UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS ... · 2 Contaje en cámara Neubauer 17 ... 11...

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS

CARRERA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA

Caracterización morfológica de aislamientos nativos como potenciales agentes de

control biológico asociados a Fusarium spp., en tomate riñón.

Trabajo de titulación presentado como requisito previo a la obtención del título de

Ingeniero Agrónomo

AUTOR: Galárraga Sánchez David Alejandro

TUTOR: M.Sc. Sebastián Gonzalo Yánez Segovia

Quito, abril 2018

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DERECHOS DE AUTOR

Yo, DAVID ALEJANDRO GALÁRRAGA SÁNCHEZ en calidad de autor y titular de

los derechos morales y patrimoniales del trabajo de titulación Caracterización

morfológica de aislamientos nativos como potenciales agentes de control biológico

asociados a Fusarium spp., en tomate riñón, modalidad presencial, de conformidad con

el Art. 114 del CÓDIGO ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS

CONOCIMIENTOS, CREATIVIDAD E INNOVACIÓN, concedemos a favor de la

Universidad Central del Ecuador una licencia gratuita, intransferible y no exclusiva para

el uso no comercial de la obra, con fines estrictamente académicos. Conservamos a

mi/nuestro favor todos los derechos de autor sobre la obra, establecidos en la normativa

citada.

Así mismo, autorizo/autorizamos a la Universidad Central del Ecuador para que realice

la digitalización y publicación de este trabajo de titulación en el repositorio virtual, de

conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.

El (los) autor (es) declara (n) que la obra objeto de la presente autorización es original

en su forma de expresión y no infringe el derecho de autor de terceros, asumiendo la

responsabilidad por cualquier reclamación que pudiera presentarse por esta causa y

liberando a la Universidad de toda responsabilidad.

________________________________

David Alejandro Galárraga Sánchez

CC. 1711924546

Dirección electrónica: [email protected]

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APROBACIÓN DEL TUTOR/A

En mi calidad de Tutor del Trabajo de Titulación, presentado por DAVID

ALEJANDRO GALARRAGA SANCHEZ, para optar por el Grado de Ingeniero

Agrónomo; cuyo título es: CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA DE

AISLAMIENTOS NATIVOS COMO POTENCIALES AGENTES DE

CONTROL BIOLÓGICO ASOCIADOS A Fusarium spp., EN TOMATE

RIÑÓN, considero que dicho trabajo reúne los requisitos y méritos suficientes para ser

sometido a la presentación pública y evaluación por parte del tribunal examinador que

se designe.

En la ciudad de Quito, a los 3 días del mes de abril del 2018.

_____________________________

M.Sc. Sebastián Yánez

DOCENTE-TUTOR

C.C. 1713201059

iv

CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA DE AISLAMIENTOS NATIVOS

COMO POTENCIALES AGENTES DE CONTROL BIOLÓGICO ASOCIADOS

A Fusarium spp., EN TOMATE RIÑÓN

APROBADO POR:

Ing. Agr. Sebastián Yánez, M. Sc. _______________________

TUTOR

Ing. Agr. Clara Iza, M.Sc. _______________________

PRESIDENTE DEL TRIBUNAL

Dra. Gioconda García, Ph.D. _______________________

PRIMER VOCAL

Ing. Agr. Jorge Caicedo, M. Sc. ______________________

SEGUNDO VOCAL

2018

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DEDICATORIA

A mis padres.

A todos quienes colaboraron para elaborar este trabajo.

vi

AGRADECIMIENTO

A todos aquellos ingenieros que me han ayudado con su sabiduría y compromiso,

especialmente a mi tutor Ing. Agr. Sebastián Yánez, M.Sc., quien me supo orientar

desde el principio dándome la confianza, consejos y apoyo moral para no desistir.

Agradezco a todas las autoridades que me supieron acompañar en este proceso, a la

Ing. Agr. Clara Iza, M.Sc., Ing. Agr. Jorge Caicedo, M.Sc., Dra. Gioconda García,

Ph.D., por el interés prestado y por su apoyo en la elaboración de este proyecto.

A todos mis familiares en especial a mis padres por el apoyo incondicional que me han

sabido demostrar desde el inicio de mi carrera profesional.

A todos mis compañeros que han estado ahí desde el principio hasta el final con su

constante apoyo en pro de nuestra mutua superación.

A mis amigos en general presentes o ausentes que han sido incondicionales en todo

momento.

A EGEEMIP, por sus aportes en pro del conocimientos, con sus especialistas por medio

del blog.

A la Universidad Central del Ecuador y a la Facultad de Ciencias Agrícolas por ser el

pilar de mi formación académica y profesional.

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INDICE DE CONTENIDOS

CAPÍTULOS PÁGINAS

1. INTRODUCCIÓN ....................................................................................... 1

2. REVISIÓN DE LITERATURA ................................................................. 2

2.1. CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA ................................................... 2

2.1.1. Géneros fúngicos presentes en suelos agrícolas ............................................ 2

2.1.2. Géneros de bacterias en suelos agrícolas ....................................................... 2

2.1.3. Aislamiento de material vegetal con sintomatología de la enfermedad ....... 2

2.1.4. Caracterización morfológica en Laboratorio ................................................ 3

2.2. ESTIMACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN POBLACIONAL .................. 3

2.3. CONTROL BIOLÓGICO (CB)..................................................................... 3

2.3.1. Ventajas y desventajas del control biológico ................................................ 4

2.3.2. Control biológico en Ecuador ........................................................................ 4

2.4. POTENCIALES AGENTES DE CONTROL BIOLÓGICO ........................ 5

2.4.1. Trichoderma spp. ........................................................................................... 5

2.4.2. Pseudomonas flourescens .............................................................................. 7

2.4.3. Ventajas del aislamientos nativos en un mismo ecosistema ligado al

patógeno......................................................................................................... 8

2.5. MICROORGANISMOS FITOPATÓGENOS EN EL CULTIVO DE

TOMATE RINÓN ......................................................................................... 8

2.5.1. Enfermedades del tomate riñón bajo invernadero ......................................... 9

2.5.2. Fusarium spp. ................................................................................................ 9

2.5.3. Taxonomía ..................................................................................................... 9

2.5.4. Ciclo de la enfermedad ................................................................................ 10

2.5.5. Fusarium spp., como patógeno del suelo .................................................... 10

2.5.6. Fusarium spp., en Ecuador .......................................................................... 11

3. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................. 12

3.1. UBICACIÓN ............................................................................................... 12

3.2. MATERIALES ............................................................................................ 12

3.2.1. Material de campo ....................................................................................... 12

3.2.2. Material experimental .................................................................................. 12

3.2.3. Materiales de laboratorio ............................................................................. 12

3.2.4. Material de recolección y procesamiento de datos ...................................... 13

3.2.5. Material Biológico Experimental ................................................................ 13

viii

3.3. MÉTODOS .................................................................................................. 13

3.3.1. FASE I: MUESTREO Y AISLAMIENTO ................................................. 13

3.3.2. FASE II. CARACTERIZACIÓN DE MICROORGANISMOS DE

INTERÉS ..................................................................................................... 16

3.3.3. FASE III. PROSPECCIÓN POBLACIONAL DE LOS HONGOS

AISLADOS ................................................................................................. 17

4. RESULTADOS Y DISCUSIONES .......................................................... 19

4.1. FASE I: MUESTREO Y RECOLECCIÓN DE AISLAMIENTOS ............ 19

4.1.1. Medición del pH, temperatura y humedad del laboratorio e invernadero. .. 27

4.1.2. Aislamientos fúngicos en los Invernaderos del CADET. ............................ 28

4.2. FASE II: CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA ........................................ 31

4.2.1. Características culturales de Fusarium spp. y Trichoderma spp. ............... 31

4.3. FASE III. CARACTERIZACIÓN PROSPECCIONAL CUANTITATIVA

DE FUSARIUM SPP. Y TRICHODERMA SPP. ......................................... 41

4.3.1. Tasa de crecimiento micelial de Fusarium spp. y Trichoderma spp. .......... 42

4.3.2. Concentración de los aislamientos de Fusarium spp. y Trichoderma spp. . 43

4.3.3. Escala de evaluación de la infecciión de Fusarium spp., en plantas de

tomate riñón. ................................................ ¡Error! Marcador no definido.

4.3.4. Análisis de conglomerados .......................................................................... 44

5. CONCLUSIONES ..................................................................................... 47

6. RECOMENDACIONES ........................................................................... 48

7. RESUMEN ................................................................................................. 49

SUMMARY................................................................................................. 51

8. REFERENCIAS ......................................................................................... 53

9. ANEXOS ..................................................................................................... 58

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LISTA DE CUADROS

CUADROS PÁGINAS

1 Ubicación del sitio experimental, Tumbaco, Pichincha 2016. 12

2 Antescedentes de uso de suelo en los seis invernaderos del

CADET, Tumbaco, Pichincha 2016.

14

3 Detalle del tipo de muestras en Invernaderos del CADET, con

reportes de existencia del cultivo de tomate riñón. Tumbaco,

Pichincha 2016.

15

4 Escala de evaluación de daño en tallos y raíces en plantas de

tomate riñón por Fusarium spp. Tumbaco, Pichincha 2016.

18

5 Características fenotípicas de las variedades de tomate riñón

cultivadas en los invernaderos del CADET. Tumbaco,

Pichincha 2016.

19

6 Muestras recolectadas e identificadas de los invernaderos del

CADET. Tumbaco, Pichincha 2016.

21

7 Promedios de pH, temperatura y humedad relativa de los

invernaderos y laboratorio del CADET. Tumbaco, Pichincha

2016.

27

8 Presencia y asociatividad de Fusarium spp. (F) y Trichoderma

spp. (T), identificados en los aislamientos de los invernaderos

del CADET. Tumbaco, Pichincha 2016.

30

9 Caracterización fenotípica de los aislamientos de Fusarium spp.

y Trichoderma spp., de los invernaderos del CADET, a los 7

días de sembrado. Tumbaco, Pichincha, 2016.

31

10 Caracterización métrica de las conidias de Fusarium spp. y

Trichoderma spp., de los invernaderos del CADET. Tumbaco,

41

x

Pichincha, 2016.

11 Tasa de crecimiento micelial de los aislamientos de Fusarium

spp., de los invernaderos del CADET. Tumbaco, Pichincha,

2016.

42

12 Tasa de crecimiento micelial de los aislamientos de

Trichoderma spp., de los invernaderos del CADET. Tumbaco,

Pichincha, 2016

43

13 Concentración de conidias.mL-1 de los aislamientos de

Fusarium spp. y Trichoderma spp., en los invernaderos del

CADET. Tumbaco, Pichincha 2016

44

xi

LISTA DE GRÁFICOS

GRÁFICOS PÁGINAS

1 Muestreo al azar utilizado en los invernaderos del CADET 14

2 Contaje en cámara Neubauer 17

3 Digitalización e interpolación de los invernaderos del CADET 20

4 Observaciones macro y microscópicas de hongos en las muestras de

los invernaderos del CADET

29

5 Coloración, forma y avance de crecimiento del micelio de

Fusarium spp.

33

6 Presencia y forma de las Microconidias de Fusarium spp. 34

7 Presencia, forma y número de septos de las Macroconidias de

Fusarium spp.

35

8 Presencia y forma de Clamidósporas de Fusarium spp. 36

9 Coloración, forma y avance de crecimiento del micelio de

Trichoderma spp.

37

10 Presencia y forma de las Conidias de Trichoderma spp. 38

11 Presencia y forma de las Fialides de Trichoderma spp. 39

12 Presencia y forma de Clamidósporas de Trichoderma spp. 40

13 Dinámica de la curva de crecimiento por severidad de los

aislamientos de Fusarium spp., en los invernaderos del CADET.

Tumbaco, Pichincha, 2016

45

14 Análisis de conglomerados de los aislamientos de Fusarium spp., en

los invernaderos del CADET. Tumbaco, Pichincha, 2016

46

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LISTA DE ANEXOS

ANEXOS PÁGINAS

1 Digitalización del CADET 58

2 Invernaderos de muestreo en la investigación 59

3 Sintomatología expresiva de Fusarium spp. en campo 60

4 Muestras vegetales procesadas en Laboratorio 61

5 Muestras de suelo procesadas en Laboratorio 62

6 Aislamiento en fuentes de agua 63

7 Materiales y equipos utilizados en la investigación 64

8 Dispensado del medio de cultivo 65

9 Procesamiento para la siembra de suelo en laboratorio 66

10 Postulados de Koch en plantas de tomate 67

11 Conservación de microorganismos a largo plazo 69

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TITULO: Caracterización morfológica de aislamientos nativos como potenciales

agentes de control biológico asociados a Fusarium spp., en tomate riñón.

Autor: David Alejandro Galárraga Sánchez

Tutor: Sebastián Gonzalo Yánez Segovia

RESUMEN La investigación se centró en el aislamiento de Fusarium spp., y sus potenciales Agentes de

Control Biológico, obtenidos de ambientes tróficos en los invernaderos del CADET. Con el fin

de caracterizar morfoestructuras; se lo hizo en tres etapas secuenciales. Muestreo: Utilizando

material vegetal, suelo y agua. Se identificó Fusarium spp. y Trichoderma spp. Caracterización

morfológica: Macro y microscópicamente mostrando variabilidad entre aislamientos en cuanto a

coloración, tamaños y estructuras de Fusarium spp. y Trichoderma spp. Prospección

poblacional: utilizando tasa de crecimiento, concentración de conidias y análisis de

conglomerados. Los aislamientos con mayor patogenicidad de Fusarium spp., se presentaron para los invernaderos 3, 5 y 6. Las dinámicas de las curvas de crecimiento de este agente patógeno se correlacionan a una tendencia polinómica de segundo orden.

PALABRAS CLAVE: ENEMIGOS NATURALES / MORFOESTRUCTURAS /

PROSPECCIÓN / SOLANACEAE

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TITLE: Morphological characterization of native isolates as potential biological control

agents associated with Fusarium spp., in tomatoes.

Author: David Alejandro Galárraga Sánchez

Tutor: Sebastián Gonzalo Yánez Segovia

ABSTRACT

The research focused on the isolation of Fusarium spp., and its potential biological

control agents, obtained from trophic environments in the CADET greenhouses. In

order to characterize morphostructures; it was done in three sequential stages. Sampling:

using plant material, soil and water. Was identified Fusarium spp. and Trichoderma

spp. Morphological characterization: Macro and microscopically showing variability

between isolates in terms of coloration, sizes and structures of the fungi under study.

Population prospecting: using growth rate, concentration of condids and analysis of

conglomerates. The isolates with higher pathogenicity of Fusarium spp., were presented

for greenhouses 3, 5 and 6. The dynamics of the growth curves of this pathogen

correlate to a second-order polynomial trend.

