UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE … · A la Facultad de Ingeniería Química por todo...
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA VALIDACIÓN DEL MÉTODO MICROBIOLÓGICO PARA DETERMINAR EL ÁCIDO FÓLICO EN UN LECTOR ELISA TRABAJO DE GRADO PARA LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE INGENIERA QUÍMICA AUTOR: YOVANA BEATRIZ JIMA SALINAS QUITO 2015
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA
CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA
VALIDACIÓN DEL MÉTODO MICROBIOLÓGICO PARA DETERMINAR EL
ÁCIDO FÓLICO EN UN LECTOR ELISA
TRABAJO DE GRADO PARA LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE
INGENIERA QUÍMICA
AUTOR: YOVANA BEATRIZ JIMA SALINAS
QUITO
2015
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA
CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA
VALIDACIÓN DEL MÉTODO MICROBIOLÓGICO PARA DETERMINAR EL
ÁCIDO FÓLICO EN UN LECTOR ELISA
TRABAJO DE GRADO PARA LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE
INGENIERA QUÍMICA
AUTOR: YOVANA BEATRIZ JIMA SALINAS
TUTOR: ULLRICH RAINER STAHL Ph.D.
QUITO
2015
iii
APROBACIÓN DEL TUTOR
En calidad de Tutor del trabajo de grado titulado: “VALIDACIÓN DEL MÉTODO
MICROBIOLÓGICO PARA DETERMINAR EL ÁCIDO FÓLICO EN UN LECTOR
ELISA”, me permito certificar que el mismo es original y ha sido desarrollado por la señorita
YOVANA BEATRIZ JIMA SALINAS, bajo mi dirección, y conforme a todas las
observaciones realizadas, considero que el trabajo está concluido y tiene mi aprobación.
En la ciudad de Quito, a los 28 días del mes de octubre del 2015
Dr. Ullrich Stahl
PROFESOR TUTOR
iv
AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL
Yo, YOVANA BEATRIZ JIMA SALINAS, en calidad de autora del trabajo de grado realizado
sobre “VALIDACIÓN DEL MÉTODO MICROBIOLÓGICO PARA DETERMINAR EL
ÁCIDO FÓLICO EN UN LECTOR ELISA”, por la presente autorizo a la UNIVERSIDAD
CENTRAL DEL ECUADOR, hacer uso de todos los contenidos que me pertenecen o de parte
de los que contiene esta obra, con fines estrictamente académicos o de investigación.
Los derechos que como autora me corresponden, con excepción de la presente autorización,
seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los artículos 5, 6, 8, 19 y
demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su Reglamento.
En la ciudad de Quito, a los 28 días del mes de octubre del 2015
_______________________
Yovana Beatriz Jima Salinas
C.C. 1104797301
v
DEDICATORIA
A mí Dios quién es mi guía y mi fuerza para
enfrentar las adversidades de la vida. A mis
Padres y Hermanos quienes me han
apoyado incondicionalmente en todas las
circunstancias durante toda mi vida. A mí
amada Hija quién ha sido mi mayor
motivación para lograr mis objetivos. A mí
amado Esposo quién con su amor, paciencia
y esfuerzo ha sido un pilar fundamental en
mi vida.
vi
AGRADECIMIENTOS
A Dios dador de la vida por ser el ejemplo más grande de amor en este mundo y por darme
fuerzas para superar obstáculos y dificultades a lo largo de toda mi vida. Por darme la bendición
de ser madre.
A mis padres Carlos y Beatriz, gracias por su amor, dedicación, consejo y apoyo para hacer de
mí una mujer de bien. A mis hermanos Karla, Carlos y Viviana gracias por creer en mí y por
consolarme cuando las cosas se ponían difíciles. A mi hija Danahe gracias por llegar a darle
sentido a mi vida y por ser mi más grande inspiración. A mi esposo Alex gracias por su apoyo y
amor incondicional. A mis abuelitos gracias por sus oraciones.
A la Facultad de Ingeniería Química por todo lo vivido y aprendido durante el transcurso de mi
formación profesional.
A los profesores de mi Facultad por su entrega y vocación para transmitirme sus conocimientos.
A mi profesor tutor Dr. Ullrich Stahl, porque gracias a su ayuda, amistad, guía y consejos fue
posible la culminación de mi trabajo de grado.
A Laboratorios LASA por su predisposición y apoyo incondicional en sus instalaciones para
poder desarrollar mi trabajo de grado en especial al Dr. Marco Guijarro Gerente General de
Laboratorios LASA.
A mis amigas: Paulina, Gabriela B, Anita, Carolina, Gabriela P, Liliana, Diana, Gabriela L,
Any, Dianita y Eve, gracias por su amistad, ánimo y ayuda que me han brindado en los
momentos difíciles de mi vida.
vii
CONTENIDO
pág.
LISTA DE TABLAS ...............................................................................................................xi
LISTA DE FIGURAS ........................................................................................................... xiii
LISTA DE ANEXOS..................................................................................................................xiv
GLOSARIO……………………………………………………………………………………..xv
RESUMEN................................................................................................................................xviii
ABSTRACT................................................................................................................................xix
INTRODUCCIÓN..........................................................................................................................1
1. MARCO TEÓRICO .............................................................................................................. 2
1.1. Folatos (Ácido Fólico o Vitamina B9). ................................................................................ 2
1.1.1. Generalidades ................................................................................................................. 2
1.1.2. Estructura química y nomenclatura de los folatos ............................................................ 3
1.1.3. Metabolismo y función del ácido fólico ............................................................................ 3
1.1.4. Funciones del ácido fólico en el cuerpo humano. ............................................................. 4
1.1.5. Fuentes de ácido fólico. ................................................................................................... 4
1.1.6. Valoración del contenido de folatos en los alimentos. ...................................................... 6
1.1.6.1. Método Microbiológico ................................................................................................ 6
1.1.6.2. Método Cormatográfico ............................................................................................... 6
1.1.7. Normas que describen procedimientos del método microbiológico para la detección de
ácido fólico ............................................................................................................................... 6
1.1.7.1. Norma Española UNE-EN 14131:2003 ........................................................................ 6
1.1.7.2. Método Oficial AOAC 944.12 Ácido Fólico (Ácido Pteroilglutámico) en Preparados
Vitamínicos ............................................................................................................................... 7
1.1.7.3. Método Oficial AOAC 992.05 Ácido Fólico (Ácido Pteroilglutámico) en Fórmulas
Infantiles ................................................................................................................................... 7
1.2. Matrices ............................................................................................................................. 7
1.2.1. Leche en polvo ................................................................................................................ 7
1.2.1.1. Características fisicoquímicas ...................................................................................... 8
1.2.1.2. Características Sensoriales........................................................................................... 9
viii
1.2.1.3. Clasificación ................................................................................................................ 9
1.2.2. Cereales ........................................................................................................................ 10
1.2.2.1. Importancia de los cereales. ....................................................................................... 12
1.2.2.2. Cereales integrales. .................................................................................................... 12
1.3. Lectores de Microplacas ELISA. ...................................................................................... 12
1.3.1. Principio de Operación ................................................................................................. 13
2. VALIDACIÓN E INCERTIDUMBRE ................................................................................ 14
2.1. Validación de Métodos Microbiológicos........................................................................... 14
2.1.1. Métodos Cualitativos. .................................................................................................... 14
2.1.2. Métodos Cuantitativos ................................................................................................... 14
2.1.3. Validación según la norma ISO IEC 17025:2005. ......................................................... 14
2.1.4. Esquema de un Procedimiento de Validación de un método microbiológico. .................. 15
2.1.5. Parámetros de Validación de un método microbiológico cuantitativo normalizado ........ 16
2.1.5.1. Precisión .................................................................................................................... 16
2.1.5.2. Límite de cuantificación .............................................................................................. 17
2.1.5.3. Veracidad.........................................................................................................................17
2.1.5.4. Rango Validado...............................................................................................................17
2.2. Estimación de la incertidumbre en los métodos microbiológicos. ...................................... 17
2.2.1. Estimación de la incertidumbre de la medición según la Norma ISO IEC 17025:2005 18
2.2.2. Enfoque global para la estimación de la incertidumbre de la medición .......................... 19
2.2.2.1. Incertidumbre Estándar. ............................................................................................. 19
2.2.2.2. Incertidumbre Combinada .......................................................................................... 19
2.2.2.3. Incertidumbre Expandida. .......................................................................................... 19
2.2.2.4. Incertidumbre Porcentual ........................................................................................... 20
2.2.3. Requisitos generales para las actividades de validación y para la estimación de la
incertidumbre de medición…………………………………………………………………….. . 20
2.2.4. Fuentes o componentes de la incertidumbre................................................................... 21
2.3. Análisis ANOVA. ............................................................................................................ 22
3. DISEÑO EXPERIMENTAL ............................................................................................... 25
3.1. Procedimiento general para un proceso de validación. ...................................................... 25
3.2. Detección de necesidad analítica. ..................................................................................... 26
3.3. Método oficial. ................................................................................................................. 26
3.4. Borrador del procedimiento. ............................................................................................. 26
3.5. Puesta a punto. ................................................................................................................. 27
3.5.1. Equipos. ........................................................................................................................ 27
ix
3.5.2. Reactivos. ...................................................................................................................... 27
3.5.3. Matrices. ....................................................................................................................... 27
3.5.4. Materiales. .................................................................................................................... 27
3.5.5. Kit VitaFast Folic Acid “Microbiological microtiter plate test to quantitate Folic Acid” 28
3.5.6. Material de Referencia. ................................................................................................. 28
3.6. Elección de parámetros de validación y fijación de los objetivos para el ácido fólico en las
dos matrices. ........................................................................................................................... 28
3.7. Diseño experimental y estadístico. .................................................................................... 29
3.8. Procedimientos. ................................................................................................................ 30
3.8.1. Preparación de medio-estándar de ácido fólico. ............................................................ 30
3.8.2. Preparación ácido fólico estándar. ................................................................................ 30
3.8.3. Extracción de la Muestra. .............................................................................................. 31
3.8.4. Análisis. ........................................................................................................................ 32
3.8.5. Medición. ...................................................................................................................... 32
3.9. Datos experimentales. ...................................................................................................... 32
3.10. Datos del material de referencia. ..................................................................................... 33
3.11. Datos experimentales para las curvas de calibración. ...................................................... 33
3.12. Descripción de equipos utilizados en la validación. ......................................................... 34
3.12.1. pH-metro. .................................................................................................................... 34
3.12.2. Baño María. ................................................................................................................ 34
3.12.3. Micropipeta 100-1000μL. ............................................................................................ 35
3.12.4. Balanza de Precisión. .................................................................................................. 35
3.12.5. Incubadora. ................................................................................................................. 35
3.12.6. Cabina de Flujo Laminar. ........................................................................................... 36
3.12.7. Lector de Placas ELISA. .............................................................................................. 36
4.CÁLCULOS ........................................................................................................................ 37
4.1. Tratamiento Estadístico .................................................................................................... 37
4.1.1. Precisión. ...................................................................................................................... 37
4.1.1.1. Cálculo del valor medio de las determinaciones diarias. ............................................. 37
4.1.1.2. Cálculo de la media de medias. .................................................................................. 38
4.1.1.3. Cálculo de la Suma de Diferencias Cuadráticas Dentro del Grupo “SDCW”. ............. 38
4.1.1.4. Cálculo del promedio de la Suma de Diferencias Cuadráticas Dentro del Grupo
“ ” ................................................................................................................................ 38
4.1.1.5. Cálculo de la Suma de Diferencias Cuadráticas Entre Grupos “ ”...................... 38
4.1.1.6. Cálculo del promedio de la Suma de Diferencias Cuadráticas Entre Grupos “ . 39
4.1.1.7. Cálculo de la Desviación Estándar por Repetibilidad “Sr”. ....................................... 39
x
4.1.1.8. Cálculo de Precisión Intermedia “SL”. ...................................................................... 39
4.1.1.9. Cálculo de la Desviación Estándar por Reproducibilidad “SR”.................................. 39
4.1.1.10. Cálculo del Coeficiente de Variación de Repetibilidad “CVr”. ................................. 40
4.1.1.11. Cálculo del Coeficiente de Variación de Reproducibilidad “CVR” ........................... 40
4.1.2. Cálculo de Parámetros de Validación. ........................................................................... 40
4.1.2.1. Límite de Cuantificación. ............................................................................................ 40
