Escuela acadmico profesional de Biologa y Microbiologa PRACTICA 01:

RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESOFILOS VIABLES

INFORME DE LABORATORIOASIGNATURA DOCENTE ALUMNAS : Microbiologa de Alimentos : M. Sc. Julio Cceda Quiroz : [06-29559] Ana Julissa Naquiche Calero [07-30712] Gricel Marilia Martnez Roncal AO : 5to ao

TACNA PERU 2011

RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESOFILOS VIABLES

I.

INTRODUCCION El recuento aerbico en placa (APC) tiene propuesto indicar el nivel de microorganismos en un producto. Los procedimientos detallados para determinar el APC de alimentos han sido desarrollados por la Asociacin e Qumica Analtica Oficial (AOAC) y la Asociacin Americana de Salud Pblica (APHA). El mtodo convencional de recuento en placa para examinar alimentos congelados, helados, pre-cocidos o preparados, se ajusta a los Mtodos de Anlisis Oficial de la AOAC, sec. 966.23, con un cambio relativo la procedimiento. Segn la FDA el rango apropiado del recuento de colonias es de 25-250 Adems del mtodo convencional tambin utiliza el mtodo automatizado de recuento en placa es espiral para la examinacin de alimentos y cosmticos, se ajusta a los Mtodos de Anlisis Oficial de la AOAC, sec 977.27. A diferencia del ICMSF el rango apropiado del recuento de colonias esta entre 30-300 colonias ufc/ml. Adems de ello existe otra diferencia en el clculo de resultados como se podr apreciar mas adelante.

La mayora de los alimentos (industrializados excepto, por ejemplo los productos fermentados deben ser considerados inadecuados para el consumo cuando se tiene un gran numero de microorganismos, aun cuando estos microorganismos no sean conocidos como patgenos y no hayan alterado de manera apreciable las caractersticas organolpticas del alimento. Pueden darse varias razones que justifican esta conducta: Recuentos altos en alimentos estables a menudo indican materias primas contaminadas o tratamientos no satisfactorios desde el punto de vista sanitario, mientras que los productos perecederos pueden indicar tambin condiciones inadecuadas de tiempo/temperatura durante su almacenamiento. La presencia de un numero elevado de bacterias aerobias mesofilas que crecen bien a temperatura corporal o prxima a ella, significa que puede haberse dado las condiciones favorables a la multiplicacin de los microorganismos patgenos de origen humano o animal.

Algunas cepas de bacterias mesofilas comunes, no generalmente consideradas como agente de enfermedades transmitidas por los alimentos (por ejemplo, Proteus,sp, enterococos y pseudomonas mesofilas) han sido sealas como

causa de enfermedad cuando exista un numero elevado de clulas viables en los alimentos. Todas las bacterias patgenas conocidas vehiculadas por alimentos son mesofilas y en algunos casos contribuyen con su presencia a los recuentos en placa encontrados. Cuando la alteracin de los alimentos es debida al desarrollo en ellos de microorganismos, la causa mas frecuente de alteracin, deben esperarse en los mismos recuentos elevados. Los niveles de poblacin precisos para producir modificaciones organolpticas ostensibles varan ampliamente segn el tipo de alimento y, de modo particular, la clase me microorganismo En el momento en que la descomposicin puede ser detectada por el olor, gusto o el aspecto, la mayora de los alimentos contienen ms de 10 6 microorganismos.

II.

OBJETIVOS Determinar el nmero de microorganismos aerobios mesofilos viables por el mtodo de recuento estndar presentes en una muestra de refresco.

III.

