrito por Bauer et al., (método de Kirby-
Bauer). El fundamento de esta determinación es establecer, en forma cuantitativa, el efecto
de un conjunto de sustancias, ensayados individualmente, sobre las cepas bacterianas que
se aíslan de procesos infecciosos. El método se basa en la relación entre la concentración
de la sustancia necesaria para inhibir una cepa bacteriana y el halo de inhibición de
crecimiento en la superficie de una placa de agar con un medio de cultivo adecuado y
sembrado homogéneamente con la bacteria a ensayar y sobre la cual se ha depositado un
disco de papel filtro de 6 mm de diámetro, o se ha sembrado en pozo impregnado (Ramírez
& Marín, 2009).
Figura 10. Difusión de disco en agar (Labmedica, 2012).
Método de pocillos en placa: esta técnica presenta una relación con el método de
difusión de disco en agar, por su fundamento: a través del agar solidificado en una placa
Petri se siembra homogéneamente la bacteria en estudio con una concentración de en el 1,5
x 108 unidades formadoras de colonias (ufc)/mL, lo cual equivale a un patrón de 0.5 en la
escala de Mac Farland, la variante en este método es que en vez de colocar los discos
impregnados de antibiótico, se realiza un pocillo directamente en el agar utilizando un
sacabocados con una diámetro de 7 mm que permitirá colocar un volumen de 100 μl de la
17
sustancia a ensayar con actividad antibiótica. Una vez incubadas las cajas a las condiciones
establecidas se mide el halo de inhibición producido por antibiótico y se determina su
susceptibilidad o resistencia.
Figura 11. Pocillos en agar.
2.2.12.2. Métodos de dilución
El método de dilución en agar o en caldo como test de susceptibilidad microbiana
es utilizado para determinar la concentración mínima bactericida (MBC) y la concentración
mínima inhibitoria (MIC), estas variables son una herramienta para investigar nuevos
antimicrobianos. En la técnica de dilución en caldo, son utilizados tubos o microplacas
(microdilución) que contienen concentraciones crecientes del extracto vegetal. El
organismo en estudio es inoculado en los diferentes tubos o pozos de las microplacas y la
MIC es determinada después de la incubación (Ramírez & Marín, 2009).
En el método de dilución en agar, las cajas se siembran por profundidad con una
determinada concentración de extracto vegetal, luego se inoculan con el microorganismo
en estudio y se incuban por 24 horas, después de ésta, se examina si el microorganismo
crece o no en cada una de las cajas, la principal desventaja de este método es la cantidad
necesaria de muestra a evaluar (Ramírez & Marín, 2009).
Figura 12. Método de dilución (García Q. , 2014)
18
2.2.13. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI)
La determinación de la Concentración Mínima Inhibidora (CMI) es la medida
de la sensibilidad de una bacteria a un antibiótico. Es la mínima cantidad de antimicrobiano
que es capaz de impedir el crecimiento de un microorganismo en unas condiciones
normalizadas. Es el método habitual utilizado en los laboratorios de Microbiología Clínica.
Para llevarlo a cabo es necesario utilizar cepas control (de referencia) con el fin de que los
resultados sean reproducibles y comparables. Este método nos ofrece información sobre la
sensibilidad de las bacterias Sensible (S), Intermedia (I) y Resistente (R) (García J. , 2000).
Sensible: cuando un aislado bacteriano es inhibido in vitro por una concentración
de un antimicrobiano que se asocia a una alta probabilidad con el éxito terapéutico.
Intermedio: cuando un aislado bacteriano es inhibido in vitro por una concentración
de un antimicrobiano que se asocia a un efecto terapéutico incierto.
Resistente: cuando un aislado bacteriano es inhibido in vitro por una concentración
de un antimicrobiano que se asocia a una alta probabilidad con el fracaso
terapéutico (Cantón, 2009).
Existen diferentes técnicas de laboratorio que permiten medir o calcular de forma
rutinaria, y de manera semicuantitativa, las CMI (métodos manuales y métodos
automatizados o semiautomatizados). Los más utilizados son:
a) Difusión en agar: Disco placa
b) Dilución: Medio sólido y Medio líquido (micro/macrodilución)
c) Mecanizados y Automatizados (García J. , 2000).
Figura 13. Concentración Mínima Inhibitoria: Dilución en caldo (Sociedad Española de
Microbiología, 2017).
19
2.2.14. Microdilución en placa
Este método se denomina microdilución porque involucra pequeños volúmenes de
caldo. La prueba se realiza en policubetas de plástico estériles de fondo cónico o redondo,
cada pocillo contiene un volumen aproximado de 300 μL. Para preparar las placas de
microdilución, se hacen diluciones intermedias de los agentes antimicrobianos en caldo o
agua estéril, se utiliza un inóculo de una concentración tal, que duplique la deseada. Cada
policubeta debe incluir un pocillo de control de crecimiento (sin antibiótico), y un control
negativo (caldo sin inocular).
Para evitar la desecación durante la incubación, se debe sellar cada policubeta con
su tapa plástica o película plástica autoadhesiva. El tiempo de incubación para la mayoría
de los microorganismos es de 16 a 20 hs, tanto para la técnica de macro como de
microdilución y la temperatura es 35 ± 2 °C Para mantener una temperatura de incubación
uniforme, se recomienda no apilar más de cuatro policubetas (Institute Clinical and
Laboratory Standars, 2012).
Figura 14. Placa para microdilución (Córdoba, 2013)
2.2.15. Control Positivo
Ceftriaxona es un antibiótico betalactámico que pertenece a las cefalosporinas de
tercera generación. Es un bactericida de amplio espectro y acción prolongada que muestra
una actividad significativa frente a gérmenes gramnegativos y grampositivos serios . Actúa
inhibiendo la síntesis y reparación de la pared celular bacteriana.
Figura 15. Estructura química de la Ceftriaxona
20
Según los nuevos criterios presentados por el CLSI la susceptibilidad
antimicrobiana de la Ceftriaxona frente a microorganismos patógenos viene dada por:
Tabla 1. Susceptibilidad antimicrobiana del control positivo, Ceftriaxona
Antimicrobiano
Criterios de Interpretación
Difusión en disco
[mm]
Concentración mínima
Inhibitoria [μg/ml]
S I R S I R
Cefotaxima ≥ 26 23-25 ≤ 22 ≤ 1 2 ≥ 4
Ceftriaxona ≥ 23 20-22 ≤ 19 ≤ 1 2 ≥ 4
Ceftazidima ≥ 21 18-20 ≤ 17 ≤ 4 8 ≥ 16
Ceftizoxima ≥ 25 22-24 ≤ 21 ≤ 1 2 ≥ 4
S: Sensible; I: Intermedio; R: Resistente
Elaborado por: Sarasti, D.
Tabla 2. Susceptibilidad antimicrobiana de la Ceftriaxona frente a las diferentes cepas
bacterianas
Cepas
bacterianas
CEFTRIAXONA
Difusión en disco
[mm]
Concentración
mínima Inhibitoria
[μg/ml] S I R
Escherichia
coli
≥ 23 20-22 ≤ 19 ≥ 0,125
Pseudomonas
aeruginosa
≥ 21 14-20 ≤ 13 ≥ 16
Staphylococcus
aureus
≥ 14 11-13 ≤ 10 ≥ 4
Klebsiella
pneumoniae
≥ 23 20-22 ≤ 19 ≥ 0,125
Elaborado por: Sarasti, D.
2.3. FUNDAMENTO LEGAL
- Constitución Nacional de la República del Ecuador, Registro oficial N⁰ 449,
2008
Sistema nacional de ciencia, tecnología, innovación y saberes ancestrales
Art. 385.- El sistema nacional de ciencia, tecnología, innovación y saberes ancestrales, en
el marco del respeto al ambiente, la naturaleza, la vida, las culturas y la soberanía, tendrá
como finalidad:
1) Generar, adaptar y difundir conocimientos científicos y tecnológicos.
21
2) Recuperar, fortalecer y potenciar los saberes ancestrales.
3) Desarrollar tecnologías e innovaciones que impulsen la producción nacional,
eleven la eficiencia y productividad, mejoren la calidad de vida y contribuyan a la
realización del buen vivir.
- Ley Orgánica de Salud (Ley No. 2006-67) Capítulo II. De la autoridad sanitaria nacional, sus competencias y responsabilidades
Art. 6.- Es responsabilidad del Ministerio de Salud Pública:
Regular y realizar el control sanitario de la producción, importación, distribución,
almacenamiento, transporte, comercialización, dispensación y expendio de alimentos
procesados, medicamentos y otros productos para uso y consumo humano; así como los
sistemas y procedimientos que garanticen su inocuidad, seguridad y calidad, a través del
Instituto Nacional de Higiene y Medicina Tropical Dr. Leopoldo Izquieta Pérez y otras
dependencias del Ministerio de Salud Pública.
2.4. HIPÓTESIS
2.4.1. Hipótesis de trabajo
Hi: Los extractos obtenidos a partir de las hojas frescas y secas de la especie vegetal
Moringa oleifera presentan efecto antimicrobiano frente a microorganismos patógenos.
2.4.2. Hipótesis nula
Ho: Los extractos obtenidos a partir de las hojas frescas y secas de la especie vegetal
Moringa oleifera no presentan efecto antimicrobiano frente a microorganismos patógenos.
2.5. CONCEPTUALIZACIÓN DE VARIABLES
Etapa 1: Obtención de extractos a partir de las hojas de la especie vegetal Moringa oleifera
Observación: Se utilizó un único método de extracción (Soxhlet) y solvente (Etanol 70°)
Variables Independientes:
A: Tipo de hoja
Variables Dependientes:
A: Concentración de la fracción extraída
Etapa 2: Cuantificación espectrofotométrica de flavonoides
Observación: No presenta un diseño experimental ya que no existen variables
independientes ni dependientes
22
Etapa 3: Evaluación de la actividad antimicrobiana a partir de los extractos obtenidos de
la especie vegetal Moringa oleifera
Variables Independientes:
A: Tipo de extracto
B: Tipo de cepa bacteriana
Variables Dependientes:
A: Efecto antimicrobiano frente a las diferentes cepas bacterianas
B: Diámetro del halo de inhibición
Etapa 4: Evaluación de la Concentración Mínima Inhibitoria a partir de los extractos
obtenidos de la especie vegetal Moringa oleifera
Variables Independientes:
A: Tipo de cepa bacteriana
B: Número de diluciones
Variables Dependientes:
Concentración a la que se inhibe las cepas bacterianas
23
CAPÌTULO III
METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN
3.1. DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN
- Enfoque
El enfoque de este trabajo de investigación corresponde a un enfoque cuantitativo
ya que se base en la recolección de datos para probar la hipótesis con base en una medición
numérica y estadística para establecer patrones de comportamiento y probar teorías
(Hernández R. , 2010). Los datos a recolectar están basados en determinar el porcentaje de
extracción, el porcentaje de la fracción extraída en las hojas de esta especie vegetal
mediante el método espectrofotométrico, comprobar la actividad antimicrobiana mediante
la medición de los halos de inhibición formados a partir de los extractos utilizados y evaluar
la Concentración Mínima Inhibitoria mediantes lecturas de diluciones seriadas.