4.1.2.2. Veracidad. .................................................................................................................. 41
4.2. Estimación de la incertidumbre de medición (Forma 1) .................................................... 42
4.2.1. Cálculo de la incertidumbre estándar por reproducibilidad para el nivel medio de la
matriz A. ................................................................................................................................. 42
4.2.2. Cálculo de la incertidumbre relativa.............................................................................. 42
4.2.3. Cálculo de la incertidumbre expandida.......................................................................... 42
4.3. Estimación de la incertidumbre de medición (Forma 2) .................................................... 43
5.RESULTADOS ................................................................................................................... 52
5.1. Curvas estándar obtenidas en los dos kits según el programa RIDAWIN........................... 52
5.2. Resultados de validación para la matriz A (Forma 1) ........................................................ 53
5.3. Resultados de validación para la matriz B (Forma 1) ........................................................ 53
5.4. Resultados de validación para la matriz A (Forma 2) ........................................................ 54
5.5. Resultados de validación para la matriz B (Forma 2) ........................................................ 54
5.6. Resultados del Rango de Trabajo y Límite de Cuantificación. ........................................... 55
5.7. Resultados de validación obtenidos en cuanto a precisión e incertidumbre. ....................... 55
6. DISCUSIÓN ....................................................................................................................... 56
7. CONCLUSIONES .............................................................................................................. 57
8. RECOMENDACIONES ..................................................................................................... 59
BIBLIOGRAFÍA..........................................................................................................................61
CITAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................................................63
ANEXOS......................................................................................................................................65
xi
LISTA DE TABLAS
pág
Tabla 1. Composición de alimentos y cantidades necesarias para el cumplimiento de las
recomendaciones de ingestión de ácido fólico. .......................................................................... 4
Tabla 2. Cantidad diaria y cantidad tolerable necesaria de ácido fólico ...................................... 5
Tabla 3. Composición de la leche en polvo ................................................................................ 8
Tabla 4. Requisitos Fisicoquímicos de la Leche en Polvo .......................................................... 8
Tabla 5. Características nutricionales de los cereales. .............................................................. 11
Tabla 6. Especificaciones en general de los lectores ELISA. .................................................... 12
Tabla 7. Parámetros de Validación de Métodos Microbiológicos Normalizados ....................... 16
Tabla 8. Datos para el análisis de simple varianza ................................................................... 22
Tabla 9. Modelo general para el análisis Simple de la Varianza ............................................... 23
Tabla 10. Parámetros y objetivos de validación ....................................................................... 28
Tabla 11. Diseño Experimental y Estadístico ........................................................................... 29
Tabla 12. Esquema de la curva estándar. ................................................................................. 31
Tabla 13. Datos experimentales para la matriz A. .................................................................... 32
Tabla 14. Datos experimentales para la matriz B. .................................................................... 33
Tabla 15. Datos del material de referencia. .............................................................................. 33
Tabla 16. Datos de la curva estándar del kit 1. ......................................................................... 33
Tabla 17. Datos de la curva estándar del kit 2. ......................................................................... 34
Tabla 18. Datos Generales del pH-metro ................................................................................. 34
Tabla 19. Datos Generales del Baño María .............................................................................. 34
Tabla 20. Datos Generales de la Micropipeta ........................................................................... 35
Tabla 21. Datos Generales de la Balanza de Precisión ............................................................. 35
Tabla 22. Datos Generales de la Incubadora ............................................................................ 35
Tabla 23. Datos Generales de la Cabina de Flujo Laminar ....................................................... 36
Tabla 24. Datos Generales del Lector de Placas ELISA. .......................................................... 36
Tabla 25. Datos experimentales para el nivel medio de la matriz A .......................................... 37
Tabla 26. Tabla resumen de cálculos ANOVA para nivel medio de la matriz A. ...................... 39
Tabla 27. Datos para el cálculo del límite de Cuantificación .................................................... 41
Tabla 28. Incertidumbre por reproducibilidad. ......................................................................... 44
xii
Tabla 29. Incertidumbre relativa de la balanza. ........................................................................ 46
Tabla 30. Incertidumbre relativa de la micropipeta. ................................................................. 47
Tabla 31.Incertidumbre relativa del baño maría ....................................................................... 48
Tabla 32. Incertidumbre relativa del pH metro......................................................................... 50
Tabla 33. Resultados de validación para la matriz A ................................................................ 53
Tabla 34. Resultados de validación para la matriz B ................................................................ 53
Tabla 35. Resultados de incertidumbre considerando todos los aportes para la matriz A. ......... 54
Tabla 36. Resultados de incertidumbre considerando todos los aportes para la matriz B. .......... 54
Tabla 37. Resultados de límite de cuantificación y rango de trabajo. ........................................ 55
Tabla 38. Resultados de precisión e incertidumbre. ................................................................. 55
xiii
LISTA DE FIGURAS
pág
Figura 1. Estructura química del ácido fólico ................................................................ 3
Figura 2. Clasificación de la leche en polvo según el contenido de grasa. ...................... 9
Figura 3. Lector de placas ELISA para 60,72 y 96 pozos............................................. 13
Figura 4. Esquema de un procedimiento de validación ................................................ 15
Figura 5. Diagrama de Ishikawa para el método microbiológico de cuantificación del
ácido fólico en la matriz A. ......................................................................................... 43
Figura 6. Curva estándar del kit uno. ........................................................................... 52
Figura 7. Curva estándar del kit dos ............................................................................ 52
xiv
LISTA DE ANEXOS
Pág
ANEXO A. DECLARACIÓN DEL MÉTODO VALIDADO .................................................. 66
ANEXO B. CURVAS ESTÁNDAR DE LOS KITS “QUALITY ASSURANCE CERTIFICATE” 68
ANEXO C. CURVAS ESTÁNDAR OBTENIDAS EN LOS DOS KITS SEGÚN EXCEL…..70
xv
GLOSARIO
ANALITO: Sustancia (química, física o biológica) buscada o determinada en una muestra, que
debe ser recuperada, detectada o cuantificada por el método.
BLANCO MATRIZ: Matriz que no contiene el analito de interés u objetivo para el método
seleccionado.
COMPONENTE DE LA INCERTIDUMBRE: Cada una de las contribuciones a la
incertidumbre.
ENSAYO: Operación técnica realizada de acuerdo a un procedimiento específico, que consiste
en la determinación cualitativa y/o cuantificación de una o más características (propiedades o
analitos) en un determinado producto, proceso o servicio.
INCERTIDUMBRE DE LA MEDICIÓN: Parámetro no negativo que caracteriza la
dispersión de la cantidad de valores que se atribuyen a una mensurando, basándose en la
información utilizada.
INTERVALO DE TRABAJO: Es el intervalo entre el nivel más bajo y más alto de
concentración que ha sido demostrado que puede ser determinado con la precisión y exactitud
requeridas para una determinada matriz.
MATRIZ: Es el tipo de sustancia compuesta (liquida, sólida, gaseosa) que puede o no contener
al analito de interés, ejemplo: matriz de alimento, matriz ambiental, etc.
MATERIAL DE REFERENCIA (MR): Material suficientemente homogéneo y estable con
propiedades especificadas, que se ha establecido es idóneo para uso en la medición o en el
análisis de las propiedades nominales.
MENSURANDO: Cantidad destinada a la medida.
xvi
MÉTODO DE ENSAYO VALIDADO: Método de ensayo aceptado para el que se han llevado
a cabo estudios de validación (desempeño) con el fin de determinar su precisión y fiabilidad
para un propósito específico.
MÉTODO OFICIAL: Es el método especificado por los organismos reglamentarios de un
país, con fines de aplicaciones de normas.
MÉTODO NORMALIZADO: Método apropiado para el ensayo dentro de su alcance,
publicado por organismos de normalización internacional, nacional o regional (ISO, EN, NM,
ASTM, BS, DIN, IRAM, etc.) o por organizaciones reconocidas en diferentes ámbitos ( AOAC,
FIL-IDF, EPA, USP etc.)
MÉTODO CUALITATIVO: Método que permite determinar la presencia o ausencia de un
analito en una muestra o matriz.
MÉTODO CUANTITATIVO: Método que permite determinar la concentración de un analito
presente en una muestra o matriz.
NIVEL: Es la concentración de una sustancia de interés en una solución estándar o matriz.
Generalmente, se habla en términos de nivel de concentración.
PLAN DE VALIDACIÓN: Documento tipo protocolo en el cual se definen las pruebas o
parámetros de validación necesarios y el diseño experimental a desarrollar en base a los
requerimientos del método.
REQUERIMIENTO DEL MÉTODO: Corresponde a aquellas características del método que
son esenciales para poder aplicarlo para el fin previsto. Cuando no están establecidas por el
cliente o usuario, debe definirlas el responsable del ensayo de manera confiable y científica.
RESULTADO DE UN ENSAYO (X): El valor final notificado de una cantidad medida o
calculada, tras aplicar un procedimiento de medición, incluidos todos los procedimientos
secundarios y las evaluaciones.
SUB-MUESTRA: Porción de una muestra para análisis.
xvii
VALOR VERDADERO: El grado de concordancia entre la media de un número infinito de
valores reiterados de cantidad y un valor de cantidad de referencia.
VALOR DE REFERENCIA: Valor cuantitativo que se utiliza como base para la comparación
con valores cuantitativos del mismo tipo.
xviii
VALIDACIÓN DEL MÉTODO MICROBIOLÓGICO PARA DETERMINAR EL
ÁCIDO FÓLICO EN UN LECTOR ELISA
RESUMEN
Validación del método microbiológico para determinar el ácido fólico en un lector ELISA en
muestras de matrices sólidas de acuerdo a la norma EN 14131y a los métodos de AOAC
INTERNACIONAL, AOAC (960.46; 2004.05).
Para esto, se revisaron los procedimientos normalizados referentes al método, se fijaron
objetivos y los parámetros de desempeño de validación. De acuerdo a los lineamientos del
inserto del kit de prueba, se planteó el diseño experimental y se ejecutó la puesta a punto para el
método, en condiciones de reproducibilidad y repetibilidad en los niveles de concentración bajo,
medio y alto para cada matriz. A continuación se realizó el tratamiento ANOVA de los datos, y
el cálculo de la incertidumbre con un nivel de confianza de 95,45% y un factor de cobertura
(K=2). Para la veracidad se utilizó un material de referencia interno.
Los valores de los parámetros de desempeño establecidos por los objetivos de validación están
dentro del rango establecido, por lo tanto se puede optar por la acreditación del ensayo.
PALABRAS CLAVES: / VALIDACIÓN/ MÉTODOS DE ENSAYO/ MÉTODO
MICROBIOLÓGICO/ KIT DE PRUEBA/ ÁCIDO FÓLICO/ LECTOR ELISA/
xix
VALIDATION OF MICROBIOLOGICAL METHOD FOR DETERMINING THE
FOLIC ACID IN AN ELISA READER
ABSTRACT
Validation of microbiological method for the determination of folic acid in an ELISA
reader, in samples of solid matrices, according to EN 14131 and AOAC
INTERNATIONAL methods: 960.46 and 2004.05.
For this, standard methods concerning the procedures were revised, and objectives and
performance validation parameters were set. According to the guidelines of the insertion
of the test kit, the experimental design and set-up for the method under conditions of
reproducibility and repeatability at low concentration levels were raised, medium and
high for each matrix was run. Then, the data processing ANOVA was performed, and
the calculation of the uncertainty with a confidence level of 95.45% and a coverage
factor (K=2) was made. Internal reference material was used for veracity.
The values obtained from the performance parameters are within the ranges established
by the validation objectives, so that the method is validated and can opt for further
accreditation.
KEYWORDS: VALIDATION/ TEST METHOD/ MICROBIOLOGICAL METHOD/
TEST KIT/ FOLIC ACID/ ELISA READER.
1
INTRODUCCIÓN
Los laboratorios de ensayo que brindan los servicios de análisis microbiológicos deben ser
acreditados y estandarizados de acuerdo a la norma ISO IEC 17025: Requisitos generales para
la competencia de los laboratorios de ensayo y de calibración; el organismo que evalúa el
control de los laboratorios de ensayo y sus métodos validados le corresponde al SAE (Servicio
de Acreditación Ecuatoriano).
Laboratorios LASA se ha propuesto brindar el servicio de verificación de nutrientes con la
finalidad de aportar al control del contenido nutricional de vitaminas y otros nutrientes en los
alimentos procesados.
En particular Laboratorios LASA mediante procedimientos adoptados de las normas EN 14131,
AOAC INTERNACIONAL (Método 960.46; Método 2004.05), procede a la validación interna
del método de ensayo para la cuantificación del ácido fólico añadido a los alimentos, para lo
cual hace uso de un kit de prueba “Microtiter plate test to quantitate folic acid”, debido a que
este kit expone parámetros de validación y procedimientos especificados para la realización de
este ensayo.
La validación de la cuantificación de ácido fólico añadido a los alimentos procesados tiene
como objetivo permitir a laboratorios LASA satisfacer los requerimientos de los clientes
brindando confianza, seguridad del método y calidad de los resultados, con los respectivos
respaldos para la determinación de la incertidumbre del método de ensayo aportando de esta
forma al aseguramiento de la calidad la cual rige y esta adoptada por laboratorios LASA.
La realización de una validación aporta a brindar un grado de confianza en los reportes de
declaración nutricional; los parámetros impuestos en la validación para la cuantificación del
ácido fólico están impuestos en el inserto del kit antes mencionado
Para la obtención de los resultados confiables se utilizaron materiales de referencia y equipos
calibrados, obteniéndose datos de precisión, veracidad e incertidumbre adecuadas y aceptables a
los objetivos de validación planteados; en consecuencia el método de ensayo está listo para ser
añadido en la ampliación del alcance para ser acreditado ante el SAE.
2
1. MARCO TEÓRICO
1.1. Folatos (Ácido Fólico o Vitamina B9).
1.1.1. Generalidades. El ácido fólico proviene del latín folium “hoja”, fue descubierto en 1931
en la india y se le llamo “factor de Wills”. Se aisló por primera vez de las hojas de espinaca en
1941. Contiene tres componentes principales: ácido glutámico, ácido p-aminobenzoico y un
derivado de la pteridina, compuesto heterocíclico de anillos condensados.
Los folatos son un grupo de compuestos sintetizados por plantas y bacterias, siendo los
componentes esenciales de la dieta de los animales y el hombre; Químicamente el ácido fólico
es N-[4-([(2-amino-4-hidroxi-6-pteridil)-metil]-amino)-benzoil]-glutámico, o ácido
pteroilglutámico. [1]
El ácido fólico es un compuesto en forma sintético usado en la suplementación y
enriquecimiento de alimentos por su estabilidad y por llegar activo al intestino después de su
reducción. En los alimentos se encuentran principalmente folatos naturales o reducidos, por
ejemplo derivados de tetrahidrofolato, tal como el 5 metiltetrahidrofolato, 5-formil
tetrahidrofolato y 5,10-metilen-tetrahidrofolato.