KEYWORDS: NATURAL ENEMIES / MORPHOSTRUCTURES / PROSPECTING /

SOLANACEAE

1

1. INTRODUCCIÓN

Los problemas fitosanitarios han sido el principal limitante en el cultivo de tomate riñón (Lycopersicum sculentum Mill.), en las zonas productoras del Ecuador. Agentes patógenos que han cambiado su estructura al pasar de los años, por el uso progresivo de plaguicidas, amenazan la producción del país, razón por la cual, una pertinente identificación de patógeno es necesaria al momento de buscar alternativas de control, ya que conociendo su estructura y acción, podremos tener una visión clara a lo que nos estamos enfrentando (Delira, 2009). En los últimos años el uso de plaguicidas ha aumentado considerablemente en los campos agrícolas, causando efectos nocivos sobre el ambiente debido a la residualidad, provocando acumulación en el suelo, agua y plantas, además de provocar niveles de resistencia. Por esta razón se busca obtener alternativas menos agresivas para el planeta que estén orientadas al cuidado ambiental. El uso de Agentes de Control Biológico (ACB) ha sido la mejor opción al reducir el crecimiento y diseminación de plagas, a través de la manipulación del ambiente, hospedero y patógeno, mediante microorganismos antagonistas procedentes del propio y/o entornos cercanos (Ezziyyani, 2004). Según Persoon (1794), Trichoderma spp., es un ejemplo claro, de ACB, este hongo se encuentra adaptado a todo tipo de entorno, antagonista de patógenos de las plantas que promueve, acelera y favorece procesos celulares en el hospedero. Se encuentran en raíces, tallos, rastrojos y en la mayoría de los suelos agrícolas; es de suma importancia para prevenir y controlar enfermedades en cultivos comerciales (Casimiro, 2001). Entre los problemas fitosanitarios que causan pérdidas en la producción representando un alto coste económico para el agricultor, destaca Fusarium spp., o también conocido como marchitez vascular, es un patógeno del suelo de gran importancia, cosmopolita, altamente patogénico y mutagénico. Este hongo se caracteriza por producir numerosas microconidias, macroconidias y clamidosporas, esporas capaces de sobrevivir en hospederos alternativos y producir en el huesped sintomatología de un amarillamiento de hojas básales, posteriormente marchitamiento y secado total de tejidos vasculares (Nelson, 1981). El tomate es considerado una de las hortalizas de mayor importancia en muchos países del mundo, por la gran cantidad de subproductos que se obtiene de él, y las divisas que aporta. Esto ha originado que en Ecuador se incorporen grandes extensiones de tierra para su cultivo. Según el Instituto Nacional de Estadísticas y Censos INEC en el año 2016 en el país existían alrededor de 2837 ha sembradas de tomate riñón, con una producción de 53518 TM al año. Considerando lo anterior, el uso de ACB, es una alternativa viable para el agricultor en el control de este patógeno, por ofrecer dos características importantes enfocadas dentro de esta investigación, ser nativos y obtenidos del mismo ecosistema que el patógeno, por lo cual podría ser más tolerante que microorganismos importados; sin embargo, es determinante aislar y evaluar estos materiales en laboratorio, con el fin de caracterizar sus estructuras de forma y reproductivas de manera prolija. El objetivo de esta investigación es caracterizar morfológicamente aislamientos nativos que sean potenciales agentes de control biológico de Fusarium spp., en tomate riñón. Especificamente se planteo caracterizar geográfica y morfologicamente los sitios y aislamientos de Fusarium spp. y sus posibles ACB en todos los invernaderos del CADET; realizar una prospección poblacional de los aislamientos nativos de Fusarium spp. y sus ACB.

2

2. REVISIÓN DE LITERATURA

2.1. CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA Aislamiento de microorganismos en suelos agrícolas

Las condiciones del suelo, deben ser consideradas, debido a que la temperatura, la disponibilidad de oxígeno, el contenido del agua y la duración del almacenamiento afecta enormemente a la microflora del mismo; y, de esta manera los procesos que en ellos intervienen (Arias y Piñeros, 2008). Por consiguiente, los procedimientos de muestreo tienen que asegurar que el número y las actividades de los microorganismos no se alteren, ya sea positiva o negativamente, de manera no cuantificable durante la recolección y la conservación de la muestra (Atlas y Bartha, 2005).

Metodología para la caracterización Para tener una caracterización completa de los aislamientos obtenidos en un lugar específico se necesitan tomar en cuenta algunos aspectos relevantes, las condiciones climáticas, el tipo de cultivo, zonas adyacentes y tipos de suelo (Arias y Piñeros, 2008); esto nos ayudará en primer lugar a tener una idea superficial del género el cual estamos aislando, después podemos ir un paso más allá, tratando de clasificar en base a sus características macroscópicas típicas; sin embargo, esto no es tan preciso como deseamos, aunque es de gran ayuda si tenemos multitudes de géneros por identificar, pasado este paso se puede proceder a observar sus características de heterotrofismo, formación de esporas, y cuerpos fructíferos, pudiendo llegar casi al objetivo deseado, finalmente la revisión exhaustiva de las claves taxonómicas para determinar así la especie exacta con la que estamos trabajando (Cuervo et al., 2008).

2.1.1. Géneros fúngicos presentes en suelos agrícolas

Según Arias y Piñeros (2008), los géneros de hongos más comunes en los suelos agrícolas son los siguientes: Acrostalagmus, Aspergillus, Acremonium, Botrytis, Cephalosporium, Gliocladium, Monilia, Penicillium, Scopulariopsis, Spicaria, Trichoderma, Trichothecium, Verticillium, Alternaria, Cladosporium, Pillularia, Cylindrocarpon, Fusarium, Absidia, Cunninghamella, Mortierella, Mucor, Rhizopus, Zygorynchus, Pythium, Chaetomium y Rhizoctonia. 2.1.2. Géneros de bacterias en suelos agrícolas La mayoría de la población bacteriana aerobia de gran parte de los suelos está compuesta por géneros Gram Positivos. No es extraño, encontrar que hasta el 70% de la totalidad de los aislamientos bacterianos del suelo se clasifican dentro de las denominadas bacterias Gram positivas del género Arthrobacter spp., siendo la mayoría de la microflora restante Bacillus spp., y Microccus spp. (Grant, 1989). La población Gram negativa generalmente está compuesta en su mayor parte por Pseudomonas spp. y Flavobacterium spp. Otros géneros relativamente frecuentes considerados nativos incluyen Acinetobacter spp., Agrobacterium spp., Alcaligenes spp. y Nocardia spp. (Grant, 1989).

2.1.3. Aislamiento de material vegetal con sintomatología de la enfermedad Las sustancias secretadas por los microorganismos pueden desencadenar un sin número de síntomas en las plantas, por lo que para obtener una buena muestra se necesita determinar la sintomatología clásica que este presenta en el material vegetal, además de tomar la muestra

3

directamente del sitio de acción, es decir, el área donde el patógeno ingresa y se hospeda, de esta manera podremos aislar directamente al agente causal de la enfermedad y tener mayor probabilidad de caracterizarlo (Atlas y Bartha, 2005). 2.1.4. Caracterización morfológica en Laboratorio

La caracterización morfológica en laboratorio permite predecir a qué especie pertenece un determinado aislamiento, mediante un proceso de comparación de diferentes características. Cuanta mayor similitud exista entre las particularidades del aislamiento estudiado en el laboratorio y las que tradicionalmente manifiesta una especie definida, será mayor la probabilidad de que ese aislamiento corresponda a la especie manifestada. Las características empleadas de los distintos grupos de microorganismos obedecen a las posibilidades del laboratorio que realiza la investigación, éstas son principalmente de tipo económico y de la relevancia que tenga en el estudio realizado (Arias y Piñeros, 2008). 2.2. ESTIMACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN POBLACIONAL

La técnica se basa en el conteo de las esporas en un área específica, es decir, determinar el número exacto en forma numérica de tal modo que nos ayude a saber la estimación poblacional de cada aislamiento, además de la medición polar y ecuatorial de estructuras reproductivas del microorganismo (Cuervo et al., 2008). 2.3. CONTROL BIOLÓGICO (CB)

El control biológico consiste en la utilización de organismos naturales y/o modificados, para reducir los efectos de las plagas sobre las plantas, favoreciendo al mismo tiempo el desarrollo de los microorganismos benéficos. Por lo general es altamente específico y utiliza microrganismos que atacan o interfieren directamente con una plaga. En algunos casos es posible encontrar una única cepa microbiana que sea eficaz en muchos ambientes, pero en la mayoría de los casos, se requieren cepas diferentes (Moscardi y Sosa 2000). El CB se puede enfocar en cuatro estrategias: Clásico, inoculativo, inundativo y conservacionista (Moscardi y Sosa 2000).

Control biológico clásico Fue el tipo predominante, entre finales del siglo XIX e inicios del XX. Los agentes de control biológico se importan. Una vez liberado, éste se adapta y pasa a formar parte de la fauna naturalizada de la región (Moscardi y Sosa 2000).

Control biológico inoculativo Los agentes de control biológico se introducen periódicamente, una o más veces, con la finalidad de que se multipliquen en los huertos de forma que sean sus descendencias quienes acaben controlando la plaga, pero sin establecerse de forma permanente; normalmente, por una deficiente hibernación, o por un cambio de cultivo. Aunque en un principio sería deseable que se instalaran de forma permanente, la falta de persistencia puede ser beneficiosa, ya que contribuye a minimizar el posible impacto de los enemigos naturales sobre organismos no objetivos plaga (Moscardi y Sosa 2000).

Control biológico inundativo En este caso, las introducciones son masivas, con una cantidad que controlará la plaga sin que haya que esperar a la aparición de nuevas generaciones del enemigo natural. El uso de estos enemigos naturales es exactamente igual al de un insecticida químico, aunque el momento de aplicación sea, por lo general, mucho más crítico (Moscardi y Sosa 2000).

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Control biológico de conservación Esta estrategia pretende modificar el entorno y manipular el hábitat para favorecer y potenciar la actividad de los enemigos naturales nativos. Se trata de enemigos naturales que ya están presentes en el sistema trófico. Los organismos nativos como estrategia no representan ningún costo de importación adicional ni para el agricultor ni para el medio ambiente (Moscardi y Sosa 2000). La utilización del control biológico de tipo clásico fue inicialmente desarrollado para el manejo de insectos plaga y malezas. Para el control de patógenos, especialmente de tipo fúngico, se ha comprobado que el de tipo inundativo con aislamientos nativos presentan mejor eficacia por la adaptación del agente de control en condiciones ecológicas locales (Yánez et al., 2017a).

2.3.1. Ventajas y desventajas del control biológico

Como ventajas se citan: no contaminan suelo y agua, no tienen efectos nocivos contra la salud de personas y animales, evitamos problemas de contaminación por concentración biológica en la cadena trófica; es decir, evitamos que mueran los depredadores (aves y murciélagos), que se alimentan de insectos o roedores, expuestos a insecticidas o raticidas. Son efectivos a largo plazo, mantienen la biodiversidad en los ecosistemas, reducen el costo económico, baja toxicidad, especificidad de acción, baja capacidad de generar niveles de resistencias, posibilidad de utilizar los conocimientos de biotecnología e ingeniería genética, buen instrumento para el manejo integrado de plagas (Villarroel, 2009).

Como desventajas se citan: mayor costo, eficacia variable, sensible a variaciones ambientales, posible incompatibilidad con algunos tratamientos fitosanitarios, necesidad de conocer muy bien el sistema de cultivo y las relaciones tróficas (Villarroel, 2009). Los insectos beneficos representan unas de las limitantes, por el potencial en rendimiento y la longevidad del hospedero; de igual manera la calidad foliar incrementa la densidad poblacional de fitófagos y por ende la eficiencia del depredador, por lo tanto, las estrategias de manejo deben ser consideradas en función de la fenología del cultivo y las etologías de sus hospedantes (Yanez et al., 2017b). 2.3.2. Control biológico en Ecuador El control biológico en Ecuador hace algunos años era impensable, ningún agricultor era capaz de confiar en productos elaborados con microorganismos, ya que era poco probable pensar que sin el uso de plaguicidas se podría obtener rendimientos similares; sin embargo, al pasar de los años la ineficacia de los productos químicos aumentó, obligándole al agricultor a buscar alternativas diferentes. Según La Asociación Española de Ecología Terrestre, en su investigación sobre el uso de agroquímicos en el año 2004, revelan posibles intereses de por medio, empresas transnacionales involucradas en una campaña promocional intensiva sobre el uso de plaguicidas y el estancamiento total del uso de microrganismos como alternativa viable; no obstante, en la actualidad estas mismas compañías están introduciendo al mercado productos a base de hongos y bacterias benéficas que favorecen el crecimiento vegetal, ya que según Torres (2000), jefe del departamento de Ambiente y Tecnología, de la Universidad Experimental Francisco de Miranda, la incesante contaminación ambiental expuesta en los últimos años, producto de una actividad agrícola intensiva ha obligado a las empresas a cambiar de cara ante el mundo. En el Ecuador Instituciones públicas como Universidad Central, INIAP y Agrocalidad, están implementado programas de concientización ambiental impulsando el uso del control biológico en la Costa y Sierra ecuatoriana. En el caso del tomate de mesa por ejemplo, se ha realizado trabajos minucioso en pro de bajar poblaciones de plagas insectiles importantes como mosca

5

blanca y polilla, con enemigos naturales como Trichogramma, Telenomus, Apanteles, Bacillus thuringiensis, Trichoderma, entre otros (Prado, 2013).

2.4. POTENCIALES AGENTES DE CONTROL BIOLÓGICO

El ACB más estudiado y probado que ha tenido mayor efectividad en la agricultura en contra de enfermedades ha sido Trichoderma spp. (Ezziyyani, 2004). 2.4.1. Trichoderma spp. Una de las alternativas más positivas y que ha dado una respuesta efectiva y concreta, para la protección de los cultivos atacados por patógenos fúngicos del suelo es la utilización de microorganismos antagónicos competitivos como las especies del género Trichoderma (Casimiro, 2001). El género Trichoderma posee buenas cualidades para el control de enfermedades en plantas causadas por patógenos fúngicos del suelo, principalmente de los géneros Phytophthora, Rhizoctonia, Sclerotium, Pythium y Fusarium, entre otros. Las especies de Trichoderma actúan como hiperparásitos competitivos que producen metabolitos antifúngicos y enzimas hidrolíticas a los que se les atribuyen los cambios estructurales a nivel celular, tales como vacuolización, granulación, desintegración del citoplasma y lisis celular, encontrados en los organismos con los que interactúa (Ezziyyani, 2004). Los mecanismos por los que las cepas del género Trichoderma desplazan al fitopatógeno son fundamentalmente de tres tipos: competición directa por el espacio y/o por los nutrientes, producción de metabolitos antibióticos (ya sean de naturaleza volátil o no volátil) y parasitismo directo con determinadas especies de Trichoderma sobre los hongos fitopatógenos (Ezziyyani, 2004). 2.4.1.1. Características morfológicas La mayoría de las colonias de Trichoderma en su inicio tienen color blanco, que se tornan a verde oscuro o amarillento, con esporulación densa. El micelio es ralo y visto al microscopio, es fino, los conidióforos son ramificados, los mismos se presentan como penachos compactados que forman anillos con un sistema irregular de manera piramidal, estos terminan en fiálides donde se forman las esporas asexuales o conidios, son de gran importancia para la identificación taxonómica a nivel de especies (Rodríguez, 2002). Según Delira (2009), las características macro y microscópicas por las que se identifican a Trichoderma son: 2.4.1.2. Características Macroscópicas

Las colonias crecen rápidamente y esporulan en 5 días a 30 0C en Agar Glucosado de Sabouraud, Agar papa-dextrosa y Agar malta. Las colonias son algodonosas al inicio y luego se compactan y esporulan tomando color verde de textura granular formando parches concéntricos (Rodríguez, 2002). 2.4.1.3. Características Microscópicas

Presenta hifas hialinas septadas, conidioforos, fiálides, conidios y clamidósporas. Los conidióforos son hialinos, ramificados y pueden ocasionalmente disponerse en forma piramidal. Las fiálides son en forma de botella unidas a los conidioforos en ángulo recto. Las fiálides pueden encontrarse solitarias o dispuestas en grupo. Las conidias miden 3 μm de diámetro aproximadamente de forma redonda u ovalada. Las clamidósporas tienden a ser en forma de globo con olor a moho húmedo de color amarillento o verdoso (Rodríguez, 2002).

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2.4.1.4. Taxonomía

La mayoría de los Trichoderma no tienen un periodo sexual, simplemente producen esporas asexuales; sin embargo, unos pocos materiales de Trichoderma se les conoce un periodo sexual. Su taxonomía se ha basado tradicionalmente en las diferencias morfológicas, inicialmente en los órganos de esporulación asexual, pero ahora se están utilizandose estudios moleculares, debido a los cuáles, el taxón ha pasado de nueve a más de treinta y tres especies (Dubey et al., 2007). Varios factores genéticos asexuales, tal como la recombinación parasexual, mutación y otros procesos contribuyen a la variación genética. De este modo, el hongo se adapta y evoluciona rápidamente. Existe una gran diversidad en el genotipo y fenotipo de los aislamientos silvestres. Las cepas silvestres son muy adaptables y pueden ser heterocarióticas, mientras que las cepas utilizadas para la agricultura deben ser, homocarióticas (todos los núcleos son genéticamente similares o idénticos). Esto, junto con un estricto control de la variación a través de la deriva genética, permite que estas cepas comerciales sean genéticamente distintas y no variables. Este es un punto de control de calidad muy importante para cualquier empresa que desee comercializar estos organismos (Delira, 2009).