- Nivel
El nivel de investigación de este proyecto se basa en un nivel descriptivo ya que se
analizará la capacidad antimicrobiana que presentan las hojas de la especie vegetal
Moringa oleifera frente a microorganismos patógenos mediante la caracterización de los
extractos obtenidos para la cuantificación de la fracción activa.
- Tipo de investigación
El tipo de investigación de este trabajo es bibliográfica y experimental.
Bibliográfica porque se sustentará en estudios previos realizados. Experimental ya que se
desarrollará en un lugar donde las variables pueden ser controladas y medidas
(Laboratorio).
3.2. MATERIALES Y MÉTODOS
3.2.1. Materiales
Material Botánico
Hojas de la especie vegetal Moringa oleifera
Material Biológico
Cepas ATCC 25922 de Escherichia coli
Cepas ATCC 27853 de Pseudomonas aeruginosa
Cepas ATCC 25923 de Staphylococcus aureus
Cepas ATCC de Klebsiella pneumoniae
24
Materiales
Frascos ámbar
Vasos de precipitación
Tubos de ensayo
Balones aforados
Matraces Erlenmeyer
Embudo de separación
Embudo
Pipetas aforadas
Pipetas volumétricas
Espátula
Agitadores
Gradilla
Soporte universal
Pera de succión
Papel absorbente
Papel empaque
Papel filtro
Papel aluminio
Film
Placa de porcelana
Micropipetas
Puntas para micropipetas
Cajas Petri
Hisopos
Sacabocados
Asa de inoculación
Asa de digralsky
Reactivos
Alcohol de 70°
Agua destilada
Éter de petróleo
Cloroformo
Acetato de plomo
Ácido acético
Ácido sulfúrico concentrado
Ácido Clorhídrico concentrado
Reactivo de Folin
Amoniaco
Limaduras de magnesio
Hidróxido de potasio
Cloruro de Sodio
Nitrito de Sodio 5%
Cloruro de aluminio 10%
25
Hidróxido de sodio
Estándar de quercetina
Tripteína Soya Agar (TSA)
Mueller Hinton Agar y Caldo
Equipos
Balanza analítica
Rotavapor
Estufa
Molino
Soxhlet
Sistema de filtración al vacío
Espectrofotómetro
Autoclave
Incubadora
Vortex
Lector de Elisa
Cocineta
3.2.2. Metodología
3.2.2.1. Proceso de Recolección:
Las hojas frescas de la especie vegetal Moringa oleifera se recolectaron en los
sembríos de la Finca López ubicada en El Carmen – La Esperanza, provincia de Manabí.
Se determinó que la especie vegetal recolectada corresponde a Moringa oleifera, mediante
la identificación botánica realizada por el Herbario Alfredo Paredes (QAP), Universidad
Central del Ecuador, con su respectivo certificado, como se presenta en el Anex o 1.
Etapa 1
3.2.2.2. Tratamiento de la muestra
Las hojas recolectadas fueron divididas en dos partes, la primera parte se mantuvo
fresca en fundas herméticas selladas, sin oxígeno y en refrigeración, la segunda parte fue
sometida a un proceso de deshidratación en la estufa a una temperatura de 37°C, para
posteriormente ser molidas.
3.2.2.3. Proceso de Extracción
Este procedimiento se llevó a cabo mediante una extracción por Soxhlet, es decir,
sólido - líquido en la cual la muestra sólida (hojas frescas/secas), se coloca en un cartucho
de material poroso (papel filtro) que se sitúa en la cámara del extractor Soxhlet, se colocó
en el balón de fondo plano el disolvente, 250 ml de etanol de 70°, y se sometió a
calentamiento durante un período de 6 horas aproximadamente.
26
Figura 16. Extractor Soxhlet (Jiménez, 2016).
Posteriormente a este proceso los extractos obtenidos de hoja fresca y hoja seca
fueron concentrados en el Rotavapor hasta la cuarta parte de su volumen inicial, para
obtener el extracto puro sin solvente.
Se determinó el porcentaje de rendimiento de la extracción (%R) mediante la
ecuación 1, haciendo referencia al peso inicial del extracto concentrado en la caja Petri y
el peso final después de llevar completamente a sequedad.
%𝑅 =𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑜𝑏𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑜
𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 ∗ 100
Ecuación 1. Porcentaje de rendimiento de extracción
3.2.2.4. Tamizaje Fitoquímico
Se realizó un tamizaje fitoquímico o screening fitoquímico para determinar
cualitativamente los principales metabolitos presentes en las hojas frescas y secas de
Moringa oleifera mediante el fraccionamiento del extracto para aislar los grupos de mayor
interés a través una serie de reacciones de identificación y proceso cromatográficos como
se detalla en el anexo 4.
A partir de los extractos de hoja fresca y hoja seca concentrados se llevaron a cabo
las reacciones de identificación para alcaloides, esteroles, flavonoides, antraquinonas,
taninos y saponinas y cardiotónicos.
27
Identificación de flavonoides
Se tomó 10 ml del extracto concentrado y se colocó en un embudo de separación.
Seguido se adicionó un volumen igual de éter de petróleo y se separó las dos fases. Se
realizó una segunda extracción adicionando la mitad del volumen anteriormente utilizado.
Los extractos etéreos se unieron y se concentraron a presión reducida. La fase acuosa
corresponde a la fracción activa en la misma que se determinó la presencia de flavonoides
mediante las siguientes reacciones:
Reacción de Shinoda: a un 1ml del extracto adicionar unas gotas de ácido
clorhídrico (c) con pequeñas limaduras de magnesio. La reacción será positiva
por la presencia de una coloración rojiza intensa que puede estar acompañada
de espuma.
Reacción de Cianidina: a un 1 ml del extracto añadir una solución de alcohol
clorhídrico (alcohol etílico 50° y ácido clorhídrico (c) en una relación 2:1 v/v)
y pequeñas limaduras de magnesio. La reacción será positiva mediante una
coloración rosa o roja.
Reacción en medio alcalino: a 1ml del extracto adicionar gotas de hidróxido de
potasio (5% en etanol de 95°). La reacción será positiva por la presencia de una
coloración amarillo anaranjado; al añadir unas gotas de cloruro férrico 2%
presentará una coloración azul verdosa.
Etapa 2
3.2.2.5. Cuantificación de flavonoides
Se tomó 25 ml del extracto concentrado de hoja fresca y hoja seca y se colocó en
dos embudos de separación independientemente. Seguido se adicionó un volumen igual de
éter de petróleo en ambos embudos y se separó las dos fases. Se realizó una segunda
extracción adicionando la mitad del volumen anteriormente utilizado, separando las fases.
La fase acuosa se colocó en una caja Petri y se llevó completamente a sequedad en la estufa
a 37°C con flujo constante de aire. El extracto completamente seco se redisolvió con etanol
absoluto a un volumen de 10 ml en un balón aforado.
Para la cuantificación de flavonoides totales se preparó una curva de calibración
utilizando quercetina como estándar.
Se procedió inicialmente a preparar 10 ml de una solución de concentración 2mg/ml
de Quercetina a partir de la cual se realizaron 5 diluciones seriadas a la mitad. De cada
dilución se tomó 1 ml y se añadió: 4 ml de agua destilada + 0,3 ml de nitrito do sodio al
5% (dejar 5 minutos en reposo) + 0,3 ml de cloruro de aluminio al 10% (dejar 6 minutos
en reposo) + 2,0 ml de hidróxido de sodio 1M, finalmente se aforó a 10 ml con agua
destilada y se procedió a leer espectrofotométricamente a una longitud de onda de 546 nm,
obteniendo la concentración de flavonoides expresada en mg quercetina/ml extracto como
28
se representa en la ecuación dos. Este procedimiento se repitió para el extracto total y
fracción de extracto de hoja fresca y hoja seca. Se recomienda que las lecturas se hagan
antes de cumplirse los 30 minutos para evitar la degradación de las muestras. Se determinó
la concentración del activo mediante la ecuación 2.
𝑨 = 𝑚𝐶 + 𝑏
Ecuación 2. Determinación de la concentración de Flavonoides
donde:
A = Absorbancia
m = pendiente de la recta
C = Concentración
b = Ordenada al origen
Figura 17. Esquema de cuantificación de flavonoides
Elaborado por: Sarasti, D.
Etapa 3
3.2.2.6. Evaluación de la actividad antimicrobiana
Preparación de los medios de cultivo
Se empezó preparando los medios de cultivo: Tripteína Soya Agar para crecimiento
bacteriano y Mueller Hinton Agar para la susceptibilidad antimicrobiana.
Tripteína Soya Agar:
- Se disolvió 40 g del medio en 1 litro de agua destilada.
- Se mezcló completamente y se dejó reposar por 5 minutos.
- Se calentó agitando suavemente hasta ebullición por 2 minutos.
29
- Se esterilizó en el autoclave a 121°C durante 20 minutos.
- En una temperatura aproximada de 40°C se repartió el medio en cajas Petri y se
dejó solidificar.
Mueller Hinton Agar:
- Se disolvió 40 g del medio en 1 litro de agua destilada.
- Se mezcló completamente y se dejó reposar por 5 minutos.
- Se calentó agitando suavemente hasta ebullición por 2 minutos.
- Se esterilizó en el autoclave a 121°C durante 20 minutos.
- En una temperatura aproximada de 40°C se repartió el medio en cajas Petri
cumpliendo con los siguientes parámetros antes de su utilización:
Espesor: debe ser de 4mm, es decir, se debe colocar una cantidad de medio
entre 25 a 30 ml en placas de 85-100 mm de diámetro interno. Cuando existe
un espesor mayor a 4 mm, se genera un diámetro de halo de inhibición
menor (falsa resistencia), mientras que un espesor menor a 4mm se genera
un diámetro de halo de inhibición mayor (falsa sensibilidad).
Humedad: El medio debe dejarse a temperatura ambiente unas dos horas
antes de utilizarlo. Si existe agua en la superficie del agar, las placas pueden
colocarse en la incubadora a 35ºC por 30 minutos con la tapa ligeramente
abierta (Terán, 2017).
Cultivo de Cepas ATCC bacterianas
Una vez preparado los medios se procedió a realizar el cultivo de las diferentes
cepas bacterianas en TSA. Se realizó el pase a caja de las diferentes bacterias a partir de
cepas ATCC anteriormente activadas. Se tomó con un asa de inoculación de dos a tres
colonias aisladas y se estrió en el medio solidificado. Se incubó de 18 a 24 horas. Una vez
utilizadas las cepas deben ser guardadas en refrigeración a una temperatura de
aproximadamente 8°C en empaque cerrados.
Preparación del inóculo
A partir de las cepas obtenidas, se tomó varias colonias con un asa y se inoculó
directamente en un tubo con solución salina al 0,85%.
Se ajustó el inóculo a una turbidez 0.5 McFarland que equivale a 1.5 x 108 ufc/ml, leyendo
en el espectrofotómetro a 594 nm para confirmar el valor de la escala McFarland que debe
presentar un valor de absorbancia entre 0,08 - 0,1.
Método de los pocillos en agar
Este proceso se realizó en cajas de Mueller Hinton agar, bajo los parámetros
previamente especificados anteriormente.
