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Universidad Autónoma de Durango

MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGIA

LICENCIATURA EN NUTRICION

PROFESOR: MC. MIGUEL ANGEL SANCHEZ RODRIGUEZ

1

REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

1. PARA INGRESAR AL LABORATORIO:

a) Deberá portar bata blanca larga.

b) Manual de prácticas de microbiología.

c) Deberá traer guantes de látex estériles, cofia y cubrebocas.

d) Presentación personal de acuerdo a los reglamentos de la Universidad.

e) Solamente entrarán al laboratorio los alumnos que tengan práctica (no se permiten visitas

en horas de prácticas).

2. DENTRO DE LOS LABORATORIOS:

a) No se permite fumar ni tomar alimentos.

b) No sentarse en las mesas de trabajo.

c) Solamente se saldrá del laboratorio cuando todo el grupo correspondiente termine su

trabajo y tenga firmada su práctica.

3. RECOMENDACIONES:

a) Reporte inmediatamente a su profesor cualquier daño personal por leve que sea.

b) Cuide de no contaminar los reactivos de trabajo.

c) No sacuda las pipetas.

d) Si utiliza ácido o álcalis fuertes, es mejor no pipetear directamente.

e) Mantenga siempre limpio su material de trabajo.

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PRÁCTICA No. 1 LAVADO Y ESTERILIZACIÓN DE MATERIAL DE LABORATORIO

INTRODUCCIÓN:

3

OBJETIVOS: Conocer el tipo de material requerido para llevar a cabo las prácticas del laboratorio así

como las diversas técnicas y aparatos utilizados para la esterilización del mismo.

MATERIAL: Horno de esterilización

Olla de presión

Cajas Petri

Pipetas graduadas de 1, 2, 5 y 10 mL

Portapipetero de metal

Matraces Erlenmeyer

Papel de envoltura (estraza)

Agua destilada

Papel aluminio, Masking Tape (sencillo y testigo), Algodón

Material de seguridad (guantes, cubrebocas, cofia y bata)

PROCEDIMIENTO:

LIMPIEZA

1. Lavar el material con agua y jabón.

2. Enjuagar con abundante agua de la llave.

3. Enjuagar con agua destilada y escurrir.

4. Secar el material utilizando papel absorbente para acelerar el secado.

Nota1: Si el material no se limpia bien, hay que enjuagarlo con mezcla crómica y continuar

con el paso 3.

4

Mezcla cómica: Disolver 20 ml de ácido sulfúrico concentrado en un poco de agua destilada

lentamente, adicionar 20 g de dicromato de potasio y finalmente aforar a 250 ml con agua

destilada.

EMPACADO DEL MATERIAL PARA ESTERILIZACIÓN POR CALOR HUMEDO

Una vez seco el material empaque de la siguiente manera:

CAJAS DE PETRI:

Corta el papel estraza, en forma de rectángulos adecuados para la cantidad de 2 a 3 cajas.

Colócalas en la parte central y Envuélvelas según te indique tu profesor. Se toman los

extremos de Papel y se unen, se hace un nuevo doblez recargando ligeramente en la caja

para marcarlo. Los extremos se doblan en forma triangular. Ya en forma triangular se

doblan hacia atrás quedando listas para esterilizar.

PIPETAS:

Introduce una pequeña porción de algodón en el cuello de la pipeta, procurando que quede

lo suficientemente apretada. Con tiras de papel en forma de rectángulo del tamaño de la

pipeta envuélvelas, comenzando por la punta y en forma de espiral gira hacia arriba hasta el

final de la pipeta.

MATRACES.

Tapa el cuello del matraz con algodón, lo suficientemente apretado para evitar que se

destape. Como protección coloca un gorrito de papel estraza y átalo con cinta.

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EMPACADO DEL MATERIAL PARA ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO

El material es empacado de la misma forma que el material empacado para esterilización

por calor húmedo, a diferencia que en lugar de papel estraza, se usará papel aluminio, en

tanto que el algodón no será usado.

Nota 1: Las pipetas de vidrio pueden ser metidas a esterilizar en el portapipetero de metal

sin ningún tipo de envoltura.

Nota 2: Coloque cinta testigo en algunos materiales empacados para asegurase de la

esterilización.

Nota 3: En cuanto al material como lo son las asas de platino no es necesario empacarlo

para su esterilización, ya que se pueden hacer directamente con el mechero Bunsen antes

de su utilización

ESTERILIZACIÓN POR CALOR HUMEDO

Una vez listo el material para su esterilización por calor húmedo, proseguir de la siguiente

forma.

1. Coloca el agua necesaria en la olla de presión hasta la marca e introduce el material a

esterilizar, evitando que el material toque las paredes.

2. Cierra la autoclave, cuidando de dejar abierta la válvula de salida de vapor que ayudará a

expulsar el aire contenido dentro y que éste es desplazado por el vapor que se produce.

3. Cierra la válvula cuando el vapor sea continuo. La temperatura de 105ºC indica que está

libre de aire. Vigila el termómetro. Cuando vaya en 120ºC, mantenla durante 15 minutos

para que se efectúe la esterilización (15 libras de presión). Transcurrido este tiempo se

corta la fuente de calor.

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4. Deja enfriar hasta que el manómetro marque cero. Abre la válvula de salida de vapor,

para expulsar el vapor restante. Abre la olla de presión y retira el material.

5. Si el material no está en estado líquido la válvula se puede abrir rápido a la salida de

vapor, pero si está en estado líquido la rápida pérdida de presión las hace hervir o bien

saltar los tapones. Por lo tanto se espera unos minutos a que se enfríe perfectamente.

ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO

Una vez listo el material para su esterilización por calor seco, proseguir de la siguiente

forma.

1. El material a esterilizar se deberá colocaren la estufa con esta fría, teniendo en cuenta

las siguientes recomendaciones: Cada unidad deberá quedar separada de las vecinas

Los materiales no deberán estar en contacto con las paredes, piso y techo del

esterilizador

La carga del esterilizador será homogénea y no deberá superar el 80% de la capacidad

total de la cámara.

2. Encender el Esterilizador, Verificar que los instrumentos de control de temperatura

(170ºC) se encuentren en la posición correcta.

3. Cuando se alcance la temperatura de 170ºC, se comenzará a contar el tiempo de

esterilización (1 hora). Cumplido el tiempo de exposición se apagará el Esterilizador

La descarga del Esterilizador se efectuará una vez que el material se haya enfriado.

4. Durante el ciclo de Esterilización no deberá abrirse la puerta del Esterilizador porque ello

implicaría abortar el ciclo, debiendo en este caso recomenzarlo, además de que el

cambio de temperatura rompería la cristalería.

Nota: Si la esterilización se realiza a 160ºC se tomara 2 horas como tiempo de esterilización.

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OBSERVACIONES:

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Dibuja a manera de diagrama el procedimiento que empleaste para el lavado y secado del

material de laboratorio.

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Dibuja los diferentes materiales y equipos que se usan en microbiología:

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CUESTIONARIO:

1. ¿Que finalidad tiene el lavar el material que se empleará en la realización de prácticas de

microbiología?

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2. ¿Que proceso de limpieza empleaste en esta práctica para eliminar los microorganismos

presente en el material muy sucio o contaminado?

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3. ¿Que diferencia existe entre el lavado del material y la esterilización de este?

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4. ¿Porque es importante dejar abierta la válvula de salida de vapor en la olla de presión que

ayudará a expulsar el aire contenido?

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6. ¿Porque se recomienda que la temperatura de esterilización por calor seco sea de 170ºC

por 1 hora?

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CONCLUSIONES:

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BIBLIOGRAFÍA:

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PRACTICA No. 2 CUENTA DE BACTERIAS AEROBIAS EN PLACA

(MESOFILOS AEROBIOS)

INTRODUCCIÓN:

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OBJETIVO:

Estimar la cantidad de microorganismos viables presentes en un alimento, por la cuenta de

colonias en un medio sólido, incubado aeróbicamente.

MATERIAL Y EQUIPO:

Equipo:

Incubadora capaz de mantener una temperatura entre 35 ± 2 °C

Olla de presión con manómetro.

Balanza analítica, con sensibilidad de ± 0.01 g.

Contador de colonias.

Plancha de agitación.

Material:

Encendedor

2 Mecheros Bunsen

Agitador magnético

Papel estraza,

Papel aluminio

Algodón

Cinta Masking

Cinta testigo.

Pinzas de crisol

1 Matraz Erlenmeyer de 500 mL.

Material de seguridad (Bata, guantes estériles, crubebocas y cofia).

Alcohol al 70% o Fenol al 6 % como desinfectante.

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Material y soluciones estériles:


6 Pipetas bacteriológicas de 1ml.

1 Mortero y pistilo.

7 Cajas de Petri de vidrio.

1 espátula.

1 probeta de vidrio estéril o vaso de precipitado (100 ml).

Agar para cuenta estándar (Cuenta Placa).

Sol. Buffer de fosfatos Butterfield. Disolver 34 g. de fosfato de potasio en 500 mL de

agua, ajustar el pH a 7.2 con hidróxido de sodio 1N y aforar a 1000 mL con agua.

Esterilizar durante 15 minutos a 121°C. Conservarse en refrigeración.

Sol. de fosfatos diluida. Se toma 1.25 mL de la sol. de fosfatos de Butterfield y se diluye a

1000 mL con agua, distribuir en frascos con tapa de rosca en volúmenes de 450 mL y en

tubos con tapas de rosca en volúmenes de 9 mL y se esteriliza por 15 min. a 121 °C.

Finalmente conservarse en refrigeración.

PROCEDIMIENTO:

PREPARACION DE MUESTRAS.

1. El análisis bacteriológico de la muestra debe practicarse inmediatamente después de su

colecta, para evitar proliferación o muerte de las bacterias. Durante el periodo que

transcurre del muestreo al análisis, se debe conservar la muestra de alimento de 2 a 8ºC,

con objeto de inhibir la actividad bacteriana y evitar obtener resultados falsos o dudosos.

Es importante señalar que cuando el examen se practica dos horas después de tomar la

muestra, los resultados pueden ser inciertos.

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PREPARACIÓN DE LA ZONA DE TRABAJO

1. Previamente a cualquier actividad referente a la determinación, se debe desinfectar el

área de trabajo con un desinfectante que será seleccionado de los existentes (Alcohol,

Fenol, Cloro).

2. Se debe trabajar con 2 mecheros encendidos y dentro de 20 cm. de radio entre ellos

como máximo.

CULTIVO DE MICROORGANISMOS MESOFILICOS AEROBIOS

1. Tomar 50 g. de muestra de alimento y colocarlo en el mortero con pistilo estéril, adicionar

50 mL de sol. de fosfatos diluida y moler, posteriormente vaciarla en un matraz de 500

mL y colocar 400 mL sol. de fosfato diluido (esta sería una dilución de 0.1 o -1). Si se

presume que la muestra esta contaminada, es necesario hacer las diluciones decimales

requeridas, realizarlas con relación 1:9, Ejemplo: Dilución 0.01: tomar 1 mL de la dilución

de 0.1 y transferir a un tubo que contenga 9 mL sol. de fosfatos diluida. Dilución 0.001:

tomar 1 mL de la dilución de 0.01 y transferir a un tubo que contenga 9 mL sol. de

fosfatos diluida. Agitar las diluciones vigorosamente, en un lapso de 20 segundos.