METODOLOGIA:

3.1

Segn el FDA

3.1.1 Equipos y materiales

a. rea de trabajo, mesa con superficie amplia en la habitacin que est limpia, bien iluminado (velas de 100 pies en la superficie de trabajo) y bien ventilado y razonablemente libre de polvo y corriente de aire. La densidad microbial del aire en el rea de trabajo, medido en polvo radiactivo que se vierte en las placas tomadas durante el plaqueo, no debe exceder de 15 colonias/placa durante 15 min de exposicin.

b. El espacio de almacenaje, libre de polvo e insectos y adecuado para la proteccin del equipo y artculos.

c. Placas de petri, de vidrio o plstico (al menos de 15 x 90 mm).

d. Pipetas con bombilla (no pipetear con la boca) o pipetores, de 2, 5 y 10 ml, graduadas en unidades de 0,1 ml.

e. Botellas de dilucin, de 6 oz (160 ml), e vidrio o resistente al borosilicato, con tapones de goma o tapas rosca de plstico.

f. Cajas para pipetas y placas petri, adecuadas para proteccin.

g. Bao e agua circulante, para temperar el agar, termostticamente controlada a 451C.

h. Incubadora a 351C; de leche 321C.

i. Contador de colonias, de campo oscuro, Qubec, o equivalente, con una fuente de luz apropiada y placa marcada en cuadritos.

j. Registrador del nmero total.

k. Blancos de dilucin, 901 ml de agua de dilucin de fosfato tamponado de Butterfield (R 11); de leche, 992 ml.

l. Agar de recuento en placa (mtodos estndar) (M124).

m. Refrigerador, para enfriar y mantener las muestras a 0-5C; leche, 04,4C. n. Congelador, para mantener las muestras congeladas desde 15 a 20C.

o. Termmetros (mercurio) de rango apropiado; verificados exactamente con un termmetro certificado por el Instituto Nacional de Estndares y Tecnologa (NIST).

3.1.2 Procedimiento

a. Mtodo Convencional de Recuento en Placa Procedimiento para el anlisis de alimentos congelados, helados, precocidos o preparados

Utilice

pipetas

estriles-2 - 3

por-4

separado,

prepare

diluciones

decimales de 10 ,10

,10 , y otras que sean apropiadas, del

alimento homogenizado (vea el Captulo 1 para la preparacin e la

muestra) transfiriendo 10 ml de la dilucin previa a 90 ml el diluyente. Evite que la muestra haga espuma. Sacuda todas las diluciones 25 veces en un arco de 30 cm (1 pie) dentro de 7s. Pipetee 1 ml de cada dilucin dentro e placas petri marcadas apropiadamente, en duplicado, separadas. Vuelva a sacudir la botella de la dilucin 25 veces en un arco e 30 cm en 7 s si se pasa ms de 3 min antes de que se pipetee dentro de la placa petri. Aada 12-15 ml del agar para recuento en placa (enfriado a 451C) a cada placa de la dilucin original dentro de los 15 min. Para muestras de leche, vierta un control de agar, vierta un control de agua de dilucin y pipetee el agua para un control de pipeta. Aada agar para las ltimas dos series de muestras. Aada agar inmediatamente a las placas petri cuando el diluyente de la muestra contenga materias higroscpicas, p. e., harina y almidn. Vierta al azar el agua de dilucin de las placas control para cada una de las series de las muestras. Inmediatamente mezcle las diluciones de la muestra y el medio de agar por completo y uniformemente por rotacin alternada y movimiento de atrs y

hacia delante de las placas sobre una superficie en plano horizontal. Deje que el agar solidifique. Invierta las placas de petri solidificadas, e incube inmediatamente por 48 2 h a 35C. No apile las placas cuando vierta el agar o cuando el agar est solidificando. Gua para calcular y reportar los APCs de casos no comunes

Los Mtodos de Anlisis Oficial no provee la gua para contar y reportar los recuentos en placa, mientras que los Mtodos Estndar para la examinacin de Productos Lcteos, 16va ed. presenta la gua detallada, por uniformidad, por lo tanto, utilice la gua del APHA como se modific. Reporte todos los recuentos aerbicos en plac calculados de palcas por duplicado. Para muestras de leche, reporte todos recuentos aerbicos en placa calculados de placas por duplicado que contienen menos de 25

colonias como un recuento estimado de menos de 25. Reporte todos los recuentos aerbicos en placa calculados de placas por duplicado que contienen ms de 250 colonias como recuentos estimados. Los recuentos fuera del rango normal de 25-250 pueden dar indicaciones errneas de la actual composicin bacteriana de la muestra. Los factores de dilucin pueden exagerar recuentos bajos (menos de 25), y las placas llenas (mayores de 250) pueden dificultar el recuento o inhibir el crecimiento de alguna bacteria, resultando en un recuento bajo. Reporte los recuentos menores de 25 o de ms de 250 colonias como recuentos aerbicos estimados en placa (EAPC). Utilice la siguiente gua: Placas normales (25-250). Seleccione placa(s) libre de propagacin. Cuente todas las unidades formadoras de colonia (UFC), incluyendo aquellas del tamao de la punta de un alfiler, sobre las placa(s) seleccionada(s). Registre la dilucin(s) utilizada y la cantidad total de colonias contadas.