Reino: Fungi División: Ascomycota Subdivisión: Pezizomycotina Clase: Sordariomycetes Orden: Hypocreales Familia: Moniliaceae Género: Trichoderma Agrios (2006)

2.4.1.5. Mecanismos de acción de Trichoderma

Para Trichoderma se han descrito diferentes mecanismos de acción que regulan el desarrollo de los hongos fitopatógenos; entre estos, los principales son la Competencia por espacio y nutrientes, el Micoparasitismo hifal y la Antibiosis, los que tienen una acción directa frente al hongo fitopatógeno. Estos mecanismos se ven favorecidos por la habilidad de los aislamientos de Trichoderma para colonizar la rizósfera de las plantas. Varios autores han sugerido distintos mecanismos responsables de su actividad de control, que incluyen, además de los mencionados, la secreción de enzimas y la producción de compuestos inhibidores (López, 2004). Se conoce que, Trichoderma presenta otros mecanismos, cuya acción biorreguladora es de forma indirecta; entre estos se pueden mencionar los que elicitan o inducen mecanismos de defensa fisiológicos y bioquímicos a través de metabolitos secundarios como es la activación en la planta de compuestos relacionados con los niveles de resistencia (Inducción de Resistencia), con la detoxificación de toxinas excretadas por el hongo y la desactivación de enzimas de estos durante el proceso de infección; la solubilización de elementos nutritivos, que en su forma original no son accesibles para las plantas. Tienen la capacidad además, de crear un ambiente favorable al desarrollo radical lo que aumenta la tolerancia de la planta al estrés. Micoparasitismo hifal

Es definido como una simbiosis antagónica entre organismos, en el que generalmente están implicadas enzimas extracelulares tales como quitinasas, celulasas, y que corresponden con la composición de estructura de las paredes celulares de los hongos parasitados. Las especies de Trichoderma durante el proceso de micoparasitismo crecen quimiotrópicamente hacia el hospedante, se adhieren a las hifas del mismo, se enrollan en ellas frecuentemente y las penetran en ocasiones (Carrillo, 2003).

https://es.wikipedia.org/wiki/Tax%C3%B3n

https://es.wikipedia.org/wiki/Mutaci%C3%B3n

https://es.wikipedia.org/wiki/Genotipo

https://es.wikipedia.org/wiki/Fenotipo

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Actividad lítica En esta etapa ocurre la producción de enzimas líticas extracelulares, fundamentalmente quitinasas, glucanasas y proteasas, que degradan las paredes celulares del hospedante y posibilitan la penetración de las hifas del antagonista. Por los puntos de contacto donde se produce la lisis y aparecen los orificios, penetra la hifa del micoparásito en las del hongo hospedante (Carrillo, 2003).

Antibiosis La antibiosis es la acción directa de antibióticos o metabolitos tóxicos producidos por un microorganismo sobre otro sensible a estos. Algunos autores opinan que la antibiosis no debe ser el principal mecanismo de acción de un antagonista, ya que existe el riesgo de aparición de cepas del patógeno con niveles de resistencia al antibiótico. Muchas cepas de Trichoderma producen metabolitos secundarios volátiles y no volátiles, algunos de los cuales inhiben el desarrollo de otros microorganismos con los que no hacen contacto físico. Tales sustancias inhibidoras son consideradas "antibióticos" (Carrillo, 2003). 2.4.2. Pseudomonas Flourescens Pseudomonas fluorescens son bacterias con forma de bastón, que necesitan oxígeno para vivir. En uno de sus extremos tienen varios flagelos, que son como pelos que les permiten moverse por el suelo. Son conocidas por su capacidad de estimular el crecimiento de las plantas que viven en contacto con ellas (Burgos, 2014). 2.4.2.1. Características de acción

El modo más conocido en que ayudan a estimular el crecimiento de la planta es produciendo antibióticos. Estos evitan que la planta se enferme por la presencia de otras bacterias u hongos patógenos. Cuando están presentes, las bacterias P. fluorescens compiten con patógenos e impiden su crecimiento. También tienen la capacidad de acelerar la germinación y el crecimiento de las plantas a través de hormonas. Algunas de estas bacterias pueden eliminar sustancias contaminantes para el suelo y el agua. Cuando en el suelo hay poco hierro, liberan un compuesto amarillo fluorescente para capturarlo. Las condiciones para su crecimiento óptimo son una temperatura entre 25 y 30°C y pH neutro (Orellana, 2012). 2.4.2.2. Colonización

Se sabe que P. fluorescens se adapta fácilmente al suelo para sobrevivir y colonizar el sistema radicular de las plantas. Este mecanismo inicia con el movimiento flagelar, a mayor movilidad habrá mejor colonización y el grado de infección dependerá de la especie vegetal a la que se asocia y de las condiciones de crecimiento. A la vez se presume que la movilidad de los flagelos en la rizósfera es influenciada por los exudados radicales (iones, oxígeno libre, agua, enzimas, aminoácidos, mucílago, compuestos fenólicos, entre otros) esta interacción conocida como quimiotaxis permitirá a las bacterias adherirse a la superficie radical, formar microcolonias o biofilms discontinuos entre los surcos de las células de la epidermis. Por otra parte ciertas cepas tienen la capacidad de colonizar endofíticamente, es decir desplazarse entre los espacios intercelulares de las células epidérmicas y de la corteza (Orellana, 2012).

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2.4.2.3. Clasificación Taxonómica Dominio: Bacteria Clase: Gammaproteobacteria Orden: Pseudomonadales Familia: Pseudomonadaceae Género: Pseudomonas Especie: P. fluorescens Agrios (2006) 2.4.2.4. Mecanismos de acción de Pseudomonas fluorescens

P. fluorescens se destacan por su alta frecuencia de aparición en la rizósfera de las plantas y entre sus mecanismos de acción se encuentran: Inducción de resistencia sistémica (IRS) Pueden elicitar diferentes mecanismos en las plantas como:

Genes de defensa en las plantas colonizadas.

Acumulación de proteínas relacionadas a la patogénesis (PR-1, PR-2, PR-3) y compuestos fenólicos que contiene grupos o-hydroxi.

Producción de fitoalexinas.

Incremento de la actividad peroxidasa, lisozima, fenilalanina ammonio liasa (PAL) y ácido salicílico.

La presencia de lipopolisacáridos en las paredes de las células bacterianas que actúan como elicitores e inducen la resistencia frente a ciertas enfermedades

Producción de reguladores de crecimiento vegetal. P. fluorescens tiene la capacidad de sintetizar o cambiar la concentración de ciertas sustancias promotoras del crecimiento vegetal, tales como ácido indolacético (AIA), ácido giberélico, citoquininas y etileno que pueden facilitar la absorción de nutrientes presentes en la solución del suelo (Orellana, 2012). 2.4.3. Ventajas del aislamientos nativos en un mismo ecosistema ligado al patógeno Los aislamientos nativos se caracterizan por vivir en suelos agrícolas ricos en nutrientes y con alta humedad, estos hongos tiene la ventaja de poseer un rápido crecimiento y desarrollo a comparación del patógeno, por lo cual, se lo encuentra en un sinnúmero de sustratos y suelos de diferentes locaciones, por esta razón, son muy utilizados para prevenir enfermedades en cultivos comerciales (Koppert, 2016); sin embargo, estos microorganismos han sido mal utilizado en la agricultura, como formulaciones concentradas de esporas o colonias, obtenidas de la reproducción masiva en laboratorio, pero siendo estos aislados en localidades lejanas de donde se desea utilizar. Por esto, la importancia de conservar sus hábitats, donde el ACB está relacionado íntimamente con otros hongos causantes de enfermedades para así permitir desarrollar al 100% su acción biosida en contra de patógenos.

2.5. MICROORGANISMOS FITOPATÓGENOS EN EL CULTIVO DE TOMATE RINÓN La mayoría de los microorganismos fitopatógenos pasan parte de su ciclo de vida en las plantas, en el suelo y en los residuos vegetales. Tienen su ciclo sobre el hospedero, otros sobre el suelo, en donde permanecen en reposo hasta atacar a otro hospedante. Un tercer grupo vive como parasito, pero puede desarrollarse y reproducirse como saprofito estricto. Su diseminación es

https://es.wikipedia.org/wiki/Gammaproteobacteria

https://es.wikipedia.org/wiki/Pseudomonadales

https://es.wikipedia.org/wiki/Pseudomonadaceae

https://es.wikipedia.org/wiki/Pseudomonas

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consecuencia de agentes externos como viento, agua, insectos u otros agentes que le permitan recorrer distancias muy grandes (Orellana, 2012). 2.5.1. Enfermedades del tomate riñón bajo invernadero El tomate puede verse afectado por un buen grupo de plagas y otras alteraciones, especialmente en el cultivo intensivo de invernadero, entre estas tenemos: Oidio (Oidium spp.), Alternaria (Alternaria solani.), Verticillium spp., Fusarium spp., bacterias (Pseudomonas sp., Xanthomonas sp.,); las enfermedades que mayor riesgo tienen de sobrepasar los umbrales económicos por ser hospederos de una multitud de arvenses o por tener facilidad de dispersión son: Fusarium ssp., Oidium sp., Alternaria solani (Agrocalidad, 2015). 2.5.2. Fusarium spp.

El género Fusarium comprende un amplio y heterogéneo grupo de hongos ascomicetos, con amplia distribución en el mundo y una gran importancia desde el punto de vista económico. Incluye numerosas especies, la mayoría de ellas patógenas de plantas, capaces de causar marchitez vascular en un gran número de cultivos y producir toxinas letales para algunos animales (Michielse, 2009). Fusarium también produce una gran cantidad de metabolitos secundarios tóxicos como tricotecenos y fumonisinas que pueden contaminar productos agrícolas. Los tricotecenos pueden también actuar como factores de virulencia en enfermedades de plantas. Algunas especies pueden completar el ciclo sexual, mientras que la mayoría presentan reproducción asexual. Por las pérdidas económicas y la facilidad para su cultivo y manejo en el laboratorio, ha suscitado un gran interés en el estudio de los mecanismos de infección de este patógeno, convirtiéndose en un excelente modelo de experimentación para conocer el proceso de patogénesis (Argotti, 2016). Booth et al. (1984), lo describieron, como un género con esporas asexuales hialinas, septadas y con una célula basal muy característica por la estructura de “tacón”. El hongo produce tres clases de esporas: Microconidias: Esporas generalmente unicelulares, sin septas, hialinas, elipsoidales a cilíndricas, rectas o curvadas; se forman sobre fiálides laterales, cortas, simples o sobre conidióforos poco ramificados. Las microconidias tienen 5- 12 μm de largo por 2,5- 3,5 μm de ancho Macroconidias: Esporas de paredes delgadas, fusiformes, largas, moderadamente curvadas en forma de hoz, con varias células y de 3 a 5 septas transversales, con la célula basal elongada y la célula apical atenuada; las macroconidias tiene un tamaño de 27 a 46 μm de largo por 3,0 a 4,5 μm de ancho. Clamidosporas: Esporas formadas a partir de la condensación del contenido de hifas y conidias, de paredes gruesas. Se forman simples o en pares, terminales o intercalares, poseen un tamaño de 5 a 15 μm de diámetro. Gracias a ellas el hongo sobrevive en condiciones ambientales desfavorables y en el suelo como saprófito de vida libre en ausencia de plantas hospedera. 2.5.3. Taxonomía

El género Fusarium sigue siendo objeto de numerosas clasificaciones. En 1809, Link realizó una primera clasificación morfológica centrada en la forma de los conidios, que describió como “fusiformes y hialinos”. En 1841, Fries incluyó al género dentro del orden Tuberculariaceae. Casi un siglo después, en 1935, Wollenweber y Reinking dividieron el género en 11 secciones, 65 especies, 55 variedades y 22 formas especiales. Gerlach y Niremberg en 1982, así como Nelson

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et al. 1983, desarrollaron un sistema taxonómico basado también en características morfológicas. En 1990, Nelson distinguió 14 especies (Argotti, 2016). Reino: Fungi División: Ascomycota Clase: Hypphomycetes Orden: Hyphomycetales Familia: Tuberculariaceae Género: Fusarium Leslie y Summerell (2006) 2.5.4. Ciclo de la enfermedad

La enfermedad se inicia con el crecimiento de las hifas o con la germinación de las clamidosporas en dormancia presentes en tejidos muertos del hospedante, estimulados por los exudados secretados por las raíces de las plantas recién sembradas. Las hifas del hongo penetran directamente la epidermis de las raíces, pasan a la corteza y a la endodermis, entran a los vasos del xilema, también las hifas pueden penetrar a través de las heridas hechas en forma mecánica o por nemátodos, insectos o miriápodos; sin embargo, la penetración directa a través de las raíces es el método más común de ataque del patógeno. Una vez dentro de la planta, el hongo se mueve hacia el tejido vascular por colonización intracelular a los vasos del xilema y los invade cuando están maduros. El patógeno coloniza por crecimiento del micelio o por medio de transporte pasivo de microconidias. La oclusión de los vasos del xilema infectado juega un papel muy importante en la resistencia de las plantas, ya que aquellas variedades con niveles de resistentencia tienen la capacidad de regenerar nuevos vasos del xilema, como un método para crear vías de transporte de agua para compensar vasos destruidos (Argotti, 2016). 2.5.5. Fusarium spp., como patógeno del suelo

El género Fusarium es un patógeno distribuido ampliamente a nivel mundial (en más 32 países) y afecta a más de 80 cultivos de importancia comercial, como el tomate y la cebolla. Existen diversas especies del género Fusarium, sin embargo las más relevantes para los cultivos de hortalizas son Fusarium oxysporum y Fusarium solani. 2.5.5.1. Marchitez vascular (Fusarium oxysporum) Esta enfermedad es conocida como marchitez y se presenta en distintos cultivos como cucurbitáceas, tomate, pimientos y chiles picantes. Existen tres tipos de razas, sin embargo los síntomas son los mismos en todas las variantes y, cuando se habla de razas, es para especificar la resistencia genética que posee la semilla. F. oxysporum es un hongo cosmopolita que infecta a un sinnúmero de plantas gracias a los diversos mecanismos que tiene para vencer las defensas de muchas de ellas. Se caracteriza por producir colonias de rápido crecimiento, con una tasa diaria cercana a un centímetro en medio papa- dextrosa agar (PDA) a 25 0C. La morfología de las colonias es muy variable y puede presentar dos tipos: una de tipo micelial, caracterizada por la producción de abundante micelio aéreo, algodonoso, con una coloración variable, de blanco a rosado durazno, pero usualmente con un tinte púrpura o violeta más intenso en la superficie del agar con pocas microconidias y una de tipo pionotal con la formación de poco o ningún micelio aéreo y abundantes microconidias (Michielse, 2009).

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2.5.5.2. Pudrición de la base del tallo (Fusarium solani) Esta especie de Fusarium afecta a varias hortalizas, pero los tomates y pimientos son los más afectados. Al igual que F. oxysporum, se reconocen diversas razas fisiológicas. A diferencia de F. oxysporum, esta especie ataca principalmente la zona de la base del tallo y raíz. Provoca marchitez y amarilleamiento de las hojas, así como crecimiento retardado. Afecta seriamente a las raíces y la corona, provocando necrosis en raíces principales y secundarias. Las plantas se vuelven quebradizas cuando el ataque es severo.

