Un sistema de fitorremediacin multiproceso persistente para la descontaminacin de hidrocarburos totales de petrleo (TPHs) de los suelosXiao-Dong Huang, Yousef El-Alawi, Jolanta Gurska, Bernard R. Glick, Bruce M. GreenbergTResumenMltiples tcnicas que afectan a distintos aspectos de la remocin de contaminantes pueden mejorar la remocin de hidrocarburos persistentes de los suelos. Hemos desarrollado un sistema de fitorremediacin multiproceso (MPPS) que se compone de landfarming (aireacin y exposicin a la luz), bacterias degradadoras de contaminantes, rizobacterias promotoras del crecimiento de las plantas (PGPR), y el crecimiento de plantas resistentes a los contaminantes, Festuca alta (Festuca arundinacea). En este estudio, el MPPS fue aplicado a los suelos contaminados adquiridos de las tierras de cultivo de la Imperial Oil en Sarnia,Ontario, Cnada. Este suelo fue contaminado con lodos formados de la refinera de petrleo a un nivel de aproximadamente 5% (p/p) hidrocarburos totales de petrleo ( TPHs). En un primer perodo de 4 meses, la eficiencia media de extraccin de los persistentes TPHs por el MPPS es el doble que el del land-farming por s solo , un 50% ms que la biorremediacin por s sola, y el 45% ms que la fitorremediacin sola. De forma importante removi 2,3 y 4 fracciones de petrleo con igual eficacia. Por lo tanto, las altamente hidrofbicas fracciones recalcitrantes de THP fueron remediadas del suelo con el MPPS. Despus de un segundo perodo de 4 meses, el MPPS remueve 90% de todas las fracciones de TPHs del suelo. La fitorremediacin sola fue capaz de extraer tan slo alrededor del 50% de TPHs en el mismo perodo de tiempo. Los elementos clave para el xito de la fitorremediacin fueron el uso de especies vegetales que pueden proliferar en presencia de altos niveles de contaminantes, y cepas de PGPR que incrementan la tolerancia de la planta y aceleran el crecimiento de las plantas en los suelos altamente contaminados.Palabras claves: Fitorremediacin, Rizobacteria promotora del crecimiento de las plantas, Biorremediacin, Bacteria degradante de TPH.

Introduccin Los Hidrocarburos totales de petrleo (TPHs) son uno de los grupos ms comunes de contaminantes orgnicos persistentes en el medio ambiente y son conocidos por ser txicos para muchos organismos. Hay muchas fuentes de contaminacin por hidrocarburos en suelos incluyendo extraccin de petrleo, transporte, refinacin y consumo [1,2]. Remediar de suelos los TPHs persistentes es en general un proceso lento y costoso. Esto es particularmente cierto para la porcin de THPs ms recalcitrante. Por ejemplo, el alto peso molecular las fracciones derivadas de lodos de la refinera de petrleo hace que sean excepcionalmente difcil de remediar [1,2].Para que un proceso de remediacin sea efectivo, la tasa global de remocin y degradacin de TPH necesita ser acelerado por encima de la mecnica disponible actualmente y de los procesos microbianos. Recientemente hemos desarrollado un sistema de fitorremediacin multiproceso (MPPS) [3]. Se basa en la combinacin de mecnica, microorganismos y el proceso de crecimiento de las plantas para incrementar la acumulacin de biomasa, en particular las races de las plantas en el suelo, y por lo tanto, acelerar la cintica de remediacin. Los procesos utilizados son el landfarming, la inoculacin con bacterias degradantes de contaminantes y el crecimiento de las plantas con rizobacterias que promueven a la vez su crecimiento (PGR). El MPPS se plante para aumentar la tasa general de remediacin de HAP( Hidrocarburo aromtico policiclco) en suelos contaminados con creosota [3,4 ].La combinacin de varias tcnicas de remediacin de contaminantes persistentes pueden superar muchas de las limitaciones que existen para las distintas tecnologas. Por ejemplo, para la fitorremediacin, muchas especies