Placas con ms de 250 colonias. Cuando la cantidad de UFC por placa excede a 250, para todas las diluciones, registre los recuentos como demasiado numeroso para el recuento (TNTC) para todas pero para la placa ms cercana a 250, y el recuento de UF para estas porciones de las placa que son

representativas de la distribucin de la colonia. Vea la ref. 2 para las guas detalladas. La marca calcul el APC con EAPC para denotar que fue estimado del los recuentos fuera del rango de 25-250 por placa.

Propagaciones. Las colonias que se propagan usualmente son de 3 tipos distintos: 1) una cadena de colonias, no muy distintas al estar separadas, que parecen ser causadas por la desintegracin de un grupo bacteriano; 2) una que se desarrolla

en una pelcula de agua entre el agar y el fondo de la placa; y 3) una que se forma en una pelcula de agua en el borde o en la superficie del agar. Si las placas preparadas de la muestra tienen un excesivo crecimiento en propagacin tanto que (a) un rea es cubierta por las propagaciones, incluyendo el rea total del crecimiento reprimido, que excede el 50% del rea de la placa, o (b) el rea del crecimiento reprimido excede el 25% del rea de la placa, reporte las placas como propagaciones. Cuando sea necesario el recuento de las placas que contengan propagaciones no eliminadas por (a) o por (b) mencionado, cuente cada uno delos 3 tipos distintos de propagacin como una fuente. Para el primer tipo, si solo existe una cadena, cuntelo como una colonia simple. Si aparece una o ms cadenas que se originan de fuentes separadas, cuente cada fuente como una colonia separada. Los tipos 2 y 3 usualmente resultan en colonias distintas y son contadas como tales. Combine el recuento de propagacin y el recuento de la colonia para calcular el APC.

Placas sin UFC. Cuando las placas de todas las diluciones no tienen colonias, reporte el APC como menos de 1 veces la correspondiente dilucin ms baja utilizada. Marque el clculo del APC con asterisco para denotar que fue estimado de los recuentos fuera del rango de 25-250 por placa. Cuando la placa(s) de una muestra son informadas de ser contaminadas o de otra forma insatisfactoria, registre el resultado(s) como accidente de laboratorio (AL).

Clculo y registro de los recuentos

Para evitar crear una impresin ficticia de la precisin y exactitud cuando se calcula el APC, reporte solo los dos primeros dgitos

significantes. Redondee para dos figuras significantes solo a la hora de la conversin a SPC. Para muestras de leche, cuando las placas para todas las diluciones no tienen colonias, reporte el APC como un recuento estimado con menos de 25 colonias. Redondee subiendo el segundo dgito hasta el siguiente nmero ms alto cuando el tercer dgito sea 6, 7, 8, 0 9 y use ceros para cada dgito sucesivo hacia la derecha del segundo dgito. Redondee hacia abajo cuando el tercer dgito sea 1, 2, 3, o 4. Cuando el tercer dgito sea 5, redondee hacia arriba cuando el segundo dgito sea impar y redondee hacia abajo si fuera par.

Ejemplos Recuento calculado 12,700 12,400 15,500 14,500 APC 13,000 12,000 16,000 14,000

Placas con 25-250 UFC Calcule el APC como sigue: C [(1 x n1) + (0.1 x n2)] x (d) .

N =

Donde: N = Nmero de colonias por ml o g de producto. C = Sumatoria de todas las colonias en todas las placas contadas. n1 = Nmero de placas en la primera dilucin contada. n2 = Nmero de placas en la segunda dilucin contada. d = Dilucin de la cual los primeros recuentos fueron obtenidos.