2.5.6. Fusarium spp., en Ecuador

El martes 1 de Noviembre del 2016, se reunió el sector bananero nacional para topar temas muy puntuales: evitar el ingreso del Hongo Fusarium oxysporum Raza 4 Tropical, que ocasiona el llamado ‘Mal de Panamá’. Se trata de una de las plagas más destructivas para las musáceas (banano y plátano), que está propagándose rápidamente en países productores como Australia, China, Taiwán, Filipinas, Malasia, Nueva Guinea, Jordania, Líbano, Pakistán y Mozambique. La amenaza generada por aquella plaga está relacionada con el hecho de que, además de hospedarse en varios tipos de cultivos, el microorganismo se dispersa fácilmente a través de suelo, agua o viento y, también, mediante el material adherido a implementos de siembra como zapatos, ropa y vehículos. El caso de los bananeros es un claro ejemplo de la devastación que podría provocar una nueva raza de F. oxysporum en el país. Claramente existe gran preocupación por este patógeno, de parte de los agricultores, no solo en banano sino también pimiento, tomate y un sinnúmero de cultivos de interés. En producciones tecnificadas hace algún tiempo se restringe el ingreso de personas ajenas a la finca, el desinfectar vehículos que entren a la misma, control permanente de las personas que se movilizan dentro de la plantación, entre otras medidas. Además se ejecuta una campaña comunicacional entre instituciones que incluye material de difusión, videos y capacitaciones a gremios y asociaciones de productores, técnicos, universidades, entre otros. Al momento no se tiene un claro indicio del porcentaje total de cultivos de tomate con Fusarium spp., en el país, razón por la cual no se le ha dado la debida importancia, además de que no se han registrado brotes extensivos de esta enfermedad en zonas productoras, sin embargo, este hongo sigue presente en los campos agrícolas y en cualquier momento podría desatar una infección a gran escala que se nos puede ir de las manos (Agrocalidad, 2006).

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3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. UBICACIÓN

La presente investigación se llevó a cabo en el (CADET) Centro Académico Docente Experimental La Tola (Cuadro 1), el cual pertenece a la Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad Central del Ecuador en los laboratorios de Manejo Integrado de Plagas. Cuadro 1. Ubicación del sitio experimental, Tumbaco, Pichincha 2016.

UBICACIÓN LOCALIDAD

Provincia Pichincha

Cantón Quito

Altitud 2465 m.s.n.m.

Latitud 0° 14' 46" S

Longitud 78° 22' 00" O.

Temperatura promedio anual (0C) 16,3

Precipitación promedio anual (mm.) 870,3

Humedad relativa promedio anual (%) 71,75

Evapotranspiración Potencial 62,5

Tipo de Suelo Franco Arenoso

Fuente: INAMHI, 2016; Estación Meteorológica La Tola, 2016.

3.2. MATERIALES

3.2.1. Material de campo

Etiquetas color rojo fosforescente para identificación de cajas marca Plastigama

Tijeras de podar marca Truper 8 ″

Pala de mano para remover suelo Truper 33 x 17 cm

Invernaculo plástico pequeño 0,90 x 1,50 m

Tina plástica 20 L

3.2.2. Material experimental

Suelo fino cernido sin impurezas totalmente estéril en estufa a 80 0C

Plántulas de tomate riñón (Material biológico experimental 5.2.5)

3.2.3. Materiales de Laboratorio

Cámara de flujo laminar casera (Forma rectangular 1 x 0.80, vidrio templado)

Hipoclorito de Sodio 2,5%

Cajas Petri de vidrio PyrexR 100 x 15 mm

Mechero de cobre con alcohol 900 (Forma circular 15 cm radio)

Hojas de Bisturí reforzado N0 10

Agar Malta (extracto de malta y agar) DifcoR

Medio de cultivo B king (Extracto de Tripteína, Peptona, Fosfato dipotásico, Sufato de magnesio y Agar) DifcoR

Agua destilada des ionizada y esterilizada

Autoclave de aluminio All American 6 L

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Balanza Roberval un platillo Fischbein 500 g

Sacabocados para troquelados de goma 4mm

Microscopio óptico unifocal Zeigen aumento 10x-40x

Servilletas estériles 60 x 60 cm

Jabón para platos LavaR

Tubos de ensayo PyrexR 8 mL, 13 x 100 mm

Aceite mineral Johnson´s baby 300 mL

Ácido Láctico 45% Serum

Papel aluminio Diamond

Gradilla plástica #7

Tween 20 al 0,02 %

Aza bacteorológica, de azero inoxidable

Alcohol 70% y 90% Bio pro

Cucharas plásticas Plasti-caucho 7″

Vasos de precipitación Pyrex 100 mL

Algodón sintético para tubos Pomys

Micropipeta vidrio 1 mL BrandR

Micropipeta plástica 1 mL UniPlastTM

ParafilmR

Bandas medidoras de pH (Merck R)

Calibre digital / Pie de Rey Acero 100 mm (T304B.W-1210) 3.2.4. Material de recolección y procesamiento de datos

Libreta de campo espiralada Estilo

Cámara Fotográfica 5 MP, 2592 x 1944 pixels, geo-tagging, foco táctil

Laptop Toshiba Intel Core i3

GPS Huawei p7-My Elevation (precisión horizontal de +/- 5 metros y una precisión de altitud de +/- 10 metros, error +/- 15 metros

ArcGis 10.5

InfoStat/E versión estudiantil

Tablet I Pad 2 mini con análisis fotográfico Image j

3.2.5. Material Biológico Experimental

Plántulas de tomate riñón (4 semanas de edad a partir de semilla certificada, variedad “Pietro”), variedad actualmente sembrada en el CADET, La Morita.

3.3. MÉTODOS

3.3.1. FASE I: MUESTREO Y AISLAMIENTO 3.3.1.1. Antecedentes para incidencia de muestreo

El análisis se realizó mediante muestreo, el cual permitió inferir conclusiones susceptibles para generalización con cierto grado de certeza. El muestreo se basó en plantas tomadas al azar, de todos los invernaderos del CADET, con o sin cultivo de tomate riñón, pero que tengan antecedentes de siembra de esta solanaceae, como se muestra en el Cuadro 2.

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Cuadro 2. Antescedentes de uso de suelo en los seis invernaderos del CADET, Tumbaco, Pichincha 2016.

Codificación Lote

Codificación Invernadero

Codificación Investigación

Cultivos Anteriores

Cultivo Actual

4.6 Invernadero Y 1

Tomate rinón-Zanahoria-Zuquini-

Pimiento-Frutilla

Trigo-Tomate riñón-Taxo-Fréjol-Cartucho.

4.6 Invernadero

To1 2 Tomate rinón

Tomate riñón

4.6 Invernadero

To2 3

Tomate rinón-Pimiento

Tomate riñón

2.1.1 Invernadero

Ba1 4 Tomate rinón

Babaco-Fréjol-Col-Zuquini-Acelga

2.1.1 Invernadero

To3 5 Tomate rinón

Tomate-Pimiento

2.1.1 Invernadero

Bot 6 Tomate rinón

Vivero Plantas

Fuente: Autor, 2016

3.3.1.2. Muestreo

La colecta de muestras se realizó mediante el método de muestreo al azar estratificado (Gráfico 1), el cual consistió en dividir el lote en subunidades homogéneas, dentro de las cuales se tomaron muestras al azar, evitando cualquier desuniformidad que pueda aparecer en el lote. En el caso que no existían plántulas se tomaron muestras de suelo y en los invernaderos con tomate las plantas escogidas fueron las que presentaron expresión sintomatológica de Fusarium (amarillamiento y necrosis en la parte basal de la planta) (Atlas y Bartha, 2005).

Fuente: Ferraris, 2000

Gráfico 1. Muestreo al azar utilizado en los invernaderos del CADET.

3.3.1.3. Metodología de muestreo

Se tomaron 5 muestras de partes vegetales (raíz y tallo) y del mismo lugar se tomó muestras de suelo y fuentes de agua (líneas de goteo, drenaje, surcos por inundación, aspersores) en un

A

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radio de 50 cm. Cada lugar, síntomas y muestras fueron registradas fotográficamente (Cuadro 3). Las muestras de suelo fueron transportadas en bolsas de papel, las de material vegetal en cajas petri de plástico, al laboratorio de Manejo Integrado de Plagas del CADET.

Cuadro 3. Detalle del tipo de muestras en Invernaderos del CADET, con reportes de existencia del cultivo de tomate riñón. Tumbaco, Pichincha 2016.

Lugar Tipo de aislamiento Descripción

CADET

Suelo Agrícola Suelo aislado del mismo lugar que se tomó la muestra vegetal con síntomas de Fusarium spp.

Agua Agua estancada y de riego proveniente de sitios adyacentes a síntomas de Fusarium spp.

Raíz Raíces de plantas con sintomatología clorótica y necrosis a nivel de xilema y floema.

Tallo Tallos de plantas con sintomatología clorótica y necrosis a nivel de xilema y floema.

Fuente: Autor, 2016 3.3.1.4. Georeferenciación, digitalización e interpolación del área de estudio

Las muestras fueron registradas en un sistema de coordenadas WGS 1984 UTM Zone 17S, mediante una aplicación para teléfono inteligente, (Huawei p7-My Elevation); adicionalmente se realizó una digitalización con ayuda de ortofotos obtenidas del IGM e interpolación de los puntos de muestreo por nodos, vectores y capas en el programa utilitario ArcMap 10.5

3.3.1.5. Procesamiento de muestras de Suelo agrícola

El medio de cultivo que se utilizó en primera instancia fue Agar malta (Extracto de malta 30 g, Agar 15 g. y ácido láctico 5 mL), medio universal para hongos y bacterias; este contiene un alto contenido de peptona, extracto de malta y glucosa. La preparación se la realizó mediante una dilución de 9 g. de Agar Malta en 200 mL de agua destilada estéril. Para el aislamiento a partir de suelo, tomamos una muestra representativa. Esta se mezcló bien y se pesó 10 g. en la balanza (sin impurezas), tomamos 90 mL de agua estéril y colocando los 10g. de suelo, se agitó alrededor de 1 minuto, luego se tomaron 1000 µL con una pipeta graduada y se colocaron en 9 mL de agua estéril (10-1), repetimos el procedimiento (10-2), hasta llegar a una dilución de (10-4) para luego sembrarlo en medio Agar Malta. Esta solución se la esparció con una agitación del medio de cultivo, se lo selló con ParafilmR y se lo incubó en un lugar oscuro a temperatura ambiente (Cañedo y Ames, 2004). 3.3.1.6. Procesamiento de Partes Vegetales

Partes de tejido de raíces y tallos fueron tomados para su procesamiento. Con el fin de confirmar Fusarium spp., cada muestra de raíz fue lavada y cortada en pequeñas cuadrículas con Bisturí, luego desinfectada con hipoclorito de sodio al 2,5% por 3 minutos, para retirar el exceso de hipoclorito fue sometido a 3 lavados con agua estéril, posteriormente lavados, los

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pedazos fueron colocados en el medio de cultivo, se flameó la caja y se selló con ParafilmR. Las cajas se incubaron en un lugar oscuro a temperatura ambiente. 3.3.1.7. Aislamiento - determinación visual de hongos y bacterias aisladas

Después de 7 a 10 días de sembrado, se observó un crecimiento de micelio y de colonias de algunos de los posibles aislamientos necesarios para esta investigación; los cuales fueron separados para posteriormente ser purificados clarificados y utilizados. 3.3.1.8. Purificación de microorganismos de interés

Se realizaron purificaciones simultáneas en todos los casos para evitar contaminación externa, con un saca bocados se tomó un pedazo de micelio y se los colocó en el centro de la caja PetriR estéril con medio de cultivo Agar Malta. Nota: los aislamientos bacterianos no fueron purificados ya que no se encontraron posibles Agentes de Control Biológico presentes para fines de esta investigación, después de haber realizado bioensayos de contingencia. 3.3.1.9. Multiplicación de aislamientos

La multiplicación se realizó después de haber sido purificados los aislamientos, mediante el traspaso de una pequeña parte de micelio a nuevas cajas PetriR con medio de cultivo estéril, dicha multiplicación favoreció las pruebas posteriores ya que se tuvo suficiente material experimental. 3.3.2. FASE II. CARACTERIZACIÓN DE MICROORGANISMOS DE INTERÉS

La caracterización se realizó en laboratorio, mediante la visualización de estructuras vegetativas y estructuras reproductivas por claves taxonómicas, priorizando la selección del patógeno y sus posibles controladores biológicos (Cañedo y Ames, 2004).

3.3.2.1. Caracterización morfológica de los Hongos aislados

Estructuras vegetativas Para estudiar estas estructuras fue necesario hacer preparaciones microscópicas, flamear una aguja, tomar parte del micelio, montarla en un porta objetos, sobre una gota de agua destilada, expandirla con ayuda de la aguja, cubriendo una superficie poco menor a la del cubre objetos, colocar el cubre objetos, ponerlo en el microscopio y describir las estructuras presentes; forma, color, tamaño, densidad (Cañedo y Ames, 2004).

Estructuras reproductivas Se determinó las diferentes estructuras reproductivas según su clasificación: Esporas: Se tomó con una aguja esporas del hongo y se depositó en un porta objetos con una gota de agua, cubrimos y observamos al microscopio. Al final se describió forma, tamaño, color, numero de esporas. Cuerpos fructíferos: Se observó la salida de las esporas, de donde nace, que tipo de esporas produce, como se encuentran dispuestas las esporas en el cuerpo fructífero (Cañedo y Ames, 2004).

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3.3.3. FASE III. PROSPECCIÓN POBLACIONAL DE LOS HONGOS AISLADOS 3.3.3.1. Observación microscópica Se realizó una preparación en fresco por la naturaleza hidrofóbica de los conidios, fue conveniente utilizar Tween 20al 0,02% en agua, para una fácil distribución de las estructuras a observar. Se utilizó una aguja de disección para tomar una parte de la superficie del micelio, que luego se depositó sobre una gota de lactofenol. Con la ayuda de otra aguja se extendió el preparado y se cubrió con una lámina cubreobjetos, para luego ser observada al microscopio con objetivos de 10 a 40X. 3.3.3.2. Concentración de conidias con Cámara de Neubauer

Se tomó una muestra al azar, de nuestro cultivo en desarrollo, al menos tres partes, con la ayuda de una aguja de disección, seguidamente, se mezcló con 1 mL de agua destilada estéril. De esta forma queda preparada la suspensión, se tomó la solución con un gotero y se depositó en una placa de Neubauer, para luego observarla al microscopio (40X). El proceso de recuento se realizó en los cuadrantes señalados en la imagen (Gráfico 2), los cuales son L1 y L4, con un total de 32 cuadrantes entre ambos, la forma del conteo es con una convención por la cual si las células tocan el límite superior o el límite izquierdo del cuadro, deben contabilizarse, pero no se contabilizan si tocan el límite inferior o el límite derecho por estar fuera del cuadrante. Este proceso se lo realizó tres veces para obtener un promedio general (Bastidas, 2007).

Fuente: Autor, 2016; Celeromics, 2010 Gráfico 2. Contaje en cámara Neubauer: A) Diagrama de la cámara de Neubauer, en los círculos se muestran los cuadrantes donde se realizaron los conteos B) Área de conteo de las esporas, en negro están los puntos a contarse y en blanco los que no serán contados.

Cálculo de la concentración Aplicamos la fórmula del cálculo de concentración celular. El número de células es la suma de todas las células contadas en todos los cuadrantes, omo el volumen de 1 cuadro grande es: 0,1 cm x 0,1 cm = 0,01 cm2 de superficie 0,01 cm2 * 0,01 cm (Profundidad) = 0,0001 cm3 = 0,0001 mL

1

4

L1 L2 B A

L3 L4

18

La fórmula para recuento con cuadros grandes en cámara de Neubauer:

Concentración = número de células x 10.000 / número de cuadros

3.3.3.3. Tasa de crecimiento micelial por ailamientos de patógenos y controladores biológicos

Para esta técnica se tomó un pedazo de micelio de diámetro 7x7 mm y se la colocó en el centro de una caja Petri con medio Agar Malta. La tasa de crecimiento se midió a lo largo de un número de días consecutivos 3, 5 y 7, tomando datos de largo (crecimiento polar) y ancho (crecimiento ecuatorial) del micelio (Cañedo y Ames, 2004). 3.3.3.4. Inoculación del patógeno en plántas sanas (Postulados de Koch) Se procedió a inocular plantas sanas de tomate riñón para evidenciar si los aislamientos obtenidos de Fusarium spp., son virulentos o no, por lo cual tomamos 16 plantas sanas de aproximadamente 3 a 4 semanas, limpiamos, realizamos un pequeño corte en la base del tallo de forma perpendicular, seguidamente tomamos un pedazo de micelio de cada muestra de Fusarium spp., de los invernaderos seleccionados y las colocamos en la herida (2 plantas por muestra), cubrimos la herida con ParafilmR durante dos días, se humedeció el área con agua estéril, repetimos el procedimiento diariamente con una ligera variante, ya que en vez de colocar micelio, se inyectó repetidamente una suspensión de esporas de Fusarium spp., en agua estéril (10-1) de cada muestra, durante 10 días. Las plantas fueron conservadas en el laboratorio de Manejo Integrado de plagas en un invernadero totalmente estéril simulando la temperatura promedio alcanzada en los invernaderos del CADET. Después de 35 días de la inoculación se determinó si las plantas fueron o no infectadas por el patógeno según la escala de evaluación de Rodríguez et al., 1999 (Cuadro 4). Finalmente reaislamos tejido enfermo para confirmar los postulados de Koch (Cañedo y Ames, 2004). Cuadro 4. Escala de evaluación de daño en tallos y raíces en plantas de tomate riñón por Fusarium spp. Tumbaco, Pichincha 2016.

