TRANSCRIPCION Y

PROCESAMIENTO DEL RNA

Bóvedas, partículas grandes de ribonucleoproteína en células animales, se

construyen principalmente a partir de 78 subunidades de proteínas. La estructura

hueca incluye una docena de pequeñas moléculas de ARN que probablemente sean

reguladores en lugar de estructural. Diversos estudios sugieren que las bóvedas

pueden jugar un papel en la señalización celular, metabolismo de fármacos, o

aclaramiento de patógeno. [Cortesía de Tomitake Tsukihara de la Universidad de

Osaka, Japón.]

El ADN estas confinado casi exclusivamente al núcleo de las células eucariotas, como se mostró por los microscopistas en la década de 1930. En la década de 1950, el sitio de la síntesis de proteínas se identificó al mostrar que aminoácidos marcados radiactivamente que se habían incorporado a las proteínas se asociaban a unas ARN-proteínas citosólicas llamadas ribosomas. Por lo tanto, la síntesis de proteínas no está inmediatamente dirigida por el ADN porque, al menos en los eucariotas, el ADN y los ribosomas nunca están en contacto. El intermediario entre el ADN y la maquinaria de biosíntesis de proteínas, como se describe en el dogma central de la biología molecular de Francis Crick (Sección 3-3B), es el ARN. Las células contienen tres tipos principales de ARN: ARN ribosomal (ARNr), que constituye las dos terceras partes de la masa ribosomal; el ARN de transferencia (ARNt), un conjunto de pequeñas moléculas compactas que proporcionan aminoácidos a los ribosomas para el montaje de las proteínas, y el ARN mensajero (ARNm), cuya secuencia de nucleótidos dirige la síntesis de proteínas. Además, una serie de otras pequeñas especies de ARN no codificantes desempeñan diversas funciones en la regulación de la expresión génica y en el procesamiento de moléculas de ARN recién transcritas (tabla 26.1). Todos los tipos de ARN se pueden mostrar en estado de hibridación con secuencias complementarias en el ADN a partir del mismo organismo. Por lo tanto, todos los ARN celulares son transcritos a partir de plantillas de ADN.

CONTENIDO DEL CAPÍTULO

1 procariota transcripción del ARN

A. RNA polimerasa se parece a otras

polimerasas

B. La transcripción se inicia en un promotor

C. Crece la cadena de ARN a partir de la 5?

a 3? final

Transcripción D. Finaliza en sitios

específicos

La transcripción en eucariotas 2

A. Los eucariotas tienen varias polimerasas

de ARN

B. Cada polimerasa reconoce una

diferencia

Tipo de promotor

C. Factores de transcripción son necesarios

para iniciar

transcripción

3 procesamiento postranscripcional

A. Los ARN mensajeros Someterse a 5?

nivelación,

La adición de un 3? Cola y Empalme

Precursores B. ARN ribosomal se puede

escindir,

Modificado y empalmado

C. ARN de transferencia son procesados

por nucleótidos

La eliminación, adición y modificación

La transcripción de ADN a ARN se lleva a cabo por las polimerasas de ARN (RNAPs) que funcionan como complejos de multisubunidades, al igual que las ADN polimerasas que catalizan la replicación del ADN. En este capítulo, se analiza la propiedades catalíticas de RNAPs y se discute cómo estas proteínas, a diferencia de la ADN polimerasas, están dirigidas a genes específicos. También veremos cómo el RNA recién sintetizado se procesa para ser completamente funcional.

1 la transcripción procariota del ARN ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- CONCEPTOS CLAVE

La RNA polimerasa se asemeja a la DNA polimerasa en estructura y mecanicismo

La transcripción en las bacterias comienza con la holoenzima RNAP que se une a un promotor para hacer a un lado el DNA

Como la polimerasa posesivamente extiende una cadena de RNA, otra polimerasa puede iniciar la transcripción

simultáneamente

La terminación de la transcripción en los procariotas depende de la secuencia terminadora intrínseca o del factor Rho

RNAP, la enzima responsable de la síntesis de RNA dirigida por ADN, fue descubierta independientemente en 1960 por

Samuel Weiss y Jerard Hurwitz. La enzima une en parejas a los ribonucleósido trifosfatos (NTPS) ATP, CTP, GTP, y UTP sobre la

plantilla de ADN, en una reacción que es impulsada por la liberación y posterior hidrólisis de PPi:

Todas las células contienen RNAP. En las bacterias, una enzima sintetiza todos los

ARN de la célula, excepto los ARN cortos cebadores (primers) utilizados en la

replicación del ADN (sección 25-2B). Las células eucariotas contienen cuatro o

cinco RNAPs que cada una sintetiza una clase diferente de ARN. En primer lugar

consideraremos las enzimas bacterianas porque son más pequeñas y más simples

que las enzimas eucariotas.

A | RNA polimerasas se asemeja a otras polimerasas

La holoenzima RNAP de la E. coli es una proteína de ± 449-kD cuya composición de

subunidades es α2ββ´ώσ. Una vez que la síntesis de ARN se ha iniciado, sin

embargo, la subunidad σ (también llamada factor σ) se disocia del núcleo de la

enzima α2ββ´ώ, quien lleva a cabo el proceso de polimerización. La RNAP es lo

suficientemente grande para que sea claramente visible en micrografías

electrónicas (Fig. 26-1).

Tipo Tamaño Función

RNA ribosomal (RNAr) 120 – 4718 transcripción ( el ribosoma estructura y actividad catalítica)

RNA de transferencia (RNAt) 54- 100 entrega de aminoácidos a los ribosomas durante la traducción

Pequeños RNA de interferencia (RNAsi) 20-25 inactivación de secuencia especifica del RNAm

Micro RNA (RNAmi) 20-25 inactivación de secuencia especifica del RNAm

Grandes RNA intergenicos no codificanes (RNAlinc) <17,200 control de la transcripción

RNA pequeños nuclerares (RNAsn) 60-300 splicing del RNA

RNA pequeños nucleolares (RNAsno) 70-100 metilación de secuencia especifica del RNAr

Figura 26-1 | micrografía electrónica de la holoenzima polimerasa de E. coli RNA.

Esta enzima soluble, una de las más

grandes conocidas, se une a varios

sitios promotores en el ADN del

bacteriófago T7.

TABLA 26-1 Algunos RNA que no codifican

la estructura de rayos X de una enzima relacionada con RNAP núcleo de Thermus aquaticus (Taq), y Thermus thermophilus

(Tth) que fue independientemente determinada por Set Darst y Dimitri Vassylyve. La estructura del Tth núcleo de la enzima

en complejo con el DNA y el RNA tiene una forma general de un cangrejo con pinzas, las cuales están formadas por las

subunidades β y β´. (Fig. 26-2). En este complejo, que también es llamado complejo abierto, el espacio entre las dos pinzas es

de ± 27 A°, el canal principal, está ocupado por el DNAds. La plantilladle DNA continua hasta el sitio activo en el final del

canal principal en donde forma pares de bases con el NTP entrante (no se muestra en la figura) en un sitio llamado i + 1 cerca

de un enlace con un ion MG2+. el extremo 3´del RNA forma una hélice hibrida de 9 pb con el extremo 5´ de la hebra plantilla

del DNA y luego se libera de la proteína a través de un canal que está entre las subunidades β y β´, cuando el RNA está fuera

del canal este adopta una conformación similar a una hebra sencilla de RNA formando una doble hélice. Sin embargo, las vías

en que las hebras de ADN plantilla y la no-plantilla toman para volver a unirse en el final del sitio llamado burbuja de

transcripción no está aún claro. En la estructura de rayos X del segmento Taq de la holoenzima en complejo con el DNAds

muestra que contiene un promotor, el cual causa que las pinzas se unan de tal manera que cierren el canal y queden a ± 10 A°

(fig. 26.3). En esta estructura, el DNA se une a la subunidad σ mediante su elemento promotor (ver la sección 26-1B) para

formar el así llamado complejo cerrado en el cual el DNA no ha entrado al canal principal para formar la burbuja de

transcripción (por mecanismos aún desconocidos). La cara exterior de la holoenzima está casi uniformemente negativamente

cargada, mientras que las caras que interactúan con el núcleo acido, particularmente las paredes más internas del canal

principal, están positivamente cargadas.

Solo una hebra del DNA es copiada. La sintesis de RNA es normalmente iniciada en sitios específicos sobre la hebra plantilla

del DNA. En contraste a la replicación, quien requiere que ambas hebras del cromosoma estén enteramente copiadas, la

expresión regulada de la información genética involucra a unas muchas más pequeñas porciones de hebra simple, del

genoma.

Figura 26-2. Estructura de rayos X del núcleo Tth de la RNAPs formando un complejo con una plantilla de 23 nt del DNA

La proteína esta mostrada en forma de

cinta con sus subunidades α en amarillo y

verde, su subunidad en cian, su subunidad

β´en rozado, y su subunidad ώ en gris. El

DNA y el RNA se muestran en forma……

con la plantilla de DNA en verde, la hebra

no-plantilla del DNA en azul, y el RNA en

rojo. [Basado en la estructura de rayos X de

Dimitri vassylev, de la universidad de

Alabama]

FIG. 26-3 estructura de rayos X a baja resolución (6.5 A°) del Taq de la holoenzima RANP en complejo con el DNA que contiene un promotor

Las subunidades del núcleo de la enzima, quien es visto y

coloreado en la fig. 26-2, están representadas por sus

superficies moleculares parcialmente transparentes. La

subunidad σ es mostrada en forma de gusano y coloreada en

orden arco iris desde el N-terminal en azul hasta el C

terminal en rojo. La columna vertebral de azúcar-fosfato del

DNA es dibujado en forma de caricatura con la hebra plantilla

de DNA en verde, y el elemento -10 y -35 de la hebra no

plantilla del DNA (sección 26-1B) en rojo y magenta y el resto

en azul

La hebra del DNA que sirve como plantilla durante la transcripción es conocida como la hebra antisentido o la hebra

nocodificante, debido a que su secuencia es complementarios de la hebra del RNA. La otra hebra del DNA, quien tiene la

misma secuencia que el RNA transcrito (excepto por el reemplazo de U por T), es conocida como la hebra sentido o

codificante (fig. 26.4). Las dos hebras de DNA en el cromosoma de un organismo, puede por lo tanto tener diferentes “sets”

de genes.