2. Inocular por cada dilución 1 mL de muestra en la caja de Petri aplicando la punta de la

pipeta al fondo de la caja y agregar de 12 a 15 mL de agar cuenta placa fundido y

conservado a 45 °C, (hacerlo por duplicado). Incluir una caja sin inóculo y 1 ml de

solución de fosfato diluido preparado como testigo de esterilidad (Ver figura 1).

3. Finalmente homogeneizar las cajas de Petri, con 6 movimientos de izquierda a derecha y

6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrás a adelante,

sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa incorporación del inóculo

en el medio. Cuidar que el medio no moje la cubierta de las cajas.

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4. Dejar solidificar. No debe transcurrir más de 20 min. desde el depósito de la muestra en

el diluyente hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo en las cajas.

5. Incubar las placas en posición invertida (la tapa hacia abajo) por el tiempo y la

temperatura que se requieran, según el tipo de microorganismo de que se trate.

Grupo bacteriano

Temperatura

Tiempo de incubación

Termofílicos aerobios 55 ± 2 °C 48 ± 2 h

Mesofílicos aerobios 35 ± 2 °C 24 ± 2 h

Psicotróficos 20 ± 2 °C 3 – 5 días

Psicrofílicos 5 ± 2 °C 7 – 10 días

6. Al término de las actividades el analista debe lavarse las manos con agua y jabón y

posteriormente desinfectarlas con etanol al 70 %. Así también, deberá desinfectarse el

área de trabajo con el desinfectante utilizado al inicio.

CALCULOS:

LINEAMIENTOS PARA CALCULAR LA CUENTA TOTAL AERÓBICA.

1. En la lectura se seleccionan aquellas placas donde aparecen entre 25 –250 UFC

(Unidades Formadoras de Colonias), para disminuir en error en la cuenta. Se cuentan

todas las colonias desarrolladas en las placas seleccionadas (sin contar las de mohos y

levaduras).

2. Después de contabilizar las colonias en cada caja, se promedia las dos cajas de la

misma dilución.

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3. La cifra obtenida en la cuenta se redondea de tal forma que solo aparezcan dos dígitos

significativos al inicio de esta cifra. El redondeo se realiza elevando el segundo dígito al

número inmediato superior, cuando el tercer dígito de la derecha sea 5 o mayor

(Ejemplo: 128 redondear a 130), o si el tercer dígito es 4 o menos se reemplaza este

tercer dígito con cero y el segundo dígito queda igual (Ejemplo; 2417 a 2400).

4. Multiplica el número total de colonias por el factor de dilución para obtener el número de

la UFC/g de la muestra. Ejemplo: cuenta de 180 en la dilución –3 = 180,000 UFC/g.

Dilución Forma 1 Forma 2 Multiplicar el dato por

1:10 10 10 0.1

1:1 1 1 1

1:10 -1 0.1 10

1:100 -2 0.01 100

1:1000 -3 0.001 1000

1:10000 -4 0.0001 10000

1:100000 -5 0.00001 100000

1:1000000 -6 0.000001 1000000

1:10000000 -7 .00000001 10000000

5. Cuando dos diluciones estén en el intervalo apropiado, hay que promediar la cuenta de

las 2 diluciones, para obtener así la cuenta en placa por gramo o mililitro. Ejemplo:

cuentas de 220 y 233 en la dilución 1:1000 (-3) y cuentas de 25 y 28 en la dilución

1:10000(-4), da el resultado de 250,000 UFC/g.

PLACA CON MENOS DE 25 COLONIAS:

Cuando las placas corridas para la menor dilución muestran cuentas de menos de 25

colonias, se cuenta el número de colonias presentes en dicha dilución, se promedia el

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número de colonias y se multiplica por el factor de dilución para obtener el resultado como

“Valor estimado”. Por ejemplo: cuentas de 18 y 14 UFC en la dilución de 1:100 dan como

resultado 1600 UFC/g.

PLACAS CON MÁS DE 250 COLONIAS:

Cuando el número de UFC/placa excede las 250 colonias para todas las diluciones, contar

las colonias en aquella porción de placa que sea más representativa de la distribución de

colonias. Contar por ejemplo, una cuarta parte o una mitad del área de la placa y multiplicar

el valor obtenido por 4 o 2 respectivamente. Aclarar en el informe esta situación agregando

la leyenda “valor estimado”. Por ejemplo; placas promedio 500 UFC en la dilución 1:10000,

da como resultado 5,000, 000 UFC/g.

PLACAS SIN COLONIAS (UFC):

Cuando las placas de todas las diluciones no tienen colonias, se reporta la correspondiente

dilución más baja. Por ejemplo: en cuentas de 0 UFC en la dilución 1:10, se contabiliza

como <10 UFC/g.

PLACAS CONTAMINADAS O DAÑADAS:

Cuando las placas de una muestra se contaminan o presentan alguna forma

insatisfactoriamente, se registra el resultado como accidente de laboratorio (AL).

PRECAUCION

Al terminar la prueba, todo el material utilizado y cultivos generados deben ser esterilizados

y posteriormente ser desechados.

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OBSERVACIONES:

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INFORME DE LA PRUEBA: El resultado se reporta como: Unidades Formadoras de Colonias, ___________ UFC/g de

bacterias aeróbias en placa en agar para cuenta estándar, incubadas _________ horas a

_______ °C.

Además incluir en su reporte la forma, borde, elevación y el tipo de superficie de cada

colonia, como se muestra en la figura 2.