Grado de Infección

% Daño Síntomas

1 0-10 Plantas sanas o base del tallo sano

2 11-20 Base del tallo ligeramente necrotizado, clorosis leve en las hojas.

3 21-50 Base del tallo necrotizado, presenta color violeta, marchitamiento de las hojas.

4 51-75 Tercio inferior del tallo necrotizado, marchitamiento y defoliación severo de las hojas

5 76-100 Tallos necrotizados o muertos

Fuente: Rodríguez, 2002

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4. RESULTADOS Y DISCUSIONES

Análisis histórico de los predios en estudio Este análisis permitió conocer las variedades de tomate riñón hasta ahora utilizadas en los invernaderos del CADET, durante los diferentes periodos de tiempo (Cuadro 5). Las variedades, Sheila, Daniela, Nemo-netta y Pietro, fueron utilizadas desde el año 2012 hasta la actualidad. Todas las variedades que han sido cultivadas en el CADET, presentan teóricamente niveles de resistentes a Fusarium spp., Verticillium spp. y nematodos, entre otras características de interés para el agricultor. Cuadro 5. Características fenotípicas de las variedades de tomate riñón cultivadas en los invernaderos del CADET. Tumbaco, Pichincha 2016.

VARIEDAD FECHA DE SIEMBRA

CARACTERÍSTICAS FENOTÍPICA Y DE CALIDAD

Pietro Octubre/2015

La planta fué vigorosa, con racimos entre 5 y 7 frutos semiredondos de rojo intenso. Los frutos de esta variedad pesaron entre 230 y 250 g. Tuvieron larga vida en la percha. Necrosis vascular reportada.

Nemo-netta Agosto/2014

Peso medio del fruto de 150 a 180 g, cuando fueron podadas a un solo tallo. Los frutos fueron uniformes, con forma de globo. Necrosis vascular reportada

Daniela Junio/2013

Frutos rojos tanto en firmeza como en conservación. Ampliamente adaptable a diferentes condiciones de cultivo.Necrosis vascular reportada

Sheila Octubre/2012 Los tomates alcanzaron un tamaño de 5 a 6 centímetros y un peso de hasta 200 g. Necrosis vascular reportada

Fuente: Facultad de Ciencias Agrícolas, 2016 De acuerdo con el Cuadro 5, las variedades utilizadas en el CADET, muestran características en tamaño, forma, tiempo de vida en postcosecha y variación en los niveles de resistencia a enfermedades variables; Razón por la cual fueron utilizadas en su momento. En la actualidad se trabaja con la variedad Pietro en los invernaderos 1, 2 y 3 (codificación investigación), del CADET, por su firmeza y durabilidad como lo describe Salazar (2015); demostrando que este híbrido, reporta el mayor crecimiento en longitud y diámetro del fruto, mayor peso y producción, comparado con otros materiales, además de estas razones la rotación de variedades responde a la necesidad de evitar problemas fitosanitarios, producido por un monocultivo intensivo (Yánez et al., 2017a).

4.1. FASE I: MUESTREO Y RECOLECCIÓN DE AISLAMIENTOS

Esta investigación fue realizada en Ecuador, provincia de Pichincha, Cantón Quito, Sector La Morita, Centro Académico Docente Experimental La Tola (CADET), los resultados obtenidos del muestreo y aislamiento fueron los siguientes:

20

Se utilizó la georeferenciación espacial como método de muestreo direccionado a la toma de puntos en zonas específicas del CADET. Del total de superficie del CADET, se tomaron 6 invernaderos (Gráfico 3A) como sitios de muestreo, lo cual esta representado en una ortofoto digital y nos indica que geoposicionalmente son distintos puntos. De cada invernadero, se obtuvieron 5 muestras con el método al azar estratificado, en plantas sintomatológicamente positivas.

Fuente: Autor, 2016 Gráfico 3. Digitalización e interpolación de los invernaderos del CADET: A) vista aérea satelital mostrando cada punto y lote en donde se obtuvieron las muestras. B) Interpolación de la escala de incidencia de infección de Fusarium spp., en el CADET.

Después de la sistematización por nodos y vectores, se estableció el porcentaje de daño que tienen las plantas de tomate dentro de los invernaderos. Entre la sintomatología se encontró: clorosis, caída de hojas y necrotización de tejidos. Al realizar el análisis espacial de los valores de atributo mediante estadísticas zonales se pudo establecer tres rangos de incidencia de la infección por sintomatología expresiva de Fusarium spp. (Gráfico 3B). El porcentaje de infección va desde un 20% en el Inv 5 a un 80% en el Inv. 1 (ver anexo 3); adicionalmente con estos datos se creó una interpolación (Gráfico 3B), dependiendo de los atributos utilizando geoprocesamiento para modelamiento por tipo de aislamiento muestreado.

Las muestras recolectadas en los invernaderos, acompañadas de las coordenadas espaciales, parte aislada, foto y sintomatología expresiva (Cuadro 6), fueron analizadas in situ, al momento de su recolección lo cual, presento diferencias fenotípicas de la acción del agente patógeno.

B A

21

Cuadro 6. Muestras recolectadas e identificadas de los invernaderos del CADET. Tumbaco, Pichincha 2016.

Códificación Investigación

Muestra N0

Coordenadas X Coordenadas Y Parte aislada Sintomatología Imagen

Invernadero 1

1 792545 9975028 Parte

vegetal/suelo/agua

Clorosis-

defoliación-necrosis

2 792556 9975033 Parte

vegetal/suelo/agua

Clorosis-


3 792537 9975037 Parte

vegetal/suelo/agua

Clorosis-


4 792540 9975031 Parte

vegetal/suelo/agua

Clorosis-


5 792539 9975034 Parte

vegetal/suelo/agua

Clorosis-


22


Muestra N0


Invernadero 2

1 792533 9975049 Parte

vegetal/suelo/agua

Clorosis-


2 792544 9975056 Parte

vegetal/suelo/agua

Clorosis-


3 792557 9975064 Parte

vegetal/suelo/agua

Clorosis-


4 792571 9975074 Parte

vegetal/suelo/agua

Clorosis-


5 792562 9975072 Parte

vegetal/suelo/agua

Clorosis-


23


Muestra N0


Invernadero 3

1 792565 9975097 Parte

vegetal/suelo/agua

Clorosis-


2 792540 9975078 Parte

vegetal/suelo/agua

Clorosis-


3 792525 9975068 Parte

vegetal/suelo/agua

Clorosis-


4 792531 9975063 Parte

vegetal/suelo/agua

Clorosis-


5 792538 9975067 Parte

vegetal/suelo/agua

Clorosis-


24


Muestra N0


Invernadero 4

1 792489 9974788 Suelo/agua

Clorosis-defoliación

2 792496 9974784 Suelo/agua Clorosis-defoliación




25


Muestra N0


Invernadero 5

1 792501 9974775 Parte

vegetal/suelo/agua

Clorosis-


2 792508 9974770 Parte

vegetal/suelo/agua

Clorosis-


3 792493 9974781 Parte

vegetal/suelo/agua

Clorosis-


4 792489 9974777 Parte

vegetal/suelo/agua

Clorosis-


5 792484 9974775 Parte

vegetal/suelo/agua

Clorosis-


26


Muestra N0


Invernadero 6

1 792514 9974767 Suelo/agua ____

2 792483 9974792 Suelo/agua ____

3 792480 9974787 Suelo/agua _____

4 792473 9974778 Suelo/agua _____

5 792464 9974770 Suelo/agua _____

Fuente: Autor, 2016

27

Las plantas tomadas como muestra presentaron clorosis, decaimiento generalizado, tallos necrosados y defoliación. De las plantas muestreadas se aislaron raíces y tallos con esta sintomatología, para verificar una la infección patogénica fúngica por Fusarium spp., así mismo, con las respectivas coordenadas geográficas en UTM, se procedió a realizar corelaciones multiples de distribución del grado infeccioso del presente patógeno Del total de plantas muestreadas todas presentaron estas características como se observa en el Cuadro 6, dándonos indicios de especies de Fusarium spp. Según Torres, (2000), las especies de Fusarium, presentan estos síntomas tan característicos en hortalizas, con presencia de amarillamiento, clorosis, marchitez, retardo en el crecimiento y decoloración de la corona y raíces; llegando muchas veces a un colapso y a una completa pudrición radical. Del mismo modo Garnica (2004), asegura que los agentes de diseminación de las esporas de Fusarium spp., son: agua, animales, nematodos y babosas, razón por la cual se dificulta el control en invernaderos que comparten un mismo ambiente aislado del exterior. 4.1.1. Medición del pH, temperatura y humedad del laboratorio e invernadero. Las temperaturas y humedades del laboratorio de MIP y de los Invernaderos fueron tomadas con un termohigrómetro digital a las 12 pm de la tarde (Cuadro 7), 1 vez al mes, por 5 meses consecutivos. Cuadro 7. Promedios de pH, temperatura y humedad relativa de los invernaderos y laboratorio del CADET. Tumbaco, Pichincha 2016.


pH

Temperatura 0C

Humedad %


Temperatura 0C

Humedad %


Temperatura 0C

Humedad %

Invernadero 1

5,5

32,6

45,3

Laboratorio

MIP

23,5

58,6

Estación

Meteorológica La Tola

22,3

54,4

Invernadero 2

5,5

35,1

40,8

Invernadero 3

6,5

33,7

48,6

Invernadero 4

6,5

32,8

51,1

Invernadero 5

6,7

33,4

42,5

Invernadero 6

5,5

30,6

45,2

Fuente: Autor, 2016; Estación Meteorológica La Tola, 2016 La temperatura promedio en laboratorio fue de 23,5 0C; lo cual simula condiciones ligeramente parecidas a las del invernadero, exceptuando las horas del mediodía cuando las temperaturas llegan a los 35 0C, por lo cual se trabajó con temperaturas óptimas para el crecimiento y reproducción de estos hongos. La máxima temperatura en los invernaderos, llegó a los 32,6 0C, siendo esta excesivamente alta y en casos perjudicial para las hortalizas. Por esta razón se podría incrementar el ataque de las enfermedades, al existir un agotamiento producido por la temperatura sobre las plantas.

28

El pH de todos los suelos, fluctuó entre 5,5 y 6,5 lo que nos indica que es un pH óptimo para el desarrollo de los hongos el cual se encuentra en el intervalo de 5 a 6. Como se observa en el Cuadro 7, los resultados obtenidos de pH en los suelos de los invernaderos son óptimos para el crecimiento de microorganismos fúngicos, tanto patogénicos como antagonistas; ya que se encuentran en un rango de 5 a 6 como lo describe Schäfer (1994), el cual, indica, que un pH alto perjudica enormemente el desarrollo de los hongos por la solubilidad de los metales y a pH bajos se afectan los sistemas enzimáticos, el ingreso de vitaminas esenciales, ácidos orgánicos y la toma de minerales. La temperatura de igual manera se sitúa en los rangos establecidos, para su normal crecimiento y esporulación. 4.1.2. Aislamientos fúngicos en los Invernaderos del CADET. La caracterización macroscópica de hongos se realizó en laboratorio, días después de haber sido sembradas la totalidad de las muestras, fueron examinadas exhaustivamente, la pigmentación del micelio y estructuras microscópicas fueron utilizadas para su identificación. De las 30 muestras de suelo y 20 muestras de material vegetal recolectadas y sembradas en Agar malta, se obtuvieron 5 géneros fúngicos: Fusarium, Trichoderma, Aspergillus, Penicillium y Alternaria (Gráfico 4).

A

B

C

29

Gráfico 4. Observaciones macro y microscópicas de hongos en las muestras de los invernaderos del CADET: A) Fusarium; B) Penicillium; C) Alternaria; D) Trichoderma; E) Aspergillus.

La pigmentación del micelio tuvo una variación según el tiempo de observación. Aislamientos de 3 días, presentaron menor intensidad en cuanto al color, que aislamientos de 7 a 10 días, razón por la cual, las observaciones se hicieron pasados los 7 días de sembrados tal y como se detalla en la cuarta edición de la ilustración de géneros de hongos imperfectos de Argotti, (2016). Las pigmentaciones y estructuras producidas por los hongos fueron: Para Fusarium: micelio aéreo, color rosado intenso, microconidias de forma ovoide y macroconidias en forma de canoa. Penicillum: micelio compacto, velloso, verde claro con borde blanco, hifas septadas con conidióforos simples o ramificados, fialides y conidias. Alternaria: coloración gris oscura, conidióforos simples tabicados de forma alargada, al extremo se forman conidios de color pardo, de acuerdo con Barnett y Barry (2000), la mayoría de estos hongos son saprofitos del suelo. Trichoderma: micelio compacto y de estructura granular verde oscuro, hifas septadas, conidióforos fialides y conidias de forma redonda. Aspergillus: micelio compacto verde claro con borde blanco, hifas septadas, conidióforos y conidias en su borde. El hongo con propiedades promisorias y que no causa efecto no deseado, encontrado como potencial antagónico sobre Fusarium spp., fue Trichoderma spp., descartando presencia alguna de bacterias en esta investigación, al usar ácido láctico en la preparación del medio de cultivo. Los dos hongos de interés fueron purificados y observados en detalle.

E

D

30

De todas las muestras, se escogieron al azar 6 aislamientos de Fusarium y 6 de Trichoderma, una por cada Invernadero; dando un total de 12 aislamientos. Se realizo un sesgo por cercanía promisoria de parentesco, al escoger aquellos aislamientos que se encontraban juntos, es decir, Fusarium en tejido vegetal y Trichoderrma del suelo del mismo lugar de origen (Cuadro 8), indistintamente del sistema trofico. En los invernaderos que no tenían plantas de tomate se escogió aislamientos de Fusarium y Trichoderma del suelo o fuentes de agua. Cuadro 8. Presencia y asociatividad de Fusarium spp. (F) y Trichoderma spp. (T), identificados en los aislamientos de los invernaderos del CADET. Tumbaco, Pichincha 2016.

Código Investigación

Tipos de aislamientos 1 2 3 4 5

Raíz - Suelo Tallo - Suelo

Invernadero 1 F T F

F - T F F - ___ ___ _ ___ F - T

Invernadero 2 F - T F

F - T F - T F ___ - T F - ___

Invernadero 3 F - ___ ___ - T F - T F F - T ___ - ___

Invernadero 4 ___ - T ___ - T ___ - T F

___ - T ___ - T

Invernadero 5 F - T F

F - T ___ - T ___ - T F - T

Invernadero 6 ___ - T ___ - T ___ - T ___ - T ___ - T F

Fuente: Autor, 2016 Como se muestra en el Cuadro 8, Fusarium, es el hongo que mayor presencia tuvo en las muestras de partes vegetales de tomate riñón; así mismo, Trichoderma, lo es para las muestras de suelo. En el Inv. 1, se encontró Fusarium, en 6 aislamientos, Trichoderma, en 3. En el Inv.2, Fusarium, en 6 y Trichoderma, en 4. En el Inv.3, Fusarium, en 4 ocasiones y Trichoderma spp, en 3, en el Inv. 4, solo se contó con suelo y se identificó Fusarium, en 1 ocasión y Trichoderma, en 5.; el Inv. 5, Fusarium, en 4 ocasiones y Trichoderma, en 5. Finalmente para el Inv. 6, Fusarium, en 1 ocasión y Trichoderma, en 5. Con estos resultados de presencia y asociatividad del patógeno como de su enemigo natural se puede inferir coevolución por sitio específico de localización (Yánez et al., 2017a). En el Inv. 4 y 6, no se contó con muestras de tejido vegetal, de materiales de tomate riñón en el momento de muestreo; sin embargo, en los aislamientos de suelo se identificaron especies de Fusarium y corrobora lo que manifiesta Casimiro (2001), que las esporas de Fusarium, pueden estar presentes al menos por 15 años en forma de clamidósporas. Por otro lado, Trichoderma spp., se identificaron en casi todas las muestras de suelo, posiblemente por lo expuesto por Martínez (2009), el cual, asegura que Trichoderma, es un hongo propio de suelos agrícolas de diferentes regiones en el mundo y abundante de por sí; además su presencia revela la riqueza de esos suelos.