de plantas son muy sensibles a los contaminantes, incluyendo TPHs [3- 5]. Por lo tanto, las plantas no crecen o crecen lentamente en suelos contaminados. Si el crecimiento es lento, las plantas no producen suficiente biomasa para lograr tasas significativas de remediacin. Adems, en la mayora de los suelos contaminados, ha decado la actividad de la poblacin de microorganismos por lo que tampoco hay suficientes bacterias para facilitar la degradacin de contaminantes o para promover el crecimiento de las plantas [6- 9].Para la remediacin prctica y efectiva de una gran variedad de contaminantes ambientales, es conveniente usar varias tcnicas o procedimientos para acelerar la cintica de remediacin y aumentar el crecimiento de las plantas y la biomasa microbiana [4-6, 9, 10]. En el MPPS que hemos desarrollado recientemente, el uso de rizobacterias que promueven el crecimiento de la planta (PGPR) y bacterias degradantes de contaminantes especficos, ambos, han sido de vital importancia para hallar una remediacin exitosa [3, 5, 6, 9, 11, 12]. Para los contaminantes orgnicos, el uso de bacterias como pretratamiento que consumen materia orgnica en el suelo puede promover el proceso de remediacin [13,14]. Diversas bacterias son capaces de metabolizar rpidamente algunos compuestos que estn fcilmente disponibles. Esto incluye bacterias que consumen TPH y que se han utilizado en los suelos [4, 9, 11]. De este modo se iniciar el proceso de remediacin y puede bajar el nivel de toxicidad por TPH en las plantas cuando se utiliza antes de la fitorremediacin [4, 9, 11]. Adems, hay bacterias llamadas rizobacterias que promueven el crecimiento de las plantas (PGPR) que aumentan la tolerancia de la planta a TPHs y otras tensiones. Ellas promueven el enrgico crecimiento de las plantas, dando lugar a una ms rpida y masiva acumulacin de biomasa [7, 10]. Su trabajo es prevenir el estrs por la sntesis de etileno y abastecer a las races de auxinas [15]. El resultado es mayor cantidad de biomasa (especialmente en las races) y por lo tanto una remediacin ms rpida [15,16].En un estudio anterior con el MPPS, hemos realizado una serie de experimentos de laboratorio para determinar la eficacia del sistema de descontaminacin en el suelo de pas de creosota [ 3]. El sistema se compone de landfarming, la inoculacin de bacterias degradantes, y el crecimiento de las plantas con PGPR. En un perodo de 4 meses, el MPPS ha retirado un 50% ms de los HAP suelo que cualquiera de los procesos simples solos. Para poner a prueba la eficacia del sistema, en este estudio, hemos llevado a cabo experimentos de remediacin con un suelo maduro que proviene de un ambiente contaminado. El suelo es proviene de tierra agrcola de la Imperial Oil en Sarnia, Ontario, Canad. En la realidad los suelos maduros y de ambientes contaminados se comportan de manera diferente que los suelos enriquecidos, en el laboratorio con respecto a la remediacin. Los resultados obtenidos aqu deben ser un mejor predictor de la forma en que el MPPS se ejecutar en el mbito como los trabajos previos con suelos enriquecidos. Encontramos que el MPPS fue ms eficaz que cualquier de los procesos individuales de extraccin de TPHs en el suelo. En particular, el MPPS fue eficaz en remediar las fracciones de TPHs ms recalcitrantes y con peso molecular alto. Adems, las tasas de remediacin de los suelos agrcolas fue a la par de los suelos ricos en creosota.2. Materiales y mtodos2.1. Preparacin de bacterias degradadoras de contaminantesLas bacterias degradantes de contaminantes utilizadas en estos experimentos fueron aisladas de lodos de petrleo y obtenidas del Dr. Owen Ward, Departamento de Biologa, Universidad de Waterloo. Las cepas de bacterias en la mezcla fueron identificadas mediante anlisis de cidos grasos (Identificacin Microbiana