METODOLOGÍA DE ANÁLISIS METODOLOGÍA DE ANÁLISIS DE LA INFORMACIÓN DE LA INFORMACIÓN

HEREDITARIAHEREDITARIA

Dra. Adriana MimbacasDra. Adriana Mimbacas

HISTORIAHISTORIA

CRONOLOGIACRONOLOGIA

CITOGENETICA

1866: Mendel describe las unidades fundamentales

de la herencia

1925: se descubre que la actividad del gen está

relacionada con su posición en el cromosoma.

1953: se propone la estructura en doble hélice del ADN

1956: Tijo y col.: Nº real de cromosomas = 46

1959: Lejeune y col. describieron la primera aberración

cromosómica numérica (síndrome de Down)

 inclusión en parafina y cortes con micrótomo,

técnica de aplastado

cultivo celulares "in vitro".

METODOS DE ESTUDIOS

esterilidad, medios de cultivos apropiados y

sus aditivos, dispositivos apropiados para el

cultivo, temperatura, pH, tensión del gas.

Existen múltiples factores que inciden en la obtención exitosa de un cultivo:

CULTIVOS IN VITRO Permiten obtener células en el estadio de metafases en la división mitótica

Se observan diferentes regiones:

estrechamientos o constricciones. Primarias Secundarias

MORFOLOGÍA DE LOS CROMOSOMAS METAFÁSICOS

HUMANOS: Centrómero localizadoCentrómero difuso: holocéntrico (ej: insectos, arácnidos primitivos).

CONSTRICCION PRIMARIA

Estrechamientos constantes en posición y tamaño.

En ciertos casos están íntimamente relacionadas al organizador nucleolar (evidenciadas por hibridización "in situ" con ARN ribosomal)

CONSTRICCIONES SECUNDARIAS:

segmento cromosómico presente entre el organizador nucleolar y el telómero

(grupo D humano).

SATELITES

Caracterizan a una especie. Se evidencian fundamentalmente en metafase. Las más importantes son: 

CONSTANTES CROMOSOMICAS

número cromosómico

el complemento somático diploide (2n) del ser humano es 46 formado por el aporte haploide de cada gameto

(23 cr=n) (n23+n23=2n46). 

característico de cada especie.

Se tiene en cuenta la longitud relativa con respecto a la suma de la longitud de un conjunto cromosómico haploide

tamaño cromosómico

morfología cromosómica

• Presentan 2 brazos cromosómicosPresentan 2 brazos cromosómicos– Brazo corto: pBrazo corto: p– Brazo largo: qBrazo largo: q

• Se clasifican de acuerdo a la Se clasifican de acuerdo a la posición del centrómero en:posición del centrómero en:– MetacéntricosMetacéntricos– SubmetacéntricosSubmetacéntricos– AcrocéntricosAcrocéntricos– Telocéntricos (no existen en el Telocéntricos (no existen en el hombre)hombre)

CENTROMERO

BRAZO LARGO

BRAZO CORTO METACENTRICOCENTROMERO CENTRAL

CENTROMERO

SUBMETACENTRICOBRAZOS DESIGUALES

CENTROMEROACROCENTRICOCENTROMERO EN POSICION SUBTERMINAL(UN BRAZO MUY CORTO)

Morfología cromosómica

Es un arreglo sistematizado de los cromosomas de una célula la cual es fotografiada y ordenada de acuerdo a las normas establecidas (tamaño, morfología). Es característico de un individuo y no cambia.

CARIOTIPO

Bandas transversales claras y oscuras .

Localización fija,

Su nombre se debe a que la tinción se realiza con Giemsa

Corresponden a:1) genes de replicación tardía ricas en AT

(oscuras)2) Genes de replicación temprana ricas en GC

(claras)

BANDEO G:

1

2

3

Es la representación en forma de diagrama del cariotipo y su construcción se realiza en base a valores promedios.

IDIOGRAMA:

métodos salinos,

enzimáticos (tripsina, pronasa),

técnicas varias en las que se incluyen sustancias como urea, permanganato de potasio).

Los métodos de obtención e bandas cromosómicas son variados y pueden agruparse en:

Bandeo G:Bandeo G:

• Es el bandeo que Es el bandeo que se utiliza en la se utiliza en la nomenclatura de nomenclatura de los cariotiposlos cariotipos

NOMENCLATURANOMENCLATURA

Sigue ciertas normas establecidas por convenciónSigue ciertas normas establecidas por convención

Número de cromosomas seguidos de una comaNúmero de cromosomas seguidos de una coma

cromosomas sexuales, seguidos de una comacromosomas sexuales, seguidos de una coma

alteraciones encontradas:alteraciones encontradas: del = deleccióndel = delección

t = translocaciónt = translocación

ins = inserciónins = inserción

I = isocromosomaI = isocromosoma

r = anillo r = anillo

Seguidos de paréntesis cromosoma involucrado(s), bandas afectadas

ejemplosejemplos

mujer normal: 46, XXmujer normal: 46, XX

hombre normal 46, XYhombre normal 46, XY

mujer con alteración numérica: mujer con alteración numérica: 45, XX, -845, XX, -8

hombre con alteración estructural: hombre con alteración estructural: 46, XY, t(8,14)46, XY, t(8,14)

mujer con alteración estructural: 46, mujer con alteración estructural: 46, XX, del(9p12)XX, del(9p12)