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REPORTE SUS RESULTADOS:

Dibuja a manera de diagrama el procedimiento que empleaste para el cultivo bacteriano.

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CUESTIONARIO:

1. ¿Defina el concepto de UFC (Unidad Formadora de Colonia)?

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2. ¿En el proceso de desinfección del área de trabajo es importante utilizar diferentes

desinfectantes, si o no y porque?

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3. ¿Indique que tipos de medios existen y explique cual es su diferencia?

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4. ¿Mencione 3 bacterias mesófilas aerobias?

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5. ¿Porque es importante voltear las cajas de petri una vez que se mete a incubar el cultivo?

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6. ¿Porque se recomienda que la temperatura de incubación de mesófilos aerobios sea de

35±2ºC?

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CONCLUSIONES:

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BIBLIOGRAFÍA:

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ANEXOS

Figura 1. Siembra por dilución en agar

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Figura 2. Aspectos más comunes de las diversas colonias microbianas en un medio sólido

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PRÁCTICA No. 3 MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO

INTRODUCCIÓN:

PARTES DE UN MICROSCOPIO ÓPTICO Sistema óptico

OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen del objetivo.

OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de ésta.

CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación.

DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.

FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.

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Sistema mecánico SOPORTE: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo.

PLATINA: Lugar donde se deposita la preparación.

CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Pueden ser monocular o

binocular.

REVÓLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los

objetivos.

TORNILLOS DE ENFOQUE: Macrométrico que aproxima el enfoque y micrométrico

que consigue el enfoque correcto.

OBJETIVOS: La presente práctica tiene por objetivos:

1. Identificar las partes del microscopio y comprender sus características y la visión

con él.

2. Manejar el microscopio correctamente.

3. Realizar una observación con este instrumento.

MATERIAL: Microscopio óptico

Portaobjetos

Cubreobjetos

Aceite de inmersión

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PROCEDIMIENTO:

MANEJO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO 1. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina

completamente. Si el microscopio se recogió correctamente en el uso anterior, ya

debería estar en esas condiciones.

2. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.

3. Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o colocar el de

10 aumentos (10x) si la preparación es de bacterias.

4. Para realizar el enfoque:

a) Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo

macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular,

ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose

dañar alguno de ellos o ambos.

b) Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de

la preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo nítida la muestra,

girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino.

5. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser

suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al

cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar

con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3. El objetivo de 40x

enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos

tipos de percances: incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones

anteriores y mancharlo con aceite de inmersión si se observa una preparación que ya

se enfocó con el objetivo de inmersión.

6. Empleo del objetivo de inmersión:

a) Bajar totalmente la platina.

b) Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos

indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que echar el aceite.

c) Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y

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el de x40.

d) Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz.

e) Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de

inmersión.

f) Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente

toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se

adosara a la lente.

g) Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el

objetivo de inmersión y la preparación es mínima, aun menor que con el de 40x

por lo que el riesgo de accidente es muy grande.

h) Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede

volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de aceite. Por

tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operación

desde el paso 3.

i) Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca

el objetivo de menor aumento girando el revólver. En este momento ya se puede

retirar la preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de

inmersión en posición de observación.

j) Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para

óptica. Comprobar también que el objetivo 40x está perfectamente limpio.

MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES 1. Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posición

de observación, asegurarse de que la parte mecánica de la platina no sobresale del

borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda.

2. Cuando no se está utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su

funda para evitar que se ensucien y dañen las lentes. Si no se va a usar de forma

prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del

polvo.

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3. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy

suavemente con un papel de filtro o, mejor, con un papel de óptica.

4. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se está utilizando el

microscopio.

5. Después de utilizar el objetivo de inmersión, hay que limpiar el aceite que queda en el

objetivo con pañuelos especiales para óptica o con papel de filtro (menos

recomendable). En cualquier caso se pasará el papel por la lente en un solo sentido y

con suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que

limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol. No hay que abusar de este

tipo de limpieza, porque si se aplican estos disolventes en exceso se pueden dañar

las lentes y su sujeción.

6. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico, micrométrico,

platina, revólver y condensador).

7. El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a la

preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de

objetivo agarrándolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se está observando a

través del ocular.

8. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algún

líquido, secarlo con un paño. Si se mancha de aceite, limpiarla con un paño

humedecido en xilol.

9. Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesión

práctica y, al acabar el curso, encargar a un técnico un ajuste y revisión general de

los mismos.

OBSERVACIONES:

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CUESTIONARIO:

1. ¿Cuál es la importancia del microscopio en la microbiología?

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2. ¿Puedo observar virus en el microscopio óptico?

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3. ¿Mencione que diferentes tipos de microscopios existen?

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4. ¿Cuál es la función del aceite de inmersión?

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CONCLUSIONES:

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BIBLIOGRAFÍA:

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PRÁCTICA No. 4 TINCION DE GRAM

INTRODUCCIÓN:

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OBJETIVOS: Iniciación en las técnicas del estudio de microorganismos: cultivo, tinción y morfología.

MATERIAL: Cultivo de bacterias o levaduras.

Cristal violeta (1 g de cristal violeta en 100 cc de agua destilada).

Lugol (1 g de iodo en 2 g de ioduro potásico en 100 cc de agua destilada).

Fucsina básica (1 g de fucsina básica en 100 cc de agua destilada).

Aceite de inmersión.