Normalmente éstos son naturales, y existen principalmente como pteroilpoliglutamatos, con
nueve moléculas de glutamato unida a un anillo de pteridina. [2]
3
1.1.2. Estructura química y nomenclatura de los folatos.
Fuente: INSTITUTO DE LA NUTRICIÓN E HIGIENE DE LOS ALIMENTOS. Ácido Fólico
y Vitamina B12 en la Nutrición Humana. Revista Cubana Aliment Nutr, 12(2):107-19, mayo
1998.
Figura 1. Estructura química del ácido fólico
En la figura 1 se aprecia la estructura química del ácido fólico donde se explica que todos los
folatos tienen en común la estructura del ácido pteroilglutámico (2-amino -4-hidroxi -6-
metilpteridina), molécula constituida por un anillo de pteridina unido por un puente metileno a
un residuo de ácido p-aminobenzoico que, a su vez, se une por un enlace tipo amida a un
residuo de ácido glutámico.
Los distintos folatos se diferencian en el anillo de pteridina, que puede presentar varias formas
reducidas y varios tipos de sustituciones, y en el residuo de ácido para-aminobenzoglutamato,
que se pueden presentar un numero variable de residuos de glutamato unidos entre sí por
enlaces peptídicos.
1.1.3. Metabolismo y función del ácido fólico. El ácido fólico es una vitamina incluida en la
serie conocida como complejo vitamínico B. El derivado activo de esta molécula es el ácido 5,
6, 7, 8-tetrahidrofólico, denominado normalmente tetrahidrofolato, el cual actúa como
coenzima transportando unidades activas de un átomo de carbono. La variedad e importancia de
las reacciones metabólicas en las que participa este derivado hacen que, el ácido fólico sea una
molécula indispensable para la vida.
2-amino-4-hidroxi-6-metilpteridina ácido p-aminobenzoico ácido glutámico
2 2 2
2
4
1.1.4. Funciones del ácido fólico en el cuerpo humano.
- El Ácido Fólico trabaja junto con la vitamina B12 y la vitamina C para ayudar al cuerpo a
descomponer, utilizar y crear nuevas proteínas.
- Ayuda a formar glóbulos rojos y a producir ADN (el pilar fundamental del cuerpo humano
que transporta información genética).
- Colabora en el funcionamiento celular y el crecimiento de los tejidos.
- Ayuda a incrementar el apetito cuando es necesario y estimula la formación de ácidos
digestivos.
- Tomar la cantidad correcta de Ácido Fólico antes y durante el embarazo ayuda a prevenir
ciertas anomalías congénitas, incluyendo la espina bífida.
- Ayuda al organismo a crear células nuevas (por eso todas las personas necesitan Ácido
Fólico). [3]
1.1.5. Fuentes de ácido fólico. El ácido fólico se encuentra presente en fuentes de origen
animal, vegetal y en suplementos. A continuación se presenta la tabla 1 en la que se explica la
cantidad de ácido fólico presente en los alimentos y las cantidades necesarias recomendadas
para la ingestión del mismo.
Tabla 1. Composición de alimentos y cantidades necesarias para el cumplimiento de las
recomendaciones de ingestión de ácido fólico.
Alimentos Unidad
Medida
Contenido de
ácido fólico
(μg)
Cantidad de alimento a
ingerir para cubrir la
recomendación (1)
Leche fluida de vaca 1 vaso 9,60 26 vasos
Leche en polvo entera
reconstituida
1 vaso 5,20 48 vasos
Yogurt 1 vaso 26,95 9 vasos
Huevo de gallina 1 U 17,50 14 huevos
Carne de res 1 libra 23,00 10,8 libras
Carne de ave 1 libra 27,00 9 libras
Carne de carnero 1 libra 13,80 18 libras
Carne de Cerdo 1 libra 13,80 18 libras
Hígado de cerdo 1/4 libra 218,50 1/4 libra
5
Tabla 1. (Continuación)
(1) Requerimiento diario de ácido fólico para un hombre adulto 400 μg.
Fuente: PITA RODRÍGUEZ, Gisela. Ácido Fólico y vitamina B12 en la nutrición humana.
Revista Cubana Aliment Nutr, 12(2): 107-19, mayo 1998.
En la alimentación humana es necesaria la ingestión de ácido fólico, a continuación se describe
en la tabla 2 la cantidad diaria y cantidad tolerable necesaria de ácido fólico.
Tabla 2. Cantidad diaria y cantidad tolerable necesaria de ácido fólico
Tomas Ácido Fólico
Edad Dosis recomendada,
μg/día
Dosis tolerable,
μg/día
1-3 años 150 300
4-8 años 200 400
9-13 años 300 600
14-18 años 400 800
> 19 años 400 1000
Embarazo 600 800-1000
Lactancia 500 800-1000
Fuente: LICATA, Marcela - Zonadiet [en línea]. [Fecha de consulta: 07 de Abril del 2015].
Disponible en: <http://www.zonadiet.com/nutricion/folico.htm>
Hígado de pollo 1/4 libra 762,45 1/8 libra
Corazón de cerdo 1 libra 4,60 54 libras
Corazón de res 1 libra 4,60 54 libras
Pescado 1 U 3,00 8,3 libras
Leguminosas 1 taza 44,40 5,6 tazas
Calabaza 1 taza 48,00 5,2 tazas
Berro 1 taza 83,60 3 tazas
Pimiento 1 mediano 19,55 13 pimientos
Tomate 1 mediano 24,00 10 tomates
Naranja 1 mediana 60,00 4 naranjas
Toronja 1 mediana 40,00 6,5 toronjas
Mandarina 1 mediana 20,00 12,5 mandarinas
6
1.1.6. Valoración del contenido de folatos en los alimentos. Para determinar la cantidad de
los folatos contenidos en los alimentos no es sencilla sin embargo se han establecido métodos
microbiológicos y cromatográficos que a continuación se detallan.
1.1.6.1. Método Microbiológico. El método microbiológico está basado en el uso de un
microorganismo que necesita los folatos para crecer. Teóricamente su crecimiento es
logarítmicamente proporcional al contenido de folato en la muestra. La bacteria más utilizada en
el método microbiológico es el Lactobacillus rhamnosus, y actúa sobre todos los derivados de
folatos encontrados en el alimento, a diferencia de muchas otras bacterias investigadas. Este es
el método Oficial aprobado por la “Association of Official Analytical Chemists”, AOAC, que
permite valorar el contenido de folatos totales en alimentos.
1.1.6.2. Método Cromatográfico. Uno de los principales objetivos en este tipo de métodos es
separar y cuantificar las diferentes formas de los folatos, que es importante debido al diferente
grado de biodisponibilidad dependiendo de los sustituyentes de un carbono. Sin este paso se
pierde sensibilidad y selectividad en la detección de folatos. La naturaleza hidrosoluble de los
folatos, junto con las diferencias en las propiedades iónicas e hidrofóbicas, hacen que estos
componentes se adapten perfectamente al intercambio iónico o fase - reversa del HPLC. [4]
1.1.7. Normas que describen procedimientos del método microbiológico para la detección de
ácido fólico. Actualmente no hay ningún método microbiológico oficial para el análisis del
ácido fólico en los alimentos; a continuación se describen las normas que describen
procedimientos sustentables los mismos que han dado resultados satisfactorios entre los
principales tenemos:
1.1.7.1. Norma Española UNE-EN 14131:2003. Esta norma europea describe un método
microbiológico para la determinación del contenido total de folato en los productos alimenticios
mediante detección turbidimétrica del crecimiento del microorganismo Lactobacillus casei, y
una subespecie de este el Lactobacillus rhamnosus (ATCC17469).
Este método permite la determinación de folatos en productos alimenticios, incluyendo tanto los
folatos presentes de forma natural como el ácido fólico añadido.
7
1.1.7.2. Método Oficial AOAC 944.12 Ácido Fólico (Ácido Pteroilglutámico) en Preparados
Vitamínicos. Este método solo es aplicable a las matrices que contienen al ácido fólico en forma
libre.
La importancia de este método radica en que se acoge al análisis del ácido fólico por el método
titrimétrico; el cual se lo debe realizar con una preparación previa de la muestra la misma que se
explica el método oficial AOAC 960.46 (Ensayos de Vitaminas).
Para llevar a efecto este método se realiza procedimientos para la preparación de ácido fólico
estándar, inoculación, solución de prueba y finalmente el ensayo todos estos ítems sujetos a los
principios descritos en la AOAC 960.46.
Otro método descrito en AOAC 944.12 es el método turbidimétrico que al igual que el anterior
se sujeta a la AOAC 960.46 en el cual se realizan los procedimientos para la preparación de
ácido fólico estándar, solución de prueba y el ensayo.
1.1.7.3. Método Oficial AOAC 992.05 Ácido Fólico (Ácido Pteroilglutámico) en Fórmulas
Infantiles. En este método utiliza Lactobacillus casei (L. rhamnosus), es un método
microbiológico que fue desarrollado para el análisis de ácido fólico en formulas infantiles.
Este método ha demostrado ser un punto de partida adecuado para desarrollar un método para la
medición del ácido fólico en cereales de grano. Este método no está destinado para la medición
de folato total, el método puede medir folato nativo en los ingredientes de las fórmulas para
lactantes a excepción del ácido fólico añadido.
En los pasos de extracción se emplean enzimas las mismas que aumentan el rendimiento de los
folatos en alimentos ricos en almidón o glucógeno y en alimentos ricos en proteínas (amilasa, y
proteasa, respectivamente).
1.2. Matrices
1.2.1. Leche en polvo. Es un producto obtenido por deshidratación de leche pasteurizada y se
presenta como un polvo uniforme, sin grumos, de color blanco amarillento. Contiene todos los
componentes naturales de la leche norma, sin embargo puede variar su tenor graso - entera,
8
parcialmente descremada o descremada, no puede contener sustancias conservantes ni
antioxidantes. [5]
A continuación en la tabla 3 se presenta la composición en general de la leche en polvo.
Tabla 3. Composición de la leche en polvo
Componente Leche entera, % Leche descremada, %
Agua 3.5 4.0
Grasa 27.0 1.0
Proteína 26.0 35.0
Lactosa 37.5 52.0
Sales minerales 6.0 7.0
Fuente: GRIMALDOS, Rafael Bolívar. Leche el polvo. [en línea]. 2011[Fecha de consulta: 10
de Abril del 2015]. Disponible en: <http://www.monografias.com/trabajos102/leche-
polvo/leche-polvo.shtml#ixzz3YwiOlBzI>
La mayoría de la leche en polvo se elabora a partir de leche descremada. El alto porcentaje de
grasa en el caso de polvo de leche entera dificulta la fabricación de productos de buena calidad
debido a la oxidación y el enranciamiento de las grasas durante la conservación. Las
características de la leche en polvo dependen también del método de desecación.
1.2.1.1. Características fisicoquímicas. De acuerdo a la norma INEN 298:2011 se ha
establecido que la leche en polvo debe reunir las siguientes características fisicoquímicas que en
la tabla 4 se detallan a continuación.
Tabla 4. Requisitos Fisicoquímicos de la Leche en Polvo
Requisitos Fisicoquímicos de la leche en polvo
Requisitos Entera Parcialmente
Descremada Descremada
Materia grasa (%m/m) ≥ a 26,0 1,5 a 2,5 < que 1,5
Humedad (%m/m) Máx. 3,5 Máx. 4,0 Máx. 4,0
Acidez titulable (ml.NaOH)
0,1N/10g sólidos no grasos Máx. 18,0 Max. 18,0 Máx. 18,0
9
Tabla 4. (Continuación)
Fuente: NTE INEN 298: 2011 Leche en polvo y crema en polvo- Requisitos, Primera edición,
Servicio de Normalización Ecuatoriano. Ecuador. 2011.
1.2.1.2. Características Sensoriales. Las características sensoriales de la leche en polvo
corresponden al aspecto, color, sabor y olor.
1.2.1.3. Clasificación. En la figura 2 se describe la clasificación de la leche en polvo según el
contenido de grasa, la temperatura de deshidratación y la solubilidad en agua.
Fuente: GRIMALDOS, Rafael Bolívar. Leche el polvo. [en línea]. 2011[Fecha de consulta: 10
de Abril del 2015]. Disponible en: <http://www.monografias.com/trabajos102/leche-
polvo/leche-polvo.shtml#ixzz3YwiOlBzI>
Figura 2. Clasificación de la leche en polvo según el contenido de grasa.
Contenido de grasa
•Leche en polvo con contenido del 50 % de grasa.
•Leche entera, o con toda la grasa original, (26% de grasa).
•Con tres cuartos de grasa, (no menos de 20% de grasa).
•Semidescremada, (no menos del 14% de grasa).
•Con un cuarto de grasa, (no menos de 8% de grasa).
•Descremada, (1% de grasa).
Temperatura de Deshidratación
•Temperatura baja.
•Temperatura media.
•Temepratura alta.
Solubilidadn en agua
•Leche en polvo de disolución normal.
•Leche en polvo de disolución instantánea (emulsionante natural)
Índice de solubilidad (ml) Máx. 1,0 Max. 1,0 Máx. 1,0
Leches de alto tratamiento térmico Máx. 2,0 - -
Partículas quemadas (máx.) Disco B Disco B Disco B
Humectabilidad máx. (s) 60 60 60
Dispersabilidad (% m/m) 85 90 90
10
1.2.2. Cereales. Se conoce como cereales al conjunto de semillas o granos comestibles de las
plantas de la familia de las gramíneas. Se caracterizan en que la semilla y el fruto son poco
diferenciables entre los cambios que se producen.
Existen diferentes tipos de cereales que se han clasificado de acuerdo a sus características
morfológicas y fisiológicas. Los cereales se han convertido en una parte importante de la dieta
de los seres humanos en la tabla 5 se explica el análisis nutricional de los diferentes tipos de
cereales existentes en el mundo.