Ejemplo

1:100 232,244

1:1000 33,28

N =

(232 + 244 + 33 + 28) . [(1 x 2) + (0.1 x 2)] . 10-2

= 537/0.022 = 24,409 = 24,000 Cuando los recuentos de placas por duplicado caen dentro y fuera del rango de 25-250 colonias, utilice slo aquellos recuentos que caen dentro de este rango.

Todas las placas con menos de 25 UFC. Cuando las placas de ambas diluciones produzcan menos de 25 UFC cada una, registre el recuento actual de la placa pero registre el conteo como menos de 25 x 1/d cuando d sea el factor de dilucin para la dilucin de la cual los primeros recuentos fueron obtenidos.

Ejemplo

Colonias 1:100 18 0 1:1000 2 0 EAPC/ml (g) 5,900,000 EAPC

Basado en el rea de la placa de 65 cm2. EAPC, APC estimado. Basado en el rea de 59 cm2.

3.2

Segn el mtodo realizado en el laboratorio

3.2.1 Reactivos y materiales

a. Agar PCA b. Agua peptonada c. Placas petri de 10x100 d. Tubos de ensayo de 15x125 e. Pipetas de 1, 5, 10 y 20 ml f. Agua destilada g. Matraz de 200 y 500 ml h. Mecheros i. Bombilla de succin

3.2.2 Procedimiento

a. Tomar la muestra en un recipiente esteril la cual fue obtenida de un mercado de la localidad. b. En un matraz que contiene 225 ml de agua peptonada (diluyente) agregar con una pipeta estril 25ml de la muestra seleccionada (refresco casero) obteniendo as nuestra primera dilucin de 10-1. c. Utilizando pipetas estriles por separado, preparar-2 -3

diluciones

decimales de 10 ,10 , y otras que sean apropiadas segn el criterio de quien evaluara la muestra. En este caso solo se realizara diluciones hasta 10-3

d. Paralelamente a procedimiento anterior, debemos fundir el APC previamente preparado y autoclavado (17g de APC para hidratar en 75 ml de agua destilada). e. Aadir al APC ya fundido TTC de 0.5%. luego templara el agar hasta 44 a 46 C, controlando cuidadosamente su temperatura para que al

mezclarlo con la dilucin del alimento no sean inactivados los grmenes. f. Verter inmediatamente en las placas petri 10 a 15 ml del medio fundido y templado. El periodo de tiempo transcurrido entre la realizacin de las diluciones g. Se transfiere 10 ml de la dilucin previa a 90 ml el diluyente. Evite que la muestra haga espuma. Sacuda todas las diluciones 25 veces en un arco de 30 cm (1 pie) dentro de 7s. Pipetee 1 ml de cada dilucin dentro e placas petri marcadas apropiadamente, en duplicado, separadas. Vuelva a sacudir la botella de la dilucin 25 veces en un arco e 30 cm en 7 s si se pasa ms de 3 min antes de que se pipetee dentro de la placa petri. Aada 12-15 ml del agar para recuento en placa (enfriado a 451C) a cada placa de la dilucin original dentro de los 15 min. Para muestras de leche, vierta un control de agar, vierta un control de agua de dilucin y pipetee el agua para un control de pipeta. Aada agar para las ltimas dos series de muestras. Aada agar inmediatamente a las placas petri cuando el diluyente de la muestra contenga materias higroscpicas, p. e., harina y almidn. Vierta al azar el agua de dilucin de las placas control para cada una de las series de las muestras. Inmediatamente mezcle las diluciones de la muestra y el medio de agar por completo y uniformemente por rotacin alternada y movimiento de atrs y hacia delante de las placas sobre una superficie en plano horizontal. Deje que el agar solidifique. Invierta las placas de petri solidificadas, e incube inmediatamente por 48 2 h a 35C. No apile las placas cuando vierta el agar o cuando el agar est solidificando.

IV.