Microscopio

Portaobjetos

Asas de inoculación

Mechero

Caja de Petri

Tubos de ensayo

Papel secante

Material de seguridad (guantes, cubrebocas, cofia y bata)

PROCEDIMIENTO:

Preparación de Frotis. 1. En un porta bien limpio (con alcohol, papel de filtro y flameado) se coloca una gota de

agua destilada a la que con el asa de siembra, previamente esterilizada a la llama, se

lleva una pequeña cantidad de suspensión de bacterias o, en su caso, de una colonia.

2. Con el asa se extiende la gota y las bacterias sobre el porta y se fija la extensión por

el calor, calentando suavemente a la llama del mechero hasta que se seque.

33

Coloración: 1. Se adicionan unas 4 gotas de cristal violeta (colorante inicial) y se deja por 1 minuto.

2. Se lava con agua destilada.

3. Se adicionan unas 4 gotas de lugol (mordiente) y se deja por 1 minuto.

4. Se decolora con alcohol de 95° (decolorante).

5. Se lava con agua destilada.

6. Se adicionan unas 4 gotas de fucsina básica (colorante de contraste) y se deja por 1

minuto.

7. Se lava con agua corriente

8. Se seca suavemente y se coloca el portaobjetos.

34

Observación 1. Debe utilizarse el objetivo de inmersión (100X).

2. Se coloca una gota de aceite de cedro sobre la preparación. Se enfoca,

preferentemente, con el micrométrico.

3. Después de utilizar el objetivo de inmersión debe limpiarse con xilol .

4. Anotar las observaciones a continuación considerando las formas y coloraciones de

las bacterias, si parecen aisladas o agrupadas, etc.

OBSERVACIONES:

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

Dibuja las observaciones hechas.

35

RESULTADOS (especifique que tipo de tinción obtuvo):

CUESTIONARIO:

1. ¿ Cuál es la función de la tinción Gram.?

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

2. ¿ Qué pasa a nivel celular con los colorantes utilizados en la tinción Gram.?

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

3. ¿Puede aplicar la tinción Gram. en levaduras?

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

36

CONCLUSIONES:

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

BIBLIOGRAFÍA:

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

37

PRACTICA No. 5 DETERMINACION DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES POR LA TÉCNICA DEL

NUMERO MAS PROBABLE (NMP)

INTRODUCCIÓN:

38

OBJETIVO:

Determinación de coliformes totales y coliformes fecales por el método de fermentación en

tubo (NMP) en un producto alimenticio.

MATERIAL Y EQUIPO:

Equipo:


Incubadora capaz de mantener una temperatura de 44 ± 0.5 °C.


Olla de presión con manómetro.

Plancha de agitación.

Material:

Encendedor

2 Mecheros Fisher

Papel estraza.

Papel aluminio

Cinta Masking

Cinta testigo.

Algodón

Pinzas para crisol

Tubos de ensaye de cristal refractario de 15 mm x 150 mm con tapón de baquelita.

Tubos de fermentación (Durham).

Asas de inoculación.

3 Matraces Erlenmeyer de 500 mL.

1 Matraz de 50 mL.

3 Agitadores de vidrio


39

Medios:

Caldo lactosado.

Caldo verde brillante de bilis deshidratada de buey.

Medio E. C. (E. coli).

Disolución de fosfato: disolver 34 g de fosfato de potasio monobásico (KH2PO4) en 500

mL de agua. Ajustar a pH 7.2 ± 0.5 con solución de hidróxido de sodio 0.1 N y aforar a

1000 mL con agua.

Disolución de cloruro de magnesio: disolver 38 g de cloruro de magnesio en 1000 mL de

agua.

Agua de dilución: añadir 1.25 mL de la disolución de fosfato y 5.0 mL de la disolución de

cloruro de magnesio y aforar a 1000 mL de agua. Distribuir 9 mL de esta solución en

tubos con tapón de rosca, cerrarlos hasta una media vuelta antes de su tope y esterilizar

en autoclave a 121 ± 1°C durante 15 minutos y una presión manométrica de 15 lb/in2.

Material estéril:

5 Pipetas bacteriológicas de 1ml

1 Pipeta bacteriológica de 10ml.

1 Mortero y pistilo.

1 Embudo.

1 Espátula o agitador de vidrio.

1 Probeta de vidrio de 250 ml.

1 Matraces Erlenmeyer de 500 mL.

PROCEDIMIENTO:

PREPARACIÓN DE MEDIOS:

1. Utilizar medios deshidratados y para su preparación seguir las recomendaciones del

fabricante.

40

2. Se colocan 10 mL del medio de cultivo en tubos de ensaye de tapón de rosca de

15 x 150 mm. Se requieren 12 tubos para el caldo lactosado (si se va utilizar la dilución

10, 3 de estos tubos deberán prepararse a doble concentración), 9 para el caldo verde

brillante de bilis y 9 para el medio E.C.

3. Se introduce un tubo Durham invertido, no es necesario que en este paso se llene con

medio el tubo Durham, ya que siempre presentará aire dentro de él. Este problema se

elimina al realizar la esterilización.

4. Cerrar los tubos hasta una media vuelta antes de su tope. Colocar cintas indicadoras de

esterilización en alguno que otro tubo, para verificar el esterilizado.

5. Los tubos se esterilizan en la olla de presión; de acuerdo al tiempo y presión que se

indique en la etiqueta del medio a esterilizar.

PREPARACION DE MUESTRAS.