11
Tabla 5. Características nutricionales de los cereales.
Análisis nutricional de diferentes cereales (por 100g)
Max
Min
Energía
(kJ)
Proteínas
(g)
Lípidos
(g)
Glúcidos
(g)
Calcio
(mg)
Hierro
(mg)
Potasio
(mg)
Magnesio
(mg)
Vitaminas
B1
(mg)
B2
(mg)
B6
(mg)
E
(mg)
Ácido
fólico
(mg)
B3
(mg)
Espelta 1340 11,5 2,7 69,0 22,0 4,2 447 130 0,40 0,15 0,27 1,60 0,030 6,9
Cebada 1430 11,0 2,1 72,0 38,0 2,8 444 119 0,43 0,18 0,56 0,67 0,065 4,8
Avena 1530 12,5 7,1 63,0 79,6 5,8 355 129 0,52 0,17 0,75 0,84 0,033 1,8
Mijo 1510 10,5 3,9 71,0 25,0 9,0 215 170 0,46 0,14 0,75 0,10 0,010 4,8
Maíz 1498 9,0 3,8 71,0 15,0 1,5 330 120 0,36 0,20 0,40 2,00 0,026 1,5
Arroz 1492 7,5 2,2 75,5 23,0 2,6 150 157 0,41 0,09 0,67 0,74 0,016 5,2
Centeno 1323 8,8 1,7 69,0 64,0 5,1 530 140 0,35 0,17 0,29 2,00 0,140 1,8
Trigo 1342 11,5 2,0 70,0 43,7 3,3 502 173 0,48 0,24 0,4 1,35 0,090 5,1
Fuente: SALAS Torres, Mireya. Análisis de cereales. [en línea]. 2011[Fecha de consulta: 15 de Abril del 2015]. Disponible en:
<http://www.monografias.com/trabajos94/analisis-cereales/analisis-cereales.shtml>
12
Los cereales en general se caracterizan por ser un fruto seco y constituye una fuente importante
de nutrientes para el sr humano
1.2.2.1. Importancia de los cereales. La importancia de los cereales se radica en los siguientes
aspectos:
- Proporcionan los cinco nutrientes en la dieta como lo son los carbohidratos, las proteínas,
las grasas, las vitaminas y los minerales.
- Sus lípidos poliinsaturados evitan la formación de colesterol.
- Por su bajo contenido de agua se pueden conservar por largos periodos de tiempo.
- Son fáciles de manipular, almacenar y transportar. [6]
1.2.2.2. Cereales integrales. Son granos enteros cuyos principales componentes anatómicos,
endospermo, germen y salvado, están presentes en las mismas proporciones que existen en el
grano intacto. Es decir, el grano puede ser sometido a molienda, cocción, extrusión, perlado o
descascarillado, siempre y cuando el producto final tenga todas sus partes en las mismas
proporciones que en un grano entero. [7]
1.3. Lectores de Microplacas ELISA.
Es un espectrofotómetro especializado, diseñado para efectuar la lectura de los resultados de una
técnica que se utiliza para determinar la presencia de anticuerpos o antígenos específicos
presentes en una muestra. En la tabla 6 se presentan las especificaciones generales de un lector
ELISA.
Tabla 6. Especificaciones en general de los lectores ELISA.
General
Modos de detección Absorbancia
Método de lectura
Punto final, cinética y análisis de área
de pozos. A través de control por
computadora.
Tipos de microplacas Microplacas de 6 a 384 pozos Placas
Terasaki de 60/72/96 pozos
Fuente: BioTek Instruments, Inc [en línea]. [Fecha de consulta: 16 de Abril del 2015].
Disponible en: <www.biotek.es/es/products/product_print.html?newsid=21>
13
1.3.1. Principio de Operación. A diferencia de los espectrofotómetros convencionales que
permiten efectuar lecturas en un rango amplio de longitudes de onda, este dispone de filtros o
rejillas de difracción que limitan el rango de longitudes de onda a aquellas que se utilizan en la
técnica ELISA, la cual generalmente se realiza con longitudes de onda comprendidas entre los
400 y los 750 nm. Algunos analizadores operan en el rango ultravioleta y pueden efectuar
análisis entre los 340 y los 700 nm. El sistema óptico utilizado por muchos fabricantes utiliza la
fibra óptica para llevar la luz hasta los pozos de la placa, donde se encuentra la muestra bajo
análisis. La luz que atraviesa la muestra tiene un diámetro que varía entre 1 y 3 mm. Un sistema
de detección recibe la energía lumínica, proveniente de la muestra, la amplifica, determina la
absorbancia y, a través de un sistema de lectura, la convierte en datos que permiten interpretar el
resultado de la prueba. En la figura 5 se expone un lector ELISA. [8]
Figura 3. Lector de placas ELISA para 60,72 y 96 pozos
En la actualidad, los analizadores de ELISA disponen de controles regulados por
microprocesadores, interfaces de conexión a sistemas de información, programas de control de
procesos como por ejemplo el programa RIDAWIN el mismo que a través del computador
permiten la automatización completa de los ensayos requeridos.
14
2. VALIDACIÓN E INCERTIDUMBRE
2.1. Validación de Métodos Microbiológicos.
En el campo microbiológico la validación de un método de ensayo consiste en proveer
evidencias objetivas que demuestren que el método sirve para detectar o cuantificar un
microorganismo o grupo de microorganismos. La validación de métodos microbiológicos
también se la conoce como “verificación de los métodos” debido a que sigue procedimientos
descritos en normas.
En relación a los análisis microbiológicos se establecido que existen diferentes tipos de métodos
dependiendo de sus objetivos de validación y se destacan a continuación:
2.1.1. Métodos Cualitativos. Su objetivo es detectar la presencia o ausencia del
microorganismo objetivo en una cantidad determinada de muestra.
2.1.2. Métodos Cuantitativos. Su objetivo es detectar un valor numérico del microorganismo
objetivo; estos métodos utilizan la estadística para la estimación del valor numérico o el
recuento para el contaje de unidades formadoras de colonias existentes.
2.1.3. Validación según la norma ISO IEC 17025:2005.
- La validación es la confirmación, a través del examen y el aporte de evidencias objetivas,
de que se cumplen los requisitos particulares para un uso específico previsto.
- El laboratorio debe validar los métodos no normalizados, los métodos que diseña o
desarrolla, los métodos normalizados empleados fuera del alcance previsto, así como las
ampliaciones y modificados de los métodos normalizados, para confirmar que los métodos
son aptos para el fin previsto. La validación debe ser tan amplia como sea necesario para
satisfacer las necesidades del tipo de aplicación o del campo de aplicación dados. El
laboratorio debe registrar los resultados obtenidos, el procedimiento utilizado para la
validación y una declaración sobre la aptitud del método para el uso previsto. [9]
15
2.1.4. Esquema de un Procedimiento de Validación de un método microbiológico. Para la
realización de una validación se debe seguir el siguiente algoritmo secuencial descrito en la
figura 4.
Fuente: DUFFAU Boris et al.Validación de métodos y determinación de la incertidumbre de la
medición.Chile, 2010.70 p.
Figura 4. Esquema de un procedimiento de validación
Definición del método a Validar:
Cuali o Cuantitativo-Analito-matriz-Concentración-principio
Tipo de Método
Normalizad
o
Normalizado
Modificado
No Normalizado: Nuevo o
Desarrollado por el laboratorio
No Normalizado
Tradicional:
Usado por el
Laboratorio hace años
Verificació
n Validación Prospectiva Validación
Retrospectiva
Establecer Parámetros a Evaluar
Establecer Pruebas
Experimentales
Establecer Criterios de Aceptabilidad
Desarrollar Pruebas Experimentales
Evaluar Resultados
INFORME DE VALIDACIÓN
REVISIÓN DE INFORME
Se trata de un método normalizado?
Tiene una
modificación significativa?
NO
SI NO
SI
Comparar resultados
versus criterios
16
2.1.5. Parámetros de Validación de un método microbiológico cuantitativo normalizado.
Debido a que en este método se aplican procedimientos descritos en la norma, el laboratorio
debe confirmar que puede aplicarlo correctamente previo a su uso en ensayos, mediante la
comprobación de parámetros de validación estadísticos los mismos que se indican en la norma.
En la tabla 7 se explica los parámetros de validación a desarrollar según el tipo de método
microbiológico.
Tabla 7. Parámetros de Validación de Métodos Microbiológicos Normalizados
Ensayos Cualitativos Ensayos Cuantitativos
Límite de Detección Precisión (Repetibilidad + Precisión intermedia)
Sensibilidad Límite de Cuantificación
Especificidad Verificación de la veracidad (Recuperación)
- Rango Validado
Fuente: Organismo Argentino de Acreditación GUÍA PARA LA VALIDACIÓN DE
MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS. OAA. Buenos Aires. 2013. p11.
A continuación se desccriben los parámetros de validación para los ensayos cuantitativos.
2.1.5.1. Precisión. Se puede establecer en términos de repetibilidad y reproducibilidad. El
grado de precisión se expresa habitualmente en términos de imprecisión y se calcula como
desviación estándar de los resultados.
- Repetibilidad: Es la precisión bajo las condiciones de repetibilidad, es decir, condiciones
donde los resultados de análisis independientes se obtienen con el mismo método en ítems
de análisis idénticos en el mismo laboratorio por el mismo operador utilizando el mismo
equipamiento dentro de intervalos cortos de tiempo.
- Reproducibilidad: También llamada precisión intermedia y es la precisión bajo las
condiciones de reproducibilidad, es decir, condiciones donde los resultados de los análisis
se obtienen con el mismo método en ítem idénticos de análisis en condiciones diferentes ya
sea de laboratorio, diferentes operadores, usando distintos equipos, entre otros. [10]
17
2.1.5.2. Límite de cuantificación. En los ensayos microbiológicos se define como el número
mínimo de microorganismos dentro de una variabilidad definida y se determina en las
condiciones experimentales del método evaluado.
Se lo obtien por medio de la aplicación de la siguiente ecuacion:
(1)
Dónde:
= Promedio de las mediciones del analito.
=Desviación estándar.
2.1.5.3. Veracidad. En la veracidad se determina el grado de coincidencia existente entre el
valor medio obtenido de una serie de resultados y un valor de referencia aceptado.
La veracidad puede ser determinada por sesgo o recuperación.
- Sesgo (s). La diferencia entre la expectativa relativa a los resultados de un ensayo o una
medición y el valor verdadero. En la práctica el valor convencional de cantidad puede
sustituir el valor verdadero.
- Recuperación (R): Es la fracción de la sustancia agregada a la muestra (muestra
fortificada) antes del análisis, al ser analizadas muestras fortificadas y sin fortificar. [11]
2.1.5.4. Rango Validado. Corresponde al intervalo en donde se comprueba la existencia de
microorganismos, este rango viene definido por la norma que describe el método de ensayo; el
límite inferior de este rango corresponde al límite de cuantificación.
2.2. Estimación de la incertidumbre en los métodos microbiológicos.
En los ensayos microbiológicos este parámetro se asocia al resultado de una medición, que
caracteriza la dispersión de los valores que podrían ser razonablemente al mensurado.
18
2.2.1. Estimación de la incertidumbre de la medición según la Norma ISO IEC
17025:2005.
- Un laboratorio de calibración, o un laboratorio de ensayo que realiza sus propias
calibraciones, debe tener y debe aplicar un procedimiento para estimar la incertidumbre de
la medición para todas las calibraciones y todos los tipos de calibraciones.
- Los laboratorios de ensayo deben tener y deben aplicar procedimientos para estimar la
incertidumbre de la medición. En algunos casos la naturaleza del método de ensayo puede
excluir un cálculo riguroso, metrológicamente y estadísticamente válido, de la
incertidumbre de medición. En estos casos el laboratorio debe, por lo menos, tratar de
identificar todos los componentes de la incertidumbre y hacer una estimación razonable, y
debe asegurarse de que la forma de informar el resultado no de una impresión equivocada
de la incertidumbre. Una estimación razonable se debe basar en un conocimiento del
desempeño del método y en el alcance de la medición y debe hacer uso, por ejemplo, de la
experiencia adquirida y de los datos de validación anteriores.
NOTA 1. El grado de rigor requerido en una estimación de la incertidumbre de la medición
depende de factores tales como:
- Los requisitos del método de ensayo;
- Los requisitos del cliente;
- La existencia de límites estrechos en los que se basan las decisiones sobre la conformidad
con una especificación.
Cuando se estima la incertidumbre de la medición, se deben tener en cuenta todos los
componentes de la incertidumbre que sean de importancia en la situación dada, utilizando
métodos apropiados de análisis.
NOTA 1. Las fuentes que contribuyen a la incertidumbre incluyen, pero no se limitan
necesariamente, a los patrones de referencia utilizados, los métodos y equipos utilizados, las
condiciones ambientales, las propiedades y la condición del ítem sometido al ensayo o la
calibración, y el operador.
NOTA 2. Cuando se estima la incertidumbre de medición, normalmente no se tiene en cuenta el
comportamiento previsto a largo plazo del ítem ensayado o calibrado. [12]
19
2.2.2. Enfoque global para la estimación de la incertidumbre de la medición. Según la
norma ISO 19036 en la microbiología aplicada a alimentos se tiene en cuenta solamente la
incertidumbre por reproducibilidad, la misma que se deriva de una estimación experimental de
la desviación estándar de la reproducibilidad del resultado final del proceso de medición
completo. Esta desviación estándar corresponde a la incertidumbre típica combinada
Toda este enfoque global puede ser considerado como un sistema de “caja negra”, en donde el
las principales fuentes de incertidumbre están identificadas.