Se desinfectó toda el área de trabajo utilizando alcohol antiséptico para que las
condiciones de esterilidad sean las mejores. Se introdujo un hisopo estéril dentro de la
30
suspensión bacteriana (0,5 McFarland) y se rotó varias veces sobre las paredes del tubo
para eliminar el exceso de líquido. Se inoculó sobre el agar por la técnica de hisopado, es
decir, cubriendo todos los espacios de la caja. Se dejó secar por 5 minutos.
Después de la inoculación del microorganismo, se realizaron los pocillos en el agar
utilizando un sacabocados estéril de 7 mm de diámetro, con el asa de inoculación estéril,
se retiró el resto de agar que se encuentra en las perforaciones hasta que queden los pocillos.
Se colocó 100 μl del extracto, del antibiótico patrón y del control negativo dentro de cada
pocillo. Se incubó las cajas a 35-37 °C por 24 horas y con el agar hacia abajo.
3.2.2.7. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI)
Este proceso se realizó utilizando placas para microdilución de 96 pocillos, Mueller
Hinton caldo como medio de cultivo y una suspensión bacteriana en solución salina 0,85%
de una concentración 5x105 ufc/ml (la suspensión puede prepararse a partir de una 0,5
McFarland).
En el pocillo 1 se colocó 100 μl extracto + 100 μl del medio , este pocillo servirá
como blanco. Desde el pocillo 2 al pocillo 10 se colocó 100 μl del medio, en el pocillo 2
se adicionó 100 μl del extracto, a partir del cual se realizarán diluciones seriadas a la mitad
hasta el pocillo 10, posteriormente se procedió a inocular 100 μl de suspensión bacteriana
de concentración 5x105 ufc/ml desde el pocillo 2 al pocillo 10 obteniendo un volumen final
de 200 μl, en el pocillo 11 se colocó el control positivo que corresponde a 100 μl de medio
+ 100 μl se suspensión bacteriana, en el pocillo 12 se colocó el control negativo que
corresponde a 200 μl del medio sin inocular.
Este proceso se realizó por triplicado para cada tipo de extracto y cada bacteria. Se
cubrió la placa con film para evitar que el extracto se evapore y se incubó durante 24 horas.
Finalmente se procedió a leer las absorbancia a 594 nm en el Lector de Elisa, determinando
a que concentración es inhibida la bacteria según el tipo de extracto utilizado. Es importante
que las lecturas se hagan de acuerdo al blanco para evitar las interferencias que pueda
producir la coloración del extracto.
Se determinó el porcentaje de inhibición de acuerdo a cada extracto obtenido y a
cada cepa bacteriana mediante la siguiente ecuación:
% 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 =𝐴𝑏𝑠. 𝐶𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑝𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑜 − 𝐴𝑏𝑠. 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛
𝐴𝑏𝑠. 𝐶𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑝𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑜∗ 100
Ecuación 3. Porcentaje de inhibición
La absorción del control positivo corresponde al valor del medio de cultivo con la
bacteria inoculada, a la cual se le debe restar el valor de la absorbancia de cada una de las
concentraciones obtenidas después de las diferentes diluciones.
31
Figura 18. Esquema de microdilución en placa
Elaborado por: Sarasti, D.
3.3. DISEÑO EXPERIMENTAL
3.3.1. Diseño Factorial A x B
Un diseño factorial A x B es un tipo de experimento diseñado que permite estudiar
los efectos que varios factores pueden tener en una respuesta. Al realizar un experimento,
variar los niveles de todos los factores al mismo tiempo en lugar de uno a la vez, permite
estudiar las interacciones entre los factores.
FASE III:
En esta fase se realizó la determinación de la actividad antimicrobiana mediante el
método de los pocillos en agar, midiendo el halo de inhibición formado por cada tipo de
extracto y frente a cada cepa bacteriana.
Tabla 3. Factores y niveles del diseño experimental, Fase III
Factores Niveles Codificación
Tipo de extracto
(A)
Extracto Total de Hoja fresca A1
Extracto Total de Hoja seca A2
Fracción acuosa de extracto Hoja fresca A3
Fracción acuosa de extracto Hoja seca A4
32
Cepa bacteriana
(B)
Escherichia coli B1
Pseudomonas aeruginosa B2
Staphylococcus aureus B3
Klebsiella pneumoniae B4
Tabla 4. Tratamientos del diseño, Fase III
1: primera réplica; 2: segunda réplica; 3: tercera réplica
Elaborado por: Sarasti, D.
En esta fase se aplicó un arreglo factorial AXB, con dos factores y cuatro niveles,
a fin de obtener reproducibilidad en el estudio se realizaron tres réplicas para el
correspondiente factor y nivel con un total de 48 datos.
FASE IV:
En esta fase se determinará la concentración a la cual se inhibe el crecimiento de
las cepas bacterianas según el tipo de extracto utilizado.
Tabla 5. Factores y niveles del diseño experimental, Fase IV
Factores Niveles Codificación
Tipo de Extracto
(A)
Extracto Total de Hoja fresca A1
Extracto Total de Hoja seca A2
Fracción Hoja fresca A3
Fracción Hoja seca A4
Cepa bacteriana
(B)
Escherichia coli B1
Pseudomonas aeruginosa B2
Staphylococcus aureus B3
Klebsiella pneumoniae B4
FA
CT
OR
A
TIP
O D
E E
XT
RA
CT
O
FACTOR B
CEPA BACTERIANA
B1 B2 B3 B4
A1 1 A1 B1 1 A1 B2 1 A1 B3 1 A1 B4
2 A1 B1 2 A1 B2 2 A1 B3 2 A1 B4
3 A1 B1 3 A1 B2 3 A1 B3 3 A1 B4
A2 1 A2 B1 1 A2 B2 1 A2 B3 1 A2 B4
2 A2 B1 2 A2 B2 2 A2 B3 2 A2 B4
3 A2 B1 3 A2 B2 3 A2 B3 3 A2 B4
A3 1 A3 B1 1 A3 B2 1 A3 B3 1 A3 B4
2 A3 B1 2 A3 B2 2 A3 B3 2 A3 B4
3 A3 B1 3 A3 B2 3 A3 B3 3 A3 B4
A4 1 A4 B1 1 A4 B1 1 A4 B1 1 A4 B1
2 A4 B1 2 A4 B1 2 A4 B1 2 A4 B1
3 A4 B1 3 A4 B1 3 A4 B1 3 A4 B1
33
Concentración
(C)
Dilución 1:2 C1
Dilución 1:4 C2
Dilución 1:8 C3
Dilución 1:16 C4
Dilución 1:32 C5
Dilución 1:64 C6
Dilución 1:128 C7
Dilución 1: 256 C8
Dilución 1:512 C9
Elaborado por: Sarasti. D
34
Tabla 6. Tratamientos del diseño, Fase IV
FACTOR A FACTOR B FACTOR C
Cepa
Tipo de
extracto
Diluciones Seriadas
C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9
A1
B1
1 A1 B1 C1 1 A1 B1 C2 1 A1 B1 C3 1 A1 B1 C4 1 A1 B1 C5 1 A1 B1 C6 1 A1 B1 C7 1 A1 B1 C8 1 A1 B1 C9
2 A1 B1 C1 2 A1 B1 C2 2 A1 B1 C3 2 A1 B1 C4 2 A1 B1 C5 2 A1 B1 C6 2 A1 B1 C7 2 A1 B1 C8 2 A1 B1 C9
3 A1 B1 C1 3 A1 B1 C2 3 A1 B1 C3 3 A1 B1 C4 3 A1 B1 C5 3 A1 B1 C6 3 A1 B1 C7 3 A1 B1 C8 3 A1 B1 C9
B2 1 A1 B2 C1 1 A1 B2 C2 1 A1 B2 C3 1 A1 B2 C4 1 A1 B2 C5 1 A1 B2 C6 1 A1 B2 C7 1 A1 B2 C8 1 A1 B2 C9
2 A1 B2 C1 2 A1 B2 C2 2 A1 B2 C3 2 A1 B2 C4 2 A1 B2 C5 2 A1 B2 C6 2 A1 B2 C7 2 A1 B2 C8 2 A1 B2 C9
3 A1 B2 C1 3 A1 B2 C2 3 A1 B2 C3 3 A1 B2 C4 3 A1 B2 C5 3 A1 B2 C6 3 A1 B2 C7 3 A1 B2 C8 3 A1 B2 C9
B3 1 A1 B3 C1 1 A1 B3 C2 1 A1 B3 C3 1 A1 B3 C4 1 A1 B3 C5 1 A1 B3 C6 1 A1 B3 C7 1 A1 B3 C8 1 A1 B3 C9
2 A1 B3 C1 2 A1 B3 C2 2 A1 B3 C3 2 A1 B3 C4 2 A1 B3 C5 2 A1 B3 C6 2 A1 B3 C7 2 A1 B3 C8 2 A1 B3 C9
3 A1 B3 C1 3 A1 B3 C2 3 A1 B3 C3 3 A1 B3 C4 3 A1 B3 C5 3 A1 B3 C6 3 A1 B3 C7 3 A1 B3 C8 3 A1 B3 C9
B4 1 A1 B4 C1 1 A1 B4 C2 1 A1 B4 C3 1 A1 B4 C4 1 A1 B4 C5 1 A1 B4 C6 1 A1 B4 C7 1 A1 B4 C8 1 A1 B4 C9
2 A1 B4 C1 2 A1 B4 C2 2 A1 B4 C3 2 A1 B4 C4 2 A1 B4 C5 2 A1 B4 C6 2 A1 B4 C7 2 A1 B4 C8 2 A1 B4 C9
3 A1 B4 C1 3 A1 B4 C2 3 A1 B4 C3 3 A1 B4 C1 3 A1 B4 C5 3 A1 B4 C6 3 A1 B4 C7 3 A1 B4 C8 3 A1 B4 C9
A2
B1
1 A2 B1 C1 1 A2 B1 C2 1 A2 B1 C3 1 A2 B1 C4 1 A2 B1 C5 1 A2 B1 C6 1 A2 B1 C7 1 A2 B1 C8 1 A2 B1 C9
2 A2 B1 C1 2 A2 B1 C2 2 A2 B1 C3 2 A2 B1 C4 2 A2 B1 C5 2 A2 B1 C6 2 A2 B1 C7 2 A2 B1 C8 2 A2 B1 C9
3 A2 B1 C1 3 A2 B1 C2 3 A2 B1 C3 3 A2 B1 C4 3 A2 B1 C5 3 A2 B1 C6 3 A2 B1 C7 3 A2 B1 C8 3 A2 B1 C9
B2 1 A2 B2 C1 1 A2 B2 C2 1 A2 B2 C3 1 A2 B2 C4 1 A2 B2 C5 1 A2 B2 C6 1 A2 B2 C7 1 A2 B2 C8 1 A2 B2 C9
2 A2 B2 C1 2 A2 B2 C2 2 A2 B2 C3 2 A2 B2 C4 2 A2 B2 C5 2 A2 B2 C6 2 A2 B2 C7 2 A2 B2 C8 2 A2 B2 C9
3 A2 B2 C1 3 A2 B2 C2 3 A2 B2 C3 3 A2 B2 C4 3 A2 B2 C5 3 A2 B2 C6 3 A2 B2 C7 3 A2 B2 C8 3 A2 B2 C9
B3 1 A2 B3 C1 1 A2 B3 C2 1 A2 B3 C3 1 A2 B3 C4 1 A2 B3 C5 1 A2 B3 C6 1 A2 B3 C7 1 A2 B3 C8 1 A2 B3 C9
2 A2 B3 C1 2 A2 B3 C2 2 A2 B3 C3 2 A2 B3 C4 2 A2 B3 C5 2 A2 B3 C6 2 A2 B3 C7 2 A2 B3 C8 2 A2 B3 C9
3 A2 B3 C1 3 A2 B3 C2 3 A2 B3 C3 3 A2 B3 C4 3 A2 B3 C5 3 A2 B3 C6 3 A2 B3 C7 3 A2 B3 C8 3 A2 B3 C9
B4 1 A2 B4 C1 1 A2 B4 C2 1 A2 B4 C3 1 A2 B4 C4 1 A2 B4 C5 1 A2 B4 C6 1 A2 B4 C7 1 A2 B4 C8 1 A2 B4 C9
2 A2 B4 C1 2 A2 B4 C2 2 A2 B4 C3 2 A2 B4 C4 2 A2 B4 C5 2 A2 B4 C6 2 A2 B4 C7 2 A2 B4 C8 2 A2 B4 C9
3 A2 B4 C1 3 A2 B4 C2 3 A2 B4 C3 3 A2 B4 C4 3 A2 B4 C5 3 A2 B4 C6 3 A2 B4 C7 3 A2 B4 C8 3 A2 B4 C9
35
1: primera réplica; 2: segunda réplica; 3: tercera réplica
Elaborado por: Sarasti, D.