El complemento cromosómico puede experimentar variaciones debido a:

ALTERACIONES DEL COMPLEMENTO CROMOSOMICO

•modificaciones en el número de los cromosomas que lo constituyen: alteraciones numéricas

•Modificaciones en la estructura de los cromosomas: alteraciones estructurales

HETEROPLOIDIA: cualquier alteración en el número normal del cariotipo

1. HAPLOIDIA:

1 sólo juego crom. (monoploide)

2. POLIPLOIDIA: aumento por duplicación

del complemento

cromosómico entero

(poliploide)

3. ANEUPLOIDIA: organismos o células que

tienen uno o más

cromosomas que el número

básico de la especie. 

ANOMALIAS NUMERICAS

AneuploidíaAneuploidía

MonosomíasMonosomías: : ausencia de un cromosoma ausencia de un cromosoma del par de homólogos = 2n - 1 (viable 45 del par de homólogos = 2n - 1 (viable 45 X0)X0)

TrisomíasTrisomías: : presencia de más de un presencia de más de un

cromosoma en el par de homólogos = 2n cromosoma en el par de homólogos = 2n +1 (producen abortos aunque existen +1 (producen abortos aunque existen algunas que son viables con diferente algunas que son viables con diferente grado de sobrevida: tri 21, tri 13, tri 18, grado de sobrevida: tri 21, tri 13, tri 18, 47XXY)47XXY)

Mosaicos: Mosaicos: coexistencia de células normales coexistencia de células normales y alteradasy alteradas

Anomalias numéricas

Síndrome de Down 47, XX, + 21

Síndrome de Patau: 47,XX, + 13

Síndrome de Edwards: 47, XY, +18

Síndrome de Turner 45, X0

Mujer tri-X: 47, XXX

Síndrome de Klinefelter: 47, XXY

ANOMALIAS ESTRUCTURALESANOMALIAS ESTRUCTURALES

IN TR AC R O M O S O M IC A

IN TE RC R O M O S O M IC A

N O R M A L ID A D

R E U N IO NC O R R E C TA

S IN P E R D ID AD E M A TE R IA L

C O N P E R D ID AD E M A TE R IA L

A N O M A L IA SE S TR U C TU R A L E S

R E U N IO NIN C O R R E C TA

R U P TU R AC R O M O S O M IC A

ALTERACIONES ESTRUCTURALES

Los cambios de la estructura cromosómica pueden ser agrupados en dos grandes categorías:

cromáticas cuando afectan a una sola de las cromátidas y

cromosómicas cuando afectan a ambas cromátidas en el mismo punto.

cambios submicroscópicoscambios submicroscópicos: :

mutación génica o puntualmutación génica o puntual

• cambios microscópicos:cambios microscópicos:

afectan el número y/o el arreglo afectan el número y/o el arreglo de losde los

loci de los genesloci de los genes

pérdida de un segmento pérdida de un segmento

aumento de un segmentoaumento de un segmento

reordenamiento intracromosómicoreordenamiento intracromosómico

reordenamiento intercromosómico reordenamiento intercromosómico

DELECION

Cri du Chat: 46, XX, del (5p14)

ISOCROMOSOMAS

MECANISMO NORMAL

INVERSION

fracturas con giro de 180º del fragmento intersticial.

En el hombre las inversiones más frecuentes son las que afecta las regiones heterocromatínicas del 1, 9, 16

pueden no causar alteraciones en el individuo, pero pueden provocan alteraciones en la descendencia.

Se clasifican en:

SIMPLES: un sólo segmento invertido y según su relación al centrómero pueden ser:- pericéntrica: si el fragmento involucra el centrómero- paracéntrica: si no lo involucra

COMPLEJASCOMPLEJAS::

se invierten se invierten simultáneamente simultáneamente varios segmentos de varios segmentos de un mismo cromosomaun mismo cromosoma

SI LA INVERSION OCURRE EN LOS PRECURSORES DE LOS GAMETOS PUEDE PRODUCIR GENOMAS ANORMALES EN LA PROGRESION A TRAVES DE LA MEIOSIS.

LA RECOMBINACION ENTRE HOMOLOGOS EN EL CUAL UNO DE ELLOS TENGA UNA INVERSION Y EL OTRO NO PUEDE RESULTAR EN ANOMALIAS CROMOSOMICAS

CROMOSOMA EN ANILLO

DUPLICACION

TRANS. NO BALANCEADA

TRANS. BALANCEADA

Anormalidades Cromosómicas Amniocentesis en Población General

Anormalidades Cromosómicas Amniocentesis en Población General

Rearreglos

Otras Aneuploidías

Otros Mosaicos

Mosaicos X&Y

Trisomía 21

Aneuploidías X & Y

Trisomía 13, 18

Rearreglos

Otras Aneuploidías

Otros Mosaicos

Mosaicos X&Y

Trisomía 21

Aneuploidías X & Y

Trisomía 13, 18

18.518.5

3.33.34.04.0 2.42.4

53.953.9

24.024.0

22.122.1

N = 354.341 amniocentesis; 5.802 anormalidades (1.64%)N = 354.341 amniocentesis; 5.802 anormalidades (1.64%)