Tenga en cuenta que “gen” es un término relativamente perdido que se refiere a una secuencia que codifica polipéptidos,

como aquellos que corresponden a las secuencias de RNAr, RNAt y otras especias de RNA. Aun mas, un gen típicamente

incluye secuencias que participan en la iniciación y terminación de la trascripción (y muchos otros genes también dependen

de secuencias reguladoras que directamente no flanquea las regiones codificantes pero pueden estar localizados a una

considerable distancia.

Estas unidades genéticas, llamados operones, contienen típicamente genes con funciones relacionadas. Por ejemplo, los tres genes de rRNA diferentes de E. coli ocurren en operones individuales (Sección 26-3B). La E. coli operón lac, cuya expresión se describe en detalle en la Sección 28-2A, contiene tres genes proteínas implicadas en el metabolismo de la lactosa, así como secuencias que controlar su transcripción (Fig. 26-4). Otros operones que contienen genes que codifican proteínas requeridas para las rutas biosintéticas, por ejemplo, el operón trp, cuyos seis productos génicos (proteínas se refiere a menudo como productos de genes) catalizar triptófano sintesis. Un operón se transcribe como una sola unidad, dando la altura de un mRNA policistrónico que dirige la simultánea más o menos síntesis de cada uno de los polipéptidos codificados (el término cistrón es un poco sinónimo arcaico de genes). En contraste, los genes eucariotas estructurales, que no son parte de operones, dan lugar a ARNm monocistrónicos.

Figura 26-4 | hebras sentido y antisentido del ADN.

La hebra plantilla del dúplex de ADN se conoce como antisentido o cadena no codificante. Su cadena complementaria, sentido o

codificante tiene la misma secuencia de nucleótidos y orientación que el ARN transcrito.

Figura 26-5 | El operón lac de E. coli.

Este ADN incluye los genes que codifican las proteínas que median el metabolismo de la lactosa y los sitios genéticos que

controlan su expresión. El Z, Y, y los genes A, respectivamente, especificar las proteínas?-Galactosidasa (Cuadro 8-1), permeasa

galactósido (Sección 10-3D), y transacetilasa tiogalactósido. El gen estrechamente ligado regulador, I, que no es parte del operón

lac, codifica una represora que inhibe la transcripción del operón lac.

B | La Transcripción Es Iniciada En Un Promotor

¿Cómo la RNAP reconoce la cadena de ADN correcta e inicia la síntesis de ARN en el comienzo de un gen (u operón)?. La

RNAP se une a sus sitios de iniciación a través de secuencias de bases conocidas como promotores que son reconocidos por

el correspondiente factor σ. La existencia de promotores fue revelada por primera vez a través de mutaciones que

aumentaban o disminuían las tasas de transcripción de ciertos genes. Los promotores consisten en secuencias de ± 40-bp que

se encuentran en el extremo 5´ del sitio de inicio de la transcripción. Por convención, la secuencia de este ADN está

representada como la hebra sentido (sin plantilla) de modo que tendrá la misma secuencia y direccionalidad que el ARN

transcrito. A un par de bases en una región promotora se le asigna un número negativo o positivo, esto indica su posición,

corriente arriba o corriente abajo en la dirección de desplazamiento de la RNAP, a partir del primer nucleótido que es

transcrito a ARN; este sitio de inicio es +1, no hay 0. Debido a que el ARN se sintetiza en la dirección 5´ 3´ (ver más abajo),

el promotor se dice que se encuentran corriente arriba del primer nucleótido del ARN.

La holoenzima forma complejos estrechos con los promotores (constante de disociación K=10-14 M). Esta unión fuerte se ve

demostrada al comprobar que la holoenzima protege a los segmentos de ADN unidos de la digestión in vitro por la

endonucleasa, DNasa I. a las secuencia determinantes de las regiones constantes de numerosos genes de E. coli se les ha

identificado una secuencia "Consenso" en los promotores (Fig. 26-5). Su más conservada secuencia es un hexámero centrado

aproximadamente en la posición -10 (a veces llamada la caja Pribnow, después de que David Pribnow, la describió en 1975).

Esta tiene una secuencia consenso de T-A-T-A-A-T en la que el TA al inicio y la T al final están altamente conservadas. Las

secuencias corrientes arriba alrededor de la posición -35 también tienen una región de similitud en su secuencia, TTGACA. El

nucleótido de iniciación (+1), que casi siempre es A o G, se centra en una pobremente conservad secuencia CGT o CAT. La

mayoría de las secuencias promotoras varían considerablemente en las secuencias consenso (Fig. 26-6).

Figura 26-5 | Los sentidos (codificación) secuencias de cadena de seleccionado promotores de E. coli.

Una región de 6-bp centrada alrededor de la posición -10 (sombreada en rojo) y una secuencia de 6-bp alrededor de la región -35

(sombreado azul) están conservadas. Los sitios de iniciación de la transcripción (+1), que en la mayoría de los promotores es un solo

nucleótido de purina, se han coloreado en verde. La fila inferior muestra la secuencia consenso de 298 promotores de E. coli con el

número que aparece debajo de cada base indicando su porcentaje de ocurrencia. [Después de Rosenberg, M. y la Corte, D., Annu. Rev.

Genet. 13, 321-323 (1979). Consenso secuencia de Lisser, D. y Margalit, H., Nucleic Acids Res. 21,1512 (1993).]

¿Aproximadamente cuantos giros de hélice separan los dos bloqueos de

la secuencia conservada?

Sin embargo, una mutación en una de las regiones parcialmente conservadas puede aumentar o disminuir en gran medida

la eficacia de iniciación de un promotor de. Esto se debe a que las tasas a las que E. coli transcribe sus genes varían

directamente con la velocidad a la cual sus promotores forman complejos estables de iniciación con la holoenzima RNAP.

La iniciación requiere la formación de un complejo abierto. Las regiones promotoras en contacto con la holoenzima RNAP se

han identificado gracias a un procedimiento denominado huella (footprinting). En este procedimiento, el ADN se incuba con

una proteína a la que se une y se trata luego con un agente de alquilación tal como sulfato de dimetilo (DMS). Esto da como

resultado la alquilación del ADN en sus bases seguido de la escisión de la columna principal en las posiciones alquiladas. Sin

embargo, aquellas porciones del ADN que se unen a proteínas quedan protegidas de la alquilación y por lo tanto de la

escisión. El patrón resultante de protección se denomina la huella de la proteína. Estudios sobre la huella indican que la

holoenzima RNAP se pone en contacto con el promotor principalmente en sus regiones -10 y -35. En algunos genes,

secuencias adicionales corriente arriba también pueden influir en la unión de la RNAP al ADN.

DMS metila residuos G en N7 y residuos de A en N3 en tanto ya sea en DAN de doble cadena o de cadena simple, el DMS

también metila a C en N3 y A en N1, pero sólo si las últimas posiciones no están involucradas en las interacciones de

emparejamiento de bases.

El patrón de metilación de DMS por lo tanto revela si el ADN está solo o en forma bicatenaria. Estudios de Footprinting

indican que la unión de la holoenzima "funde" (separa) aproximadamente ±11 pb del ADN (a partir de -9 hasta +2). El

complejo abierto resultante es análogo a la región de DNA desenrollado en el origen de la replicación (sección 25-2B).

El núcleo de la enzima, quien no se une específicamente a promotores, se une estrechamente al dúplex del ADN (la constante

de disociación del complejo es de K ±5x10-12 M, y su vida media es <1s). Evidentemente, la subunidad σ le permite a la

holoenzima moverse rápidamente a lo largo de una cadena de ADN en busca del correspondiente promotor de la subunidad

σ. Una vez que se ha iniciado la transcripción y la subunidad σ se ha desechado, la fuerte unión del núcleo de la enzima al

ADN al parecer estabiliza el complejo ternario enzima ADN-ARN.

La expresión génica está controlada por diferentes factores. Debido a que diferentes factores σ reconocen diferentes

promotores, un complemento celular de los factores σ, determina qué genes se transcriben. El desarrollo y la diferenciación,

quienes involucran la expresión temporalmente ordenada de conjuntos de genes (set of genes), pueden ser orquestados a

través de una "cascada" de factores σ. Por ejemplo, la infección del Bacillus subtilis por el bacteriófago SP01 requiere la

expresión de diferentes conjuntos de genes del fago en diferentes momentos. La primera serie, conocida como los genes

tempranos, son transcritos utilizando el factor σ de la bacteria. Uno de los primeros productos de los genes del fago es una

subunidad conocida como σgp28, quien desplaza al factor σ de la bacteria y por lo tanto permite al RNAP reconocer sólo los

promotores del fago genes de la mitad. Los genes de la mitad, a su vez, utilizan el factor σgp33/34, que promueve la

transcripción de genes tardíos del fagos.

Varias bacterias, incluyendo E. coli y Bacillus subtilis, tienen igualmente varios diferentes factores σ. Estos no se utilizan

necesariamente de manera secuencial. Por ejemplo, factores σ de E. coli que difieren de su factor σ principal (que se

denomina σ70 debido a que su masa molecular es de 70 kD) controla la transcripción de grupos de genes expresados de

forma coordinada para fines especiales cuyos promotores son bastante diferentes de los reconocidos por σ70.

C | la cadena de ARN crece a partir del extremo 5´ hasta el extremo 3´

Debido a que la síntesis de ARN, así como la síntesis de ADN, procede en dirección 5´ 3´ (Fig. 26-6), la molécula de RNA en

crecimiento tiene un grupo Trifosfato-5´. Las moléculas maduras de ARN, como se verá, también pueden ser químicamente

modificadas en uno o ambos extremos.

Una porción de la plantilla de ADN de doble cadena permanece abierta en el punto de la síntesis de ARN. Esto permite que la

cadena antisentido dirija la síntesis de su hebra de ARN complementario.

