UNIVERSIDAD AGRARIA

DEL ECUADOR

CAPACITACION EN POSTGRADOS

ECUATORIANOS S.A. (CAPOSE)

MAESTRIA EN PROCESAMIENTO DE ALIMENTOS

TRABAJO A DISTANCIA DE TOXICOLOGIA DE ALIMENTOS PROCESADOS

INTEGRANTES:

ARBAIZA PLÙAS GLENDA

BARRE ZAMBRANO ROY

CASTILLO ORTIZ Ma EUGENIA

FERNÀNDEZ ESCOBAR ANGEL

HACHI CECILIA

PÀRRAGA ÀLAVA CECILIA

ZAMBRANO ALCIVAR EDGARDO

PARALELO 6

INSTRUCTOR:

DRa. TAMARA FORBE

INDICE:

Pag.

I.- PROCESAMIENTO DEL CACAO…………………………….. 2

II.- SUSTANCIAS TOXICAS PRESENTES EN EL CACAO… 3

III.- OCRATOXINA A Y B…………………………………………. 4

IV.- AFLATOXINAS……………………………………………… 10

V.- TEOBROMINA………………………………………………… 16

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I.-PROCESAMIENTO DEL CACAO

1.-Cosecha, Fermentación y Secado en Origen

Al momento de la cosecha el fruto es cortado con mucho cuidado de no dañar el

nudo que lo une al tronco, ya que por ese mismo brote florecerá nuevamente.

Luego de abierta la mazorca, se extrae su interior que contiene las semillas de

cacao envueltas en una pulpa blanca de sabor dulce y agradable. El "cacao en

baba", como comúnmente se lo denomina en este estado, es luego transportado

desde las plantaciones hacia las casas donde es sometido a un proceso de

fermentación que varía mucho de lugar en lugar debido a diferencias en

infraestructura y costumbres. Suele ser depositado en cajones de madera y

cubierto con hojas de plátano. Alrededor de 3 a 5 días son destinados al

fermentado donde distintos procesos químicos internos son la causa del desarrollo

del aroma y gusto que luego aportara el cacao al chocolate. Una mala

fermentación no es posible corregirse posteriormente, de ahí la importancia de

adquirir cacao tratado en forma responsable en origen. Luego del fermentado el

cacao es secado preferentemente al sol en forma natural o en caso de ser

necesario en secaderos industriales. De esta forma el "cacao crudo" queda listo

para ser clasificado y embolsado de acuerdo a las especificaciones del cliente.

2.-Tostado y descascarillado

Las bolsas con el cacao arriban a las fábricas donde son almacenadas en

depósitos con humedad y temperatura controladas. El cacao es sometido a un

proceso de limpieza donde se procura extraer elementos extraños como piedras y

metales que pudieran haber venido desde origen. Una vez limpio el cacao es

tostado bajo controles estrictos de tiempo y temperatura. Este es otro de los

procesos de máxima importancia que define el gusto y aroma que posteriormente

resaltará en el chocolate. El cacao tostado luego es descascarillado, donde se

quita la "cascarilla" que lo recubre, elemento no deseado en la fabricación de

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chocolate. Como resultado, el interior del grano ya partido o "nib de cacao", como

comúnmente se lo llama en la industria, continua el proceso de fabricación.

3.-Molienda y Obtención de Licor de Cacao

Los nibs de cacao son sometidos a un proceso de molienda. La temperatura en el

molino ayuda a que se desprenda el alto contenido de grasa presente en los nibs,

haciendo que los fragmentos de cacao sólido se conviertan en una pasta conocida

como "pasta, masa o licor de cacao".

4.-Prensado del Licor y Subproductos

El licor de cacao es el ingrediente principal en la mezcla de un chocolate. Pero

adicionalmente se le puede prensar para obtener dos subproductos. Bajo

presión, por un lado se separa su grasa o "manteca de cacao" y por el otro lado se

recibe los sólidos de cacao conocido como "torta de cacao" (usualmente la torta

conserva un 10-12% de manteca de cacao en su interior). La torta de cacao es

comúnmente sometida a una molienda fina para obtener el "cacao en polvo",

ingrediente muy común en la pastelería tradicional.