71.971.9

Anormalidades CromosómicasPoblación de Edad Materna Avanzada

Anormalidades CromosómicasPoblación de Edad Materna Avanzada

Rearreglos

Otras aneuploidías

Otros mosaicos

Mosaicos X&Y

Trisomía 21

Aneuploidías X&Y

Trisomía 13, 18

Rearreglos

Otras aneuploidías

Otros mosaicos

Mosaicos X&Y

Trisomía 21

Aneuploidías X&Y

Trisomía 13, 18

1.91.9

3.53.5 1.21.2

14.814.8

63.663.6

17.017.019.419.4

N=88.800 amniocentesis; 1.833 anormalidades (2.08%)N=88.800 amniocentesis; 1.833 anormalidades (2.08%)

78.578.5

Estudios en:• sangre periférica• líquido amniótico• Vellosidades coriales• Sangre o tejidos neoplásicos

APLICACION DEL ANALISIS CITOGENETICO

TÉCNICAS PARA DETECTAR TÉCNICAS PARA DETECTAR CAMBIOS CAMBIOS SUBMICROSCOPICOSSUBMICROSCOPICOS

Técnicas molecularesTécnicas moleculares

Fue originalmente descripta en 1969 Fue originalmente descripta en 1969

utilizando sondas marcadas con utilizando sondas marcadas con 3232P P

radioactivo (Gall y Pardue, 1969).radioactivo (Gall y Pardue, 1969).

HIBRIDIZACION IN SITU

SONDA: fragmento de ADN que es “marcado “ con métodos radioactivos o por inmuno-histoquímica

Estas sondas se unen a su ADN complementario localizado en cromosomas fijados en un portaobjeto

DEFINICION DEFINICION

• La La hibridización "in situ"hibridización "in situ" es una es una

detección directa de ácidos detección directa de ácidos

nucleícos en el material celular en el nucleícos en el material celular en el

cual se puede realizar a la vez, un cual se puede realizar a la vez, un

análisis morfológico. (análisis morfológico. (Herrington y Herrington y

McGee, 1994)McGee, 1994)

APLICACIONESAPLICACIONES

Rápida identificación de Rápida identificación de cromosomas humanos específicos cromosomas humanos específicos en híbridos celulares somáticosen híbridos celulares somáticos

Identificación de cromosomas Identificación de cromosomas marcadores en metafases marcadores en metafases cromosómicascromosómicas

Mapeo de genes en la investigación Mapeo de genes en la investigación del genoma.del genoma.

Búsqueda de aberraciones Búsqueda de aberraciones cromosómicas en estudios de cromosómicas en estudios de dosimetría de radiación.dosimetría de radiación.

Identificación de cambios Identificación de cambios cromosómicoscromosómicos

Estas sondas se obtienen de Estas sondas se obtienen de genotecas de ADN recombinante genotecas de ADN recombinante producidos a partir de producidos a partir de cromosomas específicos aislados cromosomas específicos aislados por medio de un clasificador por medio de un clasificador celular y clonados en vectores celular y clonados en vectores (fago lambda o plásmido pBR)(fago lambda o plásmido pBR)

Se marcan con fluoroforosSe marcan con fluoroforos

WHOLE CHROMOSOME WHOLE CHROMOSOME PAINTINGPAINTING

Utiliza como sonda fragmentos que Utiliza como sonda fragmentos que

contienen secuencias homólogas de contienen secuencias homólogas de

ADN a lo largo de todo un ADN a lo largo de todo un

cromosomacromosoma

Deleción del 22q11.23Sonda Dual Color DiGeorge/VCFS TUPLE 1

Microdeleción Prader-Willi / Angelman Sonda LSI SNRPN/ CEP 15/ PML

•FISH detecta la deleción de la región 15q11-13.

Traslocación del SRY al Xp

Mezcla de sondas:

LSI SRY SpectrumOrange – región delecionada

CEP X SpectrumGreen

– sonda control

DUPLICACION

APLICACIONESAPLICACIONES

Rápida identificación de cromosomas Rápida identificación de cromosomas humanos específicos en híbridos celulares humanos específicos en híbridos celulares somáticossomáticos

Identificación de cromosomas marcadores Identificación de cromosomas marcadores en metafases cromosómicasen metafases cromosómicas

Mapeo de genes en la investigación del Mapeo de genes en la investigación del genoma.genoma.

Búsqueda de aberraciones cromosómicas Búsqueda de aberraciones cromosómicas en estudios de dosimetría de radiación.en estudios de dosimetría de radiación.

Identificación de cambios cromosómicosIdentificación de cambios cromosómicos

GENOMAGENOMA

DEFINICIÓNDEFINICIÓN

• 1920: set de cromosomas de una célula 1920: set de cromosomas de una célula haploide de un organismo. haploide de un organismo.

• 1970: suma total de genes. (no se conocía aún 1970: suma total de genes. (no se conocía aún la existencia secuencias no codificantes). la existencia secuencias no codificantes).

• Hoy: es un sistema estructural, funcional y Hoy: es un sistema estructural, funcional y evolutivo. (Es mucho más que la suma de sus evolutivo. (Es mucho más que la suma de sus partes: regiones codificantes 3% del total y no partes: regiones codificantes 3% del total y no codificantes). codificantes).