La cadena de ARN transitoriamente forma un corto dúplex híbrido de ARN-ADN. El ADN separado forma una "burbuja" en el complejo de iniciación abierto y aparentemente viaja a lo largo del ADN con el RNAP (Fig. 26-8). A medida que la hélice del ADN gira, es empujada por delante de la burbuja de transcripción, se van volviendo más enrolladas (más positivamente superenrolladas) mientras que el ADN detrás de la burbuja se van volviendo vuelve equivalentemente más desenrollado (más negativamente superenrollado). Este escenario es apoyado por la observación de que la transcripción de plásmidos en E. coli induce un superenrollamiento positivo en girasas mutantes (quienes no pueden relajar los superenrollamientos positivos, Sección 24-1D) y un superenrollamiento negativo en las topoisomerasas I mutantes (quienes no pueden relajar los superenrollamientos negativos). Una superhelice inapropiada en el ADN detiene la el proceso de transcripción. Es muy posible que la tensión torsional en el ADN generado por la superhelice negativa detrás de la burbuja de transcripción ayude a impulsar el proceso de transcripción, mientras que demasiada tensión impide la apertura y el mantenimiento de la burbuja de transcripción. La tensión que se acumula en la plantilla de ADN es aparentemente responsable de una curiosa propiedad de la RNAP: esta frecuentemente libera el recién sintetizado ARN después que sólo ± 9 a 11 nt se han polimerizado, un proceso conocido como iniciación abortiva. Cuando la RNAP inicia la transcripción, se mantiene unida al promotor (quien está en la hebra no plantilla del ADN). Por consiguiente, una tensión se acumula a medida que la cadena molde es empujada a través del sitio activo de la RNAP, un proceso llamado scrunching (arrugamiento) porque el resultante aumento de tamaño de la burbuja de transcripción en la dirección corriente abajo de alguna manera debe tener cabida dentro de la RNAP. En una iniciación exitosa, la tención eventualmente proporciona la energía suficiente para despojar al promotor de la RNAP, que luego continúa su progreso a lo largo de la plantilla. En iniciación abortiva, la RNAP no puede escapar del promotor y en su lugar se quita de encima la tensión conformacional mediante la liberación de la nueva síntesis de ARN fragmento, por lo tanto dejar que la burbuja de transcripción relajarse a su tamaño normal. La RNAP luego reinicia la transcripción de la beta +1 posición.

Figura 26-6 | el crecimiento de la cadena de ARN es en dirección 5´ 3´.

Los nucleótidos son añadidos al extremo 3´de la creciente cadena de ARN a través del ataque del Grupo-OH en 3´ al nucleósido trifosfato

entrante. Un marcador radiactivo en la posición ϒ de un NTP (indicado por un asterisco) es retenido en el nucleótido inicial del ARN (el

extremo 5´), pero se pierde como PPi durante la polimerización de los nucleótidos subsiguientes.

Figura 26-7 el superenrollamiento del ADN durante la transcripción.

En la región que se está transcribiendo, la doble hélice del ADN se desenrolla de a una vuelta para permitir que la cadena antisentido del ADN forme un

segmento corto de ADN-ARN híbrido de doble hélice. A medida que el ARN polimerasa avanza a lo largo de la plantilla de ADN (aquí a la derecha), el ADN se

desenrolla por delante del extremo 3´ del ARN en crecimiento y se re-enrolla detrás de este, de tal modo que extrae los ARN recién sintetizados a partir de la

hebra del molde. Debido a que los extremos del ADN, así como la polimerasa de ARN están aparentemente impedidas para girar por uniones dentro de la

célula (barras negras), el ADN se vuelve superenrollado (positivamente superenrollado), por delante de la burbuja de transcripción y desenrollado por detrás

(negativamente superenrollado) (considere las consecuencias de poner su dedo entre las cadenas de ADN retorcidas, como en este modelo y empuje hacia

la derecha). [Después Futcher, B., Trends Genet. 4, 272 (1988).]

……………………………………… ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….

En células bacterianas que proliferan rápidamente, la

síntesis de ADN es probable que ocurra incluso cuando los

genes están siendo transcritos. La maquinaria de

replicación del ADN se desplaza a lo largo del cromosoma

circular a una velocidad muchas veces más rápido que el

movimiento de la maquinaria de transcripción. Las colisión

entre la ADN polimerasa y ARN polimerasa parece

inevitable. ¿Qué sucede cuando los dos complejos

enzimáticos chocan? Gracias al uso de sistemas de

modelos in vitro, Bruce Alberts ha demostrado que

cuando ambas enzimas se están moviendo en la misma

dirección, el tenedor de replicación pasa sobre la ARN

polimerasa sin desplazarla, dejándola completamente

competente para reanudar la elongación de la cadena de

ARN.

Cuando el tenedor de replicación choca de frente con un

complejo de transcripción, sin embargo, el replisoma se

pausa brevemente antes de moverse para pasar a la ARN

polimerasa. Sorprendentemente, esto hace que la RNA

polimerasa cambie su cadena molde. La cadena de ARN en

crecimiento se disocia de la hebra molde original de ADN y

se hibrida con la cadena hija recién sintetizada de ADN de

la misma secuencia antes que la elongación del ARN se

reanude.

Las colisiones frontales son desventajosas porque (1) la

replicación se ralentiza cuando la ADN polimerasa se

detiene, y (2) la disociación de la ARN polimerasa durante

el salto de la hebra plantilla a la otra podría abortar el

proceso de transcripción. De hecho, en muchos genomas

bacterianos y fagos, los genes más fuertemente transcritos

son orientados de modo que los complejos de replicación

y transcripción se muevan en la misma dirección. Queda

por ver si una similar disposición se tiene en genomas

eucariotas, que contienen múltiples orígenes de

replicación y genes que son mucho más grandes que en

los procariotas.

………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….

La ARN polimerasa es procesiva. Una vez que el complejo abierto se ha formado, la transcripción procede sin la disociación

de la enzima con la plantilla. La procesividad se logra sin una obvia estructura parecida a una almeja evidente (por ejemplo, la

abrazadera de la E. coli polimerasa III del ADN; fig. 25-16), aunque la propia RNAP aparentemente funciona como una pinza

deslizante debido a su fuerte pero flexible unión al complejo de ADN-ARN. En experimentos en los que se inmovilizó al RNAP

y se unió una perla magnética al ADN, subió hasta 180 rotaciones (que representan casi dos mil pares de bases en 10,4 pb

por vuelta) esto se observó antes que la polimerasa se soltara. La procesividad es esencial, ya que los genes son a menudo

miles (en eucariotas, a veces millones) de nucleótidos de longitud.

La estrecha asociación entre RNAP y ADN y su unión a múltiple sitios puede explicar por qué un complejo de transcripción no

se disocia completamente de un molde de ADN, incluso cuando la transcripción se interrumpe debido a la actuación de la

maquinaria de replicación del ADN a lo largo de la misma hebra de ADN (ver Cuadro 26-1).

La transcripción es rápida. En E. coli, la tasa en vivo de la transcripción es 20 a 50 nucleótidos por segundo a 37 º C (pero aún

varias veces más lento que la tasa de replicación del ADN de unos 1000 nt/s; Sección 25-2C). El error de frecuencia en la

síntesis del ARN es una base equivocada incorporado por cada ± 104 transcrita. Esta frecuencia, que es 104 a 106 veces mayor

que para la síntesis de ADN, es tolerable, porque la mayoría de los genes se transcriben en repetidas ocasiones, debido a que

el código genético contiene numerosos sinónimos (Sección 27-1C), y porque las sustituciones de aminoácidos en las

proteínas son a menudo funcionalmente inocuas.

Una vez que una molécula de RNAP ha iniciado la transcripción y se aleja del promotor, otra RNAP puede seguir su ejemplo.

La síntesis de ARNs que son necesitados en grandes cantidades, como por ejemplo los rRNA, es iniciada con tal frecuencia

cómo sea posible estéricamente, aproximadamente una vez por segundo. Esto da lugar a la aparición de una punta de flecha

del ADN transcrito (Fig. 26-9). Los mRNAs que codifican proteínas se sintetizan generalmente a intervalos menos frecuentes,

y hay una enorme variación en las cantidades de diferentes polipéptidos producidos.

Por ejemplo, una célula de E. coli puede contener 10.000 copias de una proteína ribosomal, mientras que una proteína

reguladora puede estar presente en sólo unos pocas copias por célula. Muchas enzimas, en particular aquellas involucradas

en el mantenimiento básico celular "amas de casa", se sintetizan en una tasa más o menos constante, y se les llaman enzimas

constitutivas. Otras enzimas, denominadas enzimas inducibles, se sintetizan a tasas que varían con las circunstancias de la

Las colisiones entre la ADN polimerasa y la ARN polimerasa RECUADRO 26-1 PERSPECTIVAS EN

BIOQUÍMICA

célula. En gran medida, la regulación de la expresión génica se basa sobre los mecanismos que regulan la velocidad de

transcripción, como veremos en el Sección 28-2. Los productos de la transcripción también varían en sus estabilidades.

El ARN ribosómico se recicla mucho más lentamente que el ARNm, quien es rápidamente sintetizado y degradado (a veces

tan rápido que el extremo 5´ de un ARNm se degrada antes que su extremo 3´ ha sido sintetizado).

D | la Transcripción Finaliza en sitios específicos

Micrografías electrónicas tales como en la fig. 26-8 sugieren que el ADN contiene específicos sitios en los que la transcripción

es terminada. Las secuencias de terminación de la transcripción de muchos genes de E. coli comparten dos características

comunes (Fig. 26-9a):

1. Una serie de 4 a 10 pares de bases consecutivos de A-T, donde A es de la hebra plantilla. El ARN transcrito se termina

en estas bases ó apenas las pase.

2. Una región rica en A G + C, una secuencia palindrómica que inmediatamente precede a la serie de A-T.

El ARN transcrito de esta región por lo tanto puede formar una estructura de Horquilla auto-complementaria que se termina

por varios residuos de U.

La estabilidad estructural de un ARN transcrito en su horquilla rica en G +G terminadora y el débil apareamiento de bases en

su cola oligo (U) de la plantilla ADN parecen ser factores importantes para garantizar la terminación adecuada de la cadena.

La formación de la horquilla rica en G +C provoca que la RNAP haga una pausa de varios segundos en el sitio de terminación.

Esto probablemente induce un cambio conformacional en la RNAP que la permite a la cadena no plantilla del ADN desplazar

la cola oligo (U) débilmente unida de la cadena molde, haciendo así que se termine la transcripción.

No obstante lo anterior, los experimentos de Michael Chamberlin indican que la horquilla terminadora del ARN y la cola 3´

rica en U no funcionan de forma independiente a sus regiones flanqueantes de corriente arriba y corriente abajo.