II.-SUSTANCIAS TOXICAS PRESENTES EN EL CACAO

Los granos de cacao pueden contaminarse con mohos que, en ocasiones,

producen unas toxinas llamadas micotoxinas. La etapa de secado al sol es

fundamental para la formación de micotoxinas en el cacao, porque todavía hay

agua suficiente para sostener el crecimiento de hongos, lo que conduce a la

producción de micotoxinas. Entre las principales micotoxinas que se pueden

encontrar en el cacao están la Ocratoxina A y las aflatoxinas.

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Por otro lado, además de las toxinas provocadas por la presencia de hongos en el

cacao, se encuentra la Teobromina que es parte constitutiva de las semillas de

cacao.

III.- OCRATOXINA A Y B:

Las Ocratoxinas son toxinas asociadas al género del Aspergillus, (Aspergillus

ochraceus), vale resaltar que otro productor del mismo tipo de toxina es el

Penicillium viridicatum. Estos hongos pueden infestar al maíz, cacahuate, arroz,

soya, además del cacao.

De todas las ocratoxinas, la ocratoxina A es la que aparece más frecuentemente

de forma natural, seguida por la ocratoxina B, mientras que los ésteres etílicos y

metílicos de ocratoxina A se encuentran raramente de forma natural (OPS - OMS,

1983).

La ocratoxina A es la más tóxica y le sigue la ocratoxina C, debido a la

biotransformación que ella experimenta por la acción de esterasas de la sangre o

por la quimotripsina del duodeno (Fuchs et al, 1984), siendo la menos tóxica la

ocratoxina B. Por ello dedicaremos nuestra atención principalmente a la

Ocratoxina A, que además es la que más comúnmente se encuentra en el cacao.

ESTRUCTURA QUIMICA DE LA OCRATOXINA:

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ABSORCION:

Inicialmente fue descrito que la ocratoxina A se absorbía fundamentalmente en el

estómago (Galtier, 1974 a) y que la ocratoxina B era pobremente absorbida a este

nivel, pero hoy en día se conoce que es principalmente absorbida en el yeyuno

(IPCS, 1990).

La adsorción pasiva de la OA en el tracto gastrointestinal se favorece cuando la

misma se encuentra en forma no ionizada o parcialmente ionizada (Kumagai,

1988). El grupo OH tiene un papel predominante durante la absorción, no así el

grupo carbonilo debido a que su Pka es menor que la del grupo hidroxilo (Metzle,

1977). Esta absorción va estar favorecida por el pH del contenido intestinal.

EFECTO TOXICO:

Entre los efectos crónicos más importantes de la Ocratoxina A están la nefropatía

endémica de los cerdos (Franco et al, 1987) y aves (Carlton y Krogh, 1979); los

efectos teratogénicos e inmunodepresores y los más recientemente descritos

efectos cancerígenos en animales (Wang y Groopman, 1999; Gekle y

Silbernagl,1999).

La ocratoxina A está epidemiológicamente vinculada a la aparición de una

enfermedad en humanos conocida con el nombre de nefropatía endémica de los

Balcanes (Nikolov y Chernozemsky, 1990) y con la nefritis intersticial crónica en el

norte de África (Stey 1995).

La toxicidad depende del animal involucrado (ver fig). En general se puede asumir

que los principales órganos afectados son el hígado (degradación hepática), el

riñón (necrosis renal) e intestino delgado (enteritis) (Mirochoa, Pathre, et al 1980).

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Se ha planteado además que la ocratoxina A afecta el metabolismo de los

carbohidratos. Estudios realizados por Subramanian y Govindasamy (1985) al

intoxicar pollos con ocratoxina A, encontraron aumento de la glucosa en sangre y

disminución de las actividades hexoquinasa y aldolasa, provocando una

disminución de la oxidación de la glucosa y de la síntesis del glucógeno, que unido

a un aumento la gluconeogénesis, presume además un efecto diabetogénico de la

toxina.

Además de este efecto diabetogenico, se presume que la ocratoxina A provoque

una disminución de ATP mitocondrial y tenga efectos en el metabolismo de las

proteínas.

Por otro lado fue demostrado por Rahimtula et al (1988) que la peroxidación

lipídica se incrementó cuando la ocratoxina fue suministrada de forma oral a ratas,

produciendo gran cantidad de etano siendo esto una medida de la peroxidación

lipídica.