31

Las muestras de agua fueron obtenidas de relictos cercanos, como goteros, sequias y otros sistemas de riego. Los resultados evidenciaron la no presencia de Fusarium spp., lo que nos indica, que las esporas teóricamente no están siendo transportadas por el agua, al ser un medio hipotónico que no permite la germinación de las mismas; de igual manera, no existe una distribución de las esporas por todo el invernadero, a pesar de que es muy probable encontrar la presencia de esporas-cuerpos fructíferos en las fuentes de agua próximas a los cultivos con sintomatología expresiva (López, 2004).

Eziashi et al. (2007), en su investigación compararon la eficiencia de Trichoderma spp., contra Fusarium oxysporum aislados de suelos en donde se cultivaba papayas y que presentaba incidencia de agente causal de la pudrición de plántulas. Los tratamientos consistieron en diferentes dosificaciones de Trichoderma sp., y una sola dosificación de Fusarium oxysporum. El T1 Trichoderma sp. 106 + Fusarium oxysporum 106, T2 Trichoderma sp. 104 + Fusarium oxysporum 106, T3 Trichoderma sp. 103 + Fusarium oxysporum 106, T4 Trichoderma sp. 102 + Fusarium oxysporum 106 y el T5 Testigo (Fusarium oxysporum 106). Las variables de respuesta que se midieron fueron: altura de la planta a los 10, 20 y 30 días, después del transplante, los resultados se analizaron mediante la prueba de comparación de medias por Tuckey para una probabilidad del 5%, lo cual, mostró que no hubo significancia entre los tratamientos T2, T3, T4 y T5, ya que las plantas murieron a causa de la infección de Fusarium oxysporum y que en el T1 hubo diferencias altamente significativas en comparación con los demás tratamientos ya que la planta continuo con su crecimiento.

4.2. FASE II: CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA 4.2.1. Características culturales de Fusarium spp. y Trichoderma spp. Se siguieron las claves taxonómicas de: The Fusarium Laboratory Manual. Oxford, USA (Leslie y Summerell, 2002) y para Trichoderma de Guigón et al. (2010), en su libro Identificación de especies del género Trichoderma. Las observaciones macroscópicas fueron determinadas en base a similares condiciones abióticas a las cuales fueron expuestas los aislamientos en estudio (Cuadro 9, Gráficos 5 y 9). Cuadro 9. Caracterización fenotípica de los aislamientos de Fusarium spp. y Trichoderma spp., de los invernaderos del CADET, a los 7 días de sembrado. Tumbaco, Pichincha, 2016.

Código

Investigación

Fusarium spp. Trichoderma spp.

Color anverso

Borde Textura micelio

Color reverso

Color anverso

Borde Textura micelio

Invernadero 1 Rosado/violeta Blanco Algodonosa Crema/rojo Blanco-verde Blanco Granular

Invernadero 2 Rosado/violeta Blanco Algodonosa Rosado Blanco-verde Blanco Granular


Invernadero 4 Rosado/violeta Blanco Algodonosa Rosado/rojo Blanco-verde Blanco Granular


Invernadero 6 Rosado/violeta Blanco Algodonosa Rosado/rojo Blanco-verde Blanco Granular

Fuente: Autor, 2016

32

4.2.1.1. Caracterización macroscopica de Fusarium spp. Los aislamientos de Fusarium spp., presentaron una producción de abundante micelio aéreo, algodonoso con una coloración rosada. La coloración al reverso fue un poco cambiante en algunos aislados, siendo en los Inv. 4, 5 y 6 de color rojo intenso, para el Inv. 2, una coloración rosada y para los Inv. 1 y 3, una coloración crema; estas características la hemos incluido ya que como se presenta más adelante podría ser influenciable en la patogenicidad y virulencia de Fusarium (Gráfico 5). Crecimiento rápido de estructuras miceliales. En promedio 1,1 +/- 0,17 mm por dia en medicion ecuatorial y 1,6 +/- 0,21 mm de medición polar. En general los aislamientos presentaron un crecimiento de 8 +/- 0,17 mm ecuatorial y 11 +/- 0,21 mm crecimiento ecuatorial y pola. El micelio creció de forma concéntrica.

A1 A2

B1

C1

B2

C2

33

Fuente: Autor, 2016 Gráfico 5. Coloración, forma y avance de crecimiento del micelio de Fusarium spp. (vista anverso: 1 ; vista reverso: 2 ). A1 y A2): Invernadero 1; B1 y B2): Invernadero 2; C1 y C2): Invernadero 3.; D1 y D2): Invernadero 4; E1 y E2): Invernadero 5; F1 y F2): Invernadero 6.

La intensidad en el centro de la colonia es mucho mayor que en los bordes, presentando un color rojo intenso en el centro que se va difuminando hacia los extremos, en algunos casos se presenta un color crema en la totalidad como en el Inv. 1 y en otros un color rosado como en el Inv. 2. Una característica que presentan los aislamientos es el color, el mismo, varía ligeramente de un aislamiento a otro. Michielse (2009), encontró que mientras mayor pigmentación del micelio del hongo, mayor agresividad presentaba en contra del huésped, el estudio lo realizó para el control de enfermedades como Fusarium oxysporum y Botritys spp., en cultivos de banano y ornamentales.

E1 E2

F1 F2

D1 D2

34

4.2.1.2. Caracterizacción microscópica de Fusarium spp. Presencia y forma de Microconidias La presencia de microconidias fue considerable, con abundancia en la totalidad de los aislamientos pasados los 7 días. Las microconidias fueron halianas y de forma elipsoidal, rectas o ligeramente curvadas, presentando de 1 a 4 septos; las mismas se forman sobre fiálides laterales cortas (Gráfico 6).

Fuente: Autor, 2016

Gráfico 6. Presencia y forma de las microconidias de Fusarium spp: A) Invernadero 1; B) Invernadero 2; C) Invernadero 3.; D) Invernadero 4; E) Invernadero 5.; F) Invernadero 6.

Las microconidias son estructuras asexuales, gametos masculinos o ambos, muy importantes para la reproducción del hongo, el tamaño puede variar dependiendo de la especie que estemos trabajando (Grafico 6); en este caso, el género Fusarium, presenta microconidias en abundancia de tamaños que van desde los 5-12 x 2,5-3,5 µm, como lo cita Cañedo y Ames (2004). Las

A B

C D

E F

35

microconidias son las responsables de infectar al huésped ya que su propagación es exponencial, al mismo tiempo de reproducirse a altas temperaturas y sobrevevivir a condiciones adversas. Presencia y forma de la Macroconidias/ Número de Septos

De los aislamientos en estudio se pudo identificar macroconidias en los Inv. 1, Inv 4, Inv. 5 y Inv 6. Las macroconidias presentaron paredes delgadas, alargadas, ligeramente curvas en el borde, con 3 a 5 septos, con tamaño promedio de 25 µm, forma de media luna, su célula apical es afilada y su célula basal con forma de pie en los Inv. 1 y 5. En los Inv 4 y 6, su forma es largada con extremos redondeados (Gráfico 7).

Fuente: Autor, 2016 Gráfico 7. Presencia, forma y número de septos de las macroconidias de Fusarium spp: A) Invernadero 1.; B) Invernadero 4.; C) Invernadero 5.; D) Invernadero 6.

En el Gráfico 7, podemos observar las estructuras de las macroconidias identificadas en los cuatro Invernaderos. No se encontraron en todos los aislamientos, esto podría deberse a que las macroconidias necesitan una concentración mayor de carbohidratos presentes en el medio. Según Cañedo y Ames (2004), las macroconidias son esporas de resistencia más que de infección, presentándose en condiciones dificiles para la sobrevivencia y supervivencia del hongo; o simplemente por la composición del medio en donde se le siembre y la edad del aislamiento.

A B

C D

36

Presencia y forma de Clamidosporas Las clamidósporas fueron abundantes en los distintos aislamientos en estudio, estas presentaron un tamaño entre 6 a 9 µm, de diámetro, hialinas, de pared lisa, encontrándose de manera separada e intercalares a lo largo de las hifas (Gráfico 8).

Fuente: Autor, 2016 Gráfico 8. Presencia y forma de clamidósporas de Fusarium spp.: A) Invernadero 1; B) Invernadero 2; C) Invernadero 3; D) Invernadero 4; E) Invernadero 5; F) Invernadero 6.

Con base a lo observado microscópicamente en cuanto a clamidosporas, se puede inferir que Fusarium spp., produce abundantes esporas con niveles de resistencia en condiciones saprofiticas; estas se formaron en medio de cultivo de 7 a 12 días, siendo las responsables de precautelar la supervivenvia de las esporas y por ende de los hongos (Cañedo y Ames 2004).

A B

C D

E F

37

4.2.1.3. Caracterización macroscopica de Trichoderma spp. Los aislamientos de Trichoderma, presentaron un rápido crecimiento, producción de abundante micelio aéreo, de principio algodonoso y coloración blanca. En los días posteriores de observación se tornó granular y de pigmentación verde con ligeras manchas blanquesinas. Para las especies de Trichoderma en estudio, las características fenotípicas no son similares en todos los aislamientos. Existe presencia de rápido crecimiento, en todos los casos (Gráfico 9). El crecimiento ecuatorial reportado en promedio día en este estudio fue de 2,43 +/- 0,27 mm y 3 +/- 0,19 mm de crecimiento polar. El micelio creció de forma concéntrica, muy acelerada, ocupando el total de la caja en alrededor de 7 días.

Fuente: Autor, 2016 Gráfico 9. Coloración, forma y avance de crecimiento del micelio de Trichoderma spp. A): Invernadero 1; B): Invernadero 2; C): Invernadero 3.; D): Invernadero 4; E): Invernadero 5; F): Invernadero 6.

A B

C D

E F

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4.2.1.4. Caracterizacción microscopica de Trichoderma spp. Presencia y forma de las Conidias Las hifas fueron hialinas, septadas, conidióforos del cual se desprenden multiples conidias de 2 a 3 µm de diametro, de forma redonda a ligeramente ovalada. A los pocos días de ser sembrado este hongo ya presenta miles de conidias y de los 8 a 12 días, se formaron parches blanquesinos de esporas compactas en millones de ellas (Gráfico 10).

Fuente: Autor, 2016 Gráfico 10. Presencia y forma de las conidias de Trichoderma spp: A) Invernadero 1; B) Invernadero 2; C) Invernadero 3.; D) Invernadero 4; E) Invernadero 5.; F) Invernadero 6.

Las conidias fueron medidas pasados los 7 días en diámetro polar y ecuatorial, registrándose variabilidad en las lecturas métricas. Según Lopez (2004), esporulan a los 5 días a 30 0C en Papa-

A B

C D

E F

39

Dextrosa- Agar, produciendo miles de estas en 1 solo día, pero son variables en tamaño dependiendo de las condiciones del medio en el que se desarrollan. Presencia y forma de las Fialides Las fiálides se encontraron en abundancia en todos los aislamientos en estudio. Los conidióforos son los que transportan las fiálides y por lo tanto estas son el vehículo de las conidias. Las fiálides presentaron su forma característica de botella y están unidas a los conidióforos en un angulo recto, en varios aislamientos, otros tienen disposición en angulo de 450 respecto a los conidióforos. Las fiálides se encontraron mayoritariamente solitarias y tambien se presentaron en conjunto (Gráfico 11).

Fuente: Autor, 2016 Gráfico 11. Presencia y forma de las Fialides de Trichoderma spp: A) Invernadero 1; B) Invernadero 2; C) Invernadero 3.; D) Invernadero 4; E) Invernadero 5.; F) Invernadero 6.

A B

C D

E F

40

Presencia y forma de Clamidósporas Las clamidosporas al igual que las conidias y las fialides fueron muy numerosas, encontrándose con facilidad, estas presentaron un tamaño entre 7 a 12 µm, hialinas, de pared lisa, encontrándose de manera separada, intercalares a lo largo de las hifas (Gráfico 12).

Fuente: Autor, 2016 Gráfico 12. Presencia y forma de Clamidósporas de Trichoderma spp: A) Invernadero 1; B) Invernadero 2; C) Invernadero 3.; D) Invernadero 4; E) Invernadero 5.; F) Invernadero 6.

A B

C D

E F

41

4.3. FASE III. CARACTERIZACIÓN PROSPECCIONAL CUANTITATIVA DE FUSARIUM SPP. Y TRICHODERMA SPP.

Las estructuras de importancia taxonómica fueron analizadas metricamente. Podemos apreciar las mediciones realizadas en todos los aislamientos de los invernaderos del CADET. Se realizaron 5 mediciones para cada muestra por invernadero, obteniéndose un total de 180 datos para largo, ancho y diámetro de las Clamidósporas. Se calculó la media y la desviación estándar, obteniéndose los siguientes datos para Fusarium spp.: el mayor valor para el largo de las Microconidias se presentó en el Inv. 2 con 6,6 µm y el menor valor en el Inv. 5 con 5,2 µm. Para el ancho de las Microconidias, se puede apreciar que el mayor valor corresponde al Inv. 1 con 3,3 µm y el menor valor fue constante para el resto de invernaderos con 3,0 µm. El mayor promedio del diámetro de las Clamidosporas se aprecia en el Inv. 3 con 8,2 µm y el menor valor en el Inv. 4 con 7,5 µm. En general se puede corroborar que existe diferencia métrica en las esporas de Fusarium, lo cual podría presentar diferente alcance de patogenicidad y virulencia en distintos hospederos. Estos valores son muy cercanos a la media para las dos estructuras. En cuanto a los limites maximos y minimos, existe mayor variabilidad para el largo de microconidias y el diámetro de las clamidosporas, similar a lo reportado por Lopez (2004) (Cuadro 10). Cuadro 10. Caracterización metrica de las conidias de Fusarium spp. y Trichoderma spp. de los invernaderos del CADET. Tumbaco, Pichincha, 2016.

Codificación investigación

(invernaderos)

Parámetros Estadísticos

Fusarium spp.

Trichoderma spp.