UnUn marcador “genético” marcador “genético” es una es una característica genética discreta y característica genética discreta y segregante que caracteriza a una segregante que caracteriza a una población por virtud de su presencia, población por virtud de su presencia, ausencia, alta o baja frecuenciaausencia, alta o baja frecuencia (Crawford, (Crawford, 1973).1973).

Marcador genéticoMarcador genético: corre: correspondesponde a un a un lugar específico en el genoma con lugar específico en el genoma con segregación demostrable y de confiable segregación demostrable y de confiable determinación que presenta variación determinación que presenta variación (polimorfismo) en las poblaciones.(polimorfismo) en las poblaciones.

ASPECTOS CITOGENTICOS Y ASPECTOS CITOGENTICOS Y MOLECULARES DE TUMORESMOLECULARES DE TUMORES

LLas diferencias cruciales entre cas diferencias cruciales entre céélulas lulas normales y cnormales y céélulas cancerosas se lulas cancerosas se encuentran en los cambios discretos encuentran en los cambios discretos que se producen en genes especque se producen en genes especííficos ficos que controlan la proliferacique controlan la proliferacióón y n y homeostasis tisularhomeostasis tisular

Esos genes cuando son activados Esos genes cuando son activados conducen a una proliferaciconducen a una proliferacióón celular n celular

desregulada.desregulada.

Existen tres tipos de cambios que Existen tres tipos de cambios que ocurren cuando una célula comienza ocurren cuando una célula comienza la tumorogénesisla tumorogénesis

• Inmortalización:Inmortalización: crecimiento crecimiento indefinidoindefinido

• Transformación:Transformación: describe los fallos describe los fallos que se observan en el crecimiento que se observan en el crecimiento normalnormal

• Metástasis:Metástasis: capacidad de las células capacidad de las células tumorales de invadir otros tejidostumorales de invadir otros tejidos

Existen dos clases de genes en los Existen dos clases de genes en los cuales las mutaciones pueden cuales las mutaciones pueden inducir la transformacióninducir la transformación

• ONCOGENESONCOGENES

• GENES SUPRESORES DE GENES SUPRESORES DE TUMORTUMOR

ONCOGENESONCOGENES

• Inicialmente identificados como Inicialmente identificados como genes portados por virus que causan genes portados por virus que causan transformación en las células blancotransformación en las células blanco

• La mayoría de los oncogenes virales La mayoría de los oncogenes virales tiene su contrapartida celular tiene su contrapartida celular involucrada en funciones normales involucrada en funciones normales de la célula (protoncogenes)de la célula (protoncogenes)

Son genes dominantes, (protooncogenes) que en

el genoma normal, codifican proteínas, las

cuales funcionan como:

• factores de crecimiento,

• receptores de factores de crecimiento,

• señales de traducción de proteínas

• proteínas nucleares involucradas en regulación

transcripcional.

La generación de un oncogen representa una

ganancia de función en la cual un protooncogen

celular está inapropiadamente activado.

Esto puede involucrar:• un cambio mutacional en la proteína, • o activación constitutiva, • sobre-expresión • o falla en el apagado de la expresión en el tiempo

adecuado.

La activación de oncogenes, actuando en forma dominante, es un paso importante en la cascada de eventos que finalmente conducen al desarrollo de un cáncer invasivo

La transformación puede ocurrir: •espontáneamente

•o puede ser causada por la infección de ciertos virus tumorales.

 

VIRUS ONCOGENICOSVIRUS ONCOGENICOS

• la región temprana del virus utiliza splicing la región temprana del virus utiliza splicing alternativos para sintetizar proteínas (T-alternativos para sintetizar proteínas (T-antígenos) que son requeridos para la antígenos) que son requeridos para la expresión de la región tardía y para la expresión de la región tardía y para la replicación del ADN viral.replicación del ADN viral.

• Se integran al genoma de la célula huésped Se integran al genoma de la célula huésped produciendo transformaciónproduciendo transformación

• Los virus humanos equivalentes al SV40 y Los virus humanos equivalentes al SV40 y al polioma son los virus BK y JC. El BK puede al polioma son los virus BK y JC. El BK puede transformar ctransformar céélulas en cultivo pero no se ha lulas en cultivo pero no se ha asociado a ningasociado a ningúún cn cááncer humano en ncer humano en concreto.concreto.

Poliomas (ADN)Poliomas (ADN)

• Provoca tumores epiteliales Provoca tumores epiteliales generalmente benignos pero también generalmente benignos pero también se asocian a cánceres cervicales (E6, se asocian a cánceres cervicales (E6, E7)E7)

• Las proteínas producidas inmortalizan Las proteínas producidas inmortalizan las células blancolas células blanco

Papiloma (ADN) HPV,

• Comprende un gran grupo de virus Comprende un gran grupo de virus relacionadosrelacionados

• En humanos generalmente se asocia En humanos generalmente se asocia a enfermedades respiratoriasa enfermedades respiratorias

• Las células transformadas ganan una Las células transformadas ganan una parte de la región temprana del virus parte de la región temprana del virus que contienen los gene E1A y E1B que contienen los gene E1A y E1B que codifican para proteque codifican para proteíínas nas nucleares.nucleares.

