Mecanismos de transcripcion

GENETICA MECANISMOS DE TRANSCRIPCION April 4, 2011

Mecanismos de transcripcion

Cromosoma contiene genes, que controlan la trayectoria bioquímica. Hay una dependencia, el gen va a codificar una proteína y esta va a ir a actuar sobre un gen.

La información va de DNA a ARN y esto va ser traducido en una proteína que va tener una secuencia aminoacidica. Si esto parte mal desde el gen estructural vamos a tener una pérdida de la secuencia. Los ácidos ribonucleicos nos permiten el traspaso fidedigno del RNA desde el núcleo al citoplasma, ya que llevan la información.

A modo de recuerdo: Ribonucleotido con grupo fosfato, azúcar y base nitrogenada. El ADN tiene grupo hidroxilo en la posición 2. 4 bases nitrogenadas que componen el ARN: Adenina, guanina, citosina, uracilo.

El ARN la secuencia va estar escrita de 5’ a 3’. El RNA se transcribe de la cadena de DNA que va de 3’a 5’, hebra molde. Esto es entonces un Transcrito primario, unidad básica de ARN, y que luego sufrirá serie de modificaciones para llegar a ser un RNA maduro

Tenemos un gen que tiene regiones reguladoras tanto en 5’como en 3’, regiones promotoras, exones, intrones y secuencias que no se traducen. En maduración desaparecen. Las UTRi ( secuencia no codificadora). Luego de nuestro RNA primario vamos a tener todo el proceso de maduración.

Cuando se realiza la transcripción vamos a necesitar una serie de enzimas. El DNA se encuentra compactado y enrollado sobre las histonas, por lo tanto para que la enzima entre a la doble cadena debe haber un desenrollamiento previo. Para el desenrollamiento necesitaremos factores, secuencia de DNA y enzimas. Entonces primeramente vamos a necesitar la RNA polimeraza, que necesita elementos trans (factores de transcripción para iniciación del proceso) y factores CIS (secuencia regulatoria promotora rio arriba) que están en DNA y determina cuando, como y que rápido se transcribe. Junto con esto, a medida que este DNA en la parte 3’ se está desenrollando, en la parte 5’ una vez que la polimerasa ha pasado, tiene que volver a enrollarse. Por lo tanto, nosotros tenemos enzimas capaces de abrir el DNA en 5’ y elementos que van a permitir el enrollamiento en 3’. La polimerasa se ve rodeada de factores de transcripción, no hay que imaginarse a la enzima sola sobre el DNA, si no que hay una serie de factores de transcripción que junto con los factores cis que están en el DNA, van permitir el inicio de la transcripción.

TRANSCRIPCION:

Entonces, la idea de la transcripción es pasar la información de un lado a otro, transcribir, transmitir la información, de una forma que nosotros podamos entenderla, en este caso las células, y ello pueda ser traducido en una proteína. Esto fue adaptado por la evolución para tener un mensajero que llevara la información almacenada en ella en forma parcializada, ordenada y regulada. ¿Por qué parcializada? Porque se transcribe por partes, no se transcribe completa. Sin embargo, el DNA en el humano tiene una forma en que los genes por lo general están de a uno, distinto es en el genoma de las bacterias en los cuales los genes pueden ir sobrepuestos, por lo tanto las transcripciones se pueden hacer de forma simultánea. El resultado de la transcripción entonces es este “transcrito”.


Secuencia:

Lo primero que vamos a necesitar es abrir una pequeña sección de DNA. La hebra que se va a usar para la transcripción va de 3’ a 5’ ésta sirve de molde entonces para formar el mRNA. El mRNA se sintetiza de nucleótidos libres en la célula. Estos deben ser

trifosfato y tiene que existir la maquinaria necesaria para que se tomen estos nucleótidos y se los pasen o presenten a la enzima. Se deben llevar los nucleótidos respectivos; entonces, esto va a ocurrir en 3 etapas: - iniciación, que va a partir de las secuencias promotoras.- elongación que es producida por las polimerasas - terminación que puede ser dependiente o independiente de rho.

Procesamiento post-transcripcional: El mRNA es un RNA primario, necesitamos madurarlo. En primer lugar con la adición del CAP, que es la 7-metilguanosina, y este CAP se adiciona en el primero nucleótido en 5’. Su utilidad es de proteger del ataque de exonucleasas, facilitar el transporte desde el núcleo al citoplasma y permitir el anclaje del tRNA en el ribosoma. Esto es en eucariontes, porque los procariontes no necesitan etapa de maduración, porque todo el proceso se realiza en el citoplasma celular. En cambio en las eucariontes tenemos compartimentalización, y se necesita el CAP para poder pasar del núcleo al citoplasma, se necesita protegerlo, necesita un conductor hacia el ribosoma, todas estas son las funciones que tiene el CAP. Luego un segundo elemento de maduración es agregar el poli-A en el extremo 3’ , que son aprox. 200 nucleótidos de adenina que se agregan en la cola 3’. Básicamente la función de este poli-A es ayudarle o conferirle estabilidad al RNA. Finalmente a través de un complejo RNA-proteína en el spliceosoma se va a producir la eliminación de todos los intrones que no están codificando para “nada” en nuestro DNA. Existen además unas secuencias que son claves en la unión del intrón-exón que son GUAAG GUAAG. Normalmente se encuentran esas secuencias en los sitios de corte entre el intrón-exón y eso es lo que permite que sea reconocido por toda la maquinaria para que se pueda producir el corte. Esto quiere decir que el corte no se hace en cualquier lugar, sino que se necesita de esta secuencia. La poli A necesitan 200 adeninas, así forma una estructura secundaria e impide que entren las nucleasas y lo degraden. Al alcanzar una estructura secundaria, por ejemplo, en forma de trébol va a hacer al RNA mucho más estable, si es que son mas tiene una mayor estructura y por lo tanto mayor estabilidad. El CAP se adiciona en 5’ en el azúcar, se produce una unión entre los fosfatos y el 5’ del azúcar, siendo una guanosina en la posición 7 tiene un grupo metilo. Normalmente las bases están unidas de la misma forma, el CAP, entonces queda dado vuelta, o sea en la otra posición y eso impide que sea degradado, por ejemplo ya no es de 5’-3’, sino de 5’-5’, esto hace que tenga un giro lo que lo hace no susceptible a degradaciones. Entonces el CAP le da estabilidad a nivel de 5’, tal como se la da el poli A a nivel de 3’. En procariontes el sistema es bastante “simple”, porque no hay barreras que atravesar, por lo tanto una vez que tenemos este RNA maduro pase al citoplasma y en el citoplasma se produzca la traducción (el profe dice que procarionte no tiene intrones, sin embargo lennigher dice que algunas bacteria tienen secuencias no codificantes). En eucariontes sin embargo este sistema es mucho más complejo por las barreras, el núcleo y la compartimentalizacion. Otra diferencias es que los procariontes solo tienen una RNA polimeraza, mientras que los eucariontes tienen 3 RNA polimerazas.