Siendo este el caso se pueden encontrar diferentes formas de expresar la incertidumbre como
son:
2.2.2.1. Incertidumbre Estándar. Es la incertidumbre del resultado de una medición en un nivel
expresada como una desviación estándar, y se la puede calcular con la siguiente ecuación:
√ (2)
Dónde:
SR = Desviación estándar por Reproducibilidad
n = número de repeticiones
Valor medio= Media de las mediciones de cada nivel.
2.2.2.2. Incertidumbre Combinada. Es igual a la raíz cuadrada positiva de la varianza total
obtenida por combinación, es decir suma de las contribuciones de todas las fuentes que
contienen la información sobre la incertidumbre del mensurado.
2.2.2.3. Incertidumbre Expandida. Frecuentemente es necesario dar una incertidumbre que
defina un intervalo alrededor del resultado de la medición del que se espera comprenda una
fracción grande de la distribución de valores que podrían atribuirse razonablemente al
mensurando. A fin de incrementar la confiabilidad la incertidumbre combinada se multiplica
por un factor de cobertura que generalmente es cercano a 2 y se representa con la letra “k”. La
incertidumbre resultante es llamada “Incertidumbre expandida”, U, y es la que típicamente se
reporta en un informe de ensayo o calibración.
(3)
Dónde:
U= Incertidumbre Expandida.
20
= Incertidumbre Relativa.
k = Factor de cobertura.
2.2.2.4. Incertidumbre Porcentual. También representa que proporción del valor reportado es
dudosa, pero en este caso en tanto por ciento. Las incertidumbres porcentuales son
adimensionales y dependen de la magnitud de la variable medida. Mientras menor sea el valor
central mayor será el error porcentual cometido (para incertidumbres absolutas iguales).
2.2.3. Requisitos generales para las actividades de validación y para la estimación de la
incertidumbre de medición.
- La validación de los métodos de ensayo y la estimación de la incertidumbre de medición,
debe ser realizada por miembros del personal experimentados, competentes y, por lo tanto,
autorizados. El laboratorio debe operar bajo un sistema de aseguramiento de la calidad de
sus ensayos. Los equipos e instrumentos deben ser calibrados y/ o validados antes de su
uso, los medios de cultivo evaluados y controlados, etc.
- Para la validación/verificación de los métodos, el número y categoría de matrices a analizar
debe justificarse de acuerdo al alcance de la acreditación y debe basarse en referencias
bibliográficas o estándares reconocidos.
- Para la estimación de la incertidumbre, debe tenerse en cuenta: el tipo de matriz (o grupo
consistente de matrices), el microorganismo (o grupo consistente de microorganismos) y el
método empleado. El número y categoría de matrices a analizar debe justificarse de
acuerdo al alcance de la acreditación y debe basarse en referencias bibliográficas o
estándares reconocidos.
- Las actividades de validación y las de estimación de incertidumbre de medición deben
reflejar las condiciones reales de la aplicación de los métodos de ensayo, es decir, deben
tener en cuenta las condiciones encontradas en la práctica diaria.
- Tanto en la validación como en el cálculo de la incertidumbre de medición se debe tener en
cuenta el rango de trabajo que emplee el laboratorio en sus análisis de rutina.
- Se debe designar a un responsable que tenga las calificaciones y la competencia necesarias,
para evaluar el diseño experimental y los resultados obtenidos, tanto en la validación de los
métodos como en la estimación de la incertidumbre de medición. Éste decidirá además las
acciones a seguir en caso que no se obtengan los resultados esperados.
- La participación en Ensayos de Aptitud (EA), no puede ser utilizada como único método
para la validación ni para la estimación de la incertidumbre de medición, debido a las
siguientes limitaciones:
21
a) En las rondas de EA, las matrices, en muchos casos, son diferentes a las que analiza el
laboratorio en su rutina diaria y no tienen en cuenta la presencia interferencias.
b) Las muestras distribuidas durante la ronda, han sido especialmente homogeneizadas y
estabilizadas.
c) Los niveles de microorganismos en las muestras del EA, pueden no ser aquellos que el
laboratorio analiza rutinariamente y pueden no cubrir el rango encontrado en el trabajo
diario;
d) Los laboratorios participantes, utilizan una variedad de métodos empíricos para
obtener su resultado, por lo cual para evaluar el resultado de la ronda se utilizan
valores de consenso.
e) Sin embargo la participación en EA, puede utilizarse como actividades
complementarias a la validación y pueden dar una indicación de la precisión obtenida
para un método en particular. [13]
2.2.4. Fuentes o componentes de la incertidumbre. Es importante que para un método
validado o verificado por el laboratorio, se realice la determinación de las diferentes fuentes o
componentes de la incertidumbre de la medición presentes:
- Muestreo.
- Efectos de la muestra: tipo de matriz, almacenamiento, etc.
- Sesgos Instrumentales: Las debidas a las características de los equipos utilizados para
realizar las medidas tales como: deriva, resolución, magnitudes de influencia.
- Pureza de Reactivos: materiales de referencia, preparación de estándares.
- Analista: variaciones en mediciones repetidas bajo condiciones aparentemente iguales.
- Condiciones de medición: Las debidas al certificado de calibración: en él se establecen las
correcciones y las incertidumbres asociadas a ellas, para un valor de k (factor de cobertura)
determinado, en las condiciones de calibración.
- Condiciones de medición: temperatura, humedad, etc.
- Otras: Método (por ejemplo al interpolar en una recta), tablas (por ejemplo las constantes),
pesada, alícuota, efectos computacionales, etc.
Generalmente para el análisis de las fuentes de incertidumbre se utiliza el diagrama de espina de
pescado u otro tipo de diseño esquemático que permita con facilidad identificar las fuentes de
incertidumbre presentes durante el proceso analítico. [14]
22
2.3. Análisis ANOVA.
Para el caso de una validación donde se utilizan varios niveles de concentración, la precisión se
determina con ayuda del ANOVA (ANalysis Of VAriance).
Para obtener la precisión del método se lo puede realizar a través del análisis simple de varianza
(ANOVA de factores totalmente anidados y homogéneos), las desviaciones estándar de
repetibilidad (Sr) y de reproducibilidad (SR) para cada uno de los niveles de ensayo.
Tabla 8. Datos para el análisis de simple varianza
Nivel i Días de determinación
Observaciones 1 2 3
1 C11 C21 C31
2 C12 C22 C32
3 C13 C33 C33
Las medias de cada día están definidas por:
∑
(4)
La media general es:
∑ ∑
∑
∑
(5)
23
Tabla 9. Modelo general para el análisis Simple de la Varianza
Origen de la
varianza
Grados de
libertad(ν)
Sumas de diferencias
cuadráticas (SDC)
Diferencias
cuadráticas medias
(DCM = SDC/ν )
(varianzas)
Entre grupos
(Between) ν1 = 3-1 = 2 ∑
Dentro del
grupo (Within) ν2 = 9-3 = 6 ∑∑
Total ν = 9-1 = 8
(= 2+6)
∑∑( )
(= )
Fuente: PÉREZ Villacorte, Ricardo Daniel. Validación de los Métodos de Ensayo de Poder
Calórico, Viscosidad Saybolt y Contenido de Gomas en Crudo y sus Derivados en el Área de
Petróleos del DPEC. Tesis de grado. Ingeniero Químico. Facultad de Ingeniería Química.
Quito.2012. 119 p.
De acuerdo a ISO 5725 (UNE 82009):
La desviación estándar de repetibilidad (Sr) es:
√ (6)
La desviación estándar de reproducibilidad (SR) es:
√
(7)
Dónde:
(8)
24
Siendo el denominador (3) igual al número de observaciones que se realizan cada día (en cada
nivel) cuando es el caso de un diseño experimental homogéneo de dos factores como el que se
ha planteado.
NOTA 1: Si, por efectos aleatorios, , debe asumirse
(normalmente debería
cumplirse que y en caso contrario deberían existir razones que lo justificaran).
Las Sr y SR del método estarán comprendidas entre el valor menor y el valor mayor de todas las
desviaciones típicas calculadas o coeficiente de variación (CV) si se quiere presentar en
términos relativos, que es más comparable).
Si el intervalo de trabajo del método es muy amplio, es razonable esperar que las S sean
significativamente diferentes para cada punto de la función de respuesta del método, lo que nos
obligaría a tomar decisiones relativas a la definición de su uso por tramos. En algunos casos
podría ser conveniente tratar de establecer si existe alguna relación funcional entre las S y los
respectivos niveles de ensayo.
25
3. DISEÑO EXPERIMENTAL
3.1. Procedimiento general para un proceso de validación.
Es necesario validar los métodos normalizados y los no normalizados antes de su uso para ver si
son apropiados.
La metodología utilizada en un proceso de validación es la siguiente:
- Necesidad Analítica: Se establece, por la autoridad del laboratorio, la necesidad de
satisfacción de una demanda analítica.
- Método: Selección de un método más adecuado, para esto se puede acudir a la bibliografía
especializada
- Elaboración del borrador del procedimiento: Teniendo en cuenta los aspectos formales
de contenido.
- Puesta a punto: Actividad previa a la validación que se debe realizar para llegar a tener
un conocimiento general del mismo para de esta manera ajustar y afinar las distintas
variables del método.
- Elección de los parámetros de validación: Teniendo en cuenta las guías aplicables y la
experiencia obtenida en la puesta a punto.
- Fijación de objetivos para los parámetros de validación: Teniendo en cuenta la
bibliografía aplicable y la experiencia obtenida en la puesta a punto.
- Diseño experimental y estadístico: Para la obtención de los parámetros elegidos,
siguiendo el procedimiento.
- Realización de los ensayos diseñados: De acuerdo con el procedimiento (borrador).
Evidencias registrables completas.
- Tratamiento estadístico de los datos obtenidos: Se obtienen los valores propios del
laboratorio para los parámetros de validación.
¿Cumplen objetivos predefinidos?
SI Método Validado, seguir con la elaboración de una documentación.
NO Analizar incumplimientos y buscar posibles causas
26
¿Se han encontrado posibles razones?
SI Corregir y volver al diseño experimental y estadístico.
NO ¿Se pueden cambiar objetivos?
SI Cambiar y volver a fijar objetivos.
NO Volver a puesta a punto.
Elaboración de la documentación respectiva.
Aprobación del procedimiento y declaración del método validado.
Difundir, distribuir y archivar la documentación conjuntamente con los registros en forma
ordenada.
Un procedimiento se considera validado mientras no se produzcan cambios en sus
parámetros.
3.2. Detección de necesidad analítica.
Laboratorios LASA, en busca de obtener resultados confiables en los análisis, en el área de la
microbiología se ha visto en la necesidad de validar el análisis del ácido fólico por un método
microbiológico en un lector ELISA para ampliar su capacidad de servicio, para de esta manera
cumplir con la normativa que rige el método de rendimiento probado por el instituto de
investigación AOAC. Empleando metodologías que demuestren científicamente resultados
confiables, razón por la cual es de vital importancia garantizar la calidad del ensayo, mediante el
desempeño de una buena práctica profesional, a fin de asegurar la satisfacción del cliente,
basado en la confianza generada por la excelencia del servicio y la fiabilidad del resultado.
3.3. Método oficial.
EN 14131; AOAC INTERNACIONAL, 19th EDITION, 2012 (Método 960.46; Método
2004.05)
3.4. Borrador del procedimiento.
El planteamiento del plan de validación y descripción de los procedimientos para la realización
del ensayo esta descrito en el siguiente documento de laboratorios LASA.
PEE-LASA-FQ-58
27
3.5. Puesta a punto.
3.5.1. Equipos.
- Incubadora con cámara oscura(EIMB-59-If-00)
- Baño María (EIBR-108-Bn-00)
- Lector ELISA (610nm-630nm).
- pH metro (EIMB-14-Ph-00)
- Pipeta graduada de 100 – 1000 μl (MVBR-107-Mp-00)
- Cabina de flujo laminar (EIMB-62-Fl-00)
- Balanza de precisión (EIMB-39-Ba-00)
Nota: La descripción de los equipos ver en el punto 3.11.
3.5.2. Reactivos.
- Agua fosfatada
- Hidróxido de sodio concentrado 1N
3.5.3. Matrices.
- Galleta de Cereal: Matriz A
- Leche en Polvo: Matriz B
3.5.4. Materiales.
- Puntas de micro pipeta estéril de 100 – 1000 μl
- Viales estériles 1.5 – 2.0 ml
- Micropipeta 100-1000 μl (MVBR-107-Mp-00)
- Pipeta de 10 ml
- Filtros estériles polietersulfona 0.2 μm
- Embudos plásticos de 65 mm
- Tubos de vidrio de 10 ml
- Gradilla
- Vasos de precipitación de 100 ml
28
3.5.5. Kit VitaFast Folic Acid “Microbiological microtiter plate test to quantitate Folic
Acid”. Cada kit de prueba contiene suficiente material para 96 determinaciones incluidos los
estándares. Cada kit de prueba contiene:
- 1 x placa de micro titulación con 96 pocillos, recubiertos con Lactobacillus rhamnosus
(ACTT Nr. 7496).
- 3 x agua estéril (30 ml) para la preparación de ensayo medio, estándares y dilución de
muestras extraídas.
- 3 x ácido fólico ensayo medio (solido)
- 3 x ácido fólico estándar (solido)
- 3 x ácido fólico buffer (liquido)
- 3 x lamina autoadhesiva (10 x 6) cm
- 1 x tiras adicionales para micro titulación
3.5.6. Material de Referencia.
- CRE-06 “Cereal en polvo”
3.6. Elección de parámetros de validación y fijación de los objetivos para el ácido fólico
en las dos matrices.