El análisis bacteriológico de la muestra debe practicarse inmediatamente después de su

colecta, para evitar proliferación o muerte de las bacterias. Durante el periodo que transcurre

del muestreo al análisis, se debe conservar la muestra de alimento de 2 a 8 °C, con objeto

de inhibir la actividad bacteriana y evitar obtener resultados falsos o dudosos. Es importante

señalar que cuando el examen se practica dos horas después de tomar la muestra, los

resultados pueden ser inciertos.

PREPARACIÓN DE LA ZONA DE TRABAJO

Previamente a cualquier actividad referente a la determinación, se debe desinfectar el área

de trabajo con un desinfectante que será seleccionado de los existentes (Alcohol, Fenol,

Cloro).

Se debe trabajar con 2 mecheros encendidos y dentro de 20 cm. de radio entre ellos como

máximo.

41

PRUEBA PRESUNTIVA PARA COLIFORMES TOTALES

1. Cuando se trate de agua potable, pozo o cuyo origen indique que no existe una alta

contaminación en la muestra, se utilizarán únicamente 9 tubos para las diluciones de 10,

1.0 y 0.1 mL (3 para cada dilución), tomando como nota importante que para la dilución

de 10, el tubo de siembra debe estar preparado al doble de la concentración normal de

caldo lactosado.

2. Cuando se trate de muestras de agua contaminada utilizar hasta 15 tubos para las

diluciones -3, -4, -5, -6 y -7.

3. Para muestras de alimento tomar 25 g. de muestra y colocarlo en el mortero con pistilo

estériles, adicionar 25 ml de sol. de fosfatos diluida y moler, posteriormente vaciarla en

un matras de 500 mL y colocar 200 mL sol. de fosfatos diluida (esta sería una dilución de

0.1 o -1). Si se presume que la muestra esta contaminada, es necesario hacer las

diluciones decimales requeridas, realizarlas con relación 1:9.

Inoculación de la muestra en caldo lactosado:

Cuando se trate de muestras liquidas no contaminadas:

1. Inoculación de la dilución de 10: tomar 10 mL de la muestra y transferirlos a un tubo que

contenga 10 mL de caldo lactosado doble concentración. Para el inóculo, utilizar una

pipeta estéril de 10 mL.

2. Inoculación de la dilución de 1: tomar 1 mL de la muestra y transferir a un tubo que

contenga 10 mL de caldo lactosado. Para el inóculo, utilizar una pipeta estéril de 1 mL.

3. Inoculación de la dilución de 0.1 o -1: tomar 1 mL de muestra y colocarla en un tubo con

9 mL de Sol. de fosfatos diluida, agitar vigorosamente y transferir 1 mL a un tubo que

contenga 10 mL de caldo lactosado. Para el inóculo, utilizar una pipeta estéril de 1 mL.

42

Cuando se trate de muestras liquidas contaminadas:

1. Prepara las diluciones de la -1 y -2:

Dilución -1: tomar 1 mL de muestra y colocarla en un tubo con 9 mL de Sol. de fosfatos

diluida, agitar vigorosamente.

Dilución -2: tomar 1 mL de la dilución -1 y colocarla en un tubo con 9 mL de Sol. de

fosfatos diluida, agitar vigorosamente.

2. Inoculación de la dilución de - 3: tomar 1 mL de la dilución – 2 y colocarla en un tubo con

9 mL de Sol. de fosfatos diluida, agitar vigorosamente (esta será la dilución -3) y

transferir 1 mL a un tubo que contenga 10 mL de caldo lactosado. Para el inóculo, utilizar

una pipeta estéril de 1 mL.

















43

Cuando se trate de muestras de alimento:

1. Inoculación de la dilución de 0.1 ( -1 ): tomar 1 mL de la dilución -1 y transferir a un tubo

que contenga 10 mL de caldo lactosado. Para el inóculo, utilizar una pipeta estéril de 1

mL.

2. Inoculación de la dilución de 0.01 ( -2 ): tomar 1 mL de la dilución –1 y colocarla en un

tubo con 9 mL de Sol. de fosfatos diluida, agitar vigorosamente (esta será la dilución -2) y











Incubación de tubos

1. Incubar los tubos de fermentación inoculados a 35 ó 37 ± 1°C. Se debe registrar en la

bitácora de la incubadora utilizada, la temperatura que presenta por medio del

termómetro colocado en ella y que sea trazable a un termómetro calibrado. Anotar en la

misma bitácora el número de código del termómetro utilizado.

2. Examinar cada tubo a las 24 ± 2 horas de incubación. Los tubos que presenten

formación de gas, se consideran positivos. Incubar de nuevo los tubos otras 24 ± 2

horas. Se registran los tubos positivos obtenidos en la bitácora de este procedimiento.


posteriormente desinfectarlas con etanol al 70 %.

44

PRECAUCIONA: verificar la producción de gas en los tubos inoculados, debe asegurarse de

no confundir burbujas de aire con el gas resultante de una fermentación. Si el gas fue

producido por una fermentación, el medio de cultivo tendrá una apariencia turbia, lo cual

significa que el gas se desprende del medio, debido a la acción de los microorganismos.

PRUEBA CONFIRMATIVA PARA COLIFORMES TOTALES

1. Resembrar los tubos que resulten positivos de la prueba presuntiva, tomando de una a

tres veces con el asa de inoculación en caldo lactosado al verde brillante de bilis e

incubar a 35 ó 37 ± 1°C.

2. Se debe registrar en la bitácora de la incubadora utilizada, la temperatura que presenta,

la cual será medida por el termómetro colocado en ella y que sea trazable a un

termómetro calibrado. Anotar en la misma bitácora el número de código del termómetro

utilizado.

3. Examinar cada tubo a las 24 ± 2 horas. Los tubos que presenten formación de gas se

consideran positivos. Se registran los tubos positivos obtenidos en la bitácora de este

procedimiento.