Tipos de RNA RNA mensajero (mRNA): Sirve como patrón para la síntesis de proteínas, lleva la secuencia

codificante. hnRNA procesado. RNA ribosomal (rRNA): Constituye parte de la estructura de los ribosomas (2/3 de ribosomas son

RNA ribosomal). Tiene actividad catalítica lo que significa que es capaz de procesar un elemento y sacar un producto.

RNA de transferencia (tRNA): Cuando participan como adaptador de aa., permiten el traspaso fidedigno de información. Es el mas pequeño de los RNA. Permite llevar el aminoácido hasta el ribosoma e inducir la traducción, que presenta un sitio de unión del aminoácido, y presenta el anticodón, que podrá reconocer el codón base a base el aminoácido que se quiera integrar. Todos estos RNA tienen una secuencia CCA, que es el que permite la unión del aminoácido (pagina 1017 lenningher revisar)

RNA citoplasmático pequeños (scRNA): forman parte de lo que se denomina SRP “partícula del reconocimiento señal”, y esto tiene que ver con la proteína cuando ya esta sintetizada, es una señal para donde tiene que dirigirse la proteína, hacia compartimiento intracelular o extracelular.

RNA heterogéneo nuclear (hnRNA) : molécula precursora del mRNA. Se transfieren directamente del DNA y finalmente van a codificar para una proteína.

RNA pequeño (snRNA): que participa en el proceso de soldadura de los exones, por lo tanto forma parte del espleisosoma.

RNA de interferencia ( tRNAi): cumplen varias funciones como enzimáticas, lisosimas, etc.

A veces estos mismos pasan por subtipos, por ejemplo el RNA mensajero pasa por distintos estadios (pre-RNA, RNA maduro, etc). En el caso de los eucariontes un gen podría codificar para más de una proteína, pero depende del splacing del ARNm.

Otra característica del ARNm, es su estructura lineal. Debe tener el CAP y poli A, y además en su estructura están los codones, que permiten traspasar información a las proteínas.

Existen 20 tipos de aminoácidos, por lo tanto vamos a tener, mas menos, 20 tipos de ARN.

Existen diferentes tipos de tRNA, en los procariontes: 16s 23 s 5 s que son las subunidades de cadena liviana. En los eucariontes están las subunidades 18, 28, 5,8s, y 5 s. La s corresponde al coeficiente de sedimentación que es una técnica que permite separar la proteína por gradientes ¿??

RNA nuclear pequeños: participan en el proceso de soldadura de los exones durante la formación del mRNA por lo tanto, están formado parte del spliceosoma. Estos son pequeñas secuencias de 150 nucleótidos. Algunos ejemplos de ellos U1, U2, U3, U4, U5, U6.

RNA citoplasmático: formados aproximadamente por 300 nucleótidos y forman parte de lo que se denomina SRP que es la partícula señal de reconocimiento y esto tiene que ver con la proteína.

Lo anteriormente mencionado no tiene que ver directamente con el proceso de transcripción o traducción sino que se presenta en la proteína que ya esta sintetizada.

En el DNA se ve una secuencia 5’ otra 3’ que servirá de molde para la síntesis del RNA, nuestra secuencia del DNA molde es T por lo tanto e primer riblonucleótido añadido en el mRNA es A.


Para la transcripción se necesita una RNA polimerasa dependiente de DNA (la independiente de DNA es la que sintetiza DNA a partir de DNA).

Esta enzima sintetiza nucleótido en dirección 5’a 3’, (lo ribonucleótidos deben estar trifosfatados). Se fijna a regiones promotoras y necesita una hebra de DNA molde.

Secuencia de acción:- Se une la RNA polimeraza- Hay separación de DNA por parte de una helicasa, que permiten girar el DNA (ir abriéndolo)- Ocurre el apareamiento de bases por complementariedad.- Se agrega segunda base trifosfato y se forma enlace fosfodiester, P 5’y OH 3’del nucleótido previo. - Union y adicción del tercer nucleotrido trifosfato y asi continuamente, mientras la RNA pol se va

moviendo.-

Se necesitan los trifosfatos para poder incorporar el CAP y poder establecer el puente con la base de la 7 metil guanosina.Las etapas de enrollamiento y desenrollamiento van ocurriendo simultáneamente en el DNA a medida que la trancriptasa va a vanzando y se produce esta burbuja de transcripción en lugares donde hay un hibrido DNA- RNA. Se debe llegar al estado inicial en que se encontraba este DNA y que salga este mensajero a partir de los ribosomas.

En las células procariontes ambas hebras son codificantes y también existe solapamiento de genes, cosa que no ocurre en los eucariontes.

Inhibidores de la transcripciónAcridina y actinomicina D (ambos antibióticos). Pueden intercalarse entre 2 pares sucesivos G-C o meterse en el surco menor de la doble hélice, formando una estructura cíclica. Ambos procesos son para bloquear el paso de la polimeraza y el desplazamiento a través de la cadena.

Transcripción en procariontesLa RNA polimeraza es la clave en este proceso no abandona el molde de DNA en todo el proceso.Está formada por 4 subunidades 2 α, 1β y 1β’. Las dos α dan el inicio, la β está encargada de la elongación y la β’ se une al DNA. Esta enzima, con actividad catalítica, actúa polimerizando en sentido 5’a 3’y no tienen actividad correctora por lo que tiene una tasa de error de 10 -4. No necesita de cebadores para iniciar la transcripción.Pregunta: como discrimina el sistema cuando tiene que codificar uno u otro gen si no necesita secuencias reguladoras?