Inc. , Newark, DE, USA). El cultivo contiene tres cepas de bacterias: Pseudomonas putida, Flavobacterium sp., y Pseudomonas aeruginosa. Las bacterias fueron incubadas y crecieron en medio de enriquecimiento, con agitacin, durante 4 semanas a temperatura ambiente en la oscuridad. El medio de enriquecimiento se compone de sedimentos de petrleo (50 mg/ L) y sales basales (500 mg/L K2HPO4, 500 mg/L NaNO3, 200 mg/L MgSO4*7H2O, 100 mg/L FeSO4*7H2O). Las bacterias fueron transferidas a 150 ml de medio de cultivo compuesto de caldo soya (DIFCO Laboratories, Inc. , Detroit, MI, EE.UU) y 0,1 % de lodo. Las bacterias fueron cultivadas a temperatura ambiente durante 10 das y luego el cultivo fue diluido con agua destilada a una absorcin de 0,5 a 600 nm para la rehabilitacin los experimentos.2.2. Preparacin de PGPRDos cepas de PGPR, Enterobactor cloacae UW4 y E. cloacae CAL2, fueron utilizadas en el sistema de fitorremediacin para promover el crecimiento de la planta e incremetar la tolerancia de la planta a los contaminantes [7, 10, 17]. Estas cepas producen cido indoleactico (una auxina), sidersforos y cido 1-aminociclopropano-1-carboxlico (ACC) desaminasa (que consume el precursor de etileno). Estos factores contribuyen a la capacidad de la bacteria para promover crecimiento de la planta [ 15]. Las bacterias se cultivaron en caldo trptico de soya a temperatura ambiente durante 2 das hasta que llegaron a una absorcin de 1,0 a 600 nm. Las semillas de las plantas que se utilizan para la fitorrremediacin fueron incubadas en la suspensin de estas bacterias en agua destilada (absorbancia de 0,5 a 600 nm) durante 2 h y luego secadas al aire antes de la siembra [ 5].2.3. Remediacin del sueloTodos los experimentos se llevaron a cabo en el invernadero del Departamento de Biologa de la Universidad de Waterloo a partir del 1 de abril hasta el 30 de noviembre de 2003. La iluminacin para el crecimiento de las plantas fue luz natural (luz solar) con un ciclo de luz-oscuridad de aproximadamente 16 h/8 h. La temperatura en el invernadero fue de 25C. Las macetas (39 L 26 A 15 P cm) usadas en el experimento contena cada una 12 Kg de suelo (1.2 Kg/L de suelo secado al aire). Todas las macetas se regaron da por medio (o cuando fue necesario ) con suficiente cantidad de agua del grifo (aproximadamente 1 L) para mantener la humedad en el suelo para el crecimiento de la planta. El suelo fue suministrado por Imperial Oil, Sarnia, Ontario, Canad. Este suelo deteriorado provena de tierras de cultivo las cuales contenan 50g/Kg de sedimentos de refinera de petrleo. La referencia del suelo se recogi a partir de una granja cercana. Para remediar los TPHs del suelo , cada uno de los mtodos que se describen a continuacin fue probado por separado y en combinacin con el MPPS. Todos los experimentos se realizaron por triplicado. El diseo experimental incluye tres repeticiones de cada tratamiento y tres muestras para anlisis de cada replica.2.3.1. Land-farmingEl land-farming se realiz mezclando el suelo a mano con una azada de jardinera. Los suelos fueron removidos dos veces a la semana para exponer una nueva capa de suelo a la luz y el aire. El suelo fue regado dos veces a la semana para mantener la humedad. Todo el experimento se llev a cabo en el invernadero por 2 temporadas de crecimiento (120 das/ao).2.3.2. BiorremediacinUn cultivo bacteriano degradante de contaminantes, con una absorcin de 0,5 a 600 nm, cultivado como en el caso anterior, fue rociado en el suelo a 10 ml/Kg de suelo. El suelo fue mezclado para establecer el contacto de las bacterias con el suelo. El suelo se ha diluido en 400 ml/kg de suelo en un estado de saturacin, y, posteriormente, el suelo se deben regar dos veces a la semana (o cuando sea necesario ). Este experimento se ejecute dos veces seguidas para 120 das