A3
B1
1 A3 B1 C1 1 A3 B1 C2 1 A3 B1 C3 1 A3 B1 C4 1 A3 B1 C5 1 A3 B1 C6 1 A3 B1 C7 1 A3 B1 C8 1 A3 B1 C9
2 A3 B1 C1 2 A3 B1 C2 2 A3 B1 C3 2 A3 B1 C4 2 A3 B1 C5 2 A3 B1 C6 2 A3 B1 C7 2 A3 B1 C8 2 A3 B1 C9
3 A3 B1 C1 3 A3 B1 C2 3 A3 B1 C3 3 A3 B1 C4 3 A3 B1 C5 3 A3 B1 C6 3 A3 B1 C7 3 A3 B1 C8 3 A3 B1 C9
B2 1 A3 B2 C1 1 A3 B2 C2 1 A3 B2 C3 1 A3 B2 C4 1 A3 B2 C5 1 A3 B2 C6 1 A3 B2 C7 1 A3 B2 C8 1 A3 B2 C9
2 A3 B2 C1 2 A3 B2 C2 2 A3 B2 C3 2 A3 B2 C4 2 A3 B2 C5 2 A3 B2 C6 2 A3 B2 C7 2 A3 B2 C8 2 A3 B2 C9
3 A3 B2 C1 3 A3 B2 C2 3 A3 B2 C3 3 A3 B2 C4 3 A3 B2 C5 3 A3 B2 C6 3 A3 B2 C7 3 A3 B2 C8 3 A3 B2 C9
B3 1 A3 B3 C1 1 A3 B3 C2 1 A3 B3 C3 1 A3 B3 C4 1 A3 B3 C5 1 A3 B3 C6 1 A3 B3 C7 1 A3 B3 C8 1 A3 B3 C9
2 A3 B3 C1 2 A3 B3 C2 2 A3 B3 C3 2 A3 B3 C4 2 A3 B3 C5 2 A3 B3 C6 2 A3 B3 C7 2 A3 B3 C8 2 A3 B3 C9
3 A3 B3 C1 3 A3 B3 C2 3 A3 B3 C3 3 A3 B3 C4 3 A3 B3 C5 3 A3 B3 C6 3 A3 B3 C7 3 A3 B3 C8 3 A3 B3 C9
B4 1 A3 B4 C1 1 A3 B4 C2 1 A3 B4 C3 1 A3 B4 C4 1 A3 B4 C5 1 A3 B4 C6 1 A3 B4 C7 1 A3 B4 C8 1 A3 B4 C9
2 A3 B4 C1 2 A3 B4 C2 2 A3 B4 C3 2 A3 B4 C4 2 A3 B4 C5 2 A3 B4 C6 2 A3 B4 C7 2 A3 B4 C8 2 A3 B4 C9
3 A3 B4 C1 3 A3 B4 C2 3 A3 B4 C3 3 A3 B4 C4 3 A3 B4 C5 3 A3 B4 C6 3 A3 B4 C7 3 A3 B4 C8 3 A3 B4 C9
A4
B1
1 A4 B1 C1 1 A4 B1 C2 1 A4 B1 C3 1 A4 B1 C4 1 A4 B1 C5 1 A4 B1 C6 1 A4 B1 C7 1 A4 B1 C8 1 A4 B1 C9
2 A4 B1 C1 2 A4 B1 C2 2 A4 B1 C3 2 A4 B1 C4 2 A4 B1 C5 2 A4 B1 C6 2 A4 B1 C7 2 A4 B1 C8 2 A4 B1 C9
3 A4 B1 C1 3 A4 B1 C2 3 A4 B1 C3 3 A4 B1 C4 3 A4 B1 C5 3 A4 B1 C6 3 A4 B1 C7 3 A4 B1 C8 3 A4 B1 C9
B2 1 A4 B2 C1 1 A4 B2 C2 1 A4 B2 C3 1 A4 B2 C4 1 A4 B2 C5 1 A4 B2 C6 1 A4 B2 C7 1 A4 B2 C8 1 A4 B2 C9
2 A4 B2 C1 2 A4 B2 C2 2 A4 B2 C3 2 A4 B2 C4 2 A4 B2 C5 2 A4 B2 C6 2 A4 B2 C7 2 A4 B2 C8 2 A4 B2 C9
3 A4 B2 C1 3 A4 B2 C2 3 A4 B2 C3 3 A4 B2 C4 3 A4 B2 C5 3 A4 B2 C6 3 A4 B2 C7 3 A4 B2 C8 3 A4 B2 C9
B3 1 A4 B3 C1 1 A4 B3 C2 1 A4 B3 C3 1 A4 B3 C4 1 A4 B3 C5 1 A4 B3 C6 1 A4 B3 C7 1 A4 B3 C8 1 A4 B3 C9
2 A4 B3 C1 2 A4 B3 C2 2 A4 B3 C3 2 A4 B3 C4 2 A4 B3 C5 2 A4 B3 C6 2 A4 B3 C7 2 A4 B3 C8 2 A4 B3 C9
3 A4 B3 C1 3 A4 B3 C2 3 A4 B3 C3 3 A4 B3 C4 3 A4 B3 C5 3 A4 B3 C6 3 A4 B3 C7 3 A4 B3 C8 3 A4 B3 C9
B4 1 A4 B4 C1 1 A4 B4 C2 1 A4 B4 C3 1 A4 B4 C4 1 A4 B4 C5 1 A4 B4 C6 1 A4 B4 C7 1 A4 B4 C8 1 A4 B4 C9
2 A4 B4 C1 2 A4 B4 C2 2 A4 B4 C3 2 A4 B4 C4 2 A4 B4 C5 2 A4 B4 C6 2 A4 B4 C7 2 A4 B4 C8 2 A4 B4 C9
3 A4 B4 C1 3 A4 B4 C2 3 A4 B4 C3 3 A4 B4 C4 3 A4 B4 C5 3 A4 B4 C6 3 A4 B4 C7 3 A4 B4 C8 3 A4 B4 C9
36
3.4. TÉCNICA DE PROCESAMIENTO DE DATOS
Para la técnica de procesamiento de datos se utilizará un análisis de varianza
ANOVA para comparar las medias de la variable respuesta en los diferentes niveles de los
factores.
Tabla 7. ANOVA para un diseño factorial AxB
Fuente de
variación
Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Cuadrados
Medios
Estadística
F
Efecto A SSA ɑ-1 CMA=SSA/( ɑ-1) CMA/CME
Efecto B SSB Ƅ-1 CMB=SSB/( Ƅ-1) CMB/CME
Efecto
AB SSAB (ɑ-1)( Ƅ-1) CMAB=SSAB/(ɑ-1)( Ƅ-1) CMAB/CME
Error SSE ɑƄ(n-1) CME=SSE/( ɑƄ(n-1))
Total SST ɑƄn-1
Elaborado por: Sarasti, D.
3.5. MATRIZ DE OPERACIONALIZACIÓN DE VARIABLES
Tabla 8. Matriz de Operacionalización de Variables
Variable Dimensiones Indicadores
Tipo de Hoja
Hoja fresca - Análisis Fitoquímico
- Cuantificación espectrofotométrica
de flavonoides. Hoja Seca
Actividad antimicrobiana
Resistente - Medición de los halos de inhibición
- Determinación de la Concentración
Mínima Inhibitoria
Sensible
Intermedio
Elaborado por: Sarasti, D.
37
CAPÍTULO IV
ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
4.1. PROCESO DE EXTRACCIÓN
El proceso de extracción se realizó con las hojas frescas y hojas secas de la especie
vegetal utilizando un único solvente (Etanol 70°) y por el método de Soxhlet. El porcentaje
de rendimiento de extracción se calculó mediante la ecuación 1.
%𝑅 =𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑜𝑏𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑜
𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 ∗ 100
%𝑅 =6,82 [𝑔]
49,78[𝑔] ∗ 100
%𝑅 = 13,6
Tabla 9. Porcentaje de rendimiento de extracción
Elaborado por: Sarasti, D
En la tabla 9 se muestra el porcentaje de rendimiento de extracción realizado por el
método de Soxhlet tanto para la hoja fresca como para la hoja seca, obteniendo como
resultados 13,6% y 10,7% respectivamente. La diferencia del porcentaje de rendimiento
de extracción entre la hoja fresca y la hoja seca fue del 3% que es un valor mínimo, lo que
determina que este método de extracción permite obtener un rendimiento bueno con los
diferentes tipos de hojas de esta especie vegetal.
EXTRACCIÓN POR EL MÉTODO SOXHLET
Tipo de
Hoja
Peso inicial de
la muestra [g]
Peso final
del extracto
[g]
%R Promedio
%R
Hoja
Fresca
49,78 6,82 13,7
13,6 49,65 6,67 13,4
49,46 6,72 13,6
Hoja
Seca
49,34 5,31 10,7
10,7 49,28 5,27 10,7
49,31 5,23 10,6
38
Elaborado por: Sarasti, D.