• Ej: Epstein bar virus: carcinomas Ej: Epstein bar virus: carcinomas nasofaringeo nasofaringeo

Adenovirus (ADN)

Retrovirus (ARN)Retrovirus (ARN)

La transformación mediante

retrovirus es más complejo que la de

los virus a ADN

Su ciclo de vida básico no incluye

proteínas con actividad

transformante.

ELEMENTOS GENETICOS DEL PROVIRUS Y DE LOS PRODUCTOS GENICOS DEL VIRUS

ESQUEMA DEL CICLO DE VIDA DE UN RETROVIRUS

Ciclo de vidaCiclo de vida• 2 moléculas de ARN unidas por 2 moléculas de ARN unidas por

enlaces no covalentesenlaces no covalentes• Cada molécula tiene un ARNt unidoCada molécula tiene un ARNt unido• Cada virión contiene alrededor de Cada virión contiene alrededor de

50 moléculas de transcriptasa 50 moléculas de transcriptasa inversainversa

• En el citoplasma la transcripción En el citoplasma la transcripción inversa utiliza el ARNt como cebador inversa utiliza el ARNt como cebador para iniciar la síntesis de ADN para iniciar la síntesis de ADN

MECANISMO DE TRANSCRIPCION INVERSA

• Después de la transformación, Después de la transformación, el transcripto inverso migra el transcripto inverso migra hacia el núcleo donde se hacia el núcleo donde se circulariza y se integra al circulariza y se integra al genoma del huéspedgenoma del huésped

INTEGRACIÓN DE UNA MOLÉCULA DE ADN CIRCULAR DEL RETROVIRUS

• El ADN integrado (provírico) se El ADN integrado (provírico) se convierte en el molde para la convierte en el molde para la síntesis de ARNsíntesis de ARN

• Las secuencias de promotor e Las secuencias de promotor e intensificador y las señales de intensificador y las señales de poliadenilación están en el LTRpoliadenilación están en el LTR

• Ambas LTR poseen secuencias Ambas LTR poseen secuencias idénticas pero la 5’ promueve idénticas pero la 5’ promueve la transcripción y la la transcripción y la 3’especifica el sitio del poli(A)3’especifica el sitio del poli(A)

• 11a a evidencia de virus transductores: evidencia de virus transductores: virus de sarcoma de Rous contiene virus de sarcoma de Rous contiene

secuencias de nucleótidos que no se secuencias de nucleótidos que no se encuentran en retrovirus muy encuentran en retrovirus muy relacionados pero no transformantes relacionados pero no transformantes (secuencia (secuencia srcsrc))

• Esta secuencia fue encontrada luego en Esta secuencia fue encontrada luego en los vertebrados en el ADN normallos vertebrados en el ADN normal

• Un gen que es capaz de producir Un gen que es capaz de producir transformación celular puede surgir transformación celular puede surgir de un gen celularde un gen celular

• Por lo tanto la inducción del cáncer Por lo tanto la inducción del cáncer puede implicar la acción de genes puede implicar la acción de genes normales normales

• Los oncogenes se denominan con Los oncogenes se denominan con

letras cursivas letras cursivas scrscr

• El gen en un retrovirus se indica El gen en un retrovirus se indica

con el prefijo v (v-scon el prefijo v (v-scrcr) )

• El equivalente en el gen celular El equivalente en el gen celular

normal o proto-oncogen se indica normal o proto-oncogen se indica

con el prefijo c (c-con el prefijo c (c-scrscr))

• Los retrovirus transductores surgen como Los retrovirus transductores surgen como resultado de reordenamientos complejos resultado de reordenamientos complejos después de la integración del retrovirus después de la integración del retrovirus cerca de un protoncogen celularcerca de un protoncogen celular

• La actividad transformante es La actividad transformante es proporcionada por la información genética proporcionada por la información genética celular adquirida, los elementos genéticos celular adquirida, los elementos genéticos que permiten que los oncogenes se que permiten que los oncogenes se expresen y se transfieran de cél en cél se expresen y se transfieran de cél en cél se hereda del retrovirus madrehereda del retrovirus madre

¿Cómo un protooncogen se ¿Cómo un protooncogen se convierte en oncogen?convierte en oncogen?

• Cuando un gen celular normal se Cuando un gen celular normal se convierte en un oncogen de un convierte en un oncogen de un retrovirus se altera significativamenteretrovirus se altera significativamente

• Existen 3 tipos de alteraciones las Existen 3 tipos de alteraciones las que pueden afectar a la región de que pueden afectar a la región de codificación del gen o la expresión del codificación del gen o la expresión del mismomismo

• 1) un oncogen de un retrovirus es 1) un oncogen de un retrovirus es transcripto en cantidades más elevadas transcripto en cantidades más elevadas y en una gama diferente de células que y en una gama diferente de células que su protooncogen normalsu protooncogen normal

• 2) pérdida de parte de los genes 2) pérdida de parte de los genes celulares; la eliminación de segmentos celulares; la eliminación de segmentos podría desrregluar la actividad de una podría desrregluar la actividad de una proteína que, expresada a altos niveles proteína que, expresada a altos niveles transformaría célulastransformaría células