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BIOTRANSFORMACION:

La ocratoxina una vez absorbida en el intestino delgado es transportada por los

glóbulos rojos y las proteínas plasmáticas hasta el hígado vía portal, donde es

metabolizada por las enzimas oxidasas que las biotransforman en metabolitos,

principalmente del tipo epóxido, algunos altamente reactivos que tienen la

capacidad de unirse covalentemente con centros nucleofólicos de macromoléculas

celulares como el DNA, RNA, y proteína, teniendo así efectos mutagenicos.

EXCRECION:

La principal vía de excreción de la ocratoxina A es por la orina (Chang y Chu,

1977), aunque también hay alguna excreción fecal (Galtier, 1974 a) y láctea

(Gareis et al, 1988). La dinámica de excreción de esta micotoxina en ganado

vacuno revela que su principal metabolito es la ocratoxina α (Still, 1973), aunque

también ha sido identificada la 4-R-4hidroxi-ocratoxina A en orina humana por

HPLC (Castegnaro et al, 1990) y en orina de rata (Xiao et al 1996).

INGESTA DIARIA ADMISIBLE:

La ingesta diaria admisible de ocratoxina A es realmente muy baja. Según los

expertos varia entre0.3 a 0.89 ug para una persona de unos 60kg de peso.

LIMITE MAXIMO RESIDUAL:

La comunidad europea ha establecido que los límites legales de esta micotoxina

sean de 2ug/kg.

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MÉTODOS DE ANÁLISIS:

Las ocratoxinas al igual que las aflatoxinas tienen un carácter discreto o

heterogéneo y es posible que diferentes porciones de la muestra presenten

niveles altos de contaminación, de ahí que el muestreo presente la mayor

variabilidad dentro de los análisis (Campbell et. al. 1986, Dickens y Whitaker,

1986).

Se han desarrollado diferentes protocolos por Campbell et. al. 1986, Park y

Pohland, 1989, entre otros, para minimizar los errores del muestreo y disminuir la

varianza del ensayo en esta etapa, donde diferentes países de la comunidad

europea prefieren emplear planes de muestreo que incluyan múltiples muestras

pequeñas para confirmar posteriormente la muestra de análisis.

Extracción.

El proceso de extracción debe ser eficiente, cuantitativo y no debe modificar la

estructura de la sustancia objeto de estudio y mantener sus propiedades

biológicas. La extracción de la ocratoxina en sustratos como el maíz, la cebada y

el café se realiza con cloroformo, acidificando el medio con ácido

sulfúrico o ácido ortofosfórico (AOAC 1995. Wuhn et. al. 1995).

Durante la extracción es necesario considerar otros aspectos como son la relación

solvente: muestra, la velocidad y el tiempo de agitación(Scott 1995).

Detección.

Entre los métodos que se han empleado para detectar la OA en alimentos y

materiales biológicos, se encuentran la cromatografía de capa delgada (CCD), los

métodos espectrofotométricos y flourométricos, la cromatografía líquida de alta

resolución (HPLC) y los inmunoensayos.

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PREVENCION DE LA CONTAMINACION CON OTA:

Como hemos visto, la flora fúngica que se encuentra en el cacao, es generada en

las etapas previas al procesado en la fábrica. Estos mohos pueden desaparecer

tras cambios en las condiciones ambientales. La toxina, sin embargo, persiste en

los granos de cacao, debido a su estabilidad. Por lo que una medida de

prevención se concentra principalmente en el manejo del cacao en la fase previa

al ingreso a la planta procesadora, precisamente en la fermentación del grano, en

el secado y en el control de humedad en su almacenamiento para evitar el

desarrollo de mohos.

Por otro lado, existe una copiosa literatura relativa a diferentes métodos físicos y

químicos para eliminar la presencia de aflatoxinas en los alimentos, lo cual no

sucede con las ocratoxinas, donde el énfasis fundamental de las investigaciones

se refiere a las reducciones de la concentración de éstas mediante el

procesamiento industrial de los alimentos.

En el caso del cacao, la Ocratoxina A se concentra principalmente en su cascara,

por lo que a nivel industrial, una forma de reducir su presencia seria la aplicación

de un sistema de descascarillado eficiente que asegure la eliminación de la

misma.