4.1.1. Tamizaje Fitoquímico
Tabla 10. Resultados del Tamizaje Fitoquímico
Metabolitos
secundarios
Reacciones Hojas frescas Hojas secas
Fase
acuosa
Fase
orgánica
Fase
acuosa
Fase
orgánica
Alcaloides
Dragendorff +++ + +++ +
Mayer ++ + ++ +
Wagner +++ + ++ ++
Esteroles
Lieberman-Bouchard N/A +++ N/A +++
Zack N/A +++ N/A +++
Flavonoides Shinoda +++ N/A +++ N/A
Cianidina +++ N/A +++ N/A
Medio Alcalino +++ N/A +++ N/A
Antocianos Con Ácido
Clorhídrico
++ N/A ++ N/A
Antraquinonas Bontrager + N/A - N/A
Taninos
Con Cloruro Férrico ++ N/A ++ N/A
Gelatina Salada ++ N/A ++ N/A
Saponinas Con agua ++ N/A ++ N/A
Glúcidos
Cardiotónicos
Baljet N/A + N/A +
Kedde N/A + N/A +
Lieberman-Bouchard N/A ++ N/A ++
Abundante: +++
Moderado: ++
Poco: + No aplica: N/A
Nada: -
Elaborado por: Sarasti, D.
0
2
4
6
8
10
12
14
HOJA FRESCA HOJA SECA
13,6 10,7
Porcentaje de rendimiento de extracción
Gráfica 1. Porcentaje de Rendimiento de extracción a partir de Hojas Frescas y Secas
39
El tamizaje fitoquímico del extracto obtenido a partir de las hojas frescas y secas de
la especie vegetal Moringa oleifera se lo realizó en base al anexo 3. Los resultados
obtenidos de acuerdo a la tabla 9 permiten determinar la presencia de los siguientes
metabolitos secundarios: Alcaloides, Esteroles y Flavonoides en abundante cantidad,
Antocianinas, Taninos, Saponinas y Glúcidos cardiotónicos en cantidad moderada, y
Antraquinonas en poca cantidad.
4.2. CUANTIFICACIÓN FLAVONOIDES
La cuantificación de flavonoides se realizó mediante el método espectrofotométrico
utilizando como marcador, Quercetina obteniendo los siguientes resultados de absorbancia
de acuerdo a cada concentración.
Tabla 11. Datos de Concentración y Absorbancia del estándar Quercetina
Elaborado por: Sarasti, D.
Gráfica 2. Curva de calibración del Estándar de Quercetina
Elaborado por: Sarasti, D.
y = 0,2306x + 0,0059R² = 0,9996
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Ab
sorb
anci
a
Concentración
Curva de Estándar de Quercetina
Concentración
[mg/ml]
Absorbancia
2 0,469
1 0,231
0,5 0,122
0,25 0,068
0,125 0,034
0,0625 0,019
40
𝐴 = 𝑚𝐶 + 𝑏
0,214 = 0,2306𝐶 + 0,0059
𝐶 =0,214 − 0,0059
0,2306∗ 100
C = 90,24 [mg Quercetina / ml extracto]
Tabla 12. Concentración de flavonoides en extractos totales y fracciones activas
Absorbancia Concentración
Extracto Total Hoja Fresca 0,214 90,24
Fracción activa Hoja Fresca 0,198 83,30
Extracto Total Hoja Seca 0,205 86,34
Fracción activa Hoja seca 0,179 75,06
Elaborado por: Sarasti, D.
En la tabla 11 se muestra la concentración de la fracción extraída de las hojas frescas
y hojas secas. El extracto total presenta mayor concentración de flavonoides en los dos
tipos de hoja; en cuanto a la fracción activa presenta mayor cantidad de flavonoides la hoja
fresca en comparación a la hoja seca. De acuerdo a las concentraciones obtenidas se puede
determinar que en los dos tipos de hoja existe abundante presencia de flavonoides por lo
se podría atribuir la actividad antibacteriana a este metabolito.
Elaborado por: Sarasti, D.
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Extracto Total
Hoja Fresca
Fracción
activa Hoja
Fresca
Extracto Total
Hoja Seca
Fracción
activa Hoja
Seca
9083 86
75
Concentración de Flavonoides
[mg St/ml extracto]
Gráfica 3. Concentración de flavonoides distribuidos según el tipo de hoja
41
4.3. ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA POR EL MÉTODO DE LOS POCILLOS
EN AGAR
Tabla 13. Halos de inhibición según el tipo de cepa bacteriana con el extracto total
EXTRACTO
TOTAL
Cepa Bacteriana
Diámetro del Halo [mm] Promedio
Hoja fresca
Escherichia coli 30 29 29 29
Pseudomonas aeruginosa 20 18 18 19
Staphylococcus aureus 26 27 26 26
Klebsiella pneumoniae 28 27 28 28
Hoja Seca
Escherichia coli 28 27 27 27
Pseudomonas aeruginosa 16 17 17 17
Staphylococcus aureus 25 24 24 24
Klebsiella pneumoniae 26 26 27 26
Elaborado por: Sarasti, D.
Relacionando los datos obtenidos en la tabla 14 con los patrones de sensibilidad de
la tabla 2 se puede deducir que la fracción extraída tanto de la hoja fresca como de la hoja
seca del extracto total presentan actividad antimicrobiana eficaz frente a las cepas
bacterianas analizadas a excepción de Pseudomonas aeruginosa que presenta una
sensibilidad intermedia. Así tenemos para las enterobacterias (Escherichia coli y Klebsiella
pneumoniae) un patrón de sensibilidad ≥ 23 mm que como se observan en la tabla los halos
de inhibición experimentales superan al valor de referencia; de igual manera para
Staphylococcus aureus cuyo patrón de sensibilidad es ≥ 14 mm, por lo tanto estas cepas
son sensibles al activo extraído; en lo que refiere a Pseudomonas aeruginosa el patrón de
sensibilidad es ≥ 21 mm, por lo tanto con los halos de inhibición experimentales obtenidos
se puede deducir que esta cepa no es totalmente sensible al metabolito extraído.
Gráfica 4. Promedio de los halos de inhibición con el Extracto Total
Elaborado por: Sarasti, D.
0
5
10
15
20
25
30
E. coli P. aeruginosa S. aureus K. pneumoniae
29
19
262827
17
2426
Promedio de los diámetros de los Halos de inhibición con
el Extracto Total
Hoja Fresca
Hoja Seca
42
Tabla 14. Análisis de Varianza para halos de inhibición formados por el Extracto Total
Fuente Suma de
Cuadrados
Gl Cuadrado
Medio
Razón-F Valor-P
EFECTOS
PRINCIPALES
A:Tipo de Hoja 20,1667 1 20,1667 48,91 0,1235
B:Cepa bacteriana 409,833 3 136,611 331,35 0,0000
RESIDUOS 7,83333 19 0,412281
TOTAL (CORREGIDO) 437,833 23
Elaborado por: Sarasti, D.
Los valores-P prueban la significancia estadística de cada uno de los factores.
Puesto que 1 valor-P es menores que 0,05, este factor tiene un efecto estadísticamente
significativo sobre los Halos de inhibición con un 95,0% de nivel de confianza. Por lo
tanto se establece que las diferentes cepas bacterianas son estadísticamente significativas
sobre la variable respuesta que es el halo de inhibición formado a partir del extracto total y
que el tipo de hoja no es un efecto significativo.
Tabla 15. Halos de inhibición según el tipo de cepa bacteriana con la fracción activa
FRACCIÓN
ACTIVA
Cepa Bacteriana
Diámetro del Halo [mm] Promedio
Hoja fresca
Escherichia coli 27 28 28 28
Pseudomonas aeruginosa 16 17 17 17
Staphylococcus aureus 23 24 24 24
Klebsiella pneumoniae 26 27 27 27
Hoja Seca
Escherichia coli 26 25 25 25
Pseudomonas aeruginosa 15 15 16 15
Staphylococcus aureus 22 22 23 22
Klebsiella pneumoniae 25 24 24 24
Elaborado por: Sarasti, D.
Relacionando los valores de inhibición presentados en tabla 14 con los patrones de
sensibilidad de la tabla 2 se puede deducir que tanto en la extracción de la hoja fresca como
de la hoja seca en la fracción activa existe actividad antimicrobiana eficaz a excepción de
Pseudomonas aeruginosa que presenta una sensibilidad intermedia. Así tenemos para las
enterobacterias (Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae) un patrón de sensibilidad ≥ 23
mm que como se observan en la tabla los halos de inhibición experimentales obtenidos
superan al valor de referencia; de igual manera para Staphylococcus aureus cuyo patrón de
sensibilidad es ≥ 14 mm por lo tanto estas cepas son sensible al activo extraído, en lo que
refiere a Pseudomonas aeruginosa el patrón de sensibilidad es ≥ 21 mm, por lo tanto con
los valores obtenidos de los halos de inhibición se puede deducir que esta cepa no es
totalmente sensible al metabolito extraído.
43
Gráfica 5. Promedio de los diámetros de los halos de inhibición con la Fracción activa
Elaborado por: Sarasti, D.
Tabla 16. Análisis de Varianza para halos de inhibición formados por la Fracción activa
Fuente Suma de
Cuadrados
Gl Cuadrado
Medio
Razón-F Valor-P
EFECTOS
PRINCIPALES
A:Tipo de Hoja 20,1667 1 20,1667 56,07 0,1123
B:Cepa bacteriana 403,5 3 134,5 373,98 0,0000
RESIDUOS 6,83333 19 0,359649
TOTAL (CORREGIDO) 430,5 23
Elaborado por: Sarasti, D.
Los valores-P prueban la significancia estadística de cada uno de los factores.
Puesto que 1 valor-P es menores que 0,05, este factor tiene un efecto estadísticamente
significativo sobre los Halos de inhibición con un 95,0% de nivel de confianza. Por lo
tanto se establece que las diferentes cepas bacterianas son estadísticamente significativas
sobre la variable respuesta que es el halo de inhibición formado a partir de la fracción activa
y que el tipo de hoja no es un efecto significativo.
0
5
10
15
20
25
30
E. coli P. aeruginosa S. aureus K. pneumoniae
28
17
24
2725
15
2224
Promedio de los diámetros de los Halos de
Inbición con la Fracción activa
Hoja Fresca
Hoja Seca
44
Tabla 17. Halos de inhibición formados con el control positivo frente a cada cepa
bacteriana
Control Positivo (Ceftriaxona)
Diámetro [mm]
Promedio
Escherichia
coli
47 46 46 46 47 47 47
Pseudomonas
aeruginosa
33 33 34 33 33 33 33
Staphylococcus
aureus
39 39 39 38 39 39 39
Klebsiella
pneumoniae
45 44 44 44 45 45 45
Elaborado por: Sarasti, D.
De acuerdo a los datos obtenidos en la tabla 16 se puede deducir que las cepas
bacterianas utilizadas exhiben sensibilidad frente al antibiótico de prueba Ceftriaxona ya
que los valores obtenidos de los halos de inhibición superan a los de referencia (Ver tabla
2).
Elaborado por: Sarasti, D.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Escherichia coli Pseudomonas
aeruginosa
Staphylococcus
aureus
Klebsiella
pneumoniae
47
33
39
45
Promedio de los Halos de Inhibición
formados por la Ceftriaxona
Gráfica 6. Promedio de los diámetros de los halos de inhibición con el control positivo
45
4.4. MICRODILUCIÓN EN PLACA
Este procedimiento se realizó para determinar la Concentración Mínima Inhibitoria de cada extracto obtenido frente a las diferentes cepas
bacterianas.