4. Incubar los tubos que no presenten formación de gas otras 24 ± 2 horas.

5. La formación de gas dentro de 48 ± 3 horas de incubación total, constituye una prueba

confirmativa de la presencia de coliformes totales.

6. La ausencia de gas dentro de 48 ± 3 horas, de incubación total constituye una prueba de

la ausencia de coliformes totales.



45

Fig. 1. Inoculación de tubos

PRUEBA CONFIRMATIVA PARA COLIFORMES FECALES.

1. Resembrar los tubos que resulten positivos de la prueba presuntiva (caldo lactosado) o

de la prueba confirmativa (medio verde bilis brillante), tomando de una a tres veces con

el asa de inoculación en el medio E. coli e incubar a 44 ± 0.5 °C.

2. Se debe registrar la temperatura que presenta la incubadora, la cual será medida por el

termómetro colocado en ella y que sea trazable a un termómetro calibrado (registrarlo en

la bitácora de la incubadora).

3. Examinar cada tubo a las 24 ± 2 horas. Los tubos que presenten formación de gas se

consideran positivos. Se registran los tubos positivos obtenidos en la bitácora de este

procedimiento.

4. Incubar los tubos que no presenten formación de gas otras 24 ± 2 horas.

5. La formación de gas dentro de 48 ± 3 horas de incubación total, constituye una prueba

confirmativa de la presencia de coliformes fecales.

6. La ausencia de gas dentro de 48 ± 3 horas, de incubación total constituye una prueba de

la ausencia de coliformes fecales.



46

PRECAUCION: Al terminar la prueba, todo el material utilizado y cultivos generados deben

ser esterilizados y posteriormente ser desechados.

OBSERVACIONES:

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

CALCULOS:

1. Anotar el número de tubos positivos de cada una de las diluciones sembradas para la

prueba presuntiva y confirmativa de coliformes totales y fecales la hoja de REPORTE DE

RESULTADOS.

2. A partir del número de tubos que dan reacciones positivas en los medios presuntivos y

confirmativos, calcular el número más probable (NMP) de organismos Coliformes totales

y fecales en 100 mL de muestra, de acuerdo a la Tabla 1 para las diluciones de 10, 1 y

0.1.

3. En caso de que las diluciones sean mas grandes que las anteriores, es necesario para la

interpretación, multiplicar al valor obtenido en la tabla 1, por el factor de dilución para

hacerlo equivalente, es decir, seleccionar las tres diluciones y multiplicar el valor de la

tabla por el factor de la dilución intermedia, como se muestra en la tabla siguientes.

47

Dilución Forma 1 Forma 2 Multiplicar el dato por

1:10 10 10 0.1

1:1 1 1 1

1:10 -1 0.1 10

1:100 -2 0.01 100

1:1000 -3 0.001 1000

1:10000 -4 0.0001 10000

1:100000 -5 0.00001 100000

1:1000000 -6 0.000001 1000000

1:10000000 -7 .00000001 10000000

4. Para la interpretación de resultados se utilizan tres series de la prueba confirmativa del

total de diluciones utilizadas.

5. Otra forma de calcular el resultado es aplicando la formula siguiente.

NMP/100 mL = 10 x NMP (Tabla 1)

Volumen más grande en dilución

6. Reportar los Coliformes totales y fecales en caso de muestras positivas como NMP/100

mL. Para muestras negativas reportar como Ausentes.

REPORTE SUS RESULTADOS:

48

Dibuja a manera de diagrama el procedimiento que empleaste para el cultivo bacteriano.

49

CUESTIONARIO:

1. ¿Defina al grupo de bacterias coliformes?

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

2. ¿Cuáles son los limites máximos permisibles de Coliformes totales y fecales en muestras

de alimentos?

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

3. ¿Defina que es un limite máximo permisible?

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

4. ¿Porque es importante incubar Coliformes totales a 35 ± 1ºC?

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

5. ¿Por qué es importante hacer diluciones de la muestras?

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

50

CONCLUSIONES:

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

BIBLIOGRAFÍA:

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__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

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51

REPORTE DE RESULTADOS

Fecha

No. De Hoja

Procedencia de la muestra

Nombre del Técnico

Presuntiva Confirmativa

Coliformes Totales Confirmativa

Coliformes Fecales

Dilución

24 horas

48 horas

Código

Índice NMP / 100 mL Índice NMP / 100 mL

52

Tabla 1

Índice del NMP y límite confiable de 95 % para varias combinaciones de resultados positivos

y negativos cuando se usan: 3 tubos con porciones de 10 mL, 3 porciones de 1 mL y

porciones de 0.1 mL. No. de tubos con reacciones

positivas Índice del NMP

por 100 mL Limite confiable de 95%

3 tubos con 10mL

3 tubos con 1mL

3 tubos con 0.1mL

Inferior

Superior

0 0 0 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

0 0 1 0 0 1 1 2 0 0 1 1 2 2 0 0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 3 3

0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 2 3

<3 3 3 4 7 7 11 11 9 14 15 20 21 28 23 39 64 43 75 120 93 150 210 240 460 1100 = > 2400

< 0.5 < 0.5 < 5 1 1 3 3 1 3 3 7 4 10 4 7 15 7 14 30 15 30 35 36 71 150

- 9 13 20 21 23 36 36 37 44 89 47 150 120 130 380 210 230 280 380 440 470 1300 2400 4800

* (PROY-NMX-AA-042-SCFI-2000)

53

PRACTICA No. 6 DETERMINACION DE SALMONELLA Y SHIGELLA

INTRODUCCIÓN:

54

OBJETIVO:

Determinación de Salmonella presente en agua o alimento.