Largo microconidia

(µm)

Ancho microconidia

(µm)

Diámetro clamidóspora

(µm)

Largo conidia

(µm)

Ancho conidia (µm)

Diámetro clamidóspora

(µm)

1 σ

6,2 1,5

3,3 0,3

7,7 1,0

2,5 0,5

2,4 0,5

8,3 1,3

2

σ 6,6 1,3

3,0 0,2

7,7 0,7

2,5 0,2

2,5 0,2

8,3 0,7

3

σ 5,6 1,4

3,0 0,3

8,2 0,8

2,6 0,4

2,6 0,3

9,1 1,2

4

σ 5,9 1,1

3,0 0,1

7,5 1,5

2,8 0,3

2,8 0,3

10,1 1,4

5

σ 5,2 1,2

3,0 0,1

7,8 0,9

2,7 0,3

2,6 0,3

9,7 1,6

6

σ 5,7 1,2

3,0 0,2

7,9 1,1

2,9 0,2

2,8 0,2

8,4 0,7

Límites Máx. – Min. 4-8,3 2,7-3,6 6-9,2 2-3,1 2-3,1 7-12

Límites reportados 4-12 2,3-3,5 5-14 2-3 2-3 5-14

Fuente: Autor, 2016 Las microconidias de Fusarium, identificadas en nuestros aislamientos son en su mayor parte unicelulares. Al ser estas esporas formadas en el micelio aéreo y dependiendo de la especie se pueden producir en fiálides con un solo poro llamadas monofiálides o en fiálides con más de un poro, llamadas polifiálides, lo cual determinaria mayor o menor tamaño de sus esporas (Leslie et al., 2006). En cuanto a Trichoderma spp. se presentó el mayor valor para el largo de las Conidias en el Inv. 6 con 2,9 µm y el menor valor en los Inv. 1 y 2 con 2,5 µm. Para el ancho de las Conidias, se puede

https://www.calculadoraconversor.com/media-aritmetica/

42

apreciar que el mayor valor corresponde a los Inv. 4 y 6 con 2,8 µm y el menor valor esta en el Inv. 1 con 2,4 µm. El mayor promedio del diámetro de las Clamidosporas se aprecia en el Inv. 4 con 10,1 µm y el menor valor en los Inv. 1 y 2 con 8,3 µm. 4.3.1. Tasa de crecimiento micelial de Fusarium spp. y Trichoderma spp. La tasa de crecimiento micelial se la realizó con cada aislamiento de Fusarium spp. y Trichoderma spp. de los invernaderos del CADET; previamente purificado, obteniéndose datos para los 3, 5 y 7 días consecutivos de evaluación. La mayor tasa de crecimiento ecuatorial en los aislamientos de Fusarium se registro a los tres días de evaluación en el que se presento un valor de 21 mm. en los aislamientos del Inv. 2; y el menor valor para esta tasa de crecimiento fueron registrados en los aislamientos del Inv. 3 con 15 mm. Con relación a la tasa de crecimiento polar la mayor respuesta se registro a los tres días de evaluación en el que se presento un valor de 22 mm. en los aislamientos del Inv. 2; y, el menor valor para esta forma de crecimiento fueron registrados en los aislamientos del Inv. 3 con 15 mm. a los cinco días de evaluación (Cuadro 11). Cuadro 11. Tasa de crecimiento micelial de los aislamientos de Fusarium spp. de los invernaderos del CADET. Tumbaco, Pichincha, 2016.


Tasa de crecimiento ecuatorial

mm

Tasa de crecimiento polar mm

3 dias

5 dias

7 dias

3

dias 5

dias 7

dias

Invernadero 1

19

15

20

18

18

17

18

18

Invernadero 2 21 16 21 19 22 20 21 19

Invernadero 3 18 15 18 17 15 16 19 17

Invernadero 4 20 17 20 19 21 19 18 19

Invernadero 5 19 16 19 18 16 18 18 18

Invernadero 6 18 15 19 17 18 16 17 17

Fuente: Autor, 2016 Acorde con los resultados obtenidos en la métrica de esporas, se puede relacionar con mayor o menor incidencia de virulencia. En los aislamientos de Trichoderma la mayor tasa de crecimiento ecuatorial se registro a los tres días de evaluación en el que se presento un valor de 41 mm. en los aislamientos del Inv. 6; de igual manera, el menor valor para esta tasa de crecimiento fueron registrados en los aislamientos del mismo invernadero con 11 mm. Se puede notar que las tasas de crecimiento a

43

través del tiempo fueron considerablemente constante en los aislamientos del Inv. 1, lo cual demostraría una actividad constante antagonista. Con relación a la tasa de crecimiento polar la mayor respuesta se registro a los tres días de evaluación en el que se presento un valor de 41 mm. en los aislamientos del Inv. 4; y, el menor valor para esta forma de crecimiento fueron registrados en los aislamientos del Inv. 6 con 15 mm. a los cinco días de evaluación (Cuadro 12). Cuadro 12. Tasa de crecimiento micelial de los aislamientos de Trichoderma spp. de los invernaderos del CADET. Tumbaco, Pichincha, 2016.


Tasa de crecimiento ecuatorial

mm

Tasa de crecimiento polar mm

3 dias

5 dias

7 dias

3

dias 5

dias 7

dias

Invernadero 1

34

32

24

30

38

31

21

30

Invernadero 2 35 32 23 30 38 33 19 30

Invernadero 3 38 35 17 30 40 34 16 30

Invernadero 4 36 32 22 30 41 40 19 30

Invernadero 5 38 35 17 30 39 36 15 30

Invernadero 6 41 38 11 30 37 38 15 30

Fuente: Autor, 2016 El crecimiento micelial de Trichoderma spp., a diferencia de Fusarium spp., es de casi el doble, alcanzando la totalidad de crecimiento en la caja Petri en menos de los 7 días, por lo cual podemos decir que este hongo muestra las características ideales como ACB ya que el mismo tendría mayor oportunidad de esporulación y viabilidad que la del patógeno. La tasa de crecimiento es una herramienta fisiológica útil para predecir la habilidad de control biologico de los aislamientos de Trichoderma (Uzunovic y Webber, 1998) por lo que es utilizada como una primera referencia al caracterizar cepas nuevas de este antagonista (Hermosa et al., 2000).

4.3.2. Concentración de los aislamientos de Fusarium spp. y Trichoderma spp. El proceso de recuento de esporas se realizó en dos cuadrantes de la cámara de Neubauer con un total de 32 cuadrículas, se aplicó la respectiva formula y se obtuvo el cálculo del número de conidias totales por mL de suspensión (conidias.mL-1) Para estimar la concentración se registraron diez evaluaciones, con el afán de tener valores con mayor exactitud. Se procedió a sacar un promedio, la desviación estándar y la concentración final en conidias.mL-1 (Cuadro 13).

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Para Fusarium spp., podemos apreciar valores de concentracion de los aislados entre 1,7 x 104 en el Inv. 6 y 5,7 x 104 UFC.mL-1 en el Inv. 2, con mayor y menor valor respectivamente, en cuanto a la desviación estándar. Cuadro 13. Concentración de conidias.mL-1 de los aislamientos de Fusarium spp. y Trichoderma spp., en los invernaderos del CADET. Tumbaco, Pichincha 2016.


Fusarium spp.

Trichoderma spp.

(1) σ Concentración conidias . mL-1

(1) σ Concentración conidias . mL-1

Invernadero 1 118,0 2,0 36875,0 142,3 0,6

44468,7

Invernadero 2 183,0 5,5 57187,0 200,0 2,0

62500,0

Invernadero 3 114,3 1,2 35718,7 224,0 4,0

70000,0

Invernadero 4 88,7 0,5 27718,7 147,3 2,1

46031,2

Invernadero 5 81,3 1,2 25406,3 123,7 2,3

38656,3

Invernadero 6 54,7 2,1 17093,7 193,7 4,7

60531,2

(1) Cada valor es la media de diez repeticiones

Fuente: Autor, 2016 Para Trichoderma spp., se puede ver los valores de concentracion de los aislados entre 3,8 x 104 en el Inv. 5 y 7,0 x 104 UFC.mL-1 en el Inv. 3. La producción de conidias.mL-1 de Trichoderma spp., es casi el doble que las de Fusarium spp., por lo que, como lo describe López (2004), al enfrentarlos este podría con facilidad llegar a controlarlo, siempre y cuando tenga las condiciones en el medio en el cual se desarrollan, es decir, adaptabilidad trofica. Con estos datos teóricamente se puede estimar las poblaciones de patógeno y su respectivo agente de control y por ende compararlas entre los diferentes aislamientos de los invernaderos. Estos datos se podrían prestar para predecir las poblaciones estimadas en un mL de suspensión, y la concentración en la suspensión total. 4.3.3. Escala de evaluación de la infecciión de Fusarium spp., en plantas de tomate riñón.

Los postulados de Koch fueron utilizados para esta investigación, Fusarium spp., fue aislado, sembrado, purificado y resembrado en plántulas de tomate, la sintomatología característica de debilitamiento y clorosis generalizada fue evidenciada y evaluada de acuerdo a la escala de evaluación de daño por Fusarium spp., propuesta por Rodríguez et al., 1999. El porcentaje de severidad de infección de Fusarium spp., sobre plántulas de tomate riñón de 4 semanas de edad a los 5, 10, 15, 20, 25, 30 y 35 días de evaluación, se realizó con suspensión de conidias indefinida de un cultivo fresco. Se agregó agua destilada estéril y cada día se las re inoculaba. Todas las plantas inoculadas comenzaron a presentar síntomas a los 10 dias de la inoculación, como coloraciones café iniciando en la parte apical de las hojas. En el punto de la

45

inoculación algunas las plantas presentaron tallos de consistencia blanda, observaciones similares a las realizadas por Delgado et al., 2016. Los aislamientos de Fusarium en los invernaderos en estudio presentan diferencias en el porcentaje de severidad conforme son incrementales los días de inoculación primaria. Los aislamientos con mayor patogenicidad se presentaron para los invernaderos 3, 5 y 6; alcanzando en menor tiempo mayor capacidad infectiva. La menor expresión patogénica se presento en los aislamientos del Inv. 1, pero al final del tiempo de la evaluación fue similar el grado infectivo que los otros aislamientos en estudio (Grafico 13). Las dinámicas de las curvas de crecimiento de este agente patógeno se correlacionan a una tendencia polinómica de segundo orden para todos los aislamientos en estudio. Las correlaciones son cercanas a la unidad.

Fuente: Autor, 2016 Gráfico 13. Dinamica de la curva de crecimiento por severidad de los aislamientos de Fusarium spp., en los invernaderos del CADET. Tumbaco, Pichincha, 2016.

La comparación de medias de los índices de severidad otorgados en las pruebas de patogenicidad demuestran que hay variación patogénica entre los diversos aislados de la misma especie y entre invernaderos, lo cual puede estar relacionado con la capacidad de la especie para generar los síntomas de la enfermedad de acuerdo a l material del hospedero (Velásquez y Medina, 2004). Esto concuerda con lo reportado por Dissanayake et al. (2009), quienes señalan que algunos aislados de F. oxysporum como los agentes con mayor índice de severidad. Estos autores a su vez reportan aislados de F. oxysporum, F. verticillioides y F. solani con menor capacidad patogénica. 4.3.4. Análisis de conglomerados

Las distancias euclideanas variaron entre 0 y 3 %, con un promedio general de 2,26 %; es decir, los aislamientos tuvieron un 97 % de bandas comunes. La topología del dendrograma (Grafico 14) muestra tres ramales definidos a nivel del 2 % en la escala de distancia, lo que sugiere que

y = 0,1205x2 - 1,569x + 7,1429 R² = 0,9948

y = 0,0071x2 + 2,9786x - 14,714 R² = 0,9944

y = -0,0143x2 + 3,5714x - 20,714 R² = 0,951

y = -0,0071x2 + 4,0357x - 24,286 R² = 0,966

y = -0,0548x2 + 5,2262x - 30 R² = 0,945

0

20

40

60

80

100

120

0 5 10 15 20 25 30 35 40

% s

eve

rid

ad

Dias despues de la inoculacionn

Inv 1

Inv 2

Inv 3

Inv 4

Inv 5

Inv 6

46

en promedio los grupos de aislamientos evaluados de Fusarium spp., presentan similitudes morfometricas, de patogenicidad y virulencia, relativamente altas. No se observo una total dependencia de la topología del dendrograma con respecto a la ubicación de los aislamientos; de hecho, aislamientos que estaban separados geográficamente presentaron patrones electroforéticos comunes. En este caso los aislamientos provenientes del Inv. 3 y los del Inv. 5 -6, ambos con idénticos patrones electroforéticos. No se debe descartar la hipótesis de una procedencia común de los aislamientos, pues como sugiere Elias y Schneider (1992), una gran población que analizaron, alta proporción del patógeno pudo haberse originado de un ancestro común y posteriormente diseminarse geofraficamente. Para el presente dendrograma se establecio un correlacion cofenetica con coeficiente de 0,87; lo cual nos indica que existe una gran proporcionalidad entre las matrices ajustadas a una correlacion lineal (de Pearson).

Gráfico 13. Análisis de conglomerados de los aislamientos de Fusarium spp., en los invernaderos del CADET. Tumbaco, Pichincha, 2016.

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5. CONCLUSIONES

En la FASE I: se establecieron tres rangos de incidencia de la infección de Fusarium para los invernaderos del CADET mediante los análisis por raster en sistemas de información geográfica. Se establecieron coordenadas geográficas en UTM para las 80 muestras entre vegetales, suelo y agua asociadas a Fusarium spp. Se determino que la variabilidad en los factores abióticos como temperatura, humedad relativa y pH, influyen en las poblaciones de hongos patogénicos y antagonistas, asi como en la métrica de sus estructuras, especialmente reproductivas. Se identificaron cinco géneros de hongos: Fusarium, Trichoderma, Aspergillus, Penicillium y Alternaria. Se establecieron asociatividades de Fusarium y Trichoderma, por sitio especifico de aislamiento, indistintamente de la estructura aislada.

En la FASE II: mediante análisis macroscópico se demostró la variabilidad de los aislamientos de Fusarium spp. y Trichoderma spp., de los aislamientos en estudio. En cuanto a pigmentación del anverso del micelio para Fusarium spp., la coloración fue variable, siendo en los Inv. 4, 5 y 6 de color rojo intenso, para el Inv. 2 una coloración rosada y para los Inv. 1 y 3, una coloración crema. En la caracterización microscópica de Fusarium spp., se pudo observar diferencias de forma y métrica en microconidias (hialinas y de forma elipsoidal, rectas o ligeramente curvadas, presentando de 1 a 4 septos, de 4-12 x 2,3-3,5 µm), macroconidias y clamidosporas. Para Trichoderma spp. presentaron en general de 2 a 3 µm de diametro, de forma redonda a ligeramente ovalada. Las fiálides se encontraron en abundancia en todos los aislamientos en estudio. Las fiálides presentaron su forma característica de botella y están unidas a los conidióforos en un angulo recto, en varios aislamientos, otros tienen disposición en angulo de 450 respecto a los conidióforos. Las fiálides se encontraron mayoritariamente solitarias y tambien se presentaron en conjunto.

En la FASE III: la mayor tasa de crecimiento micelial ecuatorial en los aislamientos de Fusarium se registró a los tres días de evaluación en el que se presento un valor de 21 mm. en los aislamientos del Inv. 2; para Trichoderma spp. un valor de 41 mm. en los aislamientos del Inv. 6. La mayor tasa de crecimiento polar para Fusarium fue de 22 mm. Las concentraciones de Fusarium spp. variaron de 1,7 x 104 en el Inv. 6 y 5,7 x 104 UFC.mL-1 en el Inv. 2; y, para Trichoderma spp. entre 3,8 x 104 en el Inv. 5 y 7,0 x 104 UFC.mL-1 en el Inv. 3. Los aislamientos con mayor patogenicidad de Fusarium spp. se presentaron para los invernaderos 3, 5 y 6. Las dinámicas de las curvas de crecimiento de este agente patógeno se correlacionan a una tendencia polinómica de segundo orden para todos los aislamientos en estudio. Las distancias euclideanas variaron entre 0 y 3 %, con un promedio general de 2,26 %; es decir, los aislamientos tuvieron un 97 % de bandas comunes. La topología del dendrograma muestra tres ramales definidos a nivel del 2 % en la escala de distancia. Para el presente dendrograma se establecio un correlacion cofenetica con coeficiente de 0,87.

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6. RECOMENDACIONES

La recomendación principal para la toma de muestras:

Verificar en campo la sintomatología específica de la enfermedad

Tratar de tomar la mayor cantidad de muestras en diferentes lugares del área seleccionada

Transportar inmediatamente al laboratorio las muestras

Las recomendaciones para la manipulación de hongos en laboratorio:

Propiciar las mejores condiciones ambientales a los hongos, para que estos proliferen rápidamente.

Proveer un sustrato altamente nutritivo y comprobado en investigaciones pasadas.

Evitar la contaminación, trabajar en condiciones asépticas.

Realizar cultivos monospóricos utilizando la técnica de punta de hifa

Para el momento de la caracterización morfológica, observar las características claves que cada especie presenta y la homología-diferenciación entre ellas.

La prospección poblacional, debe ser realizada con la mayor cantidad de datos posibles ya que pequeñas variaciones pueden suceder en el transcurso del experimento.

Realizar la continuación de esta tesis.

De ser el caso realizar el analisis molecular de los aislamientos con el fin de establecer la variabilidad genética de la población.