Esta proteasa necesita el factor σ (sigma) y también hay un factor ρ (rho), con actividad ATPasica que reconoce la señal de terminación.

Hay dos factores que son claros: sigma en el inicio y rho en el final. Esto no es tan sencillo por que más adelante se verá que en eucariontes hay polimerasas, dependientes de rho y otras que son independientes de rho, pero acá se necesita tanto factor sigma como factor rho.

Acá tenemos la RNA- polimerasa con sus respectivas subunidades más el factor sigma.


RNA pol bacteriana tiene regiones:

-Alfa va a antes del inicio de la cadena permite interaccion con proteína reguladora y promotora

-Beta inicio y elongación

-Beta prima unión al DNA

Omega y omega prima: no se les conoce la función.

Sigma: tiene que ver con el reconocimiento del promotor.

Cada una de ellas tiene una función pero en su conjunto permiten la actividad.

Factor sigma: factor de iniciación, existen diversos factores en bacterias en este caso echericha colli, pero que tiene que ver que son específicos para distintos genes, un gen necesita un factor sigma especifico.

Por esto entonces la RNA-polimerasa reconoce distintos genes, al haber factor sigma especificos para distintos genes dependiendo del factor sigma que se presente es gen que se va a codificar, sigma debe asegurarse que la RNA-polimerasa se una establemente al promotor del DNA. Sigma va a desestabilizar uniones no especificas, va a estabilizar a nivel del promotor, acelera la busqueda del promotor.

Procariontes también necesitan Rna-mensajero, ribosomal y de transferencia, también necesitan la secuencias reguladoras de RNA.

Al observar la lineación de distintos genes en la E. coli, se pueden observar dos regiones de consenso la -35 o 35 bases rio arriba y la región de la -10 denominada caja PRINOW.

Bases que determinan el inicio de un gen: AUG, siempre para el inicio se necesita un codón que sea para metionina.

Estas separaciones de bases son importantes ya que el sistema noe s efectivo si estas bases no están.

Se muestra la región -35 el espaciador, la región -10 el espaciador y el primer sitio de inicio. Se necesita que se reconozcan ambas secuencias.

Pregunta, Tan grande es la RNA polimerasa que alcanza a cubrir ambas secuencias reguladoras?

Los promotores presentan diferentes eficacias en la iniciación de la transcripción, una trancripcion cada dos segundos o una transcripción cada 10 minutos. Los promotores mas fuertes son las que tienen las secuencias de consenso -35 y -10, que son estas secuencias de consenso, la distancia optima es de 17 nucleótidos.

La RNA polimerasa se une al DNA de una forma inespecífica, y sobre el DNA buscará el sitio promotor desplazándose por la molécula, esto quiere decir que no es que la polimerasa vaya a llegar y vaya a encontrar directamente la secuencia reguladora, sino que se coloca en el DNA, avanza hasta que encuentra la zona reguladora y ahí empieza a armar el sistema de transcripción. Puede detectar la secuencia incluso sin necesidad de desenrollar la doble hélice.

La gracia es que este proceso es bastante rápido, y tiene que ser así.


Se tiene la cadena de DNA, la adición del templado, los nucleótidos, la formación del enlace con la cadena siguiente. Luego la eliminación de un pirofosfato, y entre estos dos ya se ha formado un puente de estas dos bases. Estas son varias formas de elongación.

Acá nosotros necesitamos el factor rho, que es de término, al final de la cadena, y va a permitir la disociación del complejo de RNA y de la polimerasa.

Se tiene un gen de cadena lineal (de las bacterias) con secuencias codificantes y no codificantes, y que pueden codificar de corrido para tres distintas proteínas (alfa, beta y gamma). En el eucarionte, por el contrario, nosotros vamos a poder codificar a partir de un gen una proteína. Pueden haber variantes dependiendo de los splicing que se produzcan.

Una vez que la RNA polimerasa se desplazó por el DNA y encontró la secuencia promotora, región de inicio, empieza a desplazarse y empieza a abrir esta burbuja y sintetiza hasta llegar a la secuencia de término, o bien necesita el factor rho para la terminación.

Ya sabemos que las regiones promotoras río arriba son necesarias para la especificidad de la transcripción.

Necesitamos este factor sigma, que es el que permitía el reconocimiento y la entrada al DNA, éste ya no se necesita una vez iniciado el proceso con la burbuja abierta, por lo tanto este puede salir. Se produce la elongación hasta la secuencia de término, que puede necesitar factor rho, y que permite la desestabilización del sistema, la salida de la polimerasa, la salida del RNAm. El factor sigma puede volver a unirse a la polimerasa para permitir una nueva transcripción.

Ya les había dicho que necesitan factores cis y trans, factores de transcripción y secuencias regulatorias. Hay un numero de factores de transcripción es bastante abundante, está el IIb por ejemplo que media la interacción entre el IId y la polimerasa, IIf (4 proteínas) que permite la estabilización del complejo, el IIe (4 proteinas) que promueve la formación y la adición del primer nucleótido.

Esto es un complejo, se tiene el gen, todas sus secuencias regulatorias donde se va a unir el factor de transcripción I, va a entrar el segundo factor de transcripción. Luego viene la polimerasa con otro factor y se va a formar todo este complejo, el que con las características que tiene va a poder iniciar el proceso de transcripción. Una vez que el complejo se ha establecido sobre el DNA es posible que se liberen algunos de los factores, y que se desensamble el factor de transcripción inicial y pueda la polimerasa recorrer sola su camino.

LA MORALEJA de esto es que la polimerasa no va a unirse al DNA mientras no encuentre todos estos factores de transcripción asociados, que le permiten el reconocimiento del promotor y la elongación.

Otra gracia que tienen los factores de transcripción es que permiten reconocer elementos regulatorios a distancia, porque el DNA va a tomar distintas formas. Si nosotros tenemos una proteína activadora que está muy río arriba, una forma de poder ir a actuar bajo este mismo concepto es que el DNA gire en sí mismo y que este factor activador pueda facilitar y aumentar la transcripción.