Tabla 18. Resultados de absorbancia para el Extracto Total frente a las diferentes cepas bacterianas
Tipo de
Extracto
Cepa
bacteriana
B C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C(+) C(-)
EXTRACTO
TOTAL
Escherichia
coli
Hoja
seca
0,342 0,028 0,029 0,027 0,028 0,027 0,029 0,133 0,149 0,161 0,352 0,039
0,345 0,029 0,031 0,025 0,027 0,025 0,028 0,136 0,151 0,163 0,353 0,036
0,343 0,028 0,027 0,028 0,028 0,029 0,029 0,131 0,147 0,160 0,354 0,041
Promedio 0,343 0,028 0,029 0,027 0,028 0,027 0,029 0,133 0,149 0,161 0,353 0,039
Hoja
fresca
0,344 0,037 0,039 0,036 0,035 0,036 0,036 0,139 0,151 0,164 0,354 0,037
0,345 0,039 0,038 0,034 0,032 0,035 0,038 0,141 0,153 0,166 0,355 0,035
0,344 0,035 0,039 0,037 0,037 0,036 0,035 0,137 0,151 0,163 0,355 0,039
Promedio 0,344 0,037 0,039 0,036 0,035 0,036 0,036 0,139 0,152 0,164 0,355 0,037
Pseudomonas
aeruginosa
Hoja
seca
0,342 0,175 0,176 0,174 0,221 0,246 0,263 0,271 0,279 0,294 0,352 0,039
0,344 0,177 0,176 0,171 0,124 0,245 0,261 0,273 0,278 0,292 0,354 0,036
0,341 0,174 0,175 0,176 0,019 0,246 0,265 0,270 0,279 0,295 0,352 0,041
Promedio 0,342 0,175 0,176 0,174 0,121 0,246 0,263 0,271 0,279 0,294 0,353 0,039
Hoja
fresca
0,344 0,179 0,178 0,18 0,231 0,26 0,271 0,282 0,296 0,309 0,354 0,042
0,347 0,181 0,175 0,018 0,234 0,261 0,274 0,285 0,298 0,308 0,357 0,037
0,345 0,178 0,180 0,017 0,229 0,260 0,269 0,280 0,295 0,309 0,356 0,035
Promedio 0,345 0,179 0,178 0,072 0,231 0,260 0,271 0,282 0,296 0,309 0,356 0,038
46
Staphylococcus
aureus
Hoja
fresca
0,341 0,087 0,088 0,086 0,087 0,172 0,201 0,218 0,228 0,236 0,351 0,039
0,344 0,085 0,086 0,086 0,084 0,172 0,198 0,221 0,229 0,238 0,354 0,036
0,345 0,088 0,089 0,085 0,089 0,173 0,203 0,215 0,226 0,235 0,356 0,041
Promedio 0,343 0,087 0,088 0,086 0,087 0,172 0,201 0,218 0,228 0,236 0,354 0,039
Hoja
seca
0,344 0,094 0,095 0,093 0,094 0,181 0,206 0,221 0,233 0,242 0,354 0,044
0,341 0,096 0,095 0,094 0,096 0,184 0,204 0,224 0,234 0,244 0,352 0,042
0,342 0,093 0,096 0,093 0,093 0,179 0,207 0,219 0,232 0,241 0,352 0,041
Promedio 0,342 0,094 0,095 0,093 0,094 0,181 0,206 0,221 0,233 0,242 0,353 0,042
Klebsiella
pneumoniae
Hoja
Fresca
0,341 0,067 0,068 0,066 0,067 0,068 0,147 0,156 0,165 0,173 0,351 0,039
0,344 0,069 0,066 0,066 0,065 0,066 0,149 0,157 0,168 0,176 0,354 0,042
0,342 0,065 0,069 0,067 0,070 0,069 0,145 0,156 0,163 0,171 0,353 0,041
Promedio 0,342 0,067 0,068 0,066 0,067 0,068 0,147 0,156 0,165 0,173 0,353 0,041
Hoja
seca
0,346 0,074 0,073 0,075 0,074 0,073 0,155 0,165 0,174 0,189 0,356 0,044
0,341 0,076 0,075 0,078 0,073 0,072 0,153 0,170 0,175 0,193 0,351 0,042
0,344 0,073 0,072 0,073 0,076 0,075 0,157 0,161 0,173 0,185 0,355 0,045
Promedio 0,344 0,074 0,073 0,075 0,074 0,073 0,155 0,165 0,174 0,189 0,354 0,044
Elaborado por: Sarasti, D.
47
Tabla 19. Resultados de absorbancia para la Fracción activa frente a las diferentes cepas bacterianas
Tipo de
Extracto
Cepa
Bacteriana
B C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C(+) C(-)
FRACCIÓN
ACTIVA
Escherichia
coli
Hoja
fresca
0,341 0,045 0,046 0,045 0,044 0,046 0,149 0,158 0,166 0,174 0,351 0,041
0,347 0,047 0,045 0,041 0,047 0,045 0,146 0,159 0,164 0,176 0,357 0,036
0,345 0,044 0,046 0,047 0,041 0,046 0,151 0,158 0,167 0,173 0,356 0,039
Promedio 0,344 0,045 0,046 0,044 0,044 0,046 0,149 0,158 0,166 0,174 0,355 0,039
Hoja
seca
0,346 0,055 0,056 0,055 0,054 0,055 0,162 0,174 0,183 0,192 0,356 0,044
0,345 0,055 0,058 0,054 0,056 0,056 0,164 0,175 0,186 0,194 0,355 0,047
0,347 0,056 0,055 0,055 0,053 0,054 0,161 0,174 0,181 0,191 0,357 0,032
Promedio 0,346 0,055 0,056 0,055 0,054 0,055 0,162 0,174 0,183 0,192 0,356 0,041
Pseudomonas
aeruginosa
Hoja
fresca
0,345 0,192 0,193 0,195 0,245 0,273 0,288 0,3 0,311 0,319 0,355 0,042
0,344 0,194 0,194 0,193 0,242 0,275 0,287 0,302 0,308 0,317 0,355 0,038
0,342 0,191 0,193 0,196 0,247 0,272 0,288 0,299 0,314 0,321 0,353 0,041
Promedio 0,344 0,192 0,193 0,195 0,245 0,273 0,288 0,300 0,311 0,319 0,354 0,040
Hoja
seca
0,346 0,209 0,206 0,208 0,242 0,257 0,294 0,309 0,319 0,329 0,356 0,044
0,345 0,206 0,208 0,207 0,245 0,257 0,291 0,311 0,321 0,329 0,355 0,039
0,343 0,211 0,205 0,208 0,239 0,258 0,296 0,307 0,318 0,330 0,354 0,041
Promedio 0,345 0,209 0,206 0,208 0,242 0,257 0,294 0,309 0,319 0,329 0,355 0,041
Hoja
fresca
0,344 0,101 0,103 0,102 0,175 0,204 0,217 0,226 0,235 0,246 0,354 0,042
0,343 0,103 0,105 0,104 0,177 0,204 0,221 0,228 0,235 0,247 0,353 0,037
0,346 0,100 0,100 0,100 0,174 0,205 0,214 0,224 0,236 0,244 0,357 0,035
48
Staphylococcus
aureus
Promedio 0,344 0,101 0,103 0,102 0,175 0,204 0,217 0,226 0,235 0,246 0,355 0,038
Hoja
seca
0,344 0,109 0,108 0,109 0,188 0,221 0,234 0,244 0,255 0,266 0,354 0,047
0,347 0,110 0,111 0,108 0,186 0,223 0,237 0,244 0,252 0,263 0,358 0,042
0,345 0,109 0,106 0,109 0,189 0,219 0,231 0,245 0,258 0,268 0,355 0,045
Promedio 0,345 0,109 0,108 0,109 0,188 0,221 0,234 0,244 0,255 0,266 0,356 0,045
Klebsiella
pneumoniae
Hoja
fresca
0,346 0,083 0,084 0,085 0,083 0,154 0,172 0,18 0,189 0,198 0,356 0,042
0,342 0,086 0,085 0,081 0,079 0,155 0,176 0,220 0,192 0,190 0,352 0,039
0,344 0,080 0,083 0,088 0,086 0,153 0,169 0,150 0,185 0,205 0,355 0,035
Promedio 0,344 0,083 0,084 0,085 0,083 0,154 0,172 0,183 0,189 0,198 0,354 0,039
Hoja
seca
0,091 0,093 0,091 0,092 0,159 0,182 0,193 0,201 0,209 0,091 0,355 0,047
0,090 0,090 0,093 0,094 0,161 0,179 0,189 0,205 0,207 0,090 0,353 0,049
0,093 0,096 0,090 0,091 0,157 0,184 0,196 0,197 0,210 0,093 0,351 0,045
Promedio 0,091 0,093 0,091 0,092 0,159 0,182 0,193 0,201 0,209 0,091 0,353 0,047
Elaborado por: Sarasti, D.
49
Gráfica 7. Concentración Mínima Inhibitoria del extracto total de hojas frescas y hojas
secas frente a Escherichia coli
Elaborado por: Sarasti D.
Gráfica 8. Concentración Mínima Inhibitoria de la Fracción activa de hojas frescas y
hojas secas frente a Escherichia coli
Elaborado por: Sarasti D.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Ab
sorb
anci
a
Concentración
CMI de la Fracción Activa de la Hoja Fresca y Hoja
seca frente a Escherichia coli
HOJA FRESCA HOJA SECA
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Ab
sorb
anci
a
Concentración
CMI del Extracto Total de Hoja fresca y Hoja seca
frente a Escherichia coli
HOJA FRESCA HOJA SECA
50
Gráfica 9. Concentración Mínima Inhibitoria del extracto total de hojas frescas y hojas
secas frente a Pseudomonas aeruginosa
Elaborado por: Sarasti D.
Gráfica 10. Concentración Mínima Inhibitoria del extracto total de hojas frescas y hojas
secas frente a Pseudomonas aeruginosa
Elaborado por: Sarasti D.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Ab
sorb
anci
a
Concentración
CMI del Extracto Total de Hojas fresca y hoja seca
frente a Pseudomonas aeruginosa
HOJA FRESCA HOJA SECA
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Ab
sorb
anci
a
Concentración
CMI de la Fracción activa de hoja fresca y hoja seca
frente a Pseudomonas aeruginosa
HOJA FRESCA HOJA SECA
51
Gráfica 11. Concentración Mínima Inhibitoria del Extracto total de hojas frescas y hojas
secas frente a Staphylococcus aureus
Elaborado por: Sarasti D.
Gráfica 12. Concentración Mínima Inhibitoria del extracto total de hojas frescas y hojas
secas frente a Staphylococcus aureus
Elaborado por: Sarasti D.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Ab
sorb
anci
a
Concentración
CMI del Extracto Total de Hoja fresca y Hoja seca
frente a Staphylococcus aureus
HOJA FRESCA HOJA SECA
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Ab
sorb
anci
a
Concentración
CMI de la Fracción activa de la hoja fresca y hoja
seca frente a Staphylococcus aureus
HOJA FRESCA HOJA SECA
52
Gráfica 13. Concentración Mínima Inhibitoria del extracto total de hojas frescas y hojas
secas frente a Klebsiella pneumoniae
Elaborado por: Sarasti D.
