Trombofilia Hereditaria: metodología de estudio e ...

Trombofilia Hereditaria: metodología de estudio e

interpretación

R. Lecumberri

Servicio de Hematología

Clínica Universidad de Navarra

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

¿Qué?

¿Cómo?

¿Cuándo? ¿Por qué?

¿Consecuencias?

¿A quién?


Trombofilia

Tendencia al desarrollo de episodios trombóticos debido a desequilibrio entre activación del sistema

hemostático y su inhibición fisiológica


Trombofilia primaria

Hereditaria

- Deficiencia de AT, PC, PS

- Resistencia PC activada

- Factor V Leiden

- Protrombina G20210A

- Hiperhomocisteinemia

- ¿otras?

Adquirida

- Hiperhomocisteinemia

- Anticuerpos antifosfolípido

Trombofilia secundaria

- Sepsis

- Neoplasias

- Embarazo/puerperio

- Cirugías

- Traumatismos

- Inmovilización

- Síndrome metabólico

- Prótesis vasculares

- Hiperviscosidad

- Estrógenos

-SMPC, HPN,...


60% de la variación de la susceptibilidad (heredabilidad) a trombosis venosa es atribuible a factores genéticos

Factores genéticos (60%)

Factores ambientales (40%)

Souto JC, et al. Am J Hun Genet 2000; 67: 1452-9.


Qué incluir en un estudio de trombofilia

1) Clara y consistentemente asociados con significativo riesgo trombótico (¿OR>2?) y relativamente frecuentes en pacientes con trombosis venosa (¿>0,5%?)

- Deficiencia anticoagulantes: Antitrombina, Proteína C y S - Polimorfismos protrombóticos: FV Leiden y PT 20210A - No incluir MTHFR

2) Potencial utilidad clínica:

- Deficiencia anticoagulantes: Antitrombina, Proteína C y S - Defectos combinados (Polimorfismos en homocigosis, o heterocigosis compuesta)

3) Estudiados siempre en consideración con la historia personal y familiar de trombosis.


Defecto Genético Prevalencia Prevalencia

TEV (%) controles (%)

Deficiencia AT 0.5-2 0.02

Deficiencia PC 3 0.2-0.4

Deficiencia PS 1.6 0.03-0.13

FV Leiden 10-15 4

PT G20210A 6-10 3

TOTAL: 25-35%

Riesgo Incidencia

relativo anual TEV (%)*

10-50 1.7-4.0

10 0.7-2.5

10 0.7-3.2

3-5 0.1-0.7

2-3 0.1-0.4

•Negatividad no indica que el sujeto no tiene un defecto genético protrombótico

•Prueba positiva no indica que sea la causa del evento trombótico

*estudios familiares

Defectos genéticos que deben ser evaluados en estudios de trombofilia Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

60% de la variación de la susceptibilidad (heredabilidad) a trombosis venosa es atribuible a factores genéticos

Factores genéticos (60%)

Factores ambientales (40%)

Cientos de estudios de asociación en SNPs en genes candidatos: - Resultados inconsistentes o RR muy bajos (<1,5) - ABO. Grupos no OO: 1,8-2,5 veces


A quién realizar estudio de trombofilia

En los que sea útil (coste-beneficio):

1) Alta probabilidad de encontrar defecto

Y

2) La identificación sea útil en la prevención o

tratamiento


De Stefano V & Rossi E. Thromb Haemost 2013; 110: 697-705.


• NO estudio universal

• NO individuos asintomáticos expuestos a situaciones de riesgo:

ACO, THS, embarazo, COT

(10% éxito, especialmente polimorfismos) pero bajo riesgo absoluto de desarrollo de TEV

(estrategias no coste/efectivas)

(Wu & Greer. Curr Opin Hematol 2007; 14: 500-503).

A quién realizar estudio de trombofilia Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

1. Trombosis recurrente

2. Trombosis venosa antes de los 50 años

3. Trombosis venosa espontánea

4. Trombosis venosa de localización inusual (cerebral, mesentérica, portal,

hepática)

5. Trombosis venosa en paciente con historial familiar de trombosis venosa

6. Trombosis venosa secundaria a embarazo, uso de anticonceptivos orales o

tratamiento con terapia hormonal sustitutiva

7. Púrpura neonatal (AT, PC, PS)

8. Necrosis cutánea al iniciar AVK (PC, PS)

A quién realizar estudio de trombofilia

¿Complicaciones obstétricas? ¿Trombosis arterial? ¿Familiares asintomáticos de pacientes portadores?


Intensidad, esquema o tipo del tratamiento anticoagulante:

Prácticamente ninguna alteración trombofílica justifica una modificación de la

intensidad del tratamiento

Duración del tratamiento anticoagulante: Prolongación solo atendiendo a la historia clínica personal y familiar

Relación con defectos trombofilicos severos:

[Deficiencia anticoagulantes (especialmente AT) y defectos combinados]

Profilaxis en situaciones de riesgo. No debe modificarse por la presencia de una alteración trombofílica

Excepción: terapia sustitutiva en deficientes de antitrombina

¿Mujeres gestantes?