Entonces la MORALEJA de esto es que no sólo necesitamos los factores de transcripción regulares, sino que además hay elementos activadores que están mucho más río arriba. Incluso puede haber mas zonas regulatorias y entre todas ellas van a formar este complejo de activación.


¿Por qué se necesitan tantos elementos regulatorios? Para que todo este proceso sea específico. Un ejemplo de estos son los operones, que van activando o inhibiendo determinados genes, bajo presencia de un sustrato o no. Por lo tanto si hay un estímulo nosotros necesitamos deprimir o activar.

Además de todo esto existen mediadores, los que también van a ir a actuar en la región promotora. Estos son aumentadores, activadores o pueden ser también inhibidores. De alguna forma actúan sobre el complejo, la maquinaria, y pueden inhibir o activar este proceso. Son muchos a nivel humano, también en levaduras. Son proteínas y no se unen al DNA, actúan por interacciones proteína-proteína. Pueden unirse a las polimerasas y pueden regular la actividad de algunos factores de transcripción que son quinasas.

Tenemos factores de transcripcion, activadores factores mediadores , un factor mediador (CTB) que tiene que ver con actividad catalítica, kinasica, que va a producir fosforilaciones que va a permitir el proceso de transcripción, sin la presencia de este mediador este proceso no se realizaría hasta ver estas actividades kinasicas, los factores que estan en el DNA son cis y las proteínas asociadas son trans y trans es río arriba y cis es río abajo, acerca de los factores de transcripción , hay que ver la acción catalítica y activadora.

RESUMEN: Tenemos el DNA como cromatina, este DNA para poder entrar en el proceso necesita dimerizarse, por lo tanto, se comienza a descompactar la cromatina. Tenemos todo el sistema de mediadores de factores de transcripción, que van a producir finalmente la unión de la RNA polimerasa y el inicio de la elongación del RNA mensajero. Con la adhesión de su CAP , esto luego vuelve a compactarse. El RNA polimerasa va a seguir elongando este RNA y va a realizar el splicing inmediatamente, porque hay regiones intrónicas que las está cortando. Vamos a tener un RNA lineal sin intrones y además se agregó un poli A, al RNA se le agregan una serie de proteínas que protegen al RNA y muestran los poros del núcleo al citoplasma, para encontrar los ribosomas que van a realizar la síntesis de la proteína que luego tendrán todo su procesamiento posterior. Todos los factores de transcripción van a salir de sus lugares y podrán fosforilarse o desfosforilarce y volver a su actividad en el núcleo. Todos los procedimientos son simultáneos: inicio, elongación, splicing, agregación del Poli A, del CAP, la salida por el poro, el ingreso de proteínas pequeñas que permiten estabilización del RNA en el citoplasma, donde viven muchas nucleasas. Estas proteínas permiten el transporte, polaridad y lo más importante linealidad, y así evitar la estructura secundaria que le impediría la salida por el poro nuclear.

RNA polimeraza tienen dos sitios de unión a ribonucleótidos, el sitio de unión que generalmente tiene que ver con un GTP o un GTP. Generalmente en procarionte, las RNA pol comienzan con una purina. En elongación se meten el resto de nucleótido que se necesitan. Luego el grupo 3', el primer nucleótido ataca al fosfato alfa y esto va permitir los enlaces fosfodiester que van a permitir la elongacion.

Se necesita de cebadores. Posteriormente se le ira agregando la segunda base, que puede ser cualquiera. Tenemos también inhibidores de la transcripción como la prostaciclina que es un antibiótico, que ataca el complejo de iniciación.

Tras la polimerización de los primeros 3 a 6 ribonucleótidos, en la elongación, el factor sigma se va y puede ser reutilizado en un nuevo proceso.

La burbuja de transcripción se va a ir desplazando por el DNA, el RNA sintetizado se enrolla con la hebra de DNA molde formando un hibrido (máximo 8 a 10 nucleótido).La región desenrollada y la porción hibrida DNA-RNA permanecen constantes. Finalmente la molécula de DNA debe ir desenrollándose por delante de la burbuja y enrollándose por detrás, y es aquí donde encontramos a las topoisomeraza con función de las DNA girasas. La velocidad de este proceso es bastante rapida, y es 50 nucleotido por segundo.


La RNA polimerasa, carece de una actividad nucleasica y posee una tasa de error 105 104 angstrom en total. Esto es porque en el RNA si podemos tener errores no como el DNA con la DNA pol que tiene una tasa menor de errores.

Al finalizar, paralizaremos la formación de los enlaces fosfodiester, y se separara el hibrido y se va a recombinar el DNA, llevando la hebra de RNA polimerasa. Tenemos final de termino, que generalmente son secuencia ricas en GC seguida por secuencia rica en AC y el sistema se destabiliza. Si no se tienen proteínas estabilizadores se forman estructuras secundaria. En cambio, en procariontes esta estructura secundaria podría servir estabilidad y protección frente el ataque de nucleasas.

En el humano, existe un sistema en que los mensajero que tiene orquilla en 3', le da estabilidad al mensajero y mayor producción.

Puede haber una terminacion dependiente o independiente de rho.

Terminacion dependiente de rho:

- cuando RNA tienen este factor no hacen la horquilla, el factor rho detecta señales de termino, que no son detectadas por la polimerasa. Tiene una estructura hexamerica, con actividad ATPasica. Se une al RNA de la cadena y tiene 72 nucleotidos. Rho reemplaza a la orquilla, dandole estabilidad a la molecula.

Terminación independiente de rho:

Forman horquillas y son estables por si solo.

En eucariontes, la señal de termino no esta tan bien descrita como en procariontes. Con respecto a la transcripción tenemos la presencia de 3 RNA polimerasas (I, II, III). Cada una de estas polimerasas van actuar con distintos RNA.

La RNA polimeraza II transcribe para precurso del mRNA y sRNA.

La RNA pol esta formada por 8 a 12 subunidades (en la pro. eran 4 subunidades), dos de ellas son bastantes grandes (240 a 140 kDal) que son la RMP1 y RMP2.Ademas de la presencia de múltiples secuencia repetidas de consenso. Esta secuencia proteica permite regulación por fosforilación.