RESULTADOS

Tabla N 01: Nmero de colonias con respecto a las diluciones de la muestra

Placa Primera Lectura Segunda Lectura 10-1 15 23

N de colonias Dilucin 10-2 2 6

10-3 1 2

Figura N 01: Placa de la dilucin 10-1 del APC a las 56 h

Figura N 02: Placa de la dilucin 10-1 del APC a las 56 h

Figura N 03: Placa de la dilucin 10-2 del APC a las 56 h

Figura N 04: Placa de la dilucin 10-3 del APC a las 56 h

4.1 Clculo de resultados para el FDA:

4.1.1 Casos para el APC:a. Caso 1: Si los resultados obtenido en el recuento de colonias en las placas esta entre 25-250 UFC entonces se debe aplicar la siguiente formula:

N =

C . [(1 x n1) + (0.1 x n2)] x (d)

Donde: N = Nmero de colonias por ml o g de producto. C = Sumatoria de todas las colonias en todas las placas contadas. n1 = Nmero de placas en la primera dilucin contada. n2 = Nmero de placas en la segunda dilucin contada. d = Dilucin de la cual los primeros recuentos fueron obtenidos.

b.

Caso 2: En el caso que las colonias contadas en las placas hacienda a menos de 25 UFC, el recuento se expresa como menos de 25 x 1/d cuando d sea el factor de dilucin para la dilucin de la cual los primeros recuentos fueron obtenidos. Caso 3: Cuando tenemos placas con ms de 250 UFC en 2 diluciones, estime los recuentos aerobios de las placas (EAPC) ms cercanas a 250 y multiplquela por la dilucin. Caso 4: En el caso de que todas las placas contengan un promedio mayor de 100 UFC por cm2, se debe estimar el APC como mayor de 100 veces la dilucin plaqueada ms alta, veces del rea de la placa.

c.

d.

4.1.2 Obtencin de resultados:

Como la placa de mayor dilucin contiene un nmero de colonias inferior a 25 ufc se procede a ejecutar la siguiente frmula: N = 25 x 1 / d

Donde d es la dilucin de la placa, en la cual se ha efectuado la contabilizacin de las colonias.

N = 25 x N= 250

Entonces el resultado se expresara como:

EAPC/ml < 250 ufc

4.2 Clculo de resultados para la ICMSF: La ICMSF, no cuenta con una formula preestablecida para el clculo de resultados, tan solo propone estimar el numero de colonias en base a promedios de las colonias obtenidas en las placas donde se haya sembrado por duplicado. Al nosotros sembrar tan solo una placa, se ha de tomar el valor obtenido como el representante de cada dilucin En este caso, teniendo un rango de colonias aceptables como normales para la ICMSF se tiene a los valores comprendidos entre 30 y 300 ufc/ml; es asi que nuestro valor obtenido en la mayor dilucin: 23 colonias, est muy por debajo del mnimo de colonias segn la ICMSF, es por ello que se procede de la siguiente manera: Se contabilizan las colonias al trmino de las 48 horas de incubacin, el nmero de colonias encontradas, (23 colonias) no est dentro del rango establecido por la ICMSF, entonces el resultado se expresara como igual al nmero de colonias obtenidas en la mayor dilucin por el factor de dilucin.

EAPC/ml = 23 x EAPC/ml = 230

Entonces el resultado se expresara como:

EAPC/ml= 230 ufc en la muestra estudiada

V.

DISCUSION En consecuencia de la muestra tomada de mercado Leoncio Prado de la ciudad de Tacna, se presentarn todos los resultados de los valores promedio del recuento de aerbios mesfilos con el mtodo del recuento estndar en placa, del nico muestreo realizado, en donde todos los materiales se encontraban en condiciones limpias, es decir, que aun no haban sido utilizados en el proceso, para ser luego sometidos al anlisis microbiolgico. La tabla N 01 muestra el comportamiento de la formacin de colonias aerobias mesfilas presentes en las diversas etapas del proceso.