Tabla 10. Parámetros y objetivos de validación
PARÁMETROS OBJETIVO DE VALIDACIÓN
Selectividad/Especificidad pH, Disolución, Temperatura de calentamiento, Tiempo de
Incubación.
Límite de Cuantificación 0,16 μg/100g
Precisión %CVR ≤ 10%; en los todos los niveles.
%CVr ≤ 10%; en los todos los niveles.
Exactitud 90%<Recuperación<105%; en el nivel alto de una matriz.
Incertidumbre U ≤ 20% ; en todos los niveles
Intervalo de Trabajo 0,16 – 1,28 μg/100g
Dónde:
CVR: Coeficiente de variación de reproducibilidad.
CVr: Coeficiente de variación de repetibilidad.
29
3.7. Diseño experimental y estadístico.
A continuación, se presentan, un esquema de diseño experimental y una serie de criterios
elementales para la determinación de los diversos parámetros de validación.
Tabla 11. Diseño Experimental y Estadístico
DISEÑO
EXPERIMENTAL
Obtención de la curva estándar en seis niveles de concentración incluido
el cero (blanco). Siguiendo el procedimiento del inserto del kit de
prueba, la cual es una curva con ajuste logarítmico. Se realiza una curva
de calibración para cada Kit (2).
Niveles de la curva estándar: 0; 0,16; 0,32; 0,64; 0,96; 1,28 μg/100g.
Determinación de la exactitud (recuperación) en el nivel alto de
concentración del material de referencia CRE-06 “cereal en polvo”.
Nota: un solo nivel debido a que los pocillos del kit son limitados.
Determinación de la precisión con tres niveles de concentración para
cada matriz A y B.
Submuestras
2 x 5 = 10 estándares por nivel; 5 por día y por 2 días por cada kit.
1 x 2 = 2 Blanco por cada día 1 y por dos días por cada kit.
2 x 1 = 2 material de referencia por un día.
3 x 3 = para tres niveles de concentración en las dos matrices por
tres días supondrán 54 muestras.
Procesamiento Las submuestras de matrices, matrices y estándares deberán seguir el
método completo según PEE-LASA-58.
Lectura
Lectura directa de los pocillos del kit en el lector de micro placas ELISA
de: blancos, estándares, muestras de matrices y material de referencia.
Nota: La interpretación de los resultados se los obtiene al ingresar los
resultados de absorbancia en el programa RIDAWIN.
Función Respuesta Determinación de la curva de estándar propia de cada kit a partir de los
estándares y blancos. El equipo da directamente el ajuste logarítmico.
Interpolación y
Cálculos
Las lecturas obtenidas de las submuestras, estándares y material de
referencia, al ser ingresadas al programa RIDAWIN se procesan y se
obtienen los resultados en μg/100g.
Determinación de la exactitud del material de referencia.
30
Tabla 11. (Continuación)
Tratamiento
Estadístico
Análisis de la Varianza con ANOVA de los resultados obtenidos para la
obtención de la precisión por niveles.
Obtención de:
1. Límite de Cuantificación.
2. Precisión Sr y SR asociada a cada nivel.
3. Exactitud, % Recuperación en un nivel.
4. Intervalo de trabajo.
5. Estimación de la Incertidumbre %U asociada a cada nivel.
3.8. Procedimientos.
3.8.1. Preparación de medio-estándar de ácido fólico.
a) Extraer el desecante que se encuentra en el interior de la botella.
b) Añadir 10 ml de agua estéril del kit a la botella de ácido fólico Estándar.
c) Añadir 1ml de ácido fólico Buffer.
d) Cerrar la botella de Medio-Estándar ácido fólico y agitar. Asegurarse que la botella se
encuentre bien cerrada.
e) Calentar la botella de Medio-Estándar ácido fólico en un baño de agua 90 °C por 5
minutos.
f) Cada 2 minutos agitar la botella de Medio-Estándar ácido fólico.
g) Enfriar rápidamente por debajo de 30 °C.
h) Filtrar 1-1.5 ml de la solución medio estándar.
3.8.2. Preparación ácido fólico estándar.
a) Abrir la botella de ácido fólico Estándar.
b) Quitar y descartar la tapa y tampón rojo.
c) Añadir 2 ml de agua estéril a la botella de ácido fólico Estándar.
d) Pipetear para homogenizar.
e) Preparar las diluciones estándar en viales estériles (1.5-2 ml) de acuerdo al siguiente
esquema:
31
Tabla 12. Esquema de la curva estándar.
Curva Estándar en
μg/100g (ml)
agua estéril en
μl
Concentrado
Estándar en μl
Volumen
total en μl
Blanco : 0 900 + 0 = 900
Estándar 1 : 0,16 900 + 100 = 1000
Estándar 2 : 0,32 400 + 100 = 500
Estándar 3 : 0,64 300 + 200 = 500
Estándar 4 : 0.96 200 + 300 = 500
Estándar 5 : 1.28 100 + 400 = 500
3.8.3. Extracción de la Muestra.
NOTA: no es necesario realizar este proceso en un área estéril.
3.8.3.1. Matriz A (Cereal))
a) Homogenizar la muestra.
b) Pesar 1 g de muestra y colocar en un vial estéril de 50 ml.
c) Añadir 30 ml de agua fosfatada.
d) Agitar la muestra y ajustar pH 7-7.5 (NaOH, 1N).
e) Añadir 10 ml de agua fosfatada.
f) Colocar en un baño de agua 90 °C por 30 minutos.
g) Agitar cada 6 minutos el vial.
h) Enfriar rápidamente por debajo de 30 °C.
i) Agitar y filtrar 1-1.5 ml de muestra preparada en vial estéril.
j) Dilución si es necesario.
3.8.3.2. Matriz B (Leche en polvo)
a) Colocar 1 g de muestra en un vial estéril de 50 ml.
b) Añadir 30 ml de agua fosfatada.
c) Agitar la muestra y ajustar pH 7-7.5 (NaOH, 1N).
d) Añadir 10 ml de agua fosfatada.
e) Agitar la muestra.
f) Filtrar 1-1.5 ml de muestra preparada en vial estéril.
g) Dilución con agua estéril si es necesario.
32
3.8.4. Análisis.
a) Sacar la placa de micro titulación del empaque.
b) Pipetear 150 μl de Medio-estándar de ácido fólico en cada pocillo.
c) Pipetear 150 μl del ácido fólico estándar o muestras en los pocillos. Homogenizar.
d) Cubrir la placa con las láminas autoadhesivas.
e) Nota: asegurarse que los pocillos estén cerrados herméticamente por alisado. Tener
cuidado con los bordes.
f) Incubar la placa a 37 °C en la oscuridad por 44-48 horas.
3.8.5. Medición.
a) Presione hacia abajo la lámina adhesiva para asegurar el sellado de los pocillos.
b) Colocar la micro placa al revés sobre una mesa.
c) Agitar la placa para homogenizar los microorganismos.
d) Invertir la placa a la posición regular.
e) Quitar la lámina adhesiva en diagonal. 180° a partir del botón izquierdo.
f) Eliminar burbujas presentes con la punta de la pipeta.
g) Medir la turbidez con un lector ELISA a 610-630 nm.
3.9. Datos experimentales.
Tabla 13. Datos experimentales para la matriz A.
Nivel de
concentración
Día 1 Día 2 Día 3
Concentración, μg/100g
Baja
0,183 0,186 0,186
0,185 0,186 0,185
0,185 0,185 0,186
Media
0,220 0,221 0,218
0,216 0,219 0,218
0,216 0,216 0,218
Alta
0,831 0,894 0,875
0,854 0,870 0,875
0,824 0,844 0,860
pH 7,23 7,43 7,30
33
Tabla 14. Datos experimentales para la matriz B.
Nivel de
concentración
Día 1 Día 2 Día 3
Concentración, μg/100g
Baja
0,519 0,525 0,564
0,590 0,663 0,574
0,538 0,535 0,579
Media
0,790 0,860 0,813
0,762 0,827 0,814
0,824 0,854 0,867
Alta
1,300 1,310 1,180
1,270 1,270 1,230
1,270 1,240 1,260
pH 7,16 7,31 7,09
3.10. Datos del material de referencia.
Tabla 15. Datos del material de referencia.
Identificación Ácido Fólico
μg/100g
μg/100g
μg/100g
CER-06 1,510
1,505 1,641 1,500
3.11. Datos experimentales para las curvas de calibración.
Tabla 16. Datos de la curva estándar del kit 1.
Concentración
μg/100g Absorbancia
0,0 0,049
0,16 0,114
0,32 0,200
0,64 0,401
0,96 0,588
1,28 0,759
34
Tabla 17. Datos de la curva estándar del kit 2.
Concentración
μg/100g Absorbancia
0,0 0,106
0,16 0,290
0,32 0,637
0,64 0,883
0,96 0,973
1,28 1,447
3.12. Descripción de equipos utilizados en la validación.
3.12.1. pH-metro.
Tabla 18. Datos Generales del pH-metro
Datos Generales
Código EIMB-14-Ph-00
Marca METTLER TOLEDO
Modelo MP120
Nº Serie 228206
Localización ÁREA MICROBIOLOGÍA
3.12.2. Baño María.
Tabla 19. Datos Generales del Baño María
Datos Generales
Código EIBR-108-Bn-00
Marca MEMMERT
Modelo 854 Schwabach
Nº Serie 782124
Localización DEP. BROMATOLOGÍA
35
3.12.3. Micropipeta 100-1000μL.
Tabla 20. Datos Generales de la Micropipeta
Datos Generales
Código MVBR-107-Mp-00
Marca LABNET INTERNACIONAL
Modelo BP1000
Nº Serie 244060464
Localización DEP. BROMATOLOGÍA
3.12.4. Balanza de Precisión.
Tabla 21. Datos Generales de la Balanza de Precisión
Datos Generales
Código EIMB-39-Ba-00
Marca METTLER TOLEDO
Modelo PB1501-L
Nº Serie 1128330437
Localización ÁREA MICROBIOLOGÍA
3.12.5. Incubadora.
Tabla 22. Datos Generales de la Incubadora
Datos Generales
Código EIMB-59-If-00
Marca MEMMERT
Modelo F-N:871 808
Tipo B10
Localización ÁREA MICROBIOLOGÍA
36
3.12.6. Cabina de Flujo Laminar.
Tabla 23. Datos Generales de la Cabina de Flujo Laminar
Datos Generales
Código EIMB-62-FI-00
Marca MRC
Modelo 11300
Nº Serie 3B513V0038
Localización ÁREA MICROBIOLOGÍA
3.12.7. Lector de Placas ELISA.
Tabla 24. Datos Generales del Lector de Placas ELISA.
Datos Generales
Número de Serie 1502098
Marca BioTek®
Instrument, Inc.
Modelo Elx800TM
Absorbance Microplate
Reader
Nº Serie 3B513V0038
Localización ÁREA MICROBIOLOGÍA
37
4. CÁLCULOS
4.1. Tratamiento Estadístico
4.1.1. Precisión.
Haciendo uso del análisis simple de varianza (ANOVA de un factor).
Tabla 25. Datos experimentales para el nivel medio de la matriz A
Número de
Determinación
DIA 1
μg/100g
DIA 2
μg/100g
DIA3
μg/100g
1 0,220 0,221 0,218
2 0,216 0,219 0,218
3 0,216 0,216 0,218
Sumatoria 0,652 0,656 0,654
0,217 0,219 0,218
0,218
4.1.1.1. Cálculo del valor medio de las determinaciones diarias.
Aplicando la ecuación 4 del numeral 2.4, se tiene:
0,217 μg/100
38
4.1.1.2. Cálculo de la media de medias.
Aplicando la ecuación 5 del numeral 2.4, se tiene:
0,218 μg/100g
4.1.1.3. Cálculo de la Suma de Diferencias Cuadráticas Dentro del Grupo “SDCW”.
∑ ∑
(9)
(1,07E-05+1,27E-05+0,00E+00)
2,33E-05
4.1.1.4. Cálculo del promedio de la Suma de Diferencias Cuadráticas Dentro del Grupo
“ ”
(10)
3,89E-06
4.1.1.5. Cálculo de la Suma de Diferencias Cuadráticas Entre Grupos “ ”.
∑ (11)
3*(4,44E-07+4,44E-07+0,00E00)
2,67E-06
39
4.1.1.6. Cálculo del promedio de la Suma de Diferencias Cuadráticas Entre Grupos “ ”.
(12)
1,33E-06
Tabla 26. Tabla resumen de cálculos ANOVA para nivel medio de la matriz A.
Origen de la
Varianza
Grados de
Libertad
Suma de Diferencias
Cuadráticas
Diferencias
Cuadráticas Medias
Entre Grupos 2 2,67E-06 1,33E-06
Dentro del Grupo 6 2,33E-05 3,89E-06
TOTAL 8 2,60E-05 3,25E-06
4.1.1.7. Cálculo de la Desviación Estándar por Repetibilidad “Sr”.
Aplicando la ecuación 6 del numeral 2.4, se tiene:
√
0,0019
4.1.1.8. Cálculo de Precisión Intermedia “SL”.
Aplicando la ecuación 8 del numeral 2.4, se tiene:
-8,51E-07
4.1.1.9. Cálculo de la Desviación Estándar por Reproducibilidad “SR”.
Aplicando la ecuación 7 del numeral 2.4, se tiene:
40
√
0,0017
4.1.1.10. Cálculo del Coeficiente de Variación de Repetibilidad “CVr”.
(13)
0,90
4.1.1.11. Cálculo del Coeficiente de Variación de Reproducibilidad “CVR”
(14)
0,80
4.1.2. Cálculo de Parámetros de Validación.
4.1.2.1. Límite de Cuantificación. Se calcula a partir de los datos de nivel medio de la galleta de
cereales (Matriz A). El límite de cuantificación se va calcular con el promedio del analito de
proporciona una señal igual a la señal del blanco más diez veces la desviación estándar del
blanco.