NORMAS LEGALES DE REGULACION:

1. NTE INEN 176:2006 CACAO EN GRANO. REQUISITOS

2. NTC 1252:2003. CACAO EN GRANO

3. NTE INEN 176:2006 CACAO EN GRANO. REQUISITOS

4. NTC 1252:2003. CACAO EN GRANO

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IV.- AFLATOXINAS:

Al igual que con la Ocratoxina, la contaminación del cacao con aflatoxinas puede

ocurrir durante el manejo previo al ingreso en la planta procesadora. Entre los

principales tipos de aflatoxinas que pueden contaminar el cacao están la AFB1,

AFB2, AFG1 y AFG2. De ellas la más importante por su alta toxicidad y mayor

presencia es la AFB1, por lo que fijaremos nuestra atención principalmente en

esta aflatoxina.

ESTRUCTURA QUIMICA DE LAS AFLATOXINAS:

Las aflatoxinas son micotoxinas producidas por hongos del género Aspergillus,

siendo los más notables Aspergillus flavus, Aspergillus niger y Aspergillus

parasiticus. También pueden ser producidas por hongos del género Penicillium,

como P. verrucosum.

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Las especies del genero Aspergillus normalmente requieren ciertas condiciones

especiales para crecer y producir aflatoxinas. El hongo puede crecer desde 4 0C

hasta 45 0C mientras que la toxina puede ser producida desde 11 oC hasta 35 oC,

con una temperatura óptima de 22 oC y una humedad relativa del 80-90%.

AFLATOXINA B1:

ABSORCION Y BIOTRANSFORMACION:

Tanto la aflatoxina B1 como las otras aflatoxinas son absorbidas en el tracto

gastrointestinal debido a su alta liposolubilidad, son biotransformadas en el hígado

por enzimas microsomales de la superfamilia del citocromo P450 entre las que se

encuentran CYP1A2, 3A4, 3A5 y 3A7. Las dos enzimas más importantes son

representadas por la CYP3A4 que interviene en la formación de la forma exo-

epóxido y el metabolito AFQ1. La CYP1A2 forma en su mayoría la forma

endoepóxido y la AFM1. En humanos adicionalmente se producen otros

metabolitos como son aflatoxicol, AFP1, AFB2á y AFB1-2,2 dihidrodiol, epóxido

(AFBO), que es un producto inestable y que forma aducciones con el ADN, el cual

puede llevar a mutaciones en proto-oncogen y genes supresores de tumores. El

compuesto AFBO puede llegar a conjugarse con proteínas o sufrir hidroxilación o

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conjugarse con el glutatión (GSH) en el hígado y ser excretado en la orina o en las

heces como ácido mercaptúrico, combinándose con proteínas a los diferentes

tejidos y provocando las diferentes clases de intoxicaciones.

El tiempo de vida media plasmática para la AFB1 es de 36.5 minutos, su volumen

de distribución 14 por ciento del peso corporal y el aclaramiento renal 1,25 l/kg/h.

Aproximadamente el 80 por ciento de la dosis total de AFB1 se excreta en una

semana. La AFM1 se excreta en las 48 horas siguientes a la ingestión y

representa entre el 1-4 por ciento de la AFB1 ingerida.

EFECTO TOXICO:

La exposición humana a aflatoxinas se produce principalmente por ingestión de

comidas contaminadas.

La inhalación de estas toxinas también puede suceder ocasionalmente debido a

exposición de tipo laboral o profesional.

Toxicidad aguda:

Los síntomas más frecuentes son:

- Vómitos

- Dolor abdominal

- Edemas

- Alteraciones hepáticas

-Convulsiones y muerte en el peor de los casos.

Toxicidad crónica:

Se producen fundamentalmente:

- Inmunosupresión.

- Cáncer.

MECANISMOS DE ACCIÓN DE LAS AFLATOXINAS EN EL SISTEMA INMUNE.

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El mecanismo de acción de las micotoxinas sobre el sistema inmunitario es

diferente, dependiendo de la toxina en cuestión. Así, la aflatoxina B1, provoca una

hipoplasia del timo y una depleción de los timocitos. La inmunosupresión se

manifiesta de diversas formas, como una disminución de los linfocitos T ó B, una

supresión de los anticuerpos o un retraso en la actividad de los

macrófagos/neutrófilos, también puede disminuir la actividad del complemento. La

dosis diaria mínima de aflatoxina B1 que induce inmunosupresión es de 0.25

mg/kg de peso vivo

La aflatoxina B1 es un carcinógeno del hígado en al menos 8 especies entre las

que se incluyen primates no humanos. Se han establecido relaciones dosis-

respuesta en estudios con ratas y truchas arco iris, con un 10% de incidencia en

tumores que son esperables en niveles de aflatoxina B1 de 1 µg/kg, y 0.1 µg/kg,

respectivamente. En algunos estudios se han observado carcinomas de colon y de

riñón en ratas tratadas con aflatoxinas.