MATERIAL:

Equipo:



Plancha de agitación

Material:


1 Agitador magnético

Encendedor

2 Mecheros Fisher

Asas de inoculación.

Papel estraza.

Papel aluminio

Pinza para crisol

Cinta Masking

Cinta testigo.

Algodón


Caldo lactosado

Agar Salmonella-Shigella

Alcohol al 70 % o Fenol al 6%

55

Material estéril:

1 Cajas de Petri estériles por persona.

Tubos de caldo lactosado positivos de la práctica 3.

Licuadora con vaso

Probeta de 100 mL.

PROCEDIMIENTO:

PREPARACIÓN DE AGAR Salmonella- Shigella:

1. Utilizar medios deshidratados y para su preparación seguir las recomendaciones del

fabricante.

2. Se colocan 10-15 mL del Agar en una caja previamente esterilizada (Preparar 1 caja

por alumno).

3. Dejar enfriar hasta que solidifique el Agar y voltear la caja.

PREPARACION DE MUESTRAS:

1. El análisis bacteriológico de la muestra debe practicarse inmediatamente después de su

colecta, para evitar proliferación o muerte de las bacterias. Durante el periodo que

transcurre del muestreo al análisis, se debe conservar la muestra de alimento de 0 a 4 °C

hasta un límite máximo de 36 horas, para la muestra de agua potable, conservarla

máximo 24 horas y 6 horas para otro tipo de agua, con objeto de inhibir la actividad

bacteriana y evitar obtener resultados falsos o dudosos.

56

PREPARACIÓN DE LA ZONA DE TRABAJO:

1. Previamente a cualquier actividad referente a la determinación, se debe desinfectar el

área de trabajo con un desinfectante que será seleccionado de los existentes (Alcohol al

70 % o Fenol al 6%).

2. Se debe trabajar con 2 mecheros encendidos y dentro de 20 cm. de radio entre ellos

como máximo.

ETAPA DE ENRIQUECIMIENTO:

Muestras sólidas:

1. Pesar asépticamente 25 g. de muestra de alimento en un vaso estéril de licuadora y

adicionar 225 mL de caldo lactosado concentración normal estéril.

2. Licuar durante 1 min. y transferir la mezcla homogeneizada a un recipiente estéril de

boca ancha con tapón de rosca y dejar reposar por 60 min. a temperatura ambiente con

la tapa bien enroscada.

3. Mezclar bien, determinar el pH y ajustar si es necesario a un pH entre 6.8 ± 0.2 con

hidróxido de sodio 1N o ácido clorhídrico 1N estériles. Finalmente mezclar y cerrar el

recipiente sin sellar.

4. Incubar por 24 ± 2 h a 35 °C.

Muestras líquidas:

1. Tomar asépticamente 25 mL de muestra de agua y vaciarlos en 225 mL de caldo

lactosado concentración normal estéril.

2. Agitar y dejar reposar por 60 min. a temperatura ambiente con la tapa bien enroscada.

3. Mezclar bien, determinar el pH y ajustar si es necesario a un pH entre 6.8 ± 0.2 con

hidróxido de sodio 1N o ácido clorhídrico 1N estériles. Finalmente mezclar y cerrar el

recipiente sin sellar.

4. Incubar por 24 ± 2 h a 35 °C.

57

ETAPA DE AISLAMIENTO:

1. Mezclar cada tubo con los cultivos de enriquecimiento en un vortex e inocular por estría

en placa en Agar Salmonella-Shigella (SS), como se muestra en la 1.

2. Incubar las placas por 24 ± 2 h a 35 °C.



Figura 1. Técnica de sembrado por estría en placa.

OBSERVACIONES:

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

58

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:

1. Las Salmonellas y Shigellas, se encuentran en el medio ambiente y se pueden detectar

en los concentraciones bajos en la mayoría de las aguas superficiales comparadas con

los coliformes

2. Examinar las placas para detectar la presencia de colonias sospechosas de Salmonella y

Shigella, de acuerdo a las características morfológicas presentadas en la siguiente tabla.

COLONIAS MICROORGANISMOS Incoloras, transparentes y a veces

cremosas. Shigella, y la mayoría de las Salmonellas

Transparentes, con centro negro Proteus, y algunas Salmonellas

De rosadas hasta rojo Escherichia coli

Mayores que las E. coli rosadas,

hasta de color cremoso

blanquecinas, opacas y mucosa.

Enterobacter aerogenes

Tabla 1: Características morfológicas de las colonia desarrolladas en Agar SS

INFORME DE LA PRUEBA:

1. El resultado de esta prueba se expresa por la presencia o ausencia de Salmonella,

estudiado como patógeno cuando se encuentra presente en alimentos y agua.

2. Se informa como presencia o ausencia de Salmonella spp. en ________ g, mL o cm2 de

muestra.

59

REPORTE SUS RESULTADOS: Dibuje las diferentes colonias observadas en las cajas de Salmonella-Shigella:

60

CUESTIONARIO:

1. ¿cuál es la finalidad de enriquecer la muestra?

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

2. ¿Por qué el Agar Salmonella-Shigella no es esterilizado?

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

3. ¿Por qué el resultado de Salmonella-Shigella se reporta como ausencia o presencia?

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

4. ¿Debido a que algunas colonias de Salmonella presentan un centro negro como se

menciona en la figura 1?

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

5. ¿En que alimentos es común encontrar la bacteria de Salmonella?

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

61

CONCLUSIONES:

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

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__________________________________________________________________________

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BIBLIOGRAFÍA:

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