Tras trabajar con dos fuentes bibliogrficas, se han obtenido dos resultados distintos pero estrechamente relacionado, en donde: la FDA, posee un rango de colonia menor con respecto a la ICMSF, ya la para la FDA el rango figuran entre 25 a 250 ufc/ml; mientras que la ICMSF de 30 a 300 colonias. El clculo de los resultados tambin es para ambas fuentes diferente, ya que mientras la FDA se basa en un formula preestablecida tomando el mnimo rango de colonias (25 ufc) multiplicado por el factor de dilucin, la ICMSF toma como resultado al valor obtenido de la multiplicacin de el numero de colonias obtenidas tras el recuento de la placa donde se sembr la mayor dilucin por el factor de dilucin, encontrando as que: FDA: EAPC/ml < 250 ufc ICMSF: EAPC/ml = 230 ufc

Si viene es cierto, son resultados con valores diferentes pero expresan ambos un numero de colonias aerobias mesfilas dentro del rango normal de ambas fuentes; es decir que los valores obtenidos expresan que la muestra tomada (refresco casero), no ha estado sumamente contaminada ya que el numero de ufc obtenido no son significativamente altos, y adems estn muy por debajo del rango normal de mesfilos aerobios. Adems, el recuento de aerobios mesfilos es un prueba que nos permite verificar la efectividad de los procedimientos de limpieza y desinfeccin, as como determinar si las temperaturas aplicadas en los procesos fueron las adecuadas en el caso del refresco seria si el agua ha sido o no hervida, tambin determinar el origen de la

contaminacin durante los procesos de elaboracin de los alimentos, verificar condiciones ptimas de almacenamiento y transporte, y obtener informacin acerca de la vida til de los alimentos, as como indicar alteracin incipiente en ciertos alimentos. (ICMSF, 2000)

Es por ello, que se puede asegurar que la muestra tomada del mercado Leoncio Prado, no ha presentado signos de haber estado sumamente contaminada, tya que los valor indicadores de contaminacin se encuentran del rango bajo normal.

Sin embargo, esto valores obtenidos del recuento estndar en placa estimado no son lo suficientemente exactos como para aseverar si un alimento es apto o no para el consumo, tan solo un recuento estndar en placa, ofrece valores confiables para determinar la aceptabilidad o el rechazo de la muestra examinada (ICMSF, 2000) La ICMSF, y el FDA, son fuentes que establecen parmetros internacionales, sin embargo internamente en el Per rige una normativa la cual indica si dentro del pas un alimento es consumible o no, por estar dentro del rango normal de los microorganismos encontrados en ellos; es as dicha normativa se titula Norma sanitaria que establece los criterios microbiolgicos de calidad sanitaria e inocuidad oara los alimentos y bebidas de consumo humano con resolucin ministerial N 591-2008-MINSA y publicado el 29 de agosto del 2008. En donde figuran para bebidas no carbonatadas en este caso refresco casero; un rango de aerobios mesfilos entre 10 y 100 por mililitro; es decir, los valores obtenidos de 23 colonias estn dentro del rango aceptable de estos microorganismos aerobios mesfilos, por lo que se asegura una vez ms que la muestra obtenida, no ha estado lo suficientemente contaminada como para declararla no apta para el consumo.

Finalmente, es necesario aportar que el recuento estndar en placa realizado por difusin posee muchas ventajas, ya que se emplea una cantidad alta de la muestra pero la desventaja es que el agar vertido en la placa petri luego de colocar la muestra puede alterar a microorganismos termosensibles, pudiendo as ofrecer datos relativamente errneos, por ellos es menester realizar otras pruebas complementarias como la de siembra en placa por gotitas, etc.

VI.

CONCLUSIONES

El recuento estndar en placa, permite determinar el nmero de ufc/ml de microorganismo contaminantes encontrados en la muestra. Los microorganismos aerobios mesfilos son indicadores de alteracin segn la normativa del Peruano, ms no indicadores de la calidad higinica. La muestra de refresco casero trabajada en laboratorio no ha estado sumamente contaminada, ya que los valores de ufc/ml obtenidos se encuentran dentro del rango normal para la normativa que rige en el Per para el consumo de alimentos.

Existen diferencias en cuanto a las dos fuentes de referencia en la practica, la ICMSF y el FDA, donde en primer lugar los rangos de contabilizacin de colonias es distinto 30 a 300 ufc y 25 a 250 ufc respectivamente. En segundo lugar el procedimiento para la obtencin de resultados mientras que uno se basa en un promedio y otro emplea una formula. Y en tercer lugar el modo de expresar los resultados.

VII.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

ICMSF. 2000. Microorganismos de los alimentos 1. Segunda edicin. Editorial ACRIBIA S.A. Zaragoza-Espaa. FDA. 2001.