Fig. 26-10 un terminador intrínseco en E. coli

Su transcripción produce un RNA (rojo)

con una segmento autocomplementario

rico en G – C que forma una horquilla de

doble hebra seguida de una secuencia de

4 a 10 U consecutivas U las que se unen

con A de la plantilla (negro) en la burbuja

de transcripción. El ovalo azul representa

el sitio de unión para un NTP entrante

Figura 26-8 | Una micrografía electrónica de tres contiguas ribosomal genes sometidos a la transcripción.

La "punta de flecha" estructuras resultantes del aumento de las longitudes de las cadenas de ARN nacientes a medida que la

ARN polimerasa las sintetiza y las mueve desde el sitio de iniciación en el ADN hasta el sitio de terminación. [Cortesía de la

Ulrich Scheer, de la Universidad de Würzburg, Alemania.]

¿Identifique los extremos 5´ y 3´del RNA transcrito

De hecho, los terminadores que carecen de un segmento rico en U pueden ser muy eficaces cuando se unen a la secuencia

apropiada inmediatamente corriente abajo del sitio de terminación. La eficiencia de la terminación también varía con las

concentraciones de nucleósido trifosfatos, con el nivel de superenrollamiento en la plantilla de ADN, con cambios en la

concentración de sal, y con la secuencia del terminador. Estos resultados sugieren que la terminación es un proceso de

múltiples etapas complejas.

La terminación a menudo requiere del factor Rho. Aproximadamente la mitad de los sitios de terminación en E. coli carecen

de cualquier similitud obvia al terminador intrínseco descrito anteriormente y son incapaces de formar fuertes horquillas. En

lugar de esto ellos requieren la acción de una proteína conocida como factor Rho para terminar la transcripción. El factor

Rho, es un hexámero de subunidades idénticas con 419-residuos, y mejora la eficacia de la terminación, espontáneamente de

las transcripciones e induce la terminación no espontáneamente de las transcripciones. Varias observaciones clave han

conducido a un modelo de terminación dependiente de Rho:

1. El factor Rho es una helicasa que cataliza el desenrollado de las dobles hélices RNA-DNA y ARN-ARN mediante la

translocación a lo largo de una hebra simple del RNA en dirección 5´ 3´. Este proceso está impulsado por la

hidrólisis de ATP a ADP + Pi.

2. Las manipulaciones genéticas indican que la terminación dependiente de Rho requiere una secuencia de

reconocimiento específica en el naciente (todavía estaba siendo sintetizado) ARN corriente arriba del sitio de

terminación. Las secuencias de reconocimiento deben estar en el RNA naciente en lugar del DNA, como fue

demostrado por la habilidad de Rho para terminar las transcripciones en presencia de RNasa A pancreática. Las

características esenciales de los sitios de determinación de la transcripción no se han elucidado bien todavía; la

construcción de sitios de terminación sintéticos indican que estos consisten en 80 a 100 nt que carecen de una

estructura secundaria estable y contiene varias regiones que son ricas en C y pobres en G.

Estas observaciones sugiere que el factor Rho se une al RNA en su secuencia de reconocimiento y luego migra a lo largo del

RNA en dirección 5´- 3´hasta que esta encuentra una RNAP pausada en el sitio de terminación (sin la pausa, Rho no debería

ser capaz de unirse a la RNA p). Así fue como lo demostró Jeffrey Roberts, Rho empuja al RNAP hacia adelante en una

dirección que parcialmente desenrolla su ADNds en la burbuja de transcripción a medida que desenrolla la hélice hibrida

RNA –ADN, por lo tanto liberando al RNA. La trascripción terminada por Ro tiene un extremo3´que típicamente se encuentra

en un rango de 50nt. Esto sugiere que Ro gradualmente suelta al RNA de su ADN plantilla en lugar de liberarlo en un punto

específico.

Cada subunidad Ro consiste de dos dominios: su dominio n terminal se une a un polinucleotido de hebra simple y su dominio

c terminal, quien es homologa a la subunidad alfa y beta de la f1-ATPasa (sección 18,3b), se une a un NTP. La estructura de

rayos x de Ro en complejo con AMPPNP Y un RNA de 8nt (fig. 26-11a) determinada por hamez Berger determino que Ro

forma una cerradura hexamerica con forma de arandela que tiene 120 A, de diámetro, y en el centro tiene un hoyo de más o

menos 30 A, y quien sus primera y sexta subunidad está separada por un espacio de 12 A y una altura de 45ª a lo largo del eje

de la hélice. El RNA se une a lo largo de la interior de la hélice en el así llamado sitio de unión primaria al RNA en el dominio n

terminal y al sí llamado sitio de unión secundaria al RNA en dominio c terminal. Esta estructura representa un estado abierto

que se encuentra posicionado para unirse al RNAm que ha entrado en su cavidad central.

La estructura e rayos x del complejo Ro con Ru12 y en homólogo del ATP ADP-BEF3 (fig. 26,11, b) la sexta unidad de la

proteína tiene formado un anillo cerrado ene l cual cada subunidad tiene una diferente conformación. Las asas de la proteína

que se extienden desde las paredes del canal central para interactuar con el RNA están helicoidalmente ordenadas al igual

que una escalera en espiral que gira a la derecha, de tal manera que siguen al esqueleto de carbono-azúcar del RNA, muy

parecido a las asas centrales de la proteína E1 (una helicasa hexagonal) quienes siguen a sus DNAss centralmente unidas

Las diferentes conformaciones de las 6 subunidades de Ro indican que ellas

secuencialmente pasan por una serie de cambios conformacionales hechos

por NTP y que los cambios son alostéricamente acoplados de tal manera que

ellos progresan alrededor del hexámero en una manera parecida a una ola.

Debido a que cada una de las asas entrantes se mantiene unida al mismo

nucleótido durante el proceso la hélice transloca alrededor su enlace de

RNA, así como la proteína transloca a lo largo de su unión a DNAss. Porque

entonces, las proteína Ro y E1 se mueven en direcciones opuestas. Las

comparaciones de las estructuras de Ro y E1 indica que el relativo orden de

los estados conformacionales alrededor del hexámero para Ro es opuesto

que para E1. Eventualmente 2 La transcripción en eucariotas CONCEPTOS CLAVE

………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

Los eucariotas utilizan tres RNA polimerasa para llevar a cabo la sintesis de RNA dirigida por DNA.

Tres RNA polimerasas reconocen diferentes y algunas veces altamente variables secuencias promotoras.

Un set de factores de transcripción generales son requeridos para iniciar la transcripción en eucariotas.

Aunque los principios fundamentales de la transcripción son similares en procariotas y eucariotas, la transcripción eucarótica se distingue por tener múltiples RNAPs y por tener muchas más secuencias de control relativamente complicadas.

Estructura en rayos X del factor Rho

(a), Rho en complejo con r (UC)4 (solamente una unidad UC de las cuatro esta visible) y AMPPNP. Cada una de las seis unidades de la proteína esta

mostrada en forma de tubos y flechas en diferente colores con la parte más superior de la subunidad coloreada en forma de arcoíris desde su N-

terminal (azul) hasta su C-terminal (rojo). Las subunidades UC y el NAPPNP son mostradas en la forma de space-filling con UC C en verde, AMPPNP C en

gris, N azul, O rojo, P naranja. El hexámero tiene una cerradura de tipo arandela con la subunidad azul ± 45 A° más cerca del observador que la

subunidad rosada. (b), Rho en complejo con rU12 (solamente 6 nt de las 12 son visibles) y ADP *BeF3. La proteína es mostrada y coloreada al igual que

en la parte a. el RNA y el ADP*BeF3 se muestran en la forma de palos y space-filling, respectivamente, con el RNA en verde ADP C en gris, N en azul, O

en rojo, P en naranja, Be en verde claro y F en azul claro. Note que cada una de las subunidades de Rho tiene diferente conformación

PUNTO DE CHEQUEO

Compare las estructuras, substratos, productos,

mecanismos, tasa de error, y especificidad de la

plantilla de la RNA con la DNA polimerasa.

Por qué es tan difícil precisar la palabra “gen” ¿

Cuál es la importancia de las diferencia de las

propiedades de unión al DNA entre el núcleo y la

holoenzima de la RNA polimerasa.

Porque es importante para la burbuja de

transcripción mantenerse en un tamaño constante?

Explique por qué un simple gen puede rápidamente

dar lugar a muchas copias de sus productos génicos

(RNA o proteínas)

Escriba como la es terminada la transcripción con y

sin el factor Rho

Compare la estructura en la parte b con la F1-ATPasa mostrada en

la fig. 18-22b

Una amplia variedad de compuestos inhiben la transcripción en procariotas y eucariotas. Estos agentes son, por tanto tóxicos para los organismos susceptibles; es decir, funcionan como antibióticos. Tales compuestos son también herramientas útiles de la investigación, ya que detienen el proceso de transcripción en puntos bien definidos. Dos antibióticos relacionados, Rifampicinas B, que se produce por Streptomyces mediterranei, y su derivado semisintético Rifampicina,

Específicamente inhiben la transcripción de la ARN polimerasa en procariotas pero no en eucariotas. La selectividad y alta potencia de la rifampicina (2x10-8 M provoca un 50% de inhibición en la RNA polimerasa bacteriana) hace que sea un agente bactericida médicamente útil. Las rifampicinas no inhiben ni la unión de ARN polimerasa al promotor ni la formación de los primeros enlaces fosfodiéster, sino que evita la elongación de la cadena. La ARN polimerasa permanece inactivada unida al promotor, por lo que se bloquea la iniciación ya que inhibe a la enzima. Una vez que el inicio de la cadena de ARN se ha producido, sin embargo, las rifampicinas no tienen ningún efecto sobre el proceso de alargamiento posterior. Las rifampicinas por lo tanto se pueden utilizar en el laboratorio para diseccionar la iniciación de la transcripción y la elongación. Actinomicina D (a la derecha), un agente de utilidad antineoplásico (contra el cáncer) producido por Streptomyces antibioticus, se une estrechamente al dúplex ADN y, de este modo, inhibe fuertemente la transcripción y la replicación del ADN, presumiblemente por interferir con el paso del ARN y ADN polimerasas. La estructura de rayos X de la Actinomicina D en complejo con un ADN de 8-pb se muestra opuesta como dos

complejos apilados verticalmente en forma de llenado de espacio, (con C en verde, H en blanco, N en azul, y O en rojo) y el DNA en forma de palos (con C en cian, H en blanco, N en azul, O en rojo, y P en naranja). El anillo de fenoxano de la actinomicina se intercala entre los pares de bases del ADN, de tal modo que desenrolla la hélice del ADN por 23° y separa las bases vecinas en 7.0 A. el depsipéptido Cíclico químicamente idéntico de la actinomicina (un depsipéptido tiene tanto los enlaces peptídicos como los enlaces de Ester) se extienden en direcciones opuestas desde el sitio de intercalación a lo largo del surco menor del ADN. Otros agentes de intercalación, incluyendo etidio y proflavina (Sección 24-3B), también inhiben la síntesis de ácidos nucleicos, presumiblemente por mecanismos similares. La seta venenosa Amanita phalloides (muerte cap), que es responsable de la mayoría de envenenamiento por hongos mortales en Europa, contiene varios tipos de sustancias tóxicas, incluyendo una serie de octapéptidos bicíclicos inusuales conocidos como amatoxinas. α-Amanitina, que es representativa de las amatoxinas, forma un complejo 1:1 apretado con RNAP II (K= 10-8 M) y uno más flojo con RNAP III (K = 10-6 M) con el fin de bloquear específicamente los pasos de elongación. La estructura en rayos X de RNAP II en complejo con α-amanitina revela que α-amanitina se une en el embudo por debajo de la