• 3) mutaciones puntuales deferencian 3) mutaciones puntuales deferencian protooncogenes celulares de oncogenes protooncogenes celulares de oncogenes

CONSECUENCIAS DE LAS CONSECUENCIAS DE LAS ALTERACIONESALTERACIONES

• A) Cambio cuantitativo a nivel de A) Cambio cuantitativo a nivel de la proteína codificadala proteína codificada

• B) Cambio cualitativo de la B) Cambio cualitativo de la proteína en si mismaproteína en si misma

RETROVIRUS HUMANOSRETROVIRUS HUMANOS

• VIRUS DE INMUNODEFICIENCIA VIRUS DE INMUNODEFICIENCIA ADQUIRIDA (VIH): destruyen los ADQUIRIDA (VIH): destruyen los linfocitos Tlinfocitos T

• HEPATITIS C HEPATITIS C

• VIRUS DE LA LEUCEMIA DE LAS VIRUS DE LA LEUCEMIA DE LAS CELULAS T HUMANAS (HTLV):su CELULAS T HUMANAS (HTLV):su infección se asocia a un tumor infección se asocia a un tumor linfocítico-T linfocítico-T

Los eventos tumorogénicos pueden Los eventos tumorogénicos pueden ser también causados por:ser también causados por:

• MutacionesMutaciones• TranslocacionesTranslocaciones• AmplificaciónAmplificación

Todas involucran un proto-oncogenTodas involucran un proto-oncogen

MUTACIONESMUTACIONES: : ej.ej. c-ras c-ras

• Variantes oncogénicas de Variantes oncogénicas de c-ras c-ras son son encontradas en varios tumores encontradas en varios tumores primarios.primarios.

• Los protoncogenes c-ras se Los protoncogenes c-ras se transforman en oncogénicos por una transforman en oncogénicos por una única mutación,única mutación,

• las mutaciones observadas en varios las mutaciones observadas en varios tumores humanos es causado por tumores humanos es causado por una sustitución de un aa, (posición 12 una sustitución de un aa, (posición 12 o 61) en una de las proteínas Raso 61) en una de las proteínas Ras

• Si se sustituye “in vitro” la glicina de la Si se sustituye “in vitro” la glicina de la posición 12 por otro aa excepto posición 12 por otro aa excepto prolina, el gen prolina, el gen c-rasc-ras mutado mutado transforma las células cultivadas (los transforma las células cultivadas (los diferentes aa cambian la capacidad diferentes aa cambian la capacidad transformante)transformante)

• En la posición 61 (ocupada por En la posición 61 (ocupada por glutamina) crea un gen con actividad glutamina) crea un gen con actividad transformante (ác. glutámico y prolina transformante (ác. glutámico y prolina no afectan)no afectan)

EXPERIMENTOS “IN VITRO”

• La proteína Ras es una unión La proteína Ras es una unión monomérica del nucleótido guanina monomérica del nucleótido guanina que se activa cuando se une a GTP y que se activa cuando se une a GTP y es inactiva cuando se une al GDP.es inactiva cuando se une al GDP.

COMO FUNCIONA?

RAS GTP FORMA ACTIVA

RAS GDP FORMA INACTIVA

• Proteína GAP estimula la capacidad de Proteína GAP estimula la capacidad de

Ras para hidrolizar GTP, convirtiendo a Ras para hidrolizar GTP, convirtiendo a

Ras de activa a inactiva. Ras de activa a inactiva.

RAS GTP

GAP

HIDROLISA

RAS GDP SE INACTIVA RAS

• Proteínas GNRF estimulan el Proteínas GNRF estimulan el

reemplazo de GDP por GTP, reemplazo de GDP por GTP,

reactivando a la proteína reactivando a la proteína

RAS GDP

GNRF

RAS GTP SE ACTIVA RAS

• Una activación constitutiva de Ras Una activación constitutiva de Ras puede ser causada por una puede ser causada por una mutación lo que hace que Ras sea mutación lo que hace que Ras sea refractario a la interacción con refractario a la interacción con GAP. GAP.

• La incapacidad de hidrolizar GTP La incapacidad de hidrolizar GTP causa que Ras permanezca en una causa que Ras permanezca en una forma activada permanentemente forma activada permanentemente

TRANSLOCACIONESTRANSLOCACIONES

• La ubicación en un nuevo cromosoma La ubicación en un nuevo cromosoma puede activar un oncogenpuede activar un oncogen

• Se descubrió mediante la conección Se descubrió mediante la conección entre los loci que codifican Ig y la entre los loci que codifican Ig y la ocurrencia de ciertos tumores (desde ocurrencia de ciertos tumores (desde linfocitos B no diferenciados).linfocitos B no diferenciados).

• En el hombre, la translocación en los En el hombre, la translocación en los tumores de células B involucra al tumores de células B involucra al crom. 8 (portador de crom. 8 (portador de c-mycc-myc) y el cr. ) y el cr. 14 (portador del locus IgH) (10%) o 14 (portador del locus IgH) (10%) o crom. 2 (locus kappa) o crom 22 crom. 2 (locus kappa) o crom 22 (locus lambda).(locus lambda).