Regiones promotoras:

-La caja TATA : Principal secuencia regulatoria. Ubicada entre el -25 y el -100 (TAT) .Esta en la mayoría de los genes eucariontes. No existe factores sigma, sino gran cantidad factores basales (en procarionte se necesita sigma). En el procesamiento de mRNA se le agrega un CAP. Estructura final TATTT, que permite la adición del poli A. También hay espliceosoma que permite la salida de los intrones. La unión entre exones es por RNA ligasa.

En procarionte transcripción y traducción esta acoplados, son procesos simultáneos. En eu la existencia de varios ribosomas traduciendo lo hace un proceso más eficiente.

La caja TATA no es única, existen más de una región promotora en los eucariontes. En procarionte también son necesario factores de transcripción donde la RNA polimerasa pueda iniciar el proceso. El factor TFIID se une a caja TATA y provoca cambio en el DNA para el inicio de la transcripción. Luego se empiezan a agregar otros factores de transcripción (A, B, F) y luego va entrar la RNA polimerasa junto con la heliasa.


Hay serie elementos que solo son reconocido por factores de transcripción. Hay elementos que responden a las big shock protein, otros solo responden a metales o glucocorticoide o hormona .Por lo tanto los genes pueden tener una activación mixta.

Existe un sitio de inicio donde hay región intensificadores. Estas no tienen una localización precisa, son bidireccionales (se pueden unir a cualquiera de las dos hebras), pero aun así ejercen un efecto regulador activando promotores a miles pares de bases. Esto es porque el DNA se puede doblar sobre sí mismo. Se pueden localizar rio arriba, rio abajo o en el medio. Luego que se una esta secuencia intensificadora al DNA, existen coactivadores como Histona acetyl transferasa, que tiene que ver con el remodelamiento de la cromatina. Se unen los factores de transcripción a la caja TATA.

Para luego la activación de RNA polimerasa.

Existen algunos RNA que en la horquilla presentan residuos de uracilo

2 da parte:

Vamos a ver un ejemplo de regulación producto de activadores o co-activadores utilizando como ejemplo los operones, nosotros ya habíamos visto en la mañana que la regulación de los genes en eucariotico es de tipo monositronico y ustedes pueden apreciar acá que este tiene una serie de elementos regulatorios, proteínas regulatorias, que hay espacios en el DNA, que hay secuencias de consenso en los promotores, hay una series de factores de transcripción, todo esto además asociado a la polimerasa II y que hay un sitio de inicio de la transcripción y esta transcripción se va a llevar a cabo abriendo el DNA utilizando una serie de enzimas que permitirán que el DNA se abra, la participación de un factor sigma en el caso de los procariotas y una vez que se ha transcrito el gen a estas unidades regulatorias van a permitir el termino de la transcripción , por lo tanto existe una serie de elementos que tienen que ver con todo lo que tiene que ver con la transcripción, elementos que se unen al promotor, existen factores de transcripción que pueden ser activadores o que pueden ser inhibidores y toda vía tiene que ver con la modificación de las características de la cromatina, entonces hay múltiples lugares o señales que permiten hacer la regulación, un concepto que tiene que quedar claro es el splicing alternativo, dependiendo la forma en que se realiza el splicing de RNA podemos tener más de un producto, en algunos casos podemos determinar productos que no son funcionales y productos que lo son, es así como en un gen cualquiera que tenemos 5 exones, esto se va a transcribir en un RAN que va a tener también 5 exones , pero al momento de hacer el splicing nos puede dar tres proteínas distintas, los intrones son funcionales. En algunos casos tenemos exones que por el splicing pueden cambiar, los exones que no pueden cambiar son el primero y el último (1-5), porque estos llevan las secuencias de inicio y de termino respectivamente. Sin embargo dentro de todos los exones que podemos alternar son todos los demás para generar un nuevo producto bioquímico. De producirse el splicing de forma correcta, por ejemplo al producirse un corrimiento en el corte se produce una proteína inactiva, es decir una proteína disfuncional. A veces un mismo gen puede codificar para mas de una proteína, esto es porque dependiendo de la escisión que tenga en el splicing puede dar una proteína de características distintas. Hay genes que dependiendo del tejido en donde se encuentren va a ser la proteína que van a producir, cada uno con un splicing alternativo distinto.

Hay proteínas que son reguladoras y que participan en el splicing, un ejemplo es el de la drosophila donde una proteína que es sintetizada previo a la embriogénesis y esta va a regular el proceso de la diferenciación sexual, si esta proteína no se activa, no se produce el corte entre dos y tres y lo que sucede es que queda con un codón de termino en 2 y queda una proteína disfuncional.


Apolipoproteina B 48 tiene una función de absorber lípidos desde el intestino.

Una vez que se traduce el ADN al RAN es traducido en los ribosomas, donde después debe pasar por un proceso de maduración en donde pueden experimentar glicosilaciones y plegamientos, de no ser así esta proteína pasara a degradación, donde se tomaran sus aminoácidos para la síntesis de otra proteína.

Por lo que tenemos muchos tipos de regulación a nivel pretraduccional y postarduccional. Uno puede generar esto con el silenciamiento de ARN, podemos afectarlo con la velocidad de síntesis y degradación de proteínas.

In vitro podemos tomar pequeñas secuencias complementarias del tRNA, se van a unir al RNA mensajero y al unirse van a producir un bloqueo o una disminución en la síntesis proteica, esto es un “knock-out”, una inhibición de un gen, pero aquí no estamos hablando de la inhibición del gen propiamente tal, estamos hablando de inhibición de siRNA, bloqueamos un gen colocándole RNA de interferencia. Basta que bloqueemos la expresión de la síntesis para que podamos ver cuál es su función real, y eso es colocando un pequeño RNA de interferencia que se une complementariamente con el RNA, y esto va a bloquear todo el proceso que involucra la expresión de las proteína. Un ejemplo: tenemos un siRNA que se une al RNA, al final lo que sucede es que no se traducirá el producto final, y esto será degradado.