cada vez.2.3.3. FitorremediacinUna especie de hierba, Festuca alta (Festuca arundinacea) (Ontario Semillas, Waterloo, ON, Canad) fue seleccionada para la fitorremediacin. Esta especie se ha utilizado anteriormente para la fitorremediacin y se muestra para ser ms tolerante a los HAP que otras especies [ 12]. Diez gramos de semillas de la planta fueron plantados en cada maceta, y la tierra fue regada con 400 ml de agua por kilo de suelo hasta saturacin. Las macetas se colocan en el invernadero y las plantas crecieron por 120 das. Despus de 120 das, el suelo era reforestado, las plantas fueron cultivadas por un plazo adicional de 120 das. Durante el perodo de crecimiento, las plantas fueron regadas cada da ( o cuando fue necesario).2.3.4. Sistema de Fitorremediacin Multi-procesoLos citados tres procedimientos (es decir, land-farming, la biorremediacin y la fitorremediacin) se combinaron en un MPPS. Las semillas fueron esterilizadas por lavado con leja 2% durante 20 min, seguido por varios lavados con agua destilada. Dos cepas PGPR (E. cloacae UW4 y CAL 2) a continuacin, se aplicaron directamente a las semillas de la planta por remojo de estas durante 2 h en una solucin bacteriana con una absorbancia de 0,5 a 600 nm [ 5]. Cada paso se llev a cabo en forma sucesiva en el invernadero de la siguiente manera. Paso 1: Land-farming dos veces a la semana durante 2 semanas. Paso 2: inoculacin del suelo con bacterias contaminantes degradantes (0,5 DO a 600 nm) a 10 ml/l suelo seguida por incubacin durante 5 das. Paso 3: plantacin de semillas tratadas con PGPR. A las plantas se dejaron crecer durante 100 das. Este experimento tuvo una duracin de 120 das y, a continuacin, repite en el mismo suelo. Se tomaron muestras de suelo y plantas en los das 0, 30, 60, 90, y 120 y se analizaron para TPHs (ver ms adelante).2.4 . Extraccin y anlisis de TPHEl nivel de TPH en el suelo se determin mediante el ensayo de hidrocarburos totales. Las muestras de suelo (aproximadamente 20 g) de la experimentacin con fitorremediacin fueron recogidos a los 0, 30 , 60, 90 y 120 das despus del inicio de los experimentos y fueron almacenados a 4C hasta su anlisis. El tiempo de almacenamiento de las muestras recogidas ya no era de 30 das y el almacenamiento no tuvo efectos en los niveles de TPH en suelo (datos no mostrados). Las muestras se dividieron en dos partes para su anlisis. Una de ellas fue enviada a Phillip Service, Mississauga, ON, para anlisis de fraccionamiento. La otra fue analizada de la siguiente manera. Las muestras de suelo se secaron al aire a temperatura ambiente en la oscuridad . El suelo secado al aire (4 g) se extrajo dos veces para ultra-sonicacin durante 20 minutos en 20 ml de hexano/ acetona (1:1 v:v) [ 18]. Los extractos se concentran bajo una corriente de gas de nitrgeno para permitir que el disolvente se evapore por completo y, a continuacin, la cantidad de lodo extrado fue determinado por gravimetra.2.5. Test de toxicidad en el sueloCien gramos de suelo tratado por los diferentes mtodos de remediacin se coloca en jarras de 100 ml. Treinta mililitros (ml) de agua se aade a las jarras y se incuban toda la noche. Diez Collembolas (Onychiurus folsomi) (6 das de edad) se colocan en cada jarra y los frascos son cubiertas con papel de aluminio . Los frascos que contienen los animales fueron colocados en una cmara a una temperatura controlada de 23C y se incubaron por 5 das, con un bombillo fro flourescente blanco de 20-W. El nmero de animales sobrevivientes se cuenta manualmente al final del 5 da- del perodo de incubacin [ 19]3. Resultados3.1. La efectividad del sistema de fitorremediacn multiproceso para remover TPHs de el sueloPara probar la eficacia del sistema de fitorremediacin multi-proceso para la extraccin de TPHs en suelos contaminados, se condujo un