Gráfica 14. Concentración Mínima Inhibitoria del extracto total de hojas frescas y hojas
secas frente a Klebsiella pneumoniae
Elaborado por: Sarasti D.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Ab
sorb
anci
a
Concentración
CMI de la Fracción activa de hoja fresca y hoja seca
frente a Klebsiella pneumoniae
HOJA FRESCA HOJA SECA
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Ab
sorb
anci
a
Concentración
CMI de la Fracción activa de hoja fresca y Hoja
seca frente a Klebsiella pneumoniae
HOJA FRESCA HOJA SECA
53
4.4.1. Evaluación del porcentaje de Inhibición
Este proceso se realizó para determinar la cantidad de bacteria inhibida mediante el metabolito extra. Se calculó en base a la ecuación 3 de
acuerdo a los valores de absorbancia obtenidos.
% 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 =𝐴𝑏𝑠. 𝐶𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑝𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑜 − 𝐴𝑏𝑠. 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛
𝐴𝑏𝑠. 𝐶𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑝𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑜∗ 100
% 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 =0,353 − 0,028
0,353∗ 100
% 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 = 92,07
Tabla 20. Porcentaje de Inhibición del Extracto Total frente a las diferentes cepas bacterianas
% de Inhibición
Tipo de
Extracto
Cepa bacteriana C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9
Extracto
Total
Escherichia coli Hoja fresca 92,07 91,78 92,35 92,07 92,35 91,78 62,32 57,79 54,39
Hoja seca 89,58 89,01 89,86 90,14 89,86 89,86 60,85 57,46 53,80
Pseudomonas
aeruginosa
Hoja fresca 50,42 50,14 50,71 37,39 30,31 25,50 23,23 20,96 16,71
Hoja seca 49,44 50,00 49,44 35,11 26,97 23,88 20,79 16,85 13,20
Staphylococcus aureus Hoja fresca 75,42 75,14 75,71 75,42 51,41 43,22 38,42 35,95 33,33
Hoja seca 73,37 73,09 73,65 73,37 48,73 41,64 37,39 33,99 31,44
Klebsiella pneumoniae Hoja fresca 81,02 80,74 81,30 81,02 80,74 58,36 55,81 53,26 50,99
Hoja seca 79,10 79,38 78,81 79,10 79,38 56,21 53,39 50,58 46,61
Elaborado por: Sarasti, D.
54
En la tabla 20 se muestra el porcentaje de inhibición obtenido en cada concentración y frente a las diferentes cepas bacterianas. Escherichia
coli y Klebsiella pneumoniae, fueron las cepas que mayor porcentaje de inhibición presentaron con el extracto total de hoja fresca, con un valor
máximo de 92 y 81 % respectivamente, Staphylococcus aureus presentó un valor máximo de inhibición de 75% , seguido finalmente de
Pseudomonas aeruginosa con el menor porcentaje de inhibición (50%), lo que nos permite determinar que los extractos totales obtenidos presentan
alta actividad antibacteriana frente a las cepas de estudio exceptuando a Pseudomonas aeruginosa.
Gráfica 15. Porcentaje de Inhibición del Extracto Total frente a Escherichia coli
Elaborado por: Sarasti, D.
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
80,0
90,0
100,0
1 2 3 4 5 6 7 8 9
92,191,8 92,4 92,1 92,4 91,8
62,357,8
54,4
89,6 89,0 89,9 90,1 89,9 89,9
60,857,5
53,8
% d
e In
hib
ició
n
Concentraciones
% de Inhibición del Extracto Total frente a Escherichia coli
HOJA FRESCA HOJA SECA
55
Gráfica 16. Porcentaje de Inhibición del Extracto Total frente a Pseudomonas aeruginosa
Elaborado por: Sarasti, D.
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
1 2 3 4 5 6 7 8 9
50,4 50,1 50,7
37,4
30,3
25,523,2
21,0
16,7
49,4 50,0 49,4
35,1
27,0
23,9
20,8
16,9
13,2
% d
e In
hib
ició
n
Concentración
% de Inhibición del Extracto total frente a Pseudomonas aeruginosa
HOJA FRESCA HOJA SECA
56
Gráfica 17. Porcentaje de Inhibición del Extracto Total frente a Staphylococcus aureus
Elaborado por: Sarasti, D.
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
80,0
1 2 3 4 5 6 7 8 9
75,4 75,1 75,7 75,4
51,4
43,2
38,435,6
33,3
73,4 73,1 73,7 73,4
48,7
41,637,4
34,031,4
% d
e In
hib
ició
n
Concentracion
% de Inhibición del Extracto Total frente a Sthapylococcus aureus
HOJA FRESCA HOJA SECA
57
Gráfica 18. Porcentaje de Inhibición del Extracto Total frente a Klebsiella pneumoniae
Elaborado por: Sarasti, D.
En todas las gráficas representadas para porcentaje de inhibición de extracto total se puede determinar que las cepas bacterianas presentan
mayor susceptibilidad frente a los extractos totales de hoja fresca que a los extractos de hoja seca pero con una diferencia que no es mayormente
significativa, de acuerdo a la inhibición obtenida en cada concentración.
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
80,0
90,0
1 2 3 4 5 6 7 8 9
81,0 80,7 81,3 81,0 80,7
58,455,8
53,351,0
79,1 79,4 78,8 79,1 79,4
56,253,4
50,846,6
% d
e In
hib
ició
n
Concentración
Porcentaje de Inhibición del Extracto Total frente a Klebsiella pneumoniae
HOJA FRESCA HOJA SECA
58
Tabla 21. Análisis de Varianza para el porcentaje de Inhibición del Extracto total
Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P
EFECTOS PRINCIPALES
A:Concentración 14737,3 8 1842,17 53,37 0,0000
B:Cepa Bacteriana 21928,4 3 7309,48 211,77 0,0000
C:Tipo de Hoja 75,1742 1 75,1742 2,18 0,1453
RESIDUOS 2036,42 59 34,5156
TOTAL (CORREGIDO) 38777,4 71
Elaborado por: Sarasti, D.
Los valores-P prueban la significancia estadística de cada uno de los factores.
Puesto que 2 valores-P son menores que 0,05, estos factores tienen un efecto
estadísticamente significativo sobre % de Inhibición con un 95,0% de nivel de confianza.
Con los resultados mostrados en la tabla 21 se puede determinar que las diferentes
concentraciones y la cepa bacteriana presentan un efecto significativo sobre el porcentaje
de inhibición obtenido con el extracto total, respecto al tipo de hoja que no presenta efecto
significativo.
59
Tabla 22. Porcentaje de Inhibición de la Fracción Activa frente a las diferentes cepas bacterianas
% de Inhibición
Tipo de
Extracto
Cepa bacteriana C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9
Fracción
Activa
Escherichia coli Hoja fresca 87,32 87,04 87,32 87,61 87,04 58,03 55,49 53,24 50,99
Hoja seca 84,55 84,27 84,55 84,83 84,55 54,49 51,12 48,60 46,07
Pseudomonas
aeruginosa
Hoja fresca 45,76 45,48 44,92 31,83 27,60 18,64 15,25 12,15 9,89
Hoja seca 41,13 41,97 41,41 29,79 22,81 17,18 12,96 10,14 7,32
Staphylococcus aureus Hoja fresca 71,55 70,99 71,27 50,70 42,54 38,87 36,34 33,80 30,70
Hoja seca 69,30 69,58 69,30 47,04 37,75 34,08 31,27 28,17 25,07
Klebsiella pneumoniae Hoja fresca 76,55 76,27 75,95 76,55 56,50 51,41 49,15 46,61 44,07
Hoja seca 74,22 73,65 74,22 73,94 54,96 48,44 45,33 43,06 40,79
Elaborado por: Sarasti, D.
En la tabla 22 se muestra el porcentaje de inhibición obtenido en cada concentración y frente a las diferentes cepas bacterianas. Escherichia
coli y Klebsiella pneumoniae, fueron las cepas que mayor porcentaje de inhibición presentaron con el extracto total de hoja fresca, con un valor
máximo de 87 y 76 % respectivamente, Staphylococcus aureus presentó un valor máximo de inhibición de 71% , seguido finalmente de
Pseudomonas aeruginosa que fue la bacteria que menos porcentaje de inhibición presentó (45%) en relación a las demás cepas, lo que nos permite
determinar que la fracción activa obtenida a partir de los extractos hojas frescas y secas obtenidos presentan alta actividad antibacteriana frente a
las cepas de estudio exceptuando a Pseudomonas aeruginosa.
Comparando los resultados de la tabla 20 y tabla 22 se puede establecer que el extracto total de hoja fresca presenta mayor porcentaje de
inhibición respecto al extracto de hoja seca, pero con una diferencia que no es mayormente significativa. La fracción activa de hoja fresca predomina
sobre el extracto de hoja seca, pero de igual manera con una diferencia que no es significativa.
60
Gráfica 19. Porcentaje de Inhibición de la Fracción activa frente a Escherichia coli
Elaborado por: Sarasti, D.
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
80,0
90,0
1 2 3 4 5 6 7 8 9
87,3 87,0 87,3 87,6 87,0
58,055,5
53,251,0
84,6 84,3 84,6 84,8 84,6
54,551,1
48,646,1
% d
e In
hib
ició
n
Concentración
% de inhibición de la Fracción activa frente a Escherichia coli
HOJA FRESCA HOJA SECA
61
Gráfica 20. Porcentaje de Inhibición dela Fracción activa frente a Pseudomonas aeruginosa
Elaborado por: Sarasti, D.
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
35,0
40,0
45,0
50,0
1 2 3 4 5 6 7 8 9
45,8 45,5 44,9
31,8
27,6
18,6
15,312,1
9,9
41,1 42,0 41,4
29,8
22,9
17,2
13,010,1
7,3
% d
e In
hib
ició
n
Concentración
% de Inhibición de la Fracción activa frente a Pseudomonas
aeruginosa
HOJA FRESCA HOJA SECA
62
Gráfica 21. Porcentaje de Inhibición de la Fracción activa frente a Staphylococcus aureus
Elaborado por: Sarasti, D.
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
80,0
1 2 3 4 5 6 7 8 9
71,5 71,0 71,3
50,7
42,538,9
36,333,8
30,7
69,3 69,6 69,3
47,0
37,734,1
31,328,2
25,1% d
e In
hib
ició
n
Concentración
% de Inhibición de la Fracción activa frente a Staphylococcus aureus
HOJA FRESCA HOJA SECA
63
Gráfica 22. Porcentaje de Inhibición de la Fracción activa frente a Klebsiella pneumoniae
Elaborado por: Sarasti, D.
En todas las gráficas representadas para porcentaje de inhibición de la fracción activa se puede determinar que las cepas bacterianas
presentan mayor susceptibilidad frente a los extractos de hoja fresca que a los de hoja seca, de acuerdo a la inhibición obtenida en cada
concentración., pero con una diferencia que no es mayormente significativa.
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
80,0
1 2 3 4 5 6 7 8 9
76,6 76,3 76,0 76,6
56,5
51,449,2
46,644,1
74,2 73,7 74,2 73,9
55,0
48,445,3
43,140,8
Ab
sorb
anci
a
Concentración
% de Inhibición de la Fracción activa frente a Klebsiella pneumoniae
HOJA FRESCA HOJA SECA
64
Tabla 23. Análisis de Varianza para el porcentaje de Inhibición de la Fracción activa
Elaborado por: Sarasti, D.