EXCRECION:

La AFB1 es distribuida por la corriente circulatoria y es metabolizada en parte a

AFM1 en el Hígado como hemos visto. La excreción de la aflatoxina B1 se

produce en un 50% por la bilis, ya metabolizada, y 15-25% por la orina, sin

metabolizar.

INGESTA DIARIA ADMISIBLE Y LIMITE MAXIMO RESIDUAL:

La Unión Europea mantiene que, para este tipo de sustancias, no existe ningún

umbral por debajo del cual no se hayan observado efectos nocivos. Por lo tanto,

no considera pertinente fijar una dosis diaria tolerable, y ha seguido el principio de

fijar los límites legales en los niveles más bajos posibles.

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Los límites máximos permitidos de las aflatoxinas B1, B2, G1 y G2 en alimentos

para consumo humano están regulados por el RD 475/198883 y son los

siguientes: 10 μg/kg para la suma de aflatoxinas B1, B2, G1 y G2 y 5 μg/kg para la

aflatoxina B1.

PREVENCION DE LA CONTAMINACION CON AFLATOXINAS

La contaminación de los productos se puede producir antes o después de la

cosecha.

Los factores que aumentan la posibilidad de contaminación por aflatoxinas son:

-Altas temperaturas

-Humedad relativa alta

-Alta humedad del suelo

-Sequias extremas

-Daños físicos (por golpes, ataques de insectos, roedores, aves, etc.).

Por lo que es necesario un control minucioso de estos factores para prevenir el

desarrollo de hongos productores de aflatoxinas.

TRATAMIENTO DE MATERIAS PRIMAS:

Existen varios tipos de métodos para reducir la concentración y/o los efectos

tóxicos de las micotoxinas presentes en las materias primas o piensos para la

alimentación animal.

Métodos químicos: Generalmente son caros y no totalmente efectivos para

eliminar las micotoxinas. No todos están autorizados en la UE.

- Amonizacion.

- Nixtamalizacion.

- Uso de agentes oxidantes. (Peróxido de hidrogeno, ozono)

- Uso de ácidos o álcalis.

Métodos biológicos: Resultan prometedores pero aun están en estudio.

- Bacterias lácticas

- Levaduras

Métodos físicos: Algunas de estas técnicas son poco prácticas, no totalmente

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efectivas o pueden disminuir el contenido en micronutrientes de los alimentos.

- Temperaturas altas.

- Radiaciones X o ultravioletas.

- Irradiación con microondas.

- Métodos mecánicos: Limpieza de semillas, fraccionamiento mediante cribado,

extrusión.

Adsorbentes:

La técnica más utilizada hoy en día para reducir los efectos tóxicos de las

micotoxinas es la adición de adsorbentes. Los adsorbentes son unos compuestos

que se unen a las micotoxinas y de esta manera impiden que ejerzan su acción

toxica en el organismo del animal.

La desventaja de los adsorbentes es que no todos son efectivos para todas las

micotoxinas y que, a veces, pueden unirse a los nutrientes e impedir que el animal

los absorba:

- CARBON ACTIVO: Es activo para casi todas las micotoxinas, pero también se

une a los nutrientes e impide que se absorban.

- POLIMEROS: Polivinilpirrolidona, colestiramina, etc.

- ARCILLAS:

- ALUMINOSILICATOS: Zeolita, esmectita.

- ALUMINOSILICATOS HIDRATADOS. (HSCAS)

- MAGNESOSILICATOS: Atapulgita

En el caso de las aflatoxinas los más efectivos son:

▫ HSCAS. Tanto para AFB1 como para AFM1.

▫ BENTONITA

▫ COLESTIRAMINA.

METODOS DE IDENTIFICACION DE AFLATOXINAS:

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Las micotoxinas son difíciles de medir por diversas razones:

Puede haber muchas micotoxinas diferentes presentes de manera

simultánea, lo cual hace que el análisis resulta difícil y costoso. Bajo

condiciones comerciales, normalmente se limita a un par de micotoxinas

como indicadores.