experimento con el objeto de comparar los distintos mtodos de remediacin, i. e., land-farming, remediacin microbiana , fitocorremediacin ( -PGPR) y el MPPS. Los resultados mostraron que los tres mtodos probados (land-farming, la biorremediacin y la fitorremediacin) fueron capaces de extraer alrededor del 25% del total de TPHs de los suelos contaminados (Fig. 1). La extraccin de TPHs por todos los tres mtodos juntos fue estadsticamente significativa en comparada con el tratamiento de suelos contaminados. Sin embargo, las diferencias en la remocin de TPH no fueron estadsticamente significativas entre los tres mtodos individuales. Esto indica que todos los tres mtodos son capaces de una modesta remocin de TPHs del suelo (Fig. 1). La examinacin del material de TPH extrado por el MPPS revel que el nivel TPH en los suelos se reduj de 50 a 23 g/kg (> 50% extraccin) en un estudio en el cuarto mes de la temporada de crecimiento (Fig. 1). Por lo tanto, el MPPS fue capaz de extraer ms del doble de TPHs del suelo que cualquiera de los mtodos individuales.Despus del primer perodo de 4 meses, los suelos tratados por los mtodos anteriores fueron tratados de la misma manera para un segundo perodo de 4 meses. El land-farming no arroj mucha ms extraccin (10%) de TPHs del suelo (Fig. 1). La efectividad de la biorremediacin fue mucho mejor que la del landfarming en la segunda temporada, con la eliminacin de slo un 20% adicional de los TPHs en el segundo perodo de 4 meses . Comparada con el land-farming y la biorremediacin, la fitorremediacin, i.e. , es decir, el crecimiento de la planta por s sola, es capaz de extraer ms TPHs (30%) de el suelo (Fig. 1). En un periodo de 8 meses , la fitorremediacin sola haba removido casi el 55% de los TPHs del suelo (de 50 a 22 g/kg). En contraste, el MPPS fue mucho ms eficaz que cualquiera de los distintos mtodos de extraccin de TPHs del suelo . En el segundo perodo de 4 meses, el MPPS ha eliminado un 40% adicional de la cantidad original de TPHs del suelo. Por lo tanto, en un periodo de 8 meses, el MPPS haba retirado aproximadamente el 90% de los TPHs del suelo ( Fig. 1).3.2. La efectividad del sistema de fitorremediacn multiproceso para remover diferentes fracciones de TPHs Las fracciones 3A (C16-23), 3B (C23-34) y 4 (C34-50) de TPHs son los contaminantes ms recalcitrantes en el suelo. Las molculas de estas fracciones son de alto peso molecular e hidrofbicas. Por lo tanto, ellas son resistentes a la remediacin. Encontramos que el land-farming por s solo solo es eficaz para remover las fracciones 2 (C10-16) y 3A, y fue completamente ineficaz para eliminar las fracciones 3B y 4 (Fig. 2). La fitorremediacin fue ligeramente ms eficaz que el land-farming, pero el proceso de remediacin fue lento (Fig. 2). Sin embargo, en comparacin con el land-farming y la fitorremediacin, el MPPS fue mucho ms eficaz en la eliminacin de todas las fracciones de TPHs del suelo. Despus de ambos, 4 meses y 8 meses, el MPPS ha disminuido notablemente los componentes de las fracciones 3A, 3B y 4 con aproximadamente la misma eficacia. Cada una de ellas se ha disminuido en un 90 %, lo que es compatible con los niveles de la remediacin total de TPH (Figs. 1 Y 2). Hay que tener en cuenta tambin, que ms del 50% de los contaminantes eran mayores que la fraccin 4(>C50). El balance de masa basado en los datos de fraccionamiento implica que del 80- 90% de C>50 tambin ha sido removido.

Fig.2. Eliminacin de fraccin TPH por el MPPS y mtodos convencionales. Datos generados del anlisis de TPH de las muestras de suelo recolectadas despus de 120 (arriba) y 240 (abajo) das de remediacin. Las barras de error son errores estndar (n=3). Etiquetas (a) y (b) indican diferencias estadsticamente significativas de los suelos contaminados no tratados y el MPPS, respectivamente (P