Los valores-P prueban la significancia estadística de cada uno de los factores.
Puesto que 2 valores-P son menores que 0,05, estos factores tienen un efecto
estadísticamente significativo sobre % de Inhibición con un 95,0% de nivel de confianza.
Con los resultados mostrados en la tabla 23 se puede determinar que las diferentes
concentraciones y la cepa bacteriana presentan un efecto significativo sobre el porcentaje
de inhibición obtenido con la fracción activa respecto al tipo de hoja que no presenta efecto
significativo.
Tabla 24. Concentración Mínima Inhibitoria de las diferentes cepas bacterianas en
relación al tipo de hoja.
Tipo de
Extracto
Cepa bacteriana Tipo de Hoja CMI experimental
Extracto Total
Escherichia
coli
Hoja fresca 2,82
Hoja seca 2,69
Pseudomonas
aeruginosa
Hoja fresca 11,28
Hoja seca 10,79
Staphylococcus
aureus
Hoja fresca 5.64
Hoja seca 5,39
Klebsiella
pneumoniae
Hoja fresca 1,41
Hoja seca 1,35
Fracción
activa
Escherichia
coli
Hoja fresca 2,60
Hoja seca 2,35
Pseudomonas
aeruginosa
Hoja fresca 10,41
Hoja seca 9,38
Staphylococcus
aureus
Hoja fresca 5,20
Hoja seca 4,69
Klebsiella
pneumoniae
Hoja fresca 1,30
Hoja seca 1,17
Elaborado por: Sarasti, D.
Fuente Suma de
Cuadrados
Gl Cuadrado
Medio
Razón-F Valor-P
EFECTOS
PRINCIPALES
A:Concentración 15819,4 8 1977,43 87,08 0,0000
B:Cepa Bacteriana 19633,6 3 6544,52 288,21 0,0000
C:Tipo de Hoja 152,979 1 152,979 6,74 0,1119
RESIDUOS 1339,73 59 22,7073
TOTAL (CORREGIDO) 36945,7 71
65
De acuerdo a los resultado presentados en la tabla 24 se determinó la CMI para las
diferentes cepas bacterianas, en la misma se muestra que las enterobacterias (Escherichia
coli y Klebsiella pneumoniae) y Staphylococcus aureus tienen una CMI mayor al valor de
referencia de la Ceftriaxona (≥ 0,125 μg/ml y ≥ 4 μg/ml respectivamente) por lo tanto los
extractos obtenidos extracto pueden ser utilizado para tratar este tipo de cepas bacterianas.
En cuanto a Pseudomonas aeruginosa, presenta una CMI menor al valor de referencia del
control positivo (≥ 16 μg/ml), este dato concuerda con los halos y porcentajes de inhibición
obtenidos experimentalmente por lo que se puede deducir que el la fracción extraída de
esta especie vegetal presenta un patrón de sensibilidad intermedio para esta cepa
bacteriana.
66
CAPÍTULO V
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1. Conclusiones
Se hizo la identificación botánica de la planta, determinando que ésta corresponde
a la especie vegetal Moringa oleifera.
Se realizó el proceso de extracción a partir de las hojas frescas y secas de la especie
vegetal Moringa oleífera por el método de Soxhlet utilizando como solvente etanol
(70°), obteniéndose un rendimiento de extracción del 13,6 % para Hoja fresca y
10,7 % para hoja seca.
Se realizó una marcha fitoquímica de los extractos obtenidos en los cuales se
identificó los metabolitos presentes en las hojas frescas y secas de la especie vegetal
Moringa oleífera, mediante pruebas de identificación y perfil cromatográfico, a
través de la cual se determinó la presencia de Alcaloides, Esteroles y Flavonoides
en abundante cantidad, Antocianinas, Taninos, Saponinas y Glúcidos cardiotónicos
en cantidad moderada, y Antraquinonas en poca cantidad.
Se determinó cuantitativamente el porcentaje de la fracción extraída mediante
valoración espectrofotométrica utilizando como marcador Quercetina,
obteniéndose como resultados una concentración de 90,24 mg Quercetina/ ml de
extracto y 86,34 mg Quercetina/ ml de extracto para el extracto total de Hoja fresca
y Hoja seca respectivamente; 83,30 mg de Quercetina/ ml de extracto y 75,06 mg
Quercetina/ ml de extracto para la fracción activa de Hoja fresca y Hoja seca
respectivamente.
Se evaluó la actividad antimicrobiana mediante el método de los pocillos en agar
obteniendo los siguientes halos de inhibición en el extracto total para Escherichia
coli 28 mm, Pseudomonas aeruginosa 18,0 mm, Staphylococcus aureus 25,0 mm
y Klebsiella pneumoniae 27,0 mm, en la fracción activa para Escherichia coli 26,5
mm, Pseudomonas aeruginosa 16,0 mm, Staphylococcus aureus 23,0 mm y
Klebsiella pneumoniae 25,0 mm.
Se determinó la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) mediante el método de
microdilución en placa frente a cepas bacterianas obteniéndose como resultados
para el extracto total una CMI para Escherichia coli 2,73 μg/ml, Pseudomonas
aeruginosa 11,03 μg/ml, Staphylococcus aureus 5,51 μg/ml, y Klebsiella
pneumoniae 2,75 μg/ml. En la fracción activa se obtuvo una CMI para Escherichia
coli 1,23 μg/ml, Pseudomonas aeruginosa 9,89 μg/ml, Staphylococcus aureus 4,95
μg/ml, y Klebsiella pneumoniae 2,47 μg/ml.
Se determinó el porcentaje de inhibición para cada cepa bacteriana respecto a las
diferentes concentraciones, obteniéndose como resultado que el extracto total
presenta mayor porcentaje en comparación a la fracción activa. Los máximos
67
valores de inhibición para el extracto total frente a para Escherichia coli fue de 90,8
%, para Pseudomonas aeruginosa 49,9 %, para Staphylococcus aureus 74,4 % y
para Klebsiella pneumoniae 80,1 % En la fracción activa se obtuvo un porcentaje
de inhibición para Escherichia coli de 85,9 %, para Pseudomonas aeruginosa 43,4
%, para Staphylococcus aureus de 70,4 % y para Klebsiella pneumoniae de 75,4
%.
Se determinó la actividad antimicrobiana del extracto total y de la fracción activa
de las hojas frescas y secas de la especie vegetal Moringa oleífera frente a
microorganismos patógenos, obteniéndose como resultados que la fracción extraída
exhibe patrones de sensibilidad eficaces frente a enterobacterias (Escherichia coli
y Klebsiella pneumoniae), un patrón de sensibilidad aceptable para Staphylococcus
aureus y para Pseudomonas aeruginosa. una susceptibilidad antimicrobiana
intermedia.
5.2. Recomendaciones
Realizar estudios científicos comparativos sobre cada una de las propiedades que
se le atribuye a esta especie vegetal, para comprobar su valor terapéutico.
Obtener extractos a base de diferentes solventes para evaluar la concentración de
los metabolitos presentes en esta especie vegetal.
Se recomienda separar y aislar completamente el activo que le atribuye la actividad
antimicrobiana a esta especie vegetal con el fin de obtener altas concentraciones,
para asociar su acción antibiótica al desarrollo de nuevas moléculas que sirvan
como modelo químico para el diseño y síntesis de nuevas drogas para tratar
infecciones ocasionadas por patógenos.
Hacer estudios de toxicidad de esta especie vegetal y sus diferentes extractos, para
evaluar el riesgo que pueda ocasionar sobre la salud humana frente a exposiciones
agudas o crónicas y para analizar el perfil de seguridad de esta planta.
Se recomienda continuar con este estudio para la elaboración de formas
farmacéuticas a partir del extracto de esta especie vegetal para el tratamiento de
infecciones producidas por las cepas bacterianas mencionadas en este trabajo de
investigación como respuesta a la problemática de salud pública que existe en la
actualidad en cuanto a resistencia microbiana ya que el activo correspondería a un
antibiótico natural.
68
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74
HOJAS FRESCAS
HOJAS SECAS
Anexo 2. Hojas frescas y secas de Moringa oleifera
Anexo 3. Extracción por el Método Soxhlet
76
Reacción de Shinoda
Reacción de Cianidina
Reacción en medio alcalino
Anexo 5. Identificación de flavonoides, reacciones de coloración
Anexo 6. Cromatografía de Flavonoides
77
Escherichia coli
Staphylococcus aureus
Pseudomonas aeruginosa
Klebsiella pneumoniae
Anexo 7. Cepas bacterianas
Anexo 8. Halos de inhibición formados a partir del extracto total de hojas frescas y secas
en bacteria Escherichia coli
78
Anexo 9. Halos de inhibición formados a partir de la fracción activa de hojas frescas y
secas en bacteria Escherichia coli
Anexo 10. Halos de inhibición formados a partir del extracto total de hojas frescas y
secas en bacteria Klebsiella pneumoniae
Anexo 11. Halos de inhibición formados a partir de la fracción activa de hojas frescas y
secas en bacteria Klebsiella pneumoniae
79
Anexo 12. Halos de inhibición formados a partir del extracto total de hojas frescas y
secas en bacteria Staphylococcus aureus
Anexo 13. Halos de inhibición formados a partir de la fracción activa de hojas frescas y
secas en bacteria Staphylococcus aureus
Anexo 14. Halos de inhibición formados a partir del extracto total de hojas frescas y
secas en bacteria Pseudomonas aeruginosa
80
Anexo 15. Halos de inhibición formados a partir de la fracción activa de hojas frescas y
secas en bacteria Pseudomonas aeruginosa
Anexo 16. Diluciones seriadas en microplaca para Escherichia coli con los diferentes
extractos
Anexo 17. Diluciones seriadas en microplaca para Pseudomonas aeruginosa con los
diferentes extractos
81
Anexo 18. Diluciones seriadas en microplaca para Staphylococcus aureus con los
diferentes extractos
Anexo 19. Diluciones seriadas en microplaca para Klebsiella pneumoniae con los
diferentes extractos
82
Especificaciones
E1: Hojas frescas / Hojas secas
E2: Etanol 70°
Proceso de Extracción
Pesar ≈ 50 g de Hojas
de Moringa
Colocar En el capuchón
Armar Equipo de
Soxhlet
Extraer Durante 6
horas
Recolectar El extracto
obtenido
Concentrar
Hasta eliminar
solvente
Determinar Rendimiento
Fin
E1
E2
Anexo 20. Diagrama de flujo del Proceso de Extracción
83
Causas:
Efectos:
Anexo 21. Diagrama de causa efecto
Resistencia
antimicrobiana
Mal uso de
antibióticos Automedicación
Bacterias
multirresistentes
Falla
terapéutica
Menor eficacia en
los tratamientos
Infecciones
complicadas
Mayor costo en
los tratamientos
Aumento de la
mortalidad
Venta libre de
antibióticos
Poca investigación
de antibióticos
naturales
Dependencia de uso de
antibióticos sintéticos
Desarrollo de nuevos mecanismos de
resistencia bacteriana