√ (15)
Dónde:
= Desviación estándar
Yi = concentración baja de ácido fólico en la matriz A, μg/100g
= promedio de las concentraciones bajas de ácido fólico en la matriz “A”, μg/100g
41
Tabla 27. Datos para el cálculo del límite de Cuantificación
Yi Yi- (Yi- )2
0,183 -2,22E-03 4,94E-06
0,185 -2,22E-04 4,94E-08
0,185 -2,22E-04 4,94E-08
0,186 7,78E-04 6,05E-07
0,186 7,78E-04 6,05E-07
0,185 -2,22E-04 4,94E-08
0,186 7,78E-04 6,05E-07
0,185 -2,22E-04 4,94E-08
0,186 7,78E-04 6,05E-07
Número de datos 9 Suma 7,556E-06
, μg/100g 0,185
, μg/100g 0,00097
Aplicando la ecuación 1 del numeral 2.2.3, se tiene:
0,19
4.1.2.2. Veracidad: Recuperación con respecto al material de referencia CRE-06.
(16)
Dónde:
= Promedio de la concetración de analito medido en la muestra, μg/100g
= Concentración verdadera del analito en la muestra, μg/100g
42
4.2. Estimación de la incertidumbre de medición (Forma 1)
4.2.1. Cálculo de la incertidumbre estándar por reproducibilidad para el nivel medio de la
matriz A.
SR Se obtiene del ANOVA U
Aplicando la ecuación 2 del numeral 2.3.2, se tiene:
√
4.2.2. Cálculo de la incertidumbre relativa.
(17)
Dónde:
Concentración en el nivel de matriz A.
4.2.3. Cálculo de la incertidumbre expandida.
Aplicando la ecuación 3 del numeral 2.3.2, se tiene:
k=2 corresponde a un nivel de confianza de 95,45%
43
4.3. Estimación de la incertidumbre de medición (Forma 2)
Para establecer todas las contribuciones a la incertidumbre de medida, a continuación se detalla
el cálculo modelo para el método microbiológico de cuantificación de ácido fólico en el nivel
medio de la matriz A.
Figura 5. Diagrama de Ishikawa para el método microbiológico de cuantificación
del ácido fólico en la matriz A.
Con el fin de establecer todas las contribuciones a la incertidumbre de medida, a continuación se
detalla el procedimiento aplicado para la cuantificación de ácido fólico.
La siguiente ecuación define la forma de determinar la incertidumbre combinada, aplicando
incertidumbres relativas, debido a que las variables que contribuyen a la incertidumbre tienen
diferentes unidades:
√
(18)
Dónde:
Incertidumbre relativa del método.
Incertidumbre relativa del método por reproducibilidad.
Incertidumbre relativa del método de la balanza.
Incertidumbre relativa del método de la micropipeta.
Balanza de Precisión
Micropipeta pH- metro
Calibración
Repetibilidad
Resolución
Tampón
Reproducibilidad
Temperatura
Repetibilidad
Resolución
Umétodo
Baño María
Repetibilid
ad Calibración
Deriva
Resolución
Calibración
Deriva
Excentricidad
44
Incertidumbre relativa del método del baño maría.
Incertidumbre relativa del método del pH metro.
Y para la matriz B no se toma el aporte del baño maría y la ecuación se define a continuación.
√
(19)
4.3.1. Cálculo de la incertidumbre estándar de la reproducibilidad.
Del cálculo 4.4 se obtiene que:
u = 0.0026 µg/l00g
Tabla 28. Incertidumbre por reproducibilidad.
Concentración, µg/l00g u,µg/l00g
0,218 0,0026 0,012
4.3.2. Cálculo de la incertidumbre estándar de la balanza de precisión.
Para calcular la incertidumbre estándar de la balanza se plantea la siguiente ecuación:
√
(20)
Dónde:
uBalanza = Incertidumbre estándar de la balanza.
urepetB = Incertidumbre estándar de la balanza por repetibilidad.
uresolB = Incertidumbre estándar de la balanza por resolución.
ucalibB = Incertidumbre estándar de la balanza por calibración.
uexcenB = Incertidumbre estándar de la balanza por excentricidad.
uderB = Incertidumbre estándar de la balanza por deriva.
- Incertidumbre estándar de la balanza por repetibilidad.
Para:
n=10
Sr =0.03 g
45
√ (21)
- Incertidumbre estándar de la balanza por resolución.
√ (22)
√
- Incertidumbre estándar de la balanza por calibración.
Para:
U= se obtiene del certificado de calibración de la balanza.
K= Factor de cobertura (generalmente k=2 corresponde a un nivel de confianza de 95,45%)
(23)
- Incertidumbre estándar de la balanza por excentricidad.
√ (24)
- Incertidumbre estándar de la balanza por deriva.
√ (25)
Dónde:
Cn = Corrección del certificado de calibración n, g
Cn-1 = Corrección del certificado de calibración n-1, g
√
46
Aplicado la ecuación 20 se tiene que:
√
Tabla 29. Incertidumbre relativa de la balanza.
Carga, g uBalanza, g
1000 0,23 2,37*10-4
4.3.3. Cálculo de la incertidumbre estándar de la micropipeta.
√
(26)
Dónde:
urepetM = Incertidumbre estándar de la micropipeta por repetibilidad.
uresolM = Incertidumbre estándar de la micropipeta por resolución.
ucalibM = Incertidumbre estándar de la micropipeta por calibración.
4.3.3.1. Incertidumbre estándar de la micropipeta por repetibilidad.
Para:
n=10
Sr =0.17 µL
√ (27)
4.3.3.2. Incertidumbre estándar de la micropipeta por resolución.
√ (28)
√
47
4.3.3.3. Incertidumbre estándar de la micropipeta por Calibración.
Para:
U= se obtiene del certificado de calibración de la micropipeta.
K= Factor de cobertura (generalmente k=2 corresponde a un nivel de confianza de 95,45%)
(29)
Aplicado la ecuación 26 se tiene que:
√
Tabla 30. Incertidumbre relativa de la micropipeta.
Volumen nominal, µL uMicropipeta, µL
0,25*103
0,58 2,32*10-3
4.3.4. Cálculo de la incertidumbre estándar del baño maría.
√
(30)
Donde:
urepetBM = Incertidumbre estándar del baño maría por repetibilidad.
uresolBM = Incertidumbre estándar del baño maría por resolución.
ucalibBM = Incertidumbre estándar del baño maría por calibración.
4.3.4.1. Incertidumbre estándar del baño maría por calibración.
Para:
U= se obtiene del certificado de calibración del baño maría.
48
k= Factor de cobertura (generalmente k=2 corresponde a un nivel de confianza de 95,45%)
(31)
4.3.4.2. Incertidumbre estándar del baño maría por deriva.
√ (32)
Dónde:
Cn = Corrección del certificado de calibración n, °C
Cn-1 = Corrección del certificado de calibración n-1, °C
√
Aplicado la ecuación 30 se tiene que:
√
°C
Tabla 31.Incertidumbre relativa del baño maría
Parámetro rango, °C uBaño maría, °C
90
0,72 8*10-3
4.3.5. Cálculo de la incertidumbre estándar del pH metro.
Se debe tomar en cuenta las contribuciones del error del pH metro.
Para lo cual se debe utilizar la siguiente ecuación:
(33)
49
Dónde:
Incertidumbre de la contribuciones del error en el pH metro.
Incertidumbre estándar del pH metro por calibración
Incertidumbre estándar del tampón.
Incertidumbre estándar del pH metro por resolución.
Incertidumbre debido a la influencia de la temperatura sobre el patrón
4.3.5.1. Incertidumbre estándar del pH –metro por repetibilidad.
Para:
n=4
x=tampón de pH 7
√
(34)
Dónde:
Desviacion estándar de repetibilidad para un tampón pH=7
Valor del tampón de referencia
Media aritmética de los valores de pH.
√
Para estimar la incertidumbre por repetibilidad se utiliza la siguiente ecuación:
n=4
√ (35)
Dónde:
Incertidumbre estándar por repetibilidad.
√
unidades de pH
50
4.3.5.2. Incertidumbre estándar del pH metro efecto tampón.
(36)
4.3.5.3. Incertidumbre estándar del pH metro por resolución.
√ (37)
√
unidades de pH
4.3.5.4. Incertidumbre debido a la influencia de la temperatura sobre el patrón.
√ (38)
√
unidades de pH
Aplicando la ecuación 33 se tiene que:
* unidades de pH
Tabla 32. Incertidumbre relativa del pH metro.
Magnitud x,
pH , unidades de pH
7 *
3,33*10-3
Aplicando la ecuación 18 se tiene que:
√
51
Aplicando la ecuación. 3 del numeral 2.3.2, se tiene:
k=2 corresponde a un nivel de confianza de 95,45%
52
5. RESULTADOS
5.1. Curvas estándar obtenidas en los dos kits según el programa RIDAWIN.
Figura 6. Curva estándar del kit uno.
Figura 7. Curva estándar del kit dos
53
5.2. Resultados de validación para la matriz A (Forma 1)
Tabla 33. Resultados de validación para la matriz A
Resultados Nivel bajo Nivel medio Nivel alto
Sr , μg/100g 0,0008 0,0019 0,0178
SR , μg/100g 0,001 0,0017 0,0241
CVr , % 0,44 0,90 2,07
CVR , % 0,55 0,80 2,81
%U, (K=2) 1,95 2,40 2,18
% Recuperación - - -
5.3. Resultados de validación para la matriz B (Forma 1)
Tabla 34. Resultados de validación para la matriz B
Resultados Nivel bajo Nivel medio Nivel alto
Sr , μg/100g 0,0494 0,0272 0,0324
SR , μg/100g 0,0427 0,0360 0,0408
CVr , % 8,75 3,31 2,58
CVR , % 7,56 4,38 3,24
%U, (K=2) 8,92 3,54 1,72
% Recuperación - - 91,70
54
5.4. Resultados de validación para la matriz A (Forma 2)
Tabla 35. Resultados de incertidumbre considerando todos los aportes para la
matriz A.
Nivel Bajo Medio Alto
Media general 0,185 0,218 0,859
Sr 0,001 0,002 0,024
urel.Rep 0,010 0,012 0,011
urel.Balanza 0,000 0,000 0,000
urel.Micropipeta 0,002 0,002 0,002
urel.BM 0,008 0,008 0,008
urel.pH metro 0,003 0,003 0,003
umétodo 0,013 0,015 0,014
%U, (K=2) 2,649 2,985 2,822
5.5. Resultados de validación para la matriz B (Forma 2)
Tabla 36. Resultados de incertidumbre considerando todos los aportes para la
matriz B.
Nivel Bajo Medio Alto
Media general 0,565 0,823 1,259
Sr 0,0427 0,036 0,0408
urel.Rep 0,045 0,018 0,009
urel.Balanza 0,000 0,000 0,000
urel.Micropipeta 0,002 0,002 0,002
urel.pH metro 0,003 0,003 0,003
umétodo 0,045 0,018 0,009
%U, (K=2) 8,954 3,635 1,899
55
5.6. Resultados del Rango de Trabajo y Límite de Cuantificación.
Tabla 37. Resultados de límite de cuantificación y rango de trabajo.
Parámetro Límite de
cuantificación Rango de Trabajo
Ácido Fólico
Fijado Obtenido Fijado Obtenido
0,16
μg/100g
0,19
μg/100g
(0,16-1,28)
μg/100g
(0,19-1,26)
μg/100g
5.7. Resultados de validación obtenidos en cuanto a precisión e incertidumbre.
Tabla 38. Resultados de precisión e incertidumbre.
Parámetro %CVr %CVR % U
Ácido
Fólico
Fijado Mayor
Obtenido Fijado
Mayor
Obtenido Fijado
Mayor
Obtenido
(Forma 1)
Mayor
Obtenido
(Forma 2)
10 8,75 10 7,56 20 5,03 8,95
56
6. DISCUSIÓN
- En la ejecución de las actividades para desarrollar el método de ensayo microbiológico se
obtuvieron valores de coeficientes de repetibilidad y reproducibilidad menores al 10 %; esta
condición porcentual fue impuesta en los objetivos de validación lo que nos permite deducir
que existe una buena precisión en la realización del ensayo.
- Para la exactitud se procedió a evaluarla mediante el porcentaje de recuperación, el mismo que
fue analizando en el nivel alto de la matriz B; este valor estuvo dentro del rango impuesto en
los objetivos de validación lo que hace confiable el ensayo.
- El límite de cuantificación se lo determinó en el primer nivel de la matriz A y se lo tomó como
el punto bajo del rango de validación. Esta determinación se la hizo siguiendo los criterios de la
guía EURACHEM.
- Las curvas estándar de cada kit fueron determinadas mediante la interpretación de los datos de
absorbancia leídos en el lector ELISA y analizados en el programa RIDAWIN; estas curvas
fueron ajustadas logarítmicamente y a partir de éstas se obtuvieron los resultados de todos los
niveles de concentración de cada matriz.
- La cantidad de pocillos de cada kit son un limitante debido a que solo permite la realización de
tres curvas estándar. Por consiguiente solo se puede realizar tres determinaciones. De las
curvas estándar obtenidas se eligió una de cada kit, las mismas que tenían una mayor
aceptación al compararlas con las curvas estándar de los certificados de los kits de prueba.
- La determinación de la incertidumbre se la realizó a partir de la reproducibilidad; este criterio
se lo aplicó debido a la metodología para la determinación de la incertidumbre utilizada por el
laboratorio en lo referente a métodos microbiológicos. Este criterio se justifica debido a que
todas las incertidumbres involucradas en la realización del ensayo están indirectamente
reflejadas en los resultados de reproducibilidad.