• En los tumores a células T involucra En los tumores a células T involucra al 8 y al 14 (locus TcR al 8 y al 14 (locus TcR ))

• Cuando el Cuando el c-mycc-myc está translocado con el está translocado con el locus Ig, el nivel de expresión está locus Ig, el nivel de expresión está aumentadoaumentado

• Por qué se activa?Por qué se activa?

A) se altere la estructura de A) se altere la estructura de c-mycc-myc

B) en la nueva posición hay B) en la nueva posición hay genes muy activosgenes muy activos

• La sobreexpresión de La sobreexpresión de c-mycc-myc apagaría el apagaría el proceso de diferenciación de los linfocitosproceso de diferenciación de los linfocitos

• En algunos casos la translocación En algunos casos la translocación genera un gen híbrido en el cual la genera un gen híbrido en el cual la unidad de transcripción activa unidad de transcripción activa cambia: los exones de un gen se cambia: los exones de un gen se conectan con los de otro gen.conectan con los de otro gen.

• Ejemplo: cromosoma filadelfia Ejemplo: cromosoma filadelfia (Ph1) presente en pacientes con (Ph1) presente en pacientes con leucemia mieloide crónica (LMC)leucemia mieloide crónica (LMC)

AMPLIFICACIONESAMPLIFICACIONES• Secuencias endógenas pueden ser Secuencias endógenas pueden ser

producidas por amplificación de una producidas por amplificación de una secuencia existente. (Generalmente son secuencia existente. (Generalmente son rearreglos en tandem)rearreglos en tandem)

• Un gen contenido dentro de los repetidos en Un gen contenido dentro de los repetidos en tandem no necesariamente es expresado por tandem no necesariamente es expresado por todas las copias pero su expresión tiende a todas las copias pero su expresión tiende a aumentar con el número de copias.aumentar con el número de copias.

• Son provocados por resistencia a ciertos Son provocados por resistencia a ciertos agentesagentes

• Ej: Ej: c-myc, c-abl, c-myb, c-erbB, c-k-ras, c-myc, c-abl, c-myb, c-erbB, c-k-ras, mdm2mdm2

• Estos tandem pueden existir en en Estos tandem pueden existir en en

dos formas dentro de la célula.dos formas dentro de la célula.

• UNIDAD EXTRACROMOSOMICAUNIDAD EXTRACROMOSOMICA

se hereda en forma irregularse hereda en forma irregular

• UNIDAD INTEGRADA AL GENOMAUNIDAD INTEGRADA AL GENOMA

• En las líneas estables las En las líneas estables las

amplificaciones pueden ser vistas a amplificaciones pueden ser vistas a

nivel cromosómico en forma de regiones nivel cromosómico en forma de regiones

de tinción homogénea (HSR= de tinción homogénea (HSR=

homogeneously staining region)homogeneously staining region)

En líneas inestables los elementos En líneas inestables los elementos

adicionales también pueden ser adicionales también pueden ser

observados y se comprueba mediante observados y se comprueba mediante

tinción con Hoechsttinción con Hoechst

Doble diminutos

GENES SUPRESORESGENES SUPRESORES

• La pérdida o inactivación de ciertos genes pueden

también ser importantes pasos en el camino que

conduce a cánceres invasivos.

• Su función normal es suprimir la proliferación celular,

funcionan como barreras fisiológicas en contra de la

expansión clonal.

• Son "genes recesivos" : deben ocurrir mutaciones o

deleciones en ambos alelos antes de que la

transformación celular ocurra.

La pérdida de la función de los genes supresores puede ocurrir por el daño provocado al genoma a través de

RETINOBLASTOMARETINOBLASTOMA

• Es un enfermedad infantil que Es un enfermedad infantil que involucra un tumor de retinainvolucra un tumor de retina

• Puede ocurrir con una forma Puede ocurrir con una forma heredable o en forma esporádicaheredable o en forma esporádica

• Está asociado con delecciones en Está asociado con delecciones en la banda q14 del cromosoma 13 la banda q14 del cromosoma 13 (13q14)(13q14)

La pérdida de RB está involucrada en La pérdida de RB está involucrada en otras formas de cáncer otras formas de cáncer

• Ej: osteosarcomas y cáncer pulmonar a Ej: osteosarcomas y cáncer pulmonar a

células pequeñascélulas pequeñas

• RB es una fosfoproteína nuclear que tiene RB es una fosfoproteína nuclear que tiene

influencia en el ciclo celularinfluencia en el ciclo celular

• Durante G0/G1 del ciclo celular RB no está Durante G0/G1 del ciclo celular RB no está

fosforilado.fosforilado.

• Durante el ciclo RB es fosforilado por el Durante el ciclo RB es fosforilado por el

complejo cdk/ciclina (final de G1)complejo cdk/ciclina (final de G1)• Se desfosforila durante la mitosisSe desfosforila durante la mitosis

• La forma no-fosforilada de RB La forma no-fosforilada de RB

específicamente se une a varias proteínas específicamente se une a varias proteínas

(ocurre sólo durante parte del ciclo: fase S)(ocurre sólo durante parte del ciclo: fase S)

• La fosforilación suelta las proteínas las La fosforilación suelta las proteínas las

cuales están accesibles nuevamentecuales están accesibles nuevamente

• Estas proteínas incluyen el grupo E2F de los Estas proteínas incluyen el grupo E2F de los

factores de transcripción, los cuales activan factores de transcripción, los cuales activan

genes blanco cuyos productos son esenciales genes blanco cuyos productos son esenciales

para la fase Spara la fase S

• Su unión con RB inhibe la capacidad de Su unión con RB inhibe la capacidad de E2F de activar la transcripción:E2F de activar la transcripción:

• RB indirectamente evita la entrada en RB indirectamente evita la entrada en fase Sfase S

• El complejo RB-E2Fdirectamente El complejo RB-E2Fdirectamente reprime algunos genes blanco, su reprime algunos genes blanco, su discociación permite que ello se discociación permite que ello se expresen. expresen.