RECUADRO 26-2 BIOQUÍMICA EN SALUD Y

ENFERMEDAD Inhibidores de la transcripción

hélice puente de la proteína (Fig. 26-13b) de tal manera que interactúa casi exclusivamente con los residuos de los la hélice puente y la parte adyacente de Rpb1. el sitio de

unión de α-Amanitina está demasiado lejos del sitio activo de la enzima para directamente interferir con el NTP entrante o la síntesis de ARN, induce a la observación que la α-amanitina no influye en la afinidad de RNAP II con los PNT. Lo más es que la unión de α-Amanitina impide el cambio conformación de la hélice puente dedicada a realizar el paso de translocación de la RNAP (Sección 26-2A), lo que apoya aún más este mecanismo. RNAP I, así como el cloroplasto mitocondrial, y las RNA polimerasas procariotas son insensibles a α-amanitina. A pesar de la alta toxicidad de las amatoxinas (5-6 mg, contenido en un champiñones fresco de ± 40 g, es suficiente para matar a un adulto humano), actúan lentamente. La muerte, por lo general se da por disfunción hepática, y no se produce antes de varios días después de la ingestión de los hongos (y después de la recuperación de los efectos de otras toxinas del hongo). Esto, en parte, refleja la tasa de rotación lenta de los ARNm eucariotas y las proteínas.

________________________________________________________________________________ Además, la maquinaria de transcripción escarótica, como veremos, es mucho más compleja que la de los procariotas, que requieren más de 100 polipéptidos que forma ensamblajes con masas moleculares de varios millones de Dalton para reconocer las secuencias de control e iniciar la transcripción.

A Los eucariotas tienen varias polimerasas de ARN

El núcleo eucariota contienen tres tipos distintos de ARN polimerasa que difieren en los ARN que sintetizan:

1. ARN polimerasa I (RNAP I), que se encuentra en los nucléolos (cuerpos nucleares obscuros donde se ensamblan los

ribosomas, fig. 1-8), sintetizan los precursores de la mayoría de los rRNA.

2. ARN polimerasa II (RNAP II), que se produce en el nucleoplasma, sintetiza los precursores de mRNA.

3. ARN polimerasa III (RNAP III), que también se produce en el nucleoplasma, sintetiza los precursores de 5S rRNA, tRNA, y

un variedad de otros pequeños ARN nucleares y citosólicas.

Además de estas enzimas nucleares, las células eucariotas contienen separados RNAPs mitocondriales y cloroplasto (en

plantas). La función esencial de las RNAPs en todas las células las convierte en blancos atractivos para los antibióticos y otros

medicamentos (Cuadro 26-2).

Los RNAPs eucariotas, que tienen masas moleculares de hasta 600 kD, tienen una mayor complejidad considerablemente en

las subunidades que las enzimas procariotas. Cada RNAP eucariota contiene dos no idénticas "grandes" (>120 kD)

subunidades, que son homólogas a las subunidades β y β´ de los procariotas, y un conjunto de hasta 13 diferentes

"pequeñas" (<50 kD) subunidades, dos de las cuales son homólogas a los de las subunidades α procariotas y una de las

cuales es un homólogo de la subunidad ώ. Cinco de las subunidades pequeñas, incluyendo el homólogo ώ, son idénticas en

las tres enzimas eucariotas, y las α homólogas son idénticas en RNAPs I y III.

En una tour cristalográfica de force, Roger Kornberg determinó la estructura de rayos X de RNAP II de una levadura (Fig. 26-

11). Esta enzima, como se esperaba, se asemeja a Tth y Taq de la RNAP (Fig. 26-2) en la forma general de pinza de cangrejo y

en las posiciones y los pliegues básicos de sus subunidades homólogas, aunque RNAP II es algo más grande y tiene varias

subunidades, que no tienen contrapartidas en la RNAP bacteriana. La RNAP II une dos iones Mg+2 en su sitio activo en la

vecindad de cinco residuos ácidos conservados, lo que sugiere que RNAPs cataliza el alargamiento del ARN a través de un

mecanismo de dos iones metálicos similar al mecanismo empleado por las ADN polimerasas (Sección 25-2A). Como es el caso

con la RNAP bacteriana, la superficie de la RNAP II está casi completamente cargada negativamente a excepción de la unión a

la hendidura del ADN y la región alrededor del sitio activo, que están cargados positivamente.

La subunidad Rpb1 de la RNAP II (rosa en la fig. 26-12), es el homólogo de la subunidad β´ en las RNAPs procariotas, tiene un

extraordinario dominio C-terminal (CTD). En los mamíferos, el CTD contiene 52 repeticiones altamente conservadas con la

secuencia consenso Pro-Thr-Ser-Pro-Ser-Tyr-Ser (26 repeticiones en la levadura, con otros eucariotas tienen valores

intermedios). Tantos como 50 residuos de Ser en este segmento de la proteína rico en hidroxilo están expuestos a una

fosforilación reversible por la CTD quinasa y CTD fosfatasas. La RNAP II inicia la transcripción sólo cuando el CTD ha sido

desfosforilado, lo que sugiere que este proceso dispara la conversión del complejo de iniciación de la RNAP II. Las repulsiones

de carga- carga entre grupos fosfatos cercano probablemente causará un muy fosforilado CTD para proyectar tan lejos como

a 500 Å partir de la Porción globular de la polimerasa. Como veremos más adelante, el CTD fosforilado proporciona los sitios

de unión para numerosos factores proteicos que son esenciales para la transcripción.

Figura 26-12 | la estructura de rayos X de levadura de la ARN polimerasa II.

(a) La enzima se orienta de manera similar a la RNAP Tth en la figura. 26-2, y las subunidades que son homólogas a aquellas en la

RNA polimerasa se muestran en los mismos colores que en la fig. 26-2. La posición de un sitio actico con un ion Mg+2 activo está

marcado por una esfera de color rojo, y ocho iones Zn2+ están representados por esferas de color naranja. Dos subunidades de la

polimerasa no esenciales y el lado C-terminal del homólogo β´ no son visibles en esta estructura. (b) Vista de la enzima de la derecha

de la parte A, que muestra la hendidura de unión al ADN. El círculo tiene el diámetro aproximado del DNA-B. [Basado en una

estructura de rayos X por Roger Kornberg, la Universidad de Stanford. PDBid 1I50.] N.

La estructura de la polimerasa de ARN explica su función. Para producir una instantánea de la RNAP II en acción, Kornberg

incubó la enzima con una molécula de dsDNA que tiene una cola monocatenaria en 3´ (la cadena molde) junto con todos los

sustratos NTP excepto UTP. Como consecuencia, la polimerasa sintetiza una corta hebra de (14-nt) de RNA antes de detenerse

en el primer residuo A (cuando los cristales de este complejo se empapo de UTP, la transcripción se reanudo, lo que

demuestra que el complejo estaba activo). La estructura de rayos X y un diagrama en corte de esta RNAP II pausada se

muestra en la figura. 26-12.

En el complejo RNAP-DNA-RNA, una porción masiva (±50-kD) de la subunidad RPB2 (el homólogo; Cian en la figura 26-11),

llamada la "pinza", está ubicada volteada por encima del ADN para atraparla en la hendidura, de esta manera es en gran

media que la enzima tiene una procesividad esencialmente infinita.

El ADN desenrollado por tres nucleótidos antes de entrar en el sitio activo (Quien está contenida en Rpb1). Pasado este

punto, sin embargo, una parte de RPB2 conocido como el "muro" que dirige la cadena molde fuera de la pinza con un giro de

± 90°. Como consecuencia, la base de la plantilla en el sitio activo (i + 1) apunta hacia el suelo del sitio activo donde puede ser

leído por la polimerasa. Esta base se combina con el ribonucleótido en el extremo 3´ del ARN, que se coloca por encima a un

poro de 12A° de diámetro, al final de un "embudo" (también llamado el canal secundario) hacia el exterior de la proteína a

través de donde la NTPS presumiblemente accede al otro lado del sitio activo acordonada.

La hélice híbrida adopta una conformación no estándar con forma intermedia entre un ADN A y uno B, quien es desenrollado

muy parecido como se muestra en la estructura de rayos X de una hélice híbrida de ARN-ADN sola (Fig. 24-4). Casi todos los

Figura 26-13 | eL complejo de elongación de la ARN polimerasa II.

(a) estructura de rayos X del complejo según se ve desde la parte inferior de la figura. 26-11a (porciones de RPB2 que forman el lado

cerca de la hendidura se ha eliminado para exponer el complejo unido a ARN-ADN). La proteína está representada por su columna

vertebral en donde la pinza, que esta cerrada sobre el dúplex de ADN corriente abajo, es de color amarillo, la hélice puente en verde, y

las porciones restantes de la proteína son de color gris. la plantilla de ADN (cian), la cadena de ADN no plantilla (verde), y el ARN

recientemente sintetizado (rojo) se dibujan con sus porciones bien ordenadas en forma de escalera ( la forma clásica) y sus partes

menos ordenadas en forma de columna principal (parecido al espagueti). Un sitio activo con un ion Mg+2 está representado por una

esfera magenta. (b) diagrama cortado del complejo de transcripción en una pieza en la que las superficies de corte de la proteína son

de color gris claro, sus superficies restantes son gris más oscuro, y varias de sus características estructurales funcionalmente

importantes están etiquetadas. El ADN, ARN, y el sitio activo con el ion Mg2 están de color como en la Parte A con porciones del ADN y

ARN que no están visibles en la estructura de rayos X representada por líneas de trazos. α-Amanitina (pelota naranja) se analiza en el

recuadro 26-2. [Modificado de diagramas Roger Kornberg, la Universidad de Stanford. PDBid 1I6H.]