- Para la selectividad se determinó que los principales factores que influyen directamente en la
realización del ensayo son el pH, la dilución, el tiempo de incubación y la temperatura de
extracción de la muestra.
57
7. CONCLUSIONES
- Para la cuantificación del ácido fólico en muestras solidas se siguió una metodología
descrita en el inserto del kit VitaFast Folic Acid, el mismo que está sustentado en las
normas UNE-EN 14131:2003, AOAC INTERNACIONAL (Método 960.46; Método
2004.05).
- Las normas antes mencionadas permitieron el cumplimiento de los objetivos de validación
y por consiguiente la validación interna del método microbiológico, los resultados se
evidencian en las tablas 29, 39 ,31 y 32.
- Debido a que la incertidumbre fue determinada a partir de la reproducibilidad, ésta se
considera como la fuente principal de incertidumbre. Razón por la cual es necesario y
obligatorio seguir con cautela las actividades del procedimiento y siendo de vital
importancia que el personal tenga un conocimiento profundo del método de ensayo
microbiológico.
- Para el nivel bajo en la matriz B se obtuvo un alto valor de reproducibilidad, repetibilidad
e incertidumbre y en el nivel bajo de la matriz A se obtuvieron valores bajos de
reproducibilidad, repetibilidad e incertidumbre. Se concluye que estos parámetros
dependen del procedimiento de extracción de la muestra.
- El método de ensayo validado está listo para ser añadido al alcance de validación de
laboratorios LASA ante el organismo acreditador SAE.
- El rango validado está dentro del rango propuesto como objetivo de validación, siendo el
punto bajo tomado como el límite de cuantificación y el nivel alto tomado como referencia
para determinar el porcentaje de recuperación; el mismo que está cerca del límite inferior
del rango de recuperación propuesto.
- De los resultados obtenidos se puede afirmar que los equipos, materiales y las condiciones
ambientales son los aptos para el desarrollo del ensayo del método microbiológico.
58
- Para el análisis de las curvas estándar y la determinación de los niveles de concentración se
debe tener un conocimiento del manejo y ajuste del programa RIDAWIN, ya que la
obtención de resultados viables depende de su correcta utilización.
- Al realizar el cálculo de la incertidumbre considerando todos los aportes de esta. Se
concluye que existe un aumento del 25% en relación a la incertidumbre de método
calculada con respecto a la reproducibilidad.
59
8. RECOMENDACIONES
- Debido a que la validación es una actividad que requiere una continua verificación se
recomienda tener en cuenta la frecuencia en que se va realizar esta actividad, la misma que
permitirá detectar algún error en la realización del ensayo.
- Se recomienda seguir rigurosamente cada uno de los pasos que se establecen en el
procedimiento PEE-LASA-FQ-58 de los métodos validados, a fin de garantizar los
resultados obtenidos y fortalecer la confianza del resultado.
- Tener cuidado al momento de ajustar el pH debido a que la solución de la muestra está casi
en el pH requerido, para lo cual se recomienda añadir el hidróxido de sodio con una micro
pipeta.
- Para las muestras que se deben someter a calentamiento para su extracción se recomienda
la temperatura adecuada y la agitación en el tiempo requerido de la misma forma para el
medio de ácido fólico estándar.
- Es necesario que la medición de la absorbancia sea en un tiempo de incubación de 44 a 48
horas para poder obtener resultados con mayor fiabilidad, así como también la incubación
debe ser a una temperatura adecuada para el crecimiento de los microorganismos
Lactobacillus rhamnosus como es 38ºC.
- El analista debe estar correctamente entrenado en el uso del kit VitaFast Folic Acid, para la
preparación de la curva estándar y en el procedimiento de la extracción de la muestra. Esta
última depende del estado de la muestra en la cual se encuentre el ácido fólico añadido.
- Los equipos a utilizar deben ser calibrados en el tiempo que sea requerido por su respectivo
certificado de calibración para de esta manera obtener resultados más confiables.
- Es necesario el procedimiento de preparación de la curva estándar y las diluciones en un
área estéril; así como también las diluciones se deben realizar con el agua estéril que
provee el kit de análisis.
60
- Se encontró que el programa RIDAWIN no tiene la opción de exponer la curva estándar
inicial. Por lo que se recomienda integrar la función de ajuste polinomial al programa.
61
CITAS BIBLIOGRÁFICAS
[1] MELO, Virginia y CUAMATZI, Oscar. Bioquímica de los Procesos Metabólicos. Segunda
edición. Editorial Reverté, México, 2007. p338.
[2] Congreso Internacional Alimentación, nutrición y Dietética (5º, 2009, Murcia, España).
Folatos del Alimento a la Funcionalidad y a la Salud Óptima. Universidad de Murcia.
Murcia, 2009. pp. 10-11.
[3] Codeconutrilife [en línea]. [Fecha de consulta: 06 de Abril del 2015]. Disponible en:
<http://www.codeconutrilife.com/ingredientes-vitamina-b9>
[4] ROMERO Braquehais, Fernando. Estabilidad de vitaminas, vida comercial y
Bioaccesibilidad de Folatos – Hierro en Fórmulas Infantiles de Continuación y
Crecimiento. Tesis Doctoral. Doctor. Universidad de Murcia. Facultad de Veterinaria y
Ciencia y Tecnología de los Alimentos. Murcia. 2008. pp 45-46.
[5] AUCAY Fajardo, Elizabeth Cristina. Utilización de suero de mantequilla para elaboración
de kumis con diferentes niveles de leche en polvo (2%, 4%, 6%). Trabajo de Grado.
Ingeniero en Industrias Pecuarias. Escuela Superior Politécnica de Chimborazo. Escuela de
Ingeniería en Industrias Pecuarias. Riobamba. 2010. p 13.
[6] Universidad Nacional Abierta y a Distancia [en línea]. [Fecha de consulta: 15 de Abril del
2015]. Disponible en:
<http://datateca.unad.edu.co/contenidos/232016/contLinea/leccin_3_aspectos_importantes
_de_los_cereales.html >
[7] UTRILLA Coello, Rubí Guadalupe. Desarrollo de galletas con bajo contenido de
carbohidratos digeribles a partir de cereales integrales y plátano en estado inmaduro. Tesis
Doctoral. Doctor en Ciencias. Instituto Politécnico Nacional. Centro de Desarrollo de
Productos Bióticos. Yautepec. 2012. p 48.
62
[8] ORGANIZACIÓN PANAMERICANA DE LA SALUD. Manual de Mantenimiento para
Equipo de Laboratorio. Editorial Nuevo Arte, Washington D. C., 2005.pp. 15-16.
[9] ISO/IEC 17025:2005 Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de
ensayo y de calibración, Segunda edición, Secretaría Central de ISO. Suiza. 2008. p 14.
[10] GUÍA PARA LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS. Organismo
Argentino de Acreditación. Buenos Aires. 2013. p14.
[11] SUÁREZ Guevara, María Josefina. Validación de Métodos Analíticos para la
Determinación de Hierro, Sulfatos, Turbiedad, Dureza Total y Cálcica en Muestras de
Aguas Claras y Residuales. Tesis de grado. Ingeniera Química. Escuela Politécnica
Nacional. Facultad de Ingeniería Química y Agroindustria. Quito.2012. p10.
[12] ISO/IEC 17025:2005, Op. Cit., p. 15
[13] GUÍA PARA LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS, Op Cit., p.5
[14] DUFFAU, Op. Cit., p. 50
63
BIBLIOGRAFIA
AOAC Oficial Method 944.12 Folic Acid (Pteroylglutamic Acid) in Vitamin Preparations. First
Edition. www.aoacofficialmethod.org.1960.45.2.03
AOAC Oficial Method 992.05 Total Folate(Pteroylglutamic Acid) in Infant Formula . First
Edition. www.aoacofficialmethod.org.1995. 50.1.02
CAMARO Sala, María Luisa “et al”. Validación y verificación analítica de los métodos
microbiológicos. Procedimientos en Microbiología Clínica, 2013
Congreso Virtual Iberoamericano sobre Gestión de Calidad en Laboratorios (3°, 2005 Madrid
España). Situación de la validación de los ensayos microbiológicos en los laboratorios.
INTERNET. 2005. 7p.
EURACHEM. Cuantificación de la Incertidumbre en Mediciones Analíticas [en línea]. México:
Centro Nacional de Metrología. 2000 [Fecha de consulta: 15 Mayo 2015]. Disponible en:
<http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Calculo_Incertidumbres_Mediciones_Analiticas_
25390.pdf>.
EURACHEM. Métodos Analíticos adecuados a su propósito [en línea]. México: Centro
Nacional de Metrología. 2005 [Fecha de consulta: 15 Mayo 2015]. Disponible en:
<http://www.fbioyf.unr.edu.ar/evirtual/pluginfile.php/119370/mod_resource/content/1/Eurache
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GRIMALDOS, Rafael Bolívar. Leche el polvo. [en línea]. 2011[Fecha de consulta: 10 de Abril
del 2015]. Disponible en: <http://www.monografias.com/trabajos102/leche-polvo/leche-
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ISO/TS 19036:2006 (E) Microbiology of food and animal feeding stuffs-Guidelines for the
estimation of measurement uncertainty for quantitative determinations, First edition, Secretaría
Central de ISO. Suiza. 2006. 17 p
64
ROMERO Braquehais, Fernando. Estabilidad de vitaminas, vida comercial y Bioaccesibilidad
de Folatos – Hierro en Fórmulas Infantiles de Continuación y Crecimiento. Tesis Doctoral.
Doctor. Universidad de Murcia. Facultad de Veterinaria y Ciencia y Tecnología de los
Alimentos. Murcia. 2008. 226 p.
UNE-EN 14131:2003 Productos alimenticios. Determinación de folatos mediante análisis
microbiológico. España. 2004. 19p.
VARELA Moreiras, Gregorio y ALONSO Aperte, Elena. Ácido Fólico y Salud. Editorial
F.E.N., Madrid, 1999. 40 p.
65
ANEXOS
66
ANEXO A. DECLARACIÓN DEL MÉTODO VALIDADO
A.1. REPORTE PARA LA MATRIZ A
HOJA DE VALIDACIÓN
Nº VAL
01
Método analítico: PEE-LASA-FQ-01
CUANTITATIVO √
CUALITATIVO
DE IDENTIFICACIÓN
Analito: Ácido Fólico (Vitamina B9)
Unidades: μg/100g
Matriz: Galleta de cereales.
Repetibilidad Reproducibilidad Exactitud %U
(K=2) Nivel:
μg /l00g %CVr %CVR %recup.
0,19 0,44 0,55 - 1,95
0,22 0,90 0,80 - 2,40
0,86 2,07 2,81 - 2,18
LÍMITE DE DETECCIÓN (L.D.) -
LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN (L.C.) 0,19 μg/100g
SELECTIVIDAD / ESPECIFIDAD
INTERFERENCIAS CONOCIDAS: pH, Disolución, Temperatura de calentamiento, Tiempo de Incubación.
CORRECCIÓN: EVITAR LAS BURBUJAS DE AIRE EN EL POCILLO.
INTERVALO DE TRABAJO VALIDADO: 0,19 - 1,26 μg/100g
CRITERIOS DE ACEPTACIÓN / RECHAZO: El método cumple para las matrices previstas y satisface los objetivos planteados.
DIRECTOR TÉCNICO
Firma.: Fecha: 2015-09-21
67
A.2. REPORTE PARA LA MATRIZ B
HOJA DE VALIDACIÓN
Nº VAL
01
Método analítico: PEE-LASA-FQ-01
CUANTITATIVO √
CUALITATIVO
DE IDENTIFICACIÓN
Analito: Ácido Fólico (Vitamina B9)
Unidades: μg/100g
Matriz: Leche en polvo.
Repetibilidad Reproducibilidad Exactitud %U
(K=2) Nivel:
μg /l00g %CVr %CVR %recup.
0,57 8,75 7,56 - 8,92
0,82 3,31 4,38 - 3,54
1,26 2,58 3,24 91,70 1,72
LÍMITE DE DETECCIÓN (L.D.) -
LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN (L.C.) 0,19 μg/100g
SELECTIVIDAD / ESPECIFIDAD
INTERFERENCIAS CONOCIDAS: pH, Disolución, Temperatura de calentamiento, Tiempo de Incubación.
CORRECCIÓN: EVITAR LAS BURBUJAS DE AIRE EN EL POCILLO.
INTERVALO DE TRABAJO VALIDADO: 0,19 - 1,26 μg/100g
CRITERIOS DE ACEPTACIÓN / RECHAZO: El método cumple para las matrices previstas y satisface los objetivos planteados.
DIRECTOR TÉCNICO
Firma.: Fecha: 2015-09-21
68
ANEXO B. CURVAS ESTÁNDAR DE LOS KITS “QUALITY ASSURANCE
CERTIFICATE”
Figura B. 1. Certificado de la curva estándar del kit uno.
69
ANEXO C.
Figura B. 2. Certificado de la curva estándar del kit dos.
70
ANEXO C. CURVAS ESTÁNDAR OBTENIDAS EN LOS DOS KITS SEGÚN EXCEL
Figura C. 2. Curva estándar en excel del kit uno.
Figura C. 2. Curva estándar en excel del kit uno.
Y = 0,2087ln(X) + 0,5664 R² = 0,9908
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4
Ab
sorb
anci
a
Concentración, μg/100g
Curva Estándar del Kit 1
Y = 0,33ln(X) + 1,0894 R² = 0,966
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4
Ab
sorb
anci
a
Curva Estándar del Kit 2
Concentración, µg/100g