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7. RESUMEN

El tomate riñón (Lycopersicom esculentum Mill.), es una de las hortalizas de mayor importancia a nivel mundial y uno de los cultivos de mayor extensión en el Ecuador con 3333 ha y una producción de 61426 toneladas métricas por año según datos de INEC, 2016, en su Encuesta de Superficie y Producción Agropecuaria Continua (ESPAC). Con el implemento de este cultivo vienen los problemas en su manejo, ya que por las temperaturas elevadas en los invernaderos, la población de insectos plaga y patógenos se ven incrementadas. Una de las enfermedades presentes en los campos agrícolas es Fusarium spp., el cual se manifiesta como una marchitez en la parte aérea, produciendo un amarillamiento que comienza en las hojas más bajas y que termina por secar la planta. Si se realiza un corte transversal al tallo se observa un oscurecimiento de los vasos vasculares, provocado por el estrangulamiento del xilema, desencadenando en la muerte de la planta.

Por esta razón la necesidad de buscar alternativas diferentes para enfrentar las adversidades que afectan a nuestros cultivos. El manejo integrado es una de ellas, ya que nos permite protegerlos de la mejor manera. La ventaja generada al utilizar productos fitosanitarios en conjunto con microorganismos nativos podría ayudar a diversificar las herramientas con las que contamos para permitir generar una protección adecuada y sustentable en el tiempo. Esta investigación se centró en buscar una alternativa al uso progresivo de químicos a lo largo de la etapa de producción de tomate riñon, de tal manera, que se pueda reducir su uso y fomentar en el tiempo nuevas estrategias de control orientadas al manejo ambiental, usando para esto microorganismos nativos presentes en los propios entornos del cultivo. Se procedió aislar los hongos de interés encontrados en el lugar experimental seleccionado, el cual se encuentra ubicado al lado oriental de Quito en la parroquia de Tumbaco sector La Morita (CADET). La Fase I consistió en recolectar muestras de cada uno de los invernaderos del CADET, sabiendo que en algún momento existió tomate riñón, o que en la actualidad se encuentra en producción. En la Fase II, cada aislamiento de Fusarium spp. y Trichoderma spp., fueron caracterizados mediante claves taxonómicas específicas, para Fusarium spp., denotando aspectos importantes de cada aislamiento como: morfología de la colonia, diámetro de la colonia, estructura de las macro y microconidias, entre otros aspectos de relevancia. En los aislamientos de Fusarium spp., se encontraron similitud y diferencias, en cuanto a pigmentación del micelio, algunos con una coloración de blanca a violeta y en otros, purpura a rosado. El reverso de la mayoría de aislamientos de Fusarium spp., fueron rojos y violetas, oscuro. Existió presencia de clamidósporas en todos los aislamientos, siendo estas: grandes, abundantes, individuales o en parejas y de pared lisa; de igual forma, se encontraron microconidias de forma ariñonadas con un tamaño que va de 4 -12x 2,3-3,5 µm. Finalmente las macroconidias fueron escasas, encontrándose en 4 aislamientos, presentando bordes ligeramente curvados, de 1 a 4 septos y un tamaño de 23-54 x 3-5 µm. Para Trichoderma spp., la coloración no varió entre aislamientos, empezando con una tonalidad blanca y tornándose verde clara, al pasar los días se formó manchas blanquecinas en el micelio; colonias compactas granulares, hifas septadas, conidióforos ramificados, fiálides solitarias, conidias redondas de 2-3 µm y abundante presencia de clamidósporas.

50

A lo largo del proceso se realizaron mediciones de distintos aspectos: temperatura, que en invernadero se situó en un rango de 30,6 0C y 35,1 0C, en laboratorio 23,5 0C, la humedad en invernadero tuvo un rango de 40,8 % y 51,1 % y en laboratorio 58,6%, el pH del suelo y de las soluciones utilizadas, siendo de 6,3 a 6,8. En la Fase III, se tomó mediciones de algunos aspectos de importancia, y se calculó el promedio y desviación estándar, obteniéndose los siguientes datos: Para el largo de las microconidias de Fusarium spp., el menor valor en promedio fue el Invernadero 5, con 5,2 µm y el mayor valor fue el invernadero 2, con 6,6 µm, en el ancho de las microconidias el mayor valor fue el del invernadero 1, con 3,3 µm y el de menor los invernaderos, 2,3,4,5,6, en el diámetro de la clamidóspora el invernadero 3, obtuvo el mayor valor con 8,2 µm y el invernadero 4 el menor con 7,5 µm; así mismo se midió las conidias de Trichoderma spp., en el largo el Invernadero 6 obtubo el mayor valor con 2,9 µm y los invernaderos 1 y 2, el menor valor con 2,5 µm, para el ancho los invernaderos 4 y 6 obtubieron el mayor valor con 2,8 µm y el invernadero 1 el menor valor con 2,4 µm, finalmente en el diámetro de las clamidosporas, el invernadero 4 tubo el mayo valor con 10,1 µm y los invernaderos 1 y 2 los menores con 8,3 µm. Para la concentración de esporas de Fusarium spp., se usó la cámara de Neubauer y se obtuvo diez mediciones para cada aislamiento y de este se obtuvo una concentración de conidias. mL-1, para el Inv. 1, 118, Inv. 2, 183, Inv. 3, 114,3 del lote 4,6; para el Inv.4, 88,7, Inv.6, 54,7 y para Inv.5, 81,3. Para Trichoderma spp., se obtuvo un promedio concentración de: Inv. 1, 142,3, Inv. 2, 200, Inv. 3, 224 del lote 4,6; para el Inv.4, 147,3, Inv.6, 193,7 y para Inv.5, 123,7. La mayor tasa de crecimiento micelial ecuatorial en los aislamientos de Fusarium se registró a los tres días de evaluación en el que se presento un valor de 21 mm. en los aislamientos del Inv. 2; para Trichoderma spp. un valor de 41 mm. en los aislamientos del Inv. 6. La mayor tasa de crecimiento polar para Fusarium fue de 22 mm. Las concentraciones de Fusarium spp. variaron de 1,7 x 104 en el Inv. 6 y 5,7 x 104 UFC.mL-1 en el Inv. 2; y, para Trichoderma spp. entre 3,8 x 104 en el Inv. 5 y 7,0 x 104 UFC.mL-1 en el Inv. 3. Los aislamientos con mayor patogenicidad de Fusarium spp. se presentaron para los invernaderos 3, 5 y 6. Las distancias euclideanas variaron entre 0 y 3 %, con un promedio general de 2,26 %; es decir, los aislamientos tuvieron un 97 % de bandas comunes. La topología del dendrograma muestra tres ramales definidos a nivel del 2 % en la escala de distancia, lo que sugiere que en promedio los grupos de aislamientos evaluados de Fusarium spp., presentan similitudes morfometricas, de patogenicidad y virulencia, relativamente altas. No se observo una total dependencia de la topología del dendrograma con respecto a la ubicación de los aislamientos; de hecho, aislamientos que estaban separados geográficamente presentaron patrones electroforéticos comunes.

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SUMMARY

The tomato kidney (Lycopersicom esculentum Mill.), Is one of the most important vegetables worldwide and one of the largest crops in Ecuador with 3333 ha and a production of 61426 metric tons per year according to INEC data, 2016 , in its Survey of Surface and Continuous Agricultural Production (ESPAC). With the implementation of this crop come the problems in their management, because the elevated temperatures in the greenhouses, the population of pests and pathogens. One of the diseases present in the agricultural fields is Fusarium spp., which manifests as a wilt in the aerial part, producing a yellowing that begins in the lower leaves and ends up drying the plant. If a cross section is made to the stem, a darkening of the vascular vessels is observed, caused by the strangulation of the xylem, triggering the death of the plant. For this reason, the need to look for different alternatives to face the adversities that affect our crops. TIntegrated management is one of them, since it allows us to protect them in the best way. The advantage generated by using phytosanitary products in conjunction with native microorganisms could help to diversify the tools we have to allow us to generate adequate and sustainable protection over time. This research focused on finding an alternative to the progressive use of chemicals throughout the kidney tomato production stage, in such a way that its use can be reduced and new control strategies oriented towards environmental management can be promoted over time, using for this, native microorganisms present in the field. We proceeded to isolate the fungi of interest found in the selected experimental site, which is located on the eastern side of Quito in the parish of Tumbaco La Morita (CADET), in the second phase, proceeded to determine the gender and possible species isolates that mostly approximate the objectives of this research. Phase I consisted of collecting samples from each of the CADET greenhouses, knowing that at some point there was a tomato plants, or that it is currently in production. In Phase II, each isolate of Fusarium spp. and Trichoderma spp., were characterized by specific taxonomic keys, for Fusarium spp., denoting important aspects of each isolation as: colony morphology, colony diameter, structure of macro and microconidia, among other aspects of relevance. In the isolates of Fusarium spp., similarity and differences were found, in terms of pigmentation of the mycelium, some with coloration from white to violet and in others, purple to pink. The reverse sides of most isolates of Fusarium spp. were red and violet, dark. There was presence of chlamydospores in all the isolations, being these: large, abundant, and individual or in pairs and smooth wall; similarly, microconidia were found in a nested form with a size ranging from 4 -12x 2.3-3.5 μm. Finally, macroconidia were scarce, found in 4 isolates, with slightly curved edges, 1 to 4 septa and a size of 23-54 x 3-5 μm. For Trichoderma spp., the coloration did not vary between isolates, starting with a white hue and turning light green, as the days passed, whitish spots formed in the mycelium; compact granular colonies, septate hyphae, branched conidiophores, solitary phialides, 2-3 μm round conidia and abundant presence of chlamydospores.

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Throughout the process measurements were made of different aspects: temperature, which in greenhouse was placed in a range of 30.6 0C and 35.1 0C, in laboratory 23.5 0C, humidity in greenhouse had a range of 40, 8% and 51.1% and in the laboratory 58.6%, the pH of the soil and of the solutions used, being from 6.3 to 6.8.

In Phase III, measurements of some important aspects were taken, and the average and standard deviation were calculated, obtaining the following data: For the length of the microconidia of Fusarium spp., The lowest value on average was Greenhouse 5, with 5.2 μm and the highest value was greenhouse 2, with 6.6 μm, in the width of the microconidia the highest value was greenhouse 1, with 3.3 μm and the least greenhouse, 2,3,4,5,6, in the diameter of the chlamydospora greenhouse 3, obtained the highest value with 8.2 μm and greenhouse 4 the smaller with 7.5 μm; Likewise, the conidia of Trichoderma spp. were measured, along the Greenhouse 6 obtained the highest value with 2.9 μm and the greenhouses 1 and 2, the lowest value with 2.5 μm, for the width the greenhouses 4 and 6 obtained the highest value with 2.8 μm and greenhouse 1 the lowest value with 2.4 μm, finally in the diameter of the chlamydospores, the greenhouse 4 tube the highest value with 10.1 μm and the greenhouses 1 and 2 the lowest with 8.3 μm. For the concentration of spores of Fusarium spp., The Neubauer chamber was used and ten measurements were obtained for each isolation and a concentration of conidia was obtained. mL-1, for Inv. 1, 118, Inv. 2, 183, Inv. 3, 114.3 of batch 4.6; for Inv.4, 88.7, Inv.6, 54.7 and for Inv.5, 81.3. For Trichoderma spp., an average concentration of: Inv. 1, 142.3, Inv. 2, 200, Inv. 3, 224 of batch 4.6; for Inv.4, 147.3, Inv.6, 193.7 and for Inv.5, 123.7. The highest rate of equatorial mycelial growth in Fusarium isolates was recorded at three days of evaluation in which a value of 21 mm was presented in the isolates of Inv. 2; for Trichoderma spp. a value of 41 mm. in the isolates of Inv. 6. The highest polar growth rate for Fusarium was 22 mm. The concentrations of Fusarium spp. they varied from 1.7 x 104 in Inv. 6 and 5.7 x 104 CFU.mL-1 in Inv. 2; and, for Trichoderma spp. between 3.8 x 104 in Inv. 5 and 7.0 x 104 CFU.mL-1 in Inv. 3. Isolates with higher pathogenicity of Fusarium spp. they were presented for greenhouses 3, 5 and 6. The Euclidean distances varied between 0 and 3%, with a general average of 2.26%; that is, the isolates had 97% common bands. The topology of the dendrogram shows three branches defined at the level of 2% on the distance scale, which suggests that, on average, the groups of evaluated isolates of Fusarium spp. Have relatively high morphometric, pathogenicity and virulence similarities. A total dependence of the topology of the dendrogram with respect to the location of the isolates was not observed; in fact, isolates that were geographically separated presented common electrophoretic patterns.

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8. REFERENCIAS

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58

9. ANEXOS

Anexo 1. Digitalización del CADET

Imágenes digitalizadas y georeferenciadas de la provincia, la parroquia y el sector en donde

fueron tomadas las muestras así como los invernaderos del CADET.

59

Anexo 2. Invernaderos de muestreo en la investigación

Lote 4.6 Invernadero Y, Invernadero To1 e Invernadero To2

Lote 2.1.1 Invernadero Y, Invernadero To1 e Invernadero To2

INVERNADERO To1

INVERNADERO To2

INVERNADERO Ba1

INVERNADERO To3

INVERNADERO Bot

INVERNADERO Y

60

Anexo 3. Sintomatología expresiva de Fusarium en campo

Lote 4.6 Invernadero 1, cultivo de tomate riñón



61

Lote 2.1.1 Invernadero 4, cultivo de Babacos

Lote 2.1.1 Invernadero 5, pilonera

Anexo 4. Muestras vegetales procesadas en laboratorio

62

Muestras vegetales (raíz-tallo) de tomate riñón obtenidas y procesadas de los Invernaderos seleccionados

de los Lotes 4.6 y 2.1.1.

Anexo 5. Muestras de suelo procesadas en Laboratorio

63

Muestras de suelo tomadas y procesadas del mismo lugar que las partes vegetales en los Invernaderos

seleccionados de los Lotes 4.6 y 2.1.1.

Anexo 6. Aislamiento de fuentes de agua

Embases donde se recolectó parte del agua recolectada en el lugar próximo a la toma de muestras vegetales con sintomatología expresiva de Fusarium spp.

Siembra de muestras de agua en medio Agar Malta en laboratorio con el fin de detectar presencia de Fusarium spp.

64

Anexo 7. Materiales y equipos utilizados en la investigación

Medio de cultivo utilizado para la siembra de hongos y bacterias en laboratorio, además de materiales cada etapa del proceso de obtención, procesamiento y siembra de muestras.

65

Áreas utilizadas para la investigación, laboratio de MIP del CADET.

Anexo 8. Dispensado del medio de cultivo

Pesaje y esterilización del medio de cultivo antes de ser dispensado.

66

Medición del pH con bandas medidoras y dispensado en cajas petri estériles.

Anexo 9. Procesamiento para la siembra de suelo en laboratorio

Dilusiones seriadas en agua destilada esteril listas para ser sembradas.

67

Anexo 10. Postulados de Koch en plantas de tomate

Plantas de tomate riñón para pruebas de infección con aislamientos de Fusarium spp.

Lote 2.1.1

Inv To3

F1 (1)

Lote 4.6

Inv To1

F1 (1)

Lote 4.6

Inv To2

F1(1)

Lote 2.1.1

Inv Ba1

F1 (1)

Lote 2.1.1

Inv Bot

F1 (1)

Lote 4.6

Inv Y

F1 (1)

68

Postulados de Koch para Fusarium spp., en plantas de tomate riñón pasados los 35 días.

Lote 4.6

Inv Y

F1 (1)

Lote 4.6

Inv To1

F1 (1)

Lote 4.6

Inv To2

F1 (1)

Lote 2.1.1

Inv Ba1

F1 (1)

Lote 2.1.1

Inv Bot

F1 (1)

Lote 2.1.1

Inv To3

F1 (1)

69

Anexo 11. Conservación de microorganismos a largo plazo

Conservación de aislamientos de Fusarium spp. y Trichoderma spp., en aceite mineral de cada Lote e

Invernadero del CADET, en medio de cultivo Agar Malta tipo flauta

Lote: 4.6

Inv: To1

Lote: 2.1.1

Inv: Ba1

Lote: 2.1.1

Inv: Bot Lote: 2.1.1

Inv: To3

Lote: 4.6

Inv: Y

Lote: 4.6

Inv: To2

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