Contactos que la proteína hace con el ARN y el ADN son con sus cadenas principales de azúcar-fosfato; ninguno es con los

bordes de sus bases. La especificidad de la enzima por un ribonucleótido en lugar de un desoxirribonucleótido aparece

debido al reconocimiento de la enzima de tanto del azúcar ribosa entrante como del híbrido ARN-ADN. Después de

aproximadamente un giro de la hélice híbrida, un asa que se extiende desde la pinza conocida como el "Timón" separa al ARN

de la hebra molde de ADN, permitiendo de ese modo la reformación de la doble hélice de ADN a medida que sale de la

enzima (aunque la cola 5´ desapareada de la hebra no plantilla, y la cola 3´ de la cadena plantilla estén desordenadas en la

estructura de rayos X).

Cómo traslada el RNAP al complejo hibrido ADN-ARN hacia el final después de cada ciclo catalítico. Un segmento muy

conservado helicoidal de Rpb1 llamado el "puente" (ya que une las dos pinzas que forman la hendidura de la enzima)

inespecíficamente se une con la plantilla base de ADN en la posición 1+. El puente esta lineal en las estructuras de rayos X de

RNAP II (Figs. 26-11a y 26-12a) pero doblado en la estructura de rayos X de la RNAP bacteriana (Fig. 26-2). El puente en la

hélice, de hecho, alterna entre sus conformaciones rectas y dobladas, para moverse entre 3 y 4 amstrongs. Kornberg

especulo que por lo tanto la translocación se produce a través de la flexión del puente en la hélice para así empujar los

nucleótidos apareadas en la posición + 1 a la posición -1. La recuperación del puente hélice a su conformación recta entonces

daría un sitio activo vacío en la posición +1 para la entrada del siguiente NTP, preparando de este modo a la enzima para una

nueva ronda de adición de nucleótidos. El proceso reverso de esto es presumiblemente prevenido mediante la unión del

siguiente sustrato NTP, y por lo tanto este mecanismo es conocido como la traba browniana [en donde de otra manera las

fluctuaciones térmicas (brownianas) aleatorias delante y atrás son convertidas en movimientos coherentes hacia adelante

mediante la inhibición de un movimiento hacia atrás]

El RNAP II selecciona si sustrato ribonucleótido a través de un proceso de dos etapas. El NTP entrante primero se une a un

sitio llamado sitio E (por entrada) (fig. 26.14), quien exhibe ninguna selectividad en la escogencia de las bases. El NTP luego

brinca hacia el sitio A (por adición) quien acepta solamente a NTP que formen un emparejamiento de Watson y Crick con la

posición +1 de la plantilla base. Este proceso es mediado por un sitio de la RNAP llamado el asa gatillo, quien acomoda a la

unio entre la base y el NTP formando una extensa red de puentes de hidrogeno que no solamente unes a estos dos sino a los

lado vecinos de esta unión para fortalecer aún más la unión. Estas interacciones discriminan efectivamente los NTP.

Figura 26-14 | El A y E y los sitios del circuito de disparo en el ARN polimerasa II.

Una vista de corte del complejo de transcripción como se ve en las Figs. 26-11a y 26-12. El ADN molde, sin plantilla ADN, ARN recién

transcrito, GTP en el sitio A, y ATP en la E sitio son cian, verde, rojo, naranja y azul, respectivamente. el gatillo bucle es magenta, la

hélice puente es de color verde, y el Mg2 dos? iones en el sitio activo están representados por esferas magenta. La RNAP II superficie

es gris. [Cortesía de Dong Wang y Roger Kornberg, la Universidad de Stanford. PDBid 2E2H.]

Las RNAPs pueden corregir sus errores. Los RNAPs no pueden leer a través de una hebra dañada y consecuentemente se

saltan todos los sitios dañados. Más aún si un desoxinucleotido o un ribonucleótido mal apareado son erróneamente

incorporado al RNA, la hélice dúplex hibrida DNA-RNA se desordena, lo que causa que la RNA se detenga. Como, entonces,

hace la RNAPs para evadir la acumulación de daños o sitios mal apareados, los cuales si ocurren en un gen importante tendría

consecuencias letales Las RNAPs no simplemente se mueven monotonicamente hacia adelante a los largo de la plantilla de

DNA. En lugar de eso, ellas frecuentemente retroceden, de tal modo que el penúltimo nucleótido del RNA, quien estaba en la

posición -1, vuelve a entrar a la posición +1, pero también el nucleótido en el extremo 3´, que ahora queda en la posición 2+,

entra al canal secundario donde se une en el sitio llamado P (del ingle proofreadin “el que corrige”). Si el movimiento hacia

adelante del RNA es impedido por un daño en la hebra o por un mal apareamiento, el retroceso más grande se favorece de

tal manera que más nucleótidos entran al canal secundario. El retroceso de solo unos pocos nucleótidos es reversible. Pero si

esto no es así, la transcripción es detenida hasta que el RNA hidrolíticamente es liberado del sitio activo. En E. Coli, esto

requiere la asistencia de la proteína homologa GreA y/o GreB, mientras que en la RNAP II, esta función es llevada a cabo por

la proteína no relacionada TFIIS. Estas proteínas inducen que el sitio activo de la RNAP hidroliza el enlace fosfodiéster entre

los ribonucleótido en las posiciones +1 y -1 (una reacción que no es la inversa de la reacción de la polimerasa debido a que

esta podría ser por pirofosforolisis). De esta manera, el RNAP puede corregir sus errores y reanudar la sintesis de RNA. RNAP I

y RNAP III también corrigen sus errores eficientemente.

B | Cada Reconoce la Polimerasa un tipo diferente de Promotor

En los eucariotas, RNAP no incluye un factor σ. En su lugar, un número de proteínas accesorias identifican promotores y

reclutan al RNAP hasta el sitio de inicio de transcripción (como se describe más detalladamente en la Sección 26-2C). Como

era de esperarse, los promotores eucariotas, son más complejos y diversos que los promotores procariotas. Además, los tres

RNAPs eucariotas reconocen diferentes tipos de promotores.

Los ARN polimerasa I de mamíferos tienen un promotor dividido en dos partes. Ambos genomas, procariotas y eucariotas

contienen múltiples copias de sus genes de rRNA con el fin de satisfacer la enorme demanda de estos rRNAs (que

comprenden, por ejemplo, 80% de ARN contenido en una célula de E. coli). Debido a que los numerosos genes de rRNA en

una célula eucariota tienen secuencias esencialmente idénticas, su RNAP I reconoce solo un tipo de promotor. Sin embargo,

en contraste con los promotores de RNAP II y II; los promotores de RNAP I son específicos de especie, es decir, un RNAP I sólo

reconoce su propio promotor y de pronto los de otras especies estrechamente relacionadas.

Los promotores de RNAP I se identificaron mediante la determinación de cómo la tasa transcripción de un gen de rRNA se ve

afectada por una serie de cada vez más grandes supresiones a lo largo del sitio de inicio de la transcripción, ya sea corriente

arriba o corriente abajo. Tales estudios han indicado, por ejemplo, que los RNAP I mamíferos requieren un elemento

promotor básico, que abarca posiciones entre -31 y +6 y por lo tanto se solapa con la región transcrita. Sin embargo, la

transcripción eficiente también requiere un elemento promotor corriente arriba, que se encuentra entre los residuos -187 y

-107. Estos elementos, que son ricos en G - C- y 85% idénticos, están sujetos a factores de transcripción específicos que a

continuación reclutan el RNAP I al sitio de inicio de transcripción.

Los promotores de la ARN polimerasa II son complejos y diversos. Los promotores reconocidos por la RNAP II son

considerablemente más largos y más diversos que los de los genes procariotas. Los genes estructurales expresados en todos

los tejidos (los genes de limpieza, que se cree que se transcriben constitutivamente) tienen tramos de ADN ricos en GC

localizados corriente arriba de sus sitios de inicio de la transcripción. Estas islas CpG (recuadro 25-4) funcionan de manera

análoga a promotores procariotas. Por otra parte genes, genes estructurales que son selectivamente expresados en uno o

unos pocos tipos de células a menudo carecen de estas secuencias ricas en GC. En cambio, contienen un promotor básico de

40 a 50 nt que incluye el sitio de inicio de la transcripción. Dentro del promotor básico para un gen dado hay uno o más

elementos conservados que actúan --en su mayor parte de forma cooperativa-- para dirigir la transcripción.

Entre los elementos promotores básicos más conocidos esta la caja TATA, una secuencia rica en AT localizada entre 25 a 30 pb

corriente arriba del sitio de inicio de la transcripción. La caja TATA (secuencia de consenso TATATAAT

A) se asemeja a la región

-10 de un promotor procariótico (TATAAT), aunque se diferencia en su ubicación en relación con el sitio de inicio de la

transcripción (-27 versus -10). Alrededor dos tercios de los genes que codifican proteínas carecen de una caja TATA, pero

aproximadamente la mitad tienen unas secuencias conservadas elemento Inr (iniciador) de 7-nt que incluye el nucleótido de

inicio de +1. Las secuencias de consenso y las posiciones relativas de varios elementos promotores básicos se muestran en la

figura. 26-15. La mayoría de estos elementos han sido identificados a partir de su conservación en muchos genes de

diferentes especies eucariotas, y su participación en la transcripción dirigida por RNAP II, se ha verificado experimentalmente

mediante la mutación de sus secuencias y/o posiciones y mediante la introducción de estos en los genes cuyo elemento

promotor básico original había sido eliminado. Ninguno de los elementos promotores básicos se producen en todos los

promotores, aunque algunas pautas generales son evidentes, por ejemplo, los promotores básicos que carecen de una caja

TATA utilizan MTE o DPE, y viceversa. Todos los elementos promotores básicos, de forma individual o como conjuntos,

interactúan con sus factores de proteínas correspondientes que a su vez reclutan a la RNAP II al sitio de iniciación

(Sección 26-2C).