Por qué realizar estudio de trombofilia Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014

Cómo realizar estudio de trombofilia: AT

- SERPINA: IIa, Xa, XIa, XIIa, otros

- Síntesis Hepática (no dependiente de Vit. K).

- Acción biológica potenciada por glicosaminoglicanos

- Primera trombofilia descrita: Egeberg 1965



SCREENING (deficiencia si nivel <70%)

- Test funcional amidolítico (actividad anti-IIa ó Xa) con exceso de trombina /FXa

en presencia de heparina. Trombina/FXa residual actúan sobre sustrato cromogénico

y es inversamente proporcional a la concentración de AT en la muestra

2º TIEMPO

- Determinación antigénica (ELISA...)

- Test funcional en ausencia de heparina e incubación prolongada (actividad progresiva)

3º TIEMPO

-Estudio genético (Gen SERPINC1: cromosoma 1, 7 exones, 13.5 kb)

Tipo Deficiencia Cantidad de AT Actividad biológica Observaciones

I Disminuida Disminuida Tipo más frecuente

IIRS Normal Disminuida Anomalía sitio reactivo

IIHBS Normal Normal (en ausencia

de heparina)

Anomalía en el sitio de

unión heparina-AT

IIPE Ligeramente

Disminuidos

Disminuida Disfunción proteica con

baja concentración

< riesgo

de TEV



Khor B & Van Cott EM. Am J Hematol 2010; 85: 947-50


Cómo realizar estudio de trombofilia: PC

- Síntesis Hepática (dependiente de Vit. K).

- Activada por complejo Trombina-Trombomodulina (+EPCR)

- Inactiva a los factores Va y VIIIa

- Precisa de PS como cofactor

- --

T

M

II

a

PC

EPC

R

PC

EPC

R

VaiAP

CX

a

VIII

aiAP

C IX

aX

V


- Deficiencia tipo I: Cuantitativa ( Funcional y antigénica)

- Deficiencia tipo II: Cualitativa ( Funcional )

Cómo realizar estudio de trombofilia: PC

SCREENING

- Test funcional: con plasma deficiente en PC + activador específico de PC

(Protac) + cefalina. La actividad de la PC es proporcional a la prolongación

del TTPa o mediante sustrato cromogénico.

- VN: 70-120%

- Mayoría heterocigotos: 30-60%

- Homocigotos o dobles heterocigotos: <25%

2º TIEMPO

- Determinación cuantitativa (ELISA)

3º TIEMPO

-Estudio genético (Gen PROC: cromosoma 2; 9 exones)


Cómo realizar estudio de trombofilia: PS

- Síntesis Hepática (dependiente de Vit. K).

- Cofactor de la PC (favorece su unión a fosfolípidos -)

- Circula en forma libre o unida a C4bBP (60%, no actividad

cofactor-PCa)

ß

PS unida a C4b-BP

PS

PS libre

PS

C4b-BP

(40%) (60%)Con

actividad

anticoagulan

te

Sin

actividad

anticoagulan

te


Cómo realizar estudio de trombofilia: PS

SCREENING

- Test funcional coagulativo con plasma deficiente en PS + PCa + FVa.

- Artefacto en caso de Resistencia a la PCa (FV Leiden)

2º TIEMPO

- Determinación cuantitativa (Inmunoturbidimétrico/ELISA) de PStotal y PSlibre

3º TIEMPO

-Estudio genético (Gen PROS1: cromosoma 3; 15 exones + pseudogen PROSP 2)


Bereczky S, et al. Clin Chem Lab Med 2010; 48 (suppl 1): S53-S66


Cómo realizar estudio de trombofilia: AT, PC y PS

NUNCA EN EL EPISODIO AGUDO

UN MES DESPUES DE RETIRAR EL TRATAMIENTO ANTICOAGULANTE

INTERPRETACIÓN ATENDIENDO A OTROS FACTORES

RESULTADO POSITIVO DEBE SER REPETIDO O CONFIRMADO EN FAMILIARES


Cómo realizar estudio de trombofilia: RPCa

Pruebas de laboratorio

Resistencia a la proteína C activada:

Plasma

Normal

FL, Ca2+

FL, Ca2+

PCA

t

tPCA

Dahlbäck

Cociente =tPCA

t Respuesta anticoagulanteRespuesta anticoagulante



FV Leiden

1487 1701

Exón 10

5´ 3´

E1 E25

1691

• Gen FV Leiden

A

Factor V Leiden

• Proteína FV Leiden

A3 , C1 , C2

21961546

COOHA2A1

1 303 317 656 709

NH2

FVLFXa y/o Trombina

Arg 306 Arg 679

FVLa??