El muestreo de alimentos a granel es difícil. Las micotoxinas están

presentes en puntos "calientes" y no están distribuidas uniformemente en

todo el alimento. Por lo tanto, deben seguirse procedimientos de muestreo

estrictos, tomando muchas muestras de un lote en particular, a fin de lograr

una lectura realista.

Las investigaciones más recientes han identificado complejos de

micotoxinas y de sus metabolitos, para los cuales no existe un método de

análisis preciso.

Entre las pruebas que se utilizan para la determinación de aflatoxinas, están la

Cromatografia de alta presión, la Cromatografia liquida de alta eficiencia (HPLC) y

los immunoensayos.

V.- TEOBROMINA:

Estructura química:

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La teobromina (C7H8N4O2), de nombre químico 3,7-dimetilxantina o 3,7-dihidro-3,7-

dimetil-1H-purina-2,6-diona) es un alcaloide de la familia de las metilxantinas,

familia que incluye también a la teofilina y la cafeína. En estado puro, es un polvo

blanco. Es soluble en ácidos y bases, poco soluble en agua y alcohol etílico, y

prácticamente insoluble en éter etílico.

Esta sustancia se encuentra en la planta del cacao (Theobroma cacao),

principalmente en las semillas, las cuales contienen entre un 1% a un 4% de ésta.

Al fermentar y secar las semillas, y luego procesar el extracto obtenido, se obtiene

el chocolate. El chocolate negro contiene aproximadamente 1,5% de teobromina,

esto es diez veces más que el chocolate con leche común.

ABSORCION:

Se produce amplia absorción gastrointestinal (> 90%) en humanos y especies

experimentales (rata, ratón, conejo y perro). La Teobromina es completamente

absorbida y distribuida dentro de los tejidos del cuerpo en proporción similar a su

contenido en agua.

EFECTO TOXICO:

A dosis alta de teobromina, los efectos adversos que se observan en humanos

incluyen náuseas y anorexia.

La Teobromina produce efectos similares a los otras metilxantinas, es decir,

estimulación del Sistema Nerviosa Central, broncodilatación y diversos efectos

cardiovasculares, sin embargo, en los humanos no se ven estos efectos al

consumir chocolate, siendo muy raros las intoxicaciones, aunque es posible, que

pueda producir dolor de cabeza, inapetencia o alergias en personas sensibles o en

grandes cantidades.

Los estimulantes metilxantinas no tienen grandes efectos adversos, solo exageran

sus efectos. Su margen terapéutico es más bien amplio.

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Su consumo lleva a una habituación, no una dependencia, como por ejemplo:

habituación a la Coca-Cola o al chocolate.

BIOTRANSFORMACION:

La biotransformación afecta al 90% de la Teobromina, transformándose por

demetilación en l-metilxantina y, en menor proporción, en ácidos metilínicos. La

Teobromina se distribuye por todo el cuerpo, es rápidamente metabolizada y se

desconoce si la Teobromina y sus metabolitos son excretados por la orina. No hay

datos que indiquen acumulación de Teobromina.

INGESTA DIARIA ADMISIBLE:

No existen valores de referencia sobre ingestas diarias máximas tolerable de

teobromina para las personas.

LIMITE MAXIMO RESIDUAL:

No existen valores de referencia de límites máximos para las personas. Pero en

animales es de 6-17 gramos de chocolate negro (el que contiene mayor

concentración de teobromina) por cada kilogramo de peso del animal.

METODOS DE DETECCION DE LA TEOBROMINA:

Los métodos más usuales para determinar y cuantificar los niveles de Teobromina

son:

• Cromatografía líquida de alta eficiencia

• Cromatografía de capa fina

• Cromatografía de gases

• Electroforesis Capilar

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TRATAMIENTO:

Las materias primas que puedan sufrir contaminación por Teobromina son:

cascarilla del cacao y harina de cacao las mismas que no deben utilizarse para la

alimentación animal.

No hay actualmente ningún método para descontaminar productos o materias

primas que contengan Teobromina.

NORMAS LEGALES DE REGULACION:

1. NTE INEN 176:2006 CACAO EN GRANO. REQUISITOS

2. REAL DECRETO 465/2003 DEL 25 DE ABRIL SOBRE LAS SUSTANCIAS

INDESEABLES EN LA ALIMENTACIÓN ANIMAL.

3. Orden PRE/1809/2006, de 5 de junio, por la que se modifica el Anexo del

Real Decreto

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