El gen de la región se extiende entre aproximadamente? 50 y? 110 también contiene elementos promotores. Por ejemplo,

muchos genes eucariotas tienen una estructurales secuencia consenso conservada de CCAAT (la caja CCAAT) situado entre

sobre? 70 y? 90 cuya alteración reduce en gran medida el gen de tasa de transcripción. Evidentemente, las secuencias aguas

arriba del promotor del núcleo constituyen adicionales de ADN de sitios de unión para las proteínas implicadas en la

transcripción iniciación.

Los potenciadores son activadores transcripcionales que pueden tener Posiciones y orientaciones Variables. Tal vez el

aspecto más sorprendente de los elementos de control transcripcional en eucariotas es que algunos de ellos no necesita tener

posiciones y orientaciones fijas con relación a sus correspondientes secuencias transcritas. Por ejemplo, el genoma del virus

de simio 40 (SV40), en la que tales elementos fueron descubiertos, contiene dos secuencias repetidas de 72 pb cada una que

se encuentran corriente arriba del promotor para la expresión temprana del gen. La transcripción se ve afectada si una de las

repeticiones se elimina, pero es casi eliminada cuando ambas están ausentes. El análisis de una serie de SV40 mutantes que

contienen sólo una de las repeticiones demostró que su capacidad para estimular la transcripción de su promotor

correspondiente es casi independiente de su posición y orientación. De hecho, la transcripción se ve afectada incluso cuando

este segmento esta varios miles de pares de bases corriente arriba o corriente abajo del sitio de inicio de transcripción.

Segmentos de genes con tales propiedades se denominan potenciadores (enhancer) para indicar que se diferencian de los

promotores, son específicos en su sitio y específicos en su hebra para alterar el inicio de la transcripción.

Figura 26-14 | Algunas secuencias básicas promotoras de ARN polimerasa II.

Se muestra la secuencia de consenso de cada elemento (algunas posiciones pueden acomodar dos o más nucleótidos; N

representa cualquier nucleótido). Las posiciones aproximadas de los elementos se muestran, con relación al sitio de inicio de la

transcripción (+1). Tenga en cuenta que un promotor básico específico puede contener todos, algunos o ninguno de estas

secuencias. El BRE (elemento de reconocimiento al TFIIB) es una extensión de la caja TATA corriente arriba. El DPE (elemento

promotor básico corriente abajo) y el MTE (motivo diez elementos) deben ir acompañada por un INR.

Los potenciadores se producen en genes celulares así como virus eucariotas y son requeridos para las actividades de sus

promotores afines. En vez de interactuar con RNAP II directamente, los potenciadores son reconocidos por factores de

transcripción específicos que estimulan la RNAP II a unirse al correspondiente pero distante promotor. Esto requiere que el

ADN entre el potenciador y promotor de bucle alrededor de modo que el factor de transcripción al mismo tiempo puede en

contacto con el potenciador y II RNAP en el promotor. Potenciadores más celulares están asociados con genes que se

expresan selectivamente en específica tejidos. Parece, por tanto, como veremos en la Sección 28-3B, que los potenciadores

mediar en la mayor parte de la expresión selectiva de genes en eucariotas.

Los promotores de la ARN polimerasa III pueden estar localizados corriente abajo de Sus sitios de inicio de transcripción.

Los promotores de algunos genes transcritos por RNAP III se encuentran en el interior de las regiones transcritas por los

genes. En un gen que codifica para el ARN 5S del Xenopus borealis, las eliminaciones de la secuencias base que comienzan

desde fuera de uno o el otro extremo de la porción transcrita del gen, evita la transcripción sólo si se extienden en el

segmento entre los nucleótidos +40 y +80. La porción del gen es eficaz como promotor, ya que contiene el sitio de unión para

un factor de transcripción que estimula la unión corriente arriba de la RNAP III. Otros estudios han demostrado, sin embargo,

que los promotores de otros genes transcritos por RNAP III se encuentran completamente corriente arriba de los sitios de su

comienzo. Estos sitios aguas arriba también se unen factores de transcripción que recluta RNAP III.

C | factores de transcripción son Se requiere para iniciar la transcripción

Diferentes células eucariotas poseen una notable capacidad para la expresión selectiva de genes específicos. Las tasas de

síntesis de una determinada proteína en dos células del mismo organismo pueden diferir en factor de 109. Así, por ejemplo,

los reticulocitos (glóbulos rojos inmaduros) sintetizan grandes cantidades de hemoglobina, pero ninguna cantidad detectable

de insulina, mientras que las células pancreáticas producen grandes cantidades de insulina pero no de hemoglobina. En

contraste, los sistemas procariotas exhiben generalmente no más de un Intervalo de mil en sus tasas de transcripción de

modo que al menos algunas copias de todas las proteínas que codifican están presentes en cualquier célula. Sin embargo, el

mecanismo básico para iniciar la transcripción de los genes estructurales es el mismo en eucariotas y procariotas: factores

proteicos se unen selectivamente a las regiones promotoras del ADN. Con los promotores clase II (aquellos transcritos por

RNAP II), un complejo de al menos seis factores de transcripción generales (GTFs; Tabla 26-1) funcionan como un

equivalente formal del factor σ en eucariotas. La estructura de varios factores de transcripción eucariotas se describe en

Sección 24-4C.

Los seis GTFs, que están altamente conservados desde las levaduras hasta los seres humanos, son requeridos para la síntesis

de todos los mRNAs, incluso aquellos con fuertes promotores. Los GTFs permiten un nivel de transcripción basal (bajo pero

constaten), que se puede aumentar por la participación de otros factores específicos de genes. Vamos a examinar la acción

de algunas de esas otras proteínas en la Sección 28-3. Los GTFs, cuyos nombres comienzan con TF (factor de transcripción),

seguido por un número romano II para indicar que están involucrados en la transcripción por RNAP II, se combinan con la

enzima y el promotor ADN en una ordenada vía para formar un complejo de preiniciación (PIC).

La formación del PIC a menudo comienza con una proteína de unión TATA que se une a la caja TATA. Como se indica en la

Sección 26-2B, los promotores de muchos genes estructurales eucariotas contienen una caja TATA en la posición -27. Los GTFs

están dirigidos a esta y otras secuencias que componen el núcleo promotor. El primer factor de transcripción que se une a los

promotores que contienen caja TATA es la proteína de unión a TATA (TBP), que como su nombre indica, se une a la caja TATA

y de ese modo ayuda a identificar el sitio de inicio de la transcripción. TBP posteriormente se une en el promotor mediante

subunidades adicionales para formar, en los seres humanos, el complejo de 17 subunidades con ± 1122 kD llamado TFIID.

El dominio C-terminal altamente conservad de TBP contiene dos directas repeticiones ± 40% idénticas de 66 residuos

separadas por un segmento muy básico (Ph alto). Su estructura de rayos X, que se determinó independientemente por Roger

Kornberg y Stephen Burley, revela una molécula en forma de silla que consta de dos dominios estructuralmente similares

acomodados con una pseudo-doble simetría (Fig. 26-16a). La Estructura del TBP sugiere que podría encajar perfectamente

montado una desorientada hélice de ADN B. Sin embargo, las estructuras de rayos X del complejo TBP-ADN, determinadas

independientemente por Burley y Paul Sigler, revelan una interacción muy diferente. El ADN de hecho se une a la superficie

cóncava de TBP pero con su eje dúplex casi perpendicular en lugar de paralelo al eje cilíndrico de la montura (Fig. 26-16b). El

ADN unido es doblado en 45° entre los dos primeros pares de bases de la caja TATA de 7-bp y entre su último par de bases y

el par de bases sucesivos, asumiendo así una conformación parecida a un manubrio. El TBP, que sufre poco cambio

conformacional al unirse con el ADN, lo hace a través de enlaces de hidrógeno y las interacciones de van der Waals.

Figura 26-15 | X-Ray estructuras de la proteína de unión TATA (TBP).

(a) Un diagrama de cintas de TBP de una levadura en ausencia

de ADN, en la que las hélices α son de color rojo, las hebras son

de color amarillo, y el resto de la columna principal del

polipéptido es cian. La proteína de pseudo-doble eje de

simetría es vertical. [Basado en una estructura de rayos X por Roger

Kornberg, Stanford Universidad. PDBid 1TBP.] (B) La estructura de

TBP humano en complejo con un dúplex de ADN que contiene

una caja TATA de 16-bp. El ADN, que es en gran medida en la

forma B, se extrae en forma de barra y de color según el tipo

de átomo, con la hebra sentido C en verde, la cadena

antisentido C en cian, N azul, O rojo y naranja P. este entra en

su sitio de unión con el extremo 5´ de la cadena sentido a la

derecha y sale a la izquierda con su eje de la hélice casi

perpendicular a la página. La proteína se extrae en forma de

gusano de color arco iris a partir de su extremo N-terminal

(azul) a su C-terminal (rojo). Las cadenas laterales de los

residuos Phe 193, 210, 284, y 301, que inducen fuerte

retorcimientos en el ADN, se dibujan en forma de barra

(magenta). Entre los retorcimientos, que están situadas en

cada extremo de la caja TATA, el ADN es parcialmente

desenrollado con ocho hebras hoja de la proteína insertada

ampliado en gran medida en la ranura menor del ADN. El TBP

no está en contacto surco mayor del ADN. [Basado en una

estructura de rayos X por Stephen Burley, estructural Genomix, Inc.,

San Diego, California. PDBid 1CDW.]

El ADN doblado y parcialmente desenrollado se estabiliza mediante una cuña de dos cadenas laterales de Phe en cada lado

de la estructura de silla de montar que el separarlas dos pares de bases que flanquean cada pliegue de sus lados surco

menor. La inclinación conformación de ADN crea una etapa para el montaje de otras proteínas para formar el PIC.