Regulación Epigenética

Existen otras regulaciones que últimamente están de moda, que es todo lo que tiene que ver con la epigenética, que son modificaciones que se producen en los genes por el ambiente, ya que estamos sometidos al estrés constante de la contaminación, alimentos, chatarra, etc; y todo este tipo de estímulos lo que producen son modificaciones de tipo epigenético, en el tiempo estas modificaciones pueden ser heredables, puede que a mí se me produzcan modificaciones pero a los que van a afectar será a mi herencia.

Metilación de citosina en islas CpG e ImprintingUna de las principales modificaciones epigenéticas es la metilación, si nosotros tenemos un DNA y

tras el proceso de replicación, este DNA tendrá las 2 hebras, y normalmente lo que sucede es que nosotros tenemos estas citosinas que no son metiladas y normalmente estas citosinas no son reconocidas y por lo tanto no son metiladas, aquellas citosinas que si son reconocidas, por lo tanto metiladas, será un proceso normal, pero cuando el sistema se sobrepasa en el proceso de metilación se cambia lo que se va a expresar.

Acetilación-desacetilación de histonasAquí vemos una cromatina activa que está abierta, y acá

una cromatina inactiva que está cerrada. Producto de la acción de la DNA metil transferasa, nosotros vemos metilado el DNA, y a la vez por estas otras enzimas que son entre otras la histona deacetilasa, también podemos quitar estos grupos acetilos, entonces la combinación de grupos metilos más la salida del grupo acetilo hacen que esta cromatina se inactive. Este es un proceso reversible, se puede producir la acetilación y demetilación y dejar la cromatina activa. El daño se produce cuando no podemos sacar estos grupos metilos y no podemos adherir acetilos. En el fondo, metilación y acetilaciones pueden llegar a producir también alteraciones del tipo epigenético que van a modificar la expresión de un gen.


El principal proceso de regulación que permite la maduración del RNA, es el que tiene que ver con el spliceosoma, en el laboratorio podemos observar cuando un intrón es sacado y como el exón 1 y el exón 2 se pegan, esto se va a producir a través de la transcripción y procesamiento, normalmente nosotros deberíamos ver este pedazo de RNA libre, lo vamos a ver en un gel de agarosa, en el que podremos ver 2 tipos de RNA, uno lineal y uno circular, que por el tamaño y la migración se pueden identificar. ¿Por qué el RNA lineal avanza más rápido que el RNA circular?

¿Cómo se empieza a producir el procesamiento de este cambio entre intrón y exón? Tenemos la secuencia del exón aquí, el intrón y el siguiente exón, les dije que tenían que existir unas secuencias específicas que tenían que estar en el sitio de corte para que se produjera la eliminación del intrón, y que habían unas guaninas. Aquí están, tenemos esta guanina y un grupo hidroxilo, se produce un ataque enzimático que va a permitir la liberación de esta guanina, y este grupo hidroxilo va a interactuar con el grupo fosfato del exón B, y esto va a producir la liberación del intrón, con la consiguiente liberación del exón A y el exón B, y estos 2 (A y B) quedan juntos. El intrón que quedo libre tiene la posibilidad de circularizarse por el ataque del hidroxilo a una región cercana a la guanosina. Generando entonces un intrón y un trozo de una secuencia de intrones, y entonces nos queda unido a través de esta interacción del grupo hidroxilo con el grupo fosfasto entre el axón A y el axón B. necesitamos la presencia de estas bases en el intercambio entre intrón y exón. Estos intrones normalmente pueden quedar en forma circular, y para ello el grupo hidroxilo de la guanosina del intrón va a ir a atacar a las primeras bases del intrón para circularizarse, y puede atacar a más de alguna base, una vez que los productos están circularizados pueden volver a sufrir un ataque. Si uno agrega agua a la reacción podemos relinearizar el intrón, o también puede que uno agregue pequeños oligonucleótidos para poder romper el intrón y dejarlo lineal.

¿Qué importancia puede tener que un intrón sea lineal o circular? ( investigar, pues no lo dijo)Qué importancia puede tener un intron tisular, de que nos va a servir. La importancia está en que como es un DNA lineal, este se va a degradar y eso nos va a dar una cantidad de nucleótidos disponibles, en cambio un RNA circular no es susceptible a la acción de endonucleasas. Que es lo que les sucede en cierto modo a un DNA familiar, los DNA familiares son circulares, por tanto son susceptibles de degradación.

Por tanto cuando el DNA esta lineal es para una disponibilidad para nucleótidos, para ir a hacer alguna función.

Aquí les muestro lo mismo pero un poco más complejo, aquí está el exón 1 y acá se inicia el exón 2 y en el intertanto hay una serie de estructuras secundarias en el intron, y de hecho cada una de estas regiones puede tener secuencias que generan de alguna forma regulación. En este caso también esta presenta la guanina con grupo hidroxilo, que es donde se va a producir el ataque para liberarlo y producir también que este exón, con el exón que esta acá, y todo eso va a ser eliminado.

Todo esto tiene dentro de este intron algunas pocas frecuencias que son constantes, que son elementos de regulación, y en algunas cosas también participan en otros procesos. Pero solamente me interesa que tengan presente que el ataque que va a producir la guanina en su grupo hidroxilo, quien se va a atacar el grupo fosfato y que va a permitir finalmente que estos dos exones se unan.

Otra forma que tenemos de visualizar este proceso en el laboratorio es a través de las características que tienen algunas bacterias, por ejemplo las Beta-galactosidasas. Lo que se ha hecho actualmente para modificar gen; donde yo tengo el promotor del gen de la beta-galactosidasa, tengo el codón de inicio, tengo la secuencia de la beta-galactosidasa, y acá tengo mi intron que yo le agregue en forma manual en el laboratorio, y aquí sigue el resto de la secuencia de la beta-galactosidasa, luego permito que esto se transcriba, se procese y produzca beta-galactosidasa, solo aquellas que estén normales van a tener el color


azul, que es la presencia de beta-galactosidasa con la enzima. Y aquellas que estén blancas van a ser las que tengan este intron insertado.

Por lo tanto si yo realizo un experimento donde inserte este intron, porque quiero modificar cualquier cosa, el producto que debería obtener es blanco, porque normalmente la beta-galactosidasa da ese pigmento azul en un medio de cultivo que contiene la lactosa. Si yo modifico la proteína y ya no está normal, no me va a producir este colorante, por lo tanto en este caso yo puedo tener una columna blanca que es donde esta modificada, una columna azul que es donde esta normal.