PCA

Gln 506Gln 506Gln 506

FVi



- Método Original: Variante del TTPa (+PCa)

- Corrección al añadir plasma (FV) normal

- Método Modificado: preincubación con plasma deficiente en FV

- Mayor S y E para discriminar la presencia de FVL

- No influido por TAO o heparina

- No tan fiable para otras causas adquiridas de RPCa

-3ª generación: Activador de protrombina dependiente de FV (Noscarina)

- Mayor S y E para FVL (prácticamente 100%)

- Menor influencia por AL, PC, PS …


Ahorro económico: 5$ vs 60$

Prüller F, et al. N Engl J Med; 2014: 685-6.


Detección de FV Leiden

1 2 3 4

1: Marcador pares de bases

2: GG 3: GA 4: AA

67 pb

Células serie

blanca

PCR Factor V Digestión MnlI

Electroforesis

en gelGradiente

Ficoll

Extracción

DNA

267 pb

267 pbMnl I

200 pbFVL

200 pb

67 pb

163 pb

37 pb

163 pb 67 pb37 pbFV

Detección de G20210A

Gradiente

Ficoll

Células serie

blanca

Extracción

DNA

1: Marcador pares de bases

2: GG 3: GA 4: AA

1 2 3 4

345 pb322 pb

23 pb

322 pb 23 pb20210G

345 pbHind III

20210A

20210G345 pb

345 pb322 pb

23 pb

Digestión

Hind III

Electroforesis

en gelPCR

protrombina

345 pb

Cómo realizar estudio de trombofilia: FV Leiden y Protrombina G20210A

En cualquier

momento


Cómo realizar estudio de trombofilia: Homocisteinemia


- Determinación en ayunas

- No se precisa sobrecarga de metionina

- No se recomienda analizar el polimorfismo C677T MTHFR

- Suplementos de ac. fólico y vitamina B12 reducen los niveles

de Hcy pero ¿modifican el riesgo vascular?

Cómo realizar estudio de trombofilia: Homocisteinemia

Di Minno MN, et al. Thromb Haemost 2010; 103: 942-61


Niveles de Factores de coagulación: ¿Sólo FVIII y FIX?

Cómo realizar estudio de trombofilia: Otros

- No clara correlación con riesgo de recurrencia

- No determinan duración del tto. anticoagulante

- Aumento de riesgo continuo (cut-off arbitrario)

- Influencia de variables pre-analíticas y condiciones clínicas

Nossent AY, et al. Semin Hematol 2007; 44: 77-84.


Chips múltiples SNPs

- Efecto aditivo de varios SNPs en riesgo vascular

- Algoritmos matemáticos (gen-gen / gen-ambiente)

- Mejoran predicción de riesgo vascular

- Consejo individualizado

Cómo realizar estudio de trombofilia: Otros

Lluis-Canella C, et al. Atherosclerosis 2012; 222: 456-63.


ALGORITMO DIAGNÓSTICO BIOLÓGICO DE TROMBOFILIA

I. Situación clínica Primaria Secundaria o mixta

Tromboembolismo venoso :

<50 años

Recurrente

Familiar

Localización inusual

Secundaria a ACO, embarazo, THS

Necrosis

cutánea

dicumarínicos

Trombosis

o púrpura

neonatal

Resistencia

a heparina

1) Abortos repetición

2) Trombosis arteriales

recidivantes o jóvenes

Asociada a

factores

trombogé-

nicos

Déficit AT, PC, PS

RPCa/FVL

PT 20210

SAF

Déficit PC

Déficit PS

Déficit AT

Déficit PC

Déficit PS

Déficit AT SAF

¿otros?

SAF: síndrome antifosfolípido; AL: Anticoagulante lúpico; AA: Anticuerpos antifosfolípido (Anticuerpos anticardiolipina y anti b2-GPI); PS: proteína S; PC: Proteína C; AT: Antitrombina; PT:

protrombina; RPCa: resistencia a proteína C activada; ACO: Anticonceptivos orales; THS: Terapia hormonal sustitutiva; LES: Lupus eritematoso sistémico; CIE: Cross-inmunoelectroforesis

Evaluación rutinaria: TTPA, TP, TT

No estudio

específico

salvo

sospecha

II. Estudios específicos de trombofilia primaria (subrayado primera elección)

AT

Funcional (anti-Fxa/IIa)

Antígeno/CIE/secuenc.

PC

Funcional

(cromogénico/coagulativo)

Antígeno

PS

Funcional + Antígeno libre

RPCa

Funcional genético

PT 20210

Genético

SAF

AL

AA

Sin cumarínicos (al menos 3semanas) ni DOACs Sin heparina

ni DOACs

No realizar en el episodio agudo. Si positivo, confirmar en otra muestra y estudios

familiares susceptibles

Estudios familiares ¿sólo defecto

homocigoto o combinado?


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