TFIIA, TFIIB y TAF Interactuar con TBP y II RNAP. Los otros GTFs necesarios para la transcripción basal montar como se

esquematiza en la figura. 26-16. El PIC requiere, como mínimo, TBP, TFIIB, TFIIE, TFIIF, TFIIH y. FIIB consta de dos dominios,

un dominio N-terminal (TFIIBN), que interactúa con RNAP II, y un dominio C-terminal (TFIIBC), que se une ADN e interacciona

con PDD. Las estructuras de rayos X de TFIIA-TBP-ADN y TFIIBC-TBP-ADN han permitido la generación de un modelo plausible

para el complejo TFIIA-TFIIBC-TBP-DNA (Fig. 26-17a). Las tres proteínas se unen al ADN justo aguas arriba de la transcripción

iniciar el sitio, dejando un amplio espacio para las proteínas adicionales y RNAP II de obligar. Dado que el TBP

pseudosymmetric se ha demostrado que se unen a la caja TATA en cualquier orientación, parece que las interacciones

específicas entre base- TFIIB y la función del promotor en la posición TFIIB para orientar adecuadamente el TBP en el

promotor. La estructura de rayos X del complejo TFIIBN-RNAP II, también se determina por Kornberg, revela que los

contactos TFIIBN el "dock" dominio de la RNAP II cerca de su canal de salida y que el ARN insertos TFIIBN su "dedo" de

dominio en el centro activo de RNAP II. Un modelo de la TFIIB-TBP-II-RNAP ADN complejo basado en esta estructura de rayos

X junto con la de la TFIIBC-TBP-ADN se muestra en la figura. 26-18b.

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DIAGRAMA DEL PROCESO

FIG: 26-17 el ensamblaje del complejo de preiniciación (PIC) con el promotor que contiene la caja TATA

[Las barras laterales son perfectas para remarcar puntos importantes del texto o proporcionar información adicional de referencia rápida, por

ejemplo una programación.

Normalmente se colocan en la parte izquierda o derecha de la página, o en la parte superior o en la inferior. Pero puede arrastrarla fácilmente

Los componentes restantes de TFIID, que son conocidos como factores asociados a TBP (TAF), forman un complejo en forma

de herradura para que TFIIA y TFIIB estén unidos (Fig. 26-18). TBP se encuentra en la parte superior de la cavidad, y el

promotor de ADN pasa a través de la cavidad. Las Porciones de 9 de los 14 TAF conocidos, están muy conservadas desde la

levadura hasta los seres humanos, y son homólogas a las histonas no enlazadoras (Sección 24-5A). De hecho , estudios de

rayos X y otros, sugieren que cuatro de estos TAF se asocian para formar una heterooctamer parecido a un nucleosoma. Sin

embargo, es poco probable que el ADN se enrolle alrededor de la TAF como lo hace en un nucleosoma porque muchos de los

residuos de histonas que hacen contactos críticos con el DNA en el nucleosoma no han sido conservados en los TAF parecidos

a histonas.

Figura 26-18 | modelos estructurales para la interacción de TFIIB.

(a) Modelo del complejo TFIIA-TBP-TFIIBC-promotor basado en las estructuras de cristalografía de rayos X determinadas

independientemente de los complejos TFIIA-TBP-promotor y TFIIBC-TBP-promotor. La ADN (palos blancos) se ha ampliado en los dos

sentidos más allá de la TATA caja. La TBP pseudosimetrica (cian y violeta), visto desde atrás, induce dos dobleces agudos en el ADN,

dándole una forma de manubrio. Tanto la TFIIA (amarillo y verde) como la TFIIBC (magenta y rojo) interactúan con TBP, pero cada una

interactúa con sitios independientes en el ADN. el sitio de inicio de transcripción (+1) está a la izquierda. (B) Modelo del complejo TFIIB-

TBP-RNAP II-promotor basado en las estructuras de rayos X de los complejos de II TFIIBN-RNAP y TFIIBC-TBP-promotor. La vista de la

RNAP II es de la parte inferior de la figura. 26-12, después de haberlo rotado 90° en el plano del papel. La proteína y el ADN están

representados por su superficies accesible a solventes con la proteína de color gris, excepto como se indica en la clave de

acompañamiento, y el color de ADN de acuerdo al tipo de átomo (C blanco, azul N, O rojo, amarillo y P). El ADN ha sido extendido por 20

pb en ambos extremos. [Cortesía de Roger Kornberg, la Universidad de Stanford. Basado en PDBid 1R5U y 1VOL.]

Figura 26-19 | Microscopía electrónica basada en imagen del complejo humano TFIID-TFIIA-TFIIB en resolución de 35 Å.

El complejo consta de tres dominios, A, B, y C, dispuestas en forma

de herradura con alrededor de 200 Å de ancho, 135 Å alto, y 110 Å

de espesor. Las mallas rojas y verdes indican las posiciones de

TFIIA y TFIIB como se determina por comparación con las imágenes

del complejo TFIID-TFIIA y TFIID solo. La malla amarilla indica la

posición de la unión de un anticuerpo anti-TBP. [Cortesía de Eva

Nogales, de la Universidad de California en Berkeley.]

En las etapas finales de la formación del PIC (Fig. 26-16), TFIIF recluta a la RNAP II hacia el promotor en una forma que

recuerda la forma en que el factor σ interactúa con la bacteriana RNAP. De hecho, la segunda más grande de las tres

subunidades de TFIIF es homóloga a σ70, quien es el factor σ predominante en las bacterias, y, Además, puede interactuar

específicamente con RNAPs bacterianas (aunque este no participa en el reconocimiento del promotor). Por último, TFIIE y

TFIIH se unen a este ensamblaje de proteínas. Una vez que este complejo ha sido montado, la actividad helicasa dependiente

de ATP del factor TFIIH induce la formación del complejo abierto, así que la síntesis de RNA puede comenzar. Tenga en cuenta

que el PIC del humano, aparte de sus ±12-subunidades en RNAP II, que pesan 600-kD, contiene 32 subunidades con un

agregado de masa de 1633 kD (Tabla 26-1). Muchas de las proteínas en el PIC son los objetivos de reguladores

transcripcionales.

Los promotores que carecen de una caja TATA también se unen al TBP. Debido a que la proteína de unión a TATA es un

componente de TFIID, un factor de transcripción general para la RNAP II, cómo se forma el complejo preiniciación

apropiadamente con promotores sin TATA?. En muchos casos, la presencia del elemento INR es suficiente para dirigir la RNAP

II al sitio de inicio correcto. Estos sistemas requieren la participación de muchos de los mismos GTFs que inician la

transcripción en promotores que contiene TATA-box. Sorprendentemente, también requieren TBP. Esto sugiere que con

promotores que carecen de TATA, Inr recluta la TFIID de tal manera que su componente TBP se une a la región -30 en una

secuencia no específica. En efecto, en promotores que contienen Inr y que también contienen un caja TATA, los dos

elementos actúan de forma sinérgica para promover la iniciación de la transcripción. Sin embargo, un TBP mutante que es

defectuoso en unirse a la caja TATA apoyará la transcripción eficiente de algunos promotores sin TATA, aunque no de otros.

Esto sugiere que los promotores no requieren una interacción estable con TBP. Por consiguiente, el esquema expuesto

en la figura. 26-16 debe ser tomado como un marco flexible para la iniciación de transcripción de la RNAP II en los eucariotas,

con los requisitos exactos de proteínas dependiendo en la naturaleza del promotor y la presencia de factores proteicos

adicionales.

TBP es un factor de transcripción Universal. RNAP I y RNAP III requieren diferentes conjuntos de GTFs el uno del otro, y de

RNAP II para iniciar la transcripción desde sus respectivos promotores. Esto no es inesperado teniendo en cuenta las

organizaciones muy diferentes de estas tres clases de promotores (Sección 26-2B). En efecto, los promotores reconocidos por

RNAP I (clase I promotores) y casi todos los reconocidos por RNAP III (clase III promotores) carecen de cajas TATA. Por lo

tanto, no fue una sorpresa cuando se demostró que TBP se requiere para la iniciación tanto de RNAP I como de RNAP III. TBP

participa mediante la combinación con diferentes conjuntos de TAFs para formar los GTFs SLI (con promotores de clase I) y

TFIIIB (Con clase III promotores). Como con ciertos promotores clase II sin TATA, un TBP mutante que es defectuoso para la

unión a la caja TATA todavía puede apoyar en la iniciación de la transcripción in vitro tanto por la RNAP I como por la III RNAP.

Claramente, TBP, el único factor de transcripción conocido universal, es inusualmente una proteína versátil.

La elongación Requiere de Diferentes factores de transcripción. Después que RNAP II inicia la síntesis de ARN y con éxito

produce una transcripción corta, la maquinaria de transcripción experimenta una transición al modo de alargamiento. El

interruptor parece implicar la fosforilación del dominio C-terminal (CTD) de la subunidad Rpb1 en RNAP II. La RNAP II

fosforilada libera a algunos de los factores de iniciación de la transcripción y avanza más allá de la región promotora. De

hecho, cuando RNAP II se aleja ("limpia") al promotor, y deja tras de sí algunas GTFs, entre ellas TFIID. Estas proteínas pueden

reiniciar la transcripción mediante el reclutamiento de otro RNAP II hacia el promotor. Por consiguiente, la primera RNAP

para transcribir un gen puede actuar como un "Pionero" polimerasa que ayuda a allanar el camino para nuevas rondas de

transcripción.

Durante la elongación, un complejo de seis proteínas llamadas alargadoras se unen al CTD fosforilado de Rpb1, tomando el

lugar de los factores de transcripción desechados. Aunque los alargadores no son esenciales para la transcripción por la RNAP

II in vitro, su presencia acelera la transcripción. Curiosamente, TFIIF y TFIIH permanecen asociados con la polimerasa durante

la elongación. Más de una docena de otras proteínas se sabe que se asocian con el complejo de elongación RNAP II. Algunas

de las proteínas están implicadas en el procesamiento de la ARN naciente, modificando el embalaje de la plantilla de ADN, y

otras que terminan la transcripción.

Los eucariotas Falta precisas Sitios terminación de la transcripción. las secuencias señalización de terminación de la

transcripción en eucariotas no han sido identificación. El es en gran parte debido a que el proceso de terminación es

impreciso, que es decir, los transcritos primarios de un gen estructural dado tienen heterogénea 3? secuencias. Sin embargo,

un sitio de terminación precisa no es necesario porque la transcripción somete a un procesamiento que incluye la escisión

endonucleolítica en un sitio específico (ver más abajo). La endonucleasa puede actuar incluso mientras que el

polimerasa se sigue la transcripción, así la escisión del ARN en sí puede señalar la polimerasa para detener.