Lo mismo puedo hacer yo con un gen que le saque el intron y vea las características por su resultado final.

Esto es solamente un poco más detalle sobre lo que estábamos viendo, acá tenemos nuestro famosa guanina con secuencias reguladoras, en el fondo lo que nosotros necesitamos para poder unir los dos segmentos son las ligasas de RNA, que es la enzima que va a permitir la unión de la guanosina del extremo 3’ del exón 1 con el fosfato en 5’ del exón 2.

Entonces, necesitamos una guanosina con su grupo hidroxilo, necesitamos un grupo fosfato, necesitamos ligasas y necesitamos además fosfatasas. Teniendo esos cuatro elementos ya podemos producir el splicing de este intron.

Las reacciones catalizadas por RNA tienen la misma forma que las reacciones catalizadas por enzimas, pero con un poco menos de eficiencia. Por tanto con distintas enzimas y distintos sustratos, hay distintas Km y distintas velocidades de cambio. La más eficiente será la que tenga la mayor tasa de recambio, ósea que el numero de sustratos transformados por unidad de tiempo es mayor.

Una de las cosas que ya les había nombrado es que los intrones pueden generar estructuras secundarias, y estas de alguna forma pueden facilitar o entorpecer el empalme. La gracia de acá es que hay proteínas que van de las U1 a la U6 que son pequeños RNA y permitían la participación en el splicing; entonces para que se produzca el splicing, es necesario además de una guanosina un fosfato, una ligasa RNA y fosfatasas necesitamos RNAs pequeños, que van de la U1 a la U6 y que van a estar ligados en el empalme, y ayudan también a que las estructuras secundarias no entorpezcan el empalme.

Tenemos un RNA nuclear lineal y se produce el ataque y se produce el splicing, y también hay estructuras secundarias pero de todas formas el ataque se produce de la misma manera.

Otra característica es el procesamiento normal, acá sacamos el intron y nos quedó el exón 1, el 2, 3 y 4. Cuando se nos puede producir en algunas mutaciones una especie de entrecruzamiento donde lo normal es 1, 2, 3 y 4, y vamos a tener 1 y 4, 2 y 3. Estos intercambios pueden ser buenos o malos, existen núcleos específicos y puede que en algunas células necesitemos que se produzcan estos intercambios y en otras células no.

Otra forma de reconocer los splicing es la presencia de unos pequeños bulbos que se producen porque se han insertado bases que no están perfectamente apareadas (eosina) y la presencia de estos bulbos va a implicar entonces que aquí van a haber sitios de corte y que van a permitir la unión con el exón siguiente. Entonces no solamente depende de la secuencia sino que también existe la posibilidad de bases que no son perfectamente apareadas.


También pueden producirse rompimientos o movimientos en los campos de lectura, esto basta para que la proteína que se esté sintetizando cambie a otra. Por lo tanto, tenemos alteración en el marco de lectura cuando se produce movimiento de una base, con el intercambio de base, deleciones e inserciones.

Existen una especie de rellenado o como una terminación de segmentos. Si nosotros tenemos un genoma, aquí tenemos lo que se denominan RNA molde, estos le permiten al RNA que estamos sintetizando sellar cualquier fragmento que le quede incompleto y le indica donde debe insertar bases para poder completarse. Necesitamos un RNA molde en la etapa de splicing dentro del procesamiento ya que nos van quedando fragmento separados y no siempre esos fragmentos van a saber asociarse correctamente. A veces el RNA molde se sintetiza junto con el mRNA.

Hemos visto que existen una serie de reguladores, pero los ejemplos más clásicos están a nivel regulación de la transcripción en procariontes (bacterias) y muchas de ellas son inducidas o reprimidas por algún factor que pueda venir por ejemplo en la piel.

Vamos a hablar del operon LAC que codifica tres proteínas inducidas, es reprimido por la unión de la proteína represora de LAC y esto se termina con la presencia de lactosa. Ahora, una mutación en el promotor va a afectar solo la expresión de los genes de la misma proteína, altero solamente genes lo que se traduce en un aumento o disminución de la expresion. Si yo modifico la secuencia del operon voy a producir una disminución de la unión del represor, entonces si no hay represor esto va a estar constantemente expresándose. Entonces esta regulación viene dada por proteínas que vienen en la dieta.

Si yo hago una mutación en la frecuencia del DNA Se me va a afectar la unión de la ARN polimerasa y esto puede disminuir o incrementar la transcripción; son represores o activadores, afectan la expresión de los genes. Los activadores, los represores actúan en TRANS, esto es afectar la expresión de los genes sin importar donde están localizados). Tenemos genes estructurales, genes reguladores, el operon, el operador, el promotor.

5 características que necesitamos para esto:

-El DNA - tenemos sitios de unión al activador

- sitios de unión de represor - tenemos frecuencias reguladoras

-el promotor y los distintos genes.

Se acuerdan ustedes que las bacterias en la transcripción están acopladas y se expresan varios genes de una sola vez, por tanto tenemos como resultado varias proteínas.

¿Cómo actúan?

Si yo tengo una señal y la tengo en el medio, al unirse la proteína señal al operador, esto me lo va a liberar. Segundo, si yo tengo mi molécula señal en la uno a mi molécula activadora esta puede activar.

Se fijan que la misma molécula señal puede tener 2 acciones: activación o inhibición y esto va a depender del operon de del cual se trate.


Una molécula señal va a producir una disociación en el DNA y en otros va a producir que se quede y va a producir activación. El desarme de la molécula señal no va a producir necesariamente una transcripción. La molécula señal y el represor, la combinación de estos dos da el incentivo, en otros casos, si esta se mantiene y queda unida acá que también puede ser señal de inhibición. Dependiendo del operon es la forma en que va a actuar.

Aquí les voy a mostrar por ejemplo que son más clásicos de forma de activación y desactivación. :

- Tenemos DNA que va a presentar un represor, este represor va a ir a unirse al DNA y que tenemos que está haciendo un control negativo, sin embargo si yo coloco un inductor que se una al represor este es capaz de liberarlo entonces va a ser inducido

- Si yo tengo un DNA que coloca un activador inactivo a activo, basta con que venga un inductor a este activador inactivo lo transforma a activo y este se une DNA y facilita la expresión.

- Tenemos un represor en estado de inactivo, pero junto con la presencia de un co-represo, se unen, y me inhiben la transcripción.

- Tenemos un activador activo que puede estar ligado al DNA pero basta con que yo coloque un co represor para q se pierda la actividad.

El operon LAC, es un operon inducido, un represor activo que se va a unir al DNA que impide que la RNA polimerasa actué por lo tanto no se va a producir RNA. Sin embargo, basta con que yo agregue aquí una lactosa para que este represor se libere y quede como represor inactivo y me produsca entonces todas las proteínas como la b-galactosidasa, la pearmease y la transacetilasa.Para que se produzca este control, en el mismo gen tenemos la síntesis de la proteína represora y va a ir a a inhibir la expresión de los genes estructurales, pero si yo hubiese colocado lactosa en el medio, el represor se sale y el gen se va a expresar

¿Qué sucede si tenemos glucosa presente en el medio? No hay transcripción, pero si tengo lactosa además, se me va a reprimir al represor y se va a producir la inducción. Si solo lactosa, se transcribe mucho más.

En este tenemos regiones de consenso en el -10 y -35, el operon y sitio CAP para unión a cAMP. .

El operon triptófano: También tenemos síntesis de represor inactivo y por lo tanto no se une al DNA y la polimerasa está constantemente trabajando. Sin embargo si yo coloco triptófano en el medio este se podrá unir al DNA y este es un co-represor. Este es un represor activo. Este gen necesita de triptófano para arreglar la actividad y que no se inactive. Debe estar rio a bajo. En el caso de la etcherichia coli tenemos cinco genes que van a estar codificando, la velocidad de generar DNA será mucho mayor cuando esto este activo por lo tanto el efecto de estos represores es bastante grande. La vida media del RNA es de tres minutos, lo que es mucho.

Otro operon que tenemos es ARA: De la arabinosa. Siendo uno de los más complejos que existe porque además es una proteína que actúa como positivo y negativo simultáneamente. Tenemos el represor, la arabinosa, producido por Arac c, se produce represor por presencia de arabinosa que produce un cambio conformacional al DNA que permite la unión. Arac c tiene una autorregulación de la síntesis.


Cuando arac C es deficiente su gen se transcribe desde su propio promotor, regula su propia síntesis uniéndose al gen ar1 y lo reprime. También regula los genes más arriba y de lo rio abajo, lo que se produce así:

-Niveles alto de glucosa, niveles bajos de laminosa, aquí esta arac1 y arac2. En cuanto a los niveles de arabinosa son baja y glucosa alta la proteína arac unida a ara, forman dímero que aceptan los sitios de transcripción para definir una represión de arac a. El hecho que se doble permite la interacción de estas dos zonas impidiendo la transcripción del gen.

Cuando los niveles de glucosa están bajos y arabinosa alto no se produce la horquilla por lo tanto no hay represión.

Entonces este ara es capaz de regularse a si mismo positivo y negativamente y también la expresión de genes que constituyen su operon.

Existen operones alejados de los sitios de transcripción, que son capaces de activar el sistemas a través de fosforilaciones que forman un loop.

La RNA polimerasa ya replico el DNA, entonces empieza la transcripción con más de un cromosoma asociado a un mensajero. Se va a empezar a producir entonces la proteína, cuya principal característica es su estructura primaria, secundaria y terciaria.

Recuerdo:

Splicing: Ovoalbúmina, 7 intrones a-b-c-d-e-f-g y si se los sacamos nos va a quedar un RNA maduro. Quedando un RNA maduro con 1700 nucleotido con su poli A y su CAP.

Ahora si tenemos 35.000 genes, ¿Por qué no tenemos 35.000 proteinas?, es porque el sistema es redundante. Tenemos 5000 proteinas. La mayor parte de estas proteínas son necesarias para cualquier tipo celular y se expresan de forma constitutiva.

Nosotros tenemos toda la maquinaria para fabricar todo esto en todas nuestras células, pero en los tejidos específicos solo se expresaran aquellas proteínas que sean necesarias para el tejido (existen los mismos genes). En el hígado se va a sintetizar la apolipoproteína B100 en el intestino la apolipoproteina B6.

VIH:

Tiene una replicación intensa, 10 9, produce la perdida de los linfocitos TD4, produce una profunda inmunodeficiencia. Lo mas característico de este virus es la transcriptasa reversa, tiene unapolimerasa DNA dependiente de RNA. Infecta a los linfocitos TD4 y a los macrófagos, esto hace demasiado rápida su replicación, que la infección se hace masiva en poco tiempo.. Tiene un RNA único que posee una nucleocapsula, recubierta capa lipidica.

La idea actual es poder trabajar con inhibidores que sean capaces de bloquear la actividad de estos tres tipos de proteína, que vayan en contra de la envoltura y de las polimerazas etc.

La función de la lipoproteina gal pol, es de desdoblar una integrasa, se pretende atacar esta enzima para q no pueda alcanzar el estado maduro.


Este virus va a asociarse a los receptores de TD4 y va a permitir entonces ingresar, entonces se rompe la nucleocapside, entra solamente material genómico y por una transcripción reversa, se va a generar un hibrido de ADN y ARN y luego este cDNA solito va a ser capaz de formar 2 hebras de DNA. Luego la enzima integrasa lo que hace es meter la hebra al núcleo, donde forma parte del cromosoma y desde aquí empieza a utilizar la maquinaria de la célula para replicarse. De esta forma a ensamblarse, replicarse y madurar.

Entonces la etapas involucradas son: adherencia o fusión (etapa primordial que se quiere frenar), la etapa de penetración y perdida de la cubierta, transcripción reversa, transcripción. Para frenar estas etapas tenemos terapias involucradas con los TD4, drogas para parar la transcripción reversa y algunas terapias que son utilizadas para inhibir la transcripción.

Una de las “gracias” de este virus es la transcriptasa reversa, que utiliza el propio ADN de la célula para poder replicarse

Mecanismos de transcripcion

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