• Ciertos antigenos tumorales virales se Ciertos antigenos tumorales virales se unen especificamente a la forma no unen especificamente a la forma no fosforilada de RBfosforilada de RB

Antioncogen p53Antioncogen p53

• MMúúltiples cltiples cáánceres humanos muestran nceres humanos muestran

ausencia de la proteausencia de la proteíína p53 o na p53 o

mutaciones en el genmutaciones en el gen

• Mapea en el Mapea en el brazo corto del cromosoma brazo corto del cromosoma

17 (17p13). 17 (17p13).

• La proteLa proteíína p53 codificada por este gen na p53 codificada por este gen

es unaes una fosfoprote fosfoproteíína nuclear de 53 kd na nuclear de 53 kd

el control del ciclo celular, el control del ciclo celular,

la reparación y síntesis del ADN, la reparación y síntesis del ADN,

la diferenciación celular la diferenciación celular

la muerte celular programada la muerte celular programada

HHa sido relacionada cona sido relacionada con::

• la proteína p53 normal regula la la proteína p53 normal regula la

transcripción a través de uniones transcripción a través de uniones

secuencia-específicas con el ADN secuencia-específicas con el ADN

mientras que mutaciones en el gen mientras que mutaciones en el gen

anulan esta actividad de activación en anulan esta actividad de activación en

trans resultando una proliferación trans resultando una proliferación

celular no controladacelular no controlada

• la protela proteíína p53 inducirna p53 induciríía la transcripcia la transcripcióón de n de

diferentes genes que presenten una diferentes genes que presenten una

secuencia de ADN especsecuencia de ADN especíífica en la regifica en la regióón n

reguladora corriente arriba ("upstream"). reguladora corriente arriba ("upstream").

Ejemplos:Ejemplos:

OncOnc.. mdm-2mdm-2 (murine double minute), (murine double minute),

gen creatin-kinasa del músculo y el gen creatin-kinasa del músculo y el

GADD45 (growth arrest DNA damage GADD45 (growth arrest DNA damage

inducible) inducible)

gen gen bcl-2bcl-2

El efecto de la proteína p53 sobre la El efecto de la proteína p53 sobre la transcripción de un gen puede estar transcripción de un gen puede estar influenciado por influenciado por ::

• modificaciones en el gen en si mismo, modificaciones en el gen en si mismo,

• mmodificaciones post-transcripcionalesodificaciones post-transcripcionales

((como fosforilacióncomo fosforilación))

• interacciones con otras proteínas tanto interacciones con otras proteínas tanto

celulares como virales celulares como virales

• Normalmente, cuando existe un daño en el Normalmente, cuando existe un daño en el

ADN se activa el p53ADN se activa el p53

• Dependiendo del estadio en que se Dependiendo del estadio en que se

produzca el daño existen 2 caminosproduzca el daño existen 2 caminos

• 1) temprano: activa la maquinaria que 1) temprano: activa la maquinaria que

previene la futura propagación del daño previene la futura propagación del daño

hasta que éste es reparadohasta que éste es reparado

• 2) tarde: p53 dispara los mecanismos de 2) tarde: p53 dispara los mecanismos de

apoptosisapoptosis

irradiación

Interacción de genes Interacción de genes supresores de tumor en el supresores de tumor en el ciclo celularciclo celular

Ciclina A,B

Cdc2 G0Cd4,6

Ciclina D

p16

p53

p27

p21cdk2

ciclinaE

CITOGENETICACITOGENETICA

origen clonalorigen clonal

• por lo menos dos células por lo menos dos células contienen la misma aberración contienen la misma aberración cromosómica cromosómica

• se utiliza para la se utiliza para la nomenclatura el cariotipo nomenclatura el cariotipo compuesto "composite compuesto "composite karyotype" (ISCN). karyotype" (ISCN).

Ejemplo:Ejemplo:

58-68,XX(p+)Y,-1x3,i(1p),58-68,XX(p+)Y,-1x3,i(1p),

i(1q),+2,-3,del(3)(q21),-4,+5,i(1q),+2,-3,del(3)(q21),-4,+5,

del(5)(q31),-8,-9,del(9)(q22),del(5)(q31),-8,-9,del(9)(q22),

-11,del(11)(q14),-12,-13,-11,del(11)(q14),-12,-13,

-14x2,-15,-17x2,-14x2,-15,-17x2,

ins(17;3)(p13;q21q29),ins(17;3)(p13;q21q29),

i(17q)x2,-19,i(17q)x2,-19,

-21,-22x2,m-21,-22x2,m22